糖尿病性局部缺血疾病的基因治療的製作方法

2023-05-15 13:57:06

專利名稱：糖尿病性局部缺血疾病的基因治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用肝細胞生長因子(HGF)對糖尿病缺血疾病進行基因治療的試劑和方法。更明確地，本發明涉及基因治療糖尿病缺血疾病的方法，其包括非侵襲性給予含HGF基因或以HGF基因為有效成分的治療試劑。
背景技術：
HGF是一種蛋白質，首先發現它是強烈刺激肝細胞成熟的生長因子，並且克隆了編碼它的基因(生物化學和生物物理研究交流(Biochem.Biophys.Res.Commun.)122，1450(1984)；美國國家科學院會議論文集(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83，6489(1986)；歐洲生物化學協會聯合會會刊(FEBS Letter)22，231(1987)；自然342，440(1989)；美國國家科學院會議論文集87，3200(1991))。後來，研究者發現HGF不僅可以作為體內的肝細胞再生因子修復和再生損傷的肝臟，還有血管生成的功能，並在局部缺血疾病和動脈疾病的治療和預防中發揮重要作用(Symp.Soc.Exp.Biol.47，細胞行為，227-234(1993)；美國國家科學院會議論文集90，1937-1941(1993)；循環97，381-390(1998))。已報導，給予兔下肢局部缺血模型HGF，可以觀察到明顯的血管生成及血流改善，血壓降低的抑制和局部缺血症狀的改善。根據這些報導，目前認為HGF可表達為一種血管生成因子並具有其功能。
如上所述，HGF具有血管生長因子的功能而表現出各種各樣的功能，許多研究者試圖把它製成藥物。然而，HGF在血液中的半衰期成為一個問題。HGF的半衰期只有10分鐘左右，很難維持在血液中的濃度。因此，問題在於如何把HGF的有效濃度遞送到效應部位。
眾所周知蛋白製劑絕大多數通過靜脈注射給予，上述向局部缺血模型給予HGF便是如此，靜脈和動脈內給予的實例見(循環97，381-390(1998))。儘管靜脈或動脈內給予HGF對局部缺血疾病和動脈疾病有效，針對HGF特異性有效的給藥方法、用藥劑量等還在研究中。由於上述HGF的半衰期和遞送到效應部位的問題，針對HGF蛋白特別有效的給藥方法或劑量還在研究。
另一方面，由於最近分子生物學的快速發展，有可能利用基因轉移的方法活化細胞功能並進行了各種各樣的嘗試。已進行了心區基因治療的試驗。已報導了一些基因轉移的方法，比如冠狀擴散注入法等，但還沒有針對局部缺血部位的基因轉移法實例，尤其對特定糖尿病性局部缺血疾病的骨骼肌肌肉內輸注法。
此外，已知糖尿病並發的或直接導致的局部缺血疾病很少發生血管再生並且預後不理想。目前還不知道這種糖尿病性局部缺血疾病給予HGF基因是否有效。

發明內容
本發明的目的是提供利用HGF基因治療糖尿病性局部缺血疾病的製劑和方法。
發明人研究了HGF基因是否適於糖尿病性局部缺血疾病的治療，結果發現通過直接在局部缺血性部位給予HGF基因得到極有效的結果。具體地，就下肢局部缺血疾病而言，發現在局部缺血下肢給予HGF基因獲得了有效的結果。如上所述，已知糖尿病並髮型或糖尿病所致局部缺血疾病很少發生血管再生並且預後不理想。所以，與單純的局部缺血疾病不同，目前未知HGF基因對糖尿病性局部缺血疾病是否有效。本發明首次揭示了HGF基因對糖尿病性局部缺血疾病的有效性。
由於本方法為非侵襲性治療，因此其具有可根據病情重複給予本基因的優勢。
因此，本發明的要點如下(1)一種糖尿病性局部缺血疾病的治療製劑，其包括肝細胞生長因子(HGF)作為有效組分；(2)根據(1)的治療製劑，其用於局部缺血部位給藥；(3)根據(1)或(2)的治療製劑，其中糖尿病性局部缺血疾病選自糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神經病或糖尿病缺血性心肌梗塞；
(4)根據(3)的治療製劑，其中糖尿病性局部缺血疾病是糖尿病性下肢局部缺血；(5)根據(1)到(4)任何一項的治療製劑，其用於缺血部位的肌肉內給藥；(6)根據(1)到(5)任何一項的治療製劑，其中HGF基因是仙臺病毒(HVJ)-脂質體的形式。
(7)根據(1)到(6)任何一項的治療製劑，其中HGF基因可根據需要重複給藥；(8)根據(1)到(7)任何一項的治療製劑，其中HGF基因的量至少50μg；(9)治療糖尿病性局部缺血疾病的方法，其包括把HGF基因導入人體。
(10)根據(9)的方法，其中HGF基因給藥於局部缺血部位。
(11)根據(9)或(10)的方法，其中糖尿病性局部缺血疾病選自糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神經病或糖尿病缺血性心肌梗塞；(12)根據(11)的方法，其中糖尿病性局部缺血疾病是糖尿病性下肢局部缺血；(13)根據(9)到(12)任何一項的方法，其中HGF基因向局部缺血部位的肌肉內給藥；(14)根據(9)到(13)任何一項的方法，其中HGF基因是仙臺病毒(HVJ)-脂質體的形式；(15)根據(9)到(14)任何一項的方法，其中HGF基因可根據需要重複給予；(16)根據(9)到(15)任何一項的方法，其中HGF基因的量至少為50μg；(17)HGF基因在製備糖尿病性局部缺血疾病的治療製劑中的用途。
(18)根據(17)涉及的用途，其中糖尿病性局部缺血疾病選自糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神經病或糖尿病缺血性心肌梗塞；(19)根據(18)涉及的用途，其中糖尿病性局部缺血疾病是糖尿病性下肢局部缺血；(20)根據(17)到(19)中任何一項的用途，其中HGF基因是仙臺病毒(HVJ)-脂質體的形式；並且(21)根據(17)到(20)中任何一項的用途，其中HGF基因的量至少為50μg。
附圖簡述

圖1顯示參考例1中糖尿病性下肢局部缺血大鼠及對照組大鼠(在正常大鼠中誘導下肢局部缺血)的血流灌注率隨時間的變化。
圖2顯示參考例1中糖尿病性下肢局部缺血大鼠及對照組大鼠(在正常大鼠中誘導下肢局部缺血)缺血部位肌肉內的HGF濃度。
圖3顯示參考例1中糖尿病性下肢局部缺血大鼠(給予或未給予HGF基因)及對照組大鼠(在正常大鼠中誘導下肢局部缺血)的血流灌注率。
圖4為通過對下肢局部缺血部位的骨骼肌進行ALP(鹼性磷酸酶)染色，揭示參考例1中糖尿病性下肢局部缺血大鼠(給予或未給予HGF基因)及對照組大鼠(在正常大鼠中誘導下肢局部缺血)的血管數比較結果。
圖5顯示參考例2中添加了葡萄糖的血管內皮細胞的培養上清(加或未加HGF)及對照組(未加葡萄糖)中的MMP-1濃度。
圖6顯示參考例3中添加了葡萄糖的血管內皮細胞的培養上清(加或未加HGF)及對照組(未加葡萄糖)中，表達於血管內皮細胞中的轉錄因子的mRNA水平。
實施本發明的最佳模式本文所用「HGF基因」指能表達HGF(HGF蛋白)的基因。具體指，在自然342440(1989)；日本專利公開號2777678；生物化學和生物物理研究交流163967(1989)；和生物化學和生物物理研究交流172321(1990)等文獻中描述的，整合至下述適當表達載體(非病毒載體，病毒載體)的HGFcDNA。編碼本發明HGF基因的鹼基序列已在上述文獻中描述，並在資料庫如Genbank中登記。因此，根據這類序列信息，以適當DNA片段作為PCR引物，通過如對肝臟或白細胞的mRNA實施RT-PCR，可克隆HGF的cDNA。這類克隆可由本領域技術人員根據基礎教材如分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)很輕易地實施。
本發明的HGF基因不限於上面提到的基因，還包括能編碼與HGF功能基本相同之蛋白的那些基因。即下述基因歸入本發明的HGF基因類1)在嚴格條件下與該cDNA雜交的DNA，和2)一種DNA，其編碼蛋白的胺基酸序列為在所述cDNA編碼蛋白中有一個或多個(優選幾個)胺基酸被取代、刪除和/或加入，而且其編碼的蛋白質具有HGF的功能。以上1)和2)的DNA很容易獲得，例如，通過定點誘變、PCR法和依次(ordinal)雜交法等。根據上述基礎教材很容易實施這些方法。
隨後闡述本發明基因治療中應用的基因轉移方法、劑型、劑量等。
含有上述基因作為有效成分以便給藥於患者的基因治療劑的劑型可大致分為兩組一組使用非病毒載體，另一組使用病毒載體。它們的製備和給藥方法詳述於實驗室手冊(實驗醫學增刊，基因治療的基本技術，Yodosha(1996)；實驗醫學增刊，基因轉移和表達分析中的實驗方法，Yodosha(1997)；基因治療的開發及研究手冊，日本基因治療協會編，NTS(1999))。具體描述如下。
A.非病毒載體的使用將目的基因整合至一種常用的基因表達載體中，產生的重組表達載體可用於將該目的基因用以下方法導入細胞或組織。
將基因轉移至細胞中的方法包括脂轉染法、磷酸鈣共沉澱法、DEAE-葡聚糖法、用顯微玻璃管將DNA直接導入法等。
就基因轉移至組織中的方法而言，將所述重組表達載體摻入細胞可通過，如使用內在型脂質體的基因轉移方法，使用靜電型脂質體的基因導入方法，HVJ-脂質體法，改良的HVJ-脂質體法(HVJ-AVE脂質體法)，受體-介導的基因導入法，將DNA分子與載體(金屬粒子)一起通過粒子槍導入的方法，直接導入裸露DNA的方法，使用帶正電的多聚體的導入方法，等。
它們中，HVJ-脂質體是一種融合產物，其通過在脂質雙層所構成的脂質體中容納DNA而產生，其中所述脂質體已融合至滅活的仙臺病毒(日本血凝病毒HVJ)。HVJ-脂質體法的特徵是與常規脂質體法比較，它與細胞膜的融合具有非常高的融合活性，它是優選的導入方法。製備HVJ-脂質體的方法可詳見文獻(實驗醫學單冊，基因治療的基本技術，Yodosha(1996)；基因導入和表達分析中的實驗方法，Yodosha(1997)；臨床研究雜誌，931458-1464(1994)；美國生理學雜誌，271R1212-1220(1996))等，詳述於下文實驗實施例。具體優選Z株(可得自ATCC)作為HVJ病毒株，但也可使用其它HVJ株(例如，ATCC VR-907和ATCC VR-105)。
此外，直接導入裸露DNA的方法是上述方法中最簡單的一種，因此也是優選的導入方法。
本文所用表達載體可以是任何表達載體，只要它們可體內表達目的基因。實例如pCAGGS(基因108193-200(1991))，pBK-CMV，pcDNA3.1，pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)等。
B.病毒載體的使用使用病毒載體的代表性方法包括使用諸如重組腺病毒、逆轉錄病毒等作為病毒載體的方法。更具體地，可將目的基因導入DNA病毒，如脫毒的逆轉錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，皰疹病毒，痘苗病毒，痘病毒，脊髓灰質炎病毒，新培斯病毒，仙臺病毒，SV40，人類免疫缺陷病毒(HIV)等，然後使病毒感染細胞以便將所述基因導入細胞。
上述病毒載體中，已知腺病毒的感染效力比其它病毒載體的高很多。故優選使用腺病毒載體系統。
將基因治療劑導入患者的方法有，能將基因治療劑直接導入機體的體內法，和從人體取出細胞，將基因治療劑導入其中，然後再導回體內的離體法(Nikkei Science，1994年4月期20-24頁；Monthly Yakuji，36(1)23-48(1994)；實驗醫學增刊12(15)(1994)；基因治療的開發及研究手冊，NTS(1999))。本發明優選體內法。
可根據上述給藥方案採用各種劑型(如液體)。當使用含有所述基因作為有效成分的注射劑時，可通過將所述有效成分溶於一種標準溶劑(緩衝液如PBS，生理鹽水，無菌水等)來製備。然後可按要求將所述注射液用濾膜過濾除菌，再裝入已滅菌的容器中。可在該注射液中加入常規載體等。脂質體，如HVJ-脂質體可採取懸浮劑，冷凍製劑，離心濃縮的冷凍製劑等形式。
本發明可以單獨使用HGF基因或與已知的具有血管生成功能的因子聯合使用。例如，已報導VEGF和FGF等因子具有血管生成功能，所以也可以使用這些基因。而且，已報導生長因子如EGF可以修復各種組織的細胞損傷，因此也可使用編碼它們的基因。
本文中糖尿病性局部缺血疾病包括糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神經病或糖尿病缺血性心肌梗塞等，本發明的治療製劑可用於任何一種上述疾病。而且，本發明的治療製劑不僅可用於危重糖尿病性局部缺血病人而且可用於進展性輕微症狀的病人。
可針對本發明的基因治療製劑選擇足以治療疾病或症狀的正確給藥方法和部位。給藥方法優選非胃腸道給藥。給藥部位優選局部缺血部位。本文「局部缺血部位」包括局部缺血的患處及其周邊的部位。
具體地，可給藥至血管或局部缺血部位的肌肉中。但優選局部缺血部位的肌肉中給藥。換言之，給藥至下肢局部缺血部位的骨骼肌能刺激局部缺血病灶的血管生成並改善血流。從而使局部缺血部位的功能恢復並正常化。在心臟病如心肌梗塞中，可通過給藥至心肌而獲得相似的效應。
優選的給藥方法有通過非侵襲性導管、非侵襲性注射器等進行的給藥。此外，可通過回波的使用來實施非侵襲性導管給藥，非侵襲性注射器給藥等。利用非侵襲性導管的方法如直接將HGF基因從心臟病人的心室內部空間注射至心肌。
應用本發明的HGF基因使糖尿病性局部缺血疾病的患者有可能得到積極的治療。例如，它能使除了外科手術切除患處以外無法有效治療的重症患者恢復功能。
本發明治療劑的用量根據患者的症狀變化，可將每成人患者的劑量定為HGF基因約1μg-50mg，優選約10μg-5mg，更優選約50μg-5mg。
本發明的治療製劑適於每隔幾天給藥一次，或每隔幾周給藥一次，優選每周給藥一次。根據本發明的治療，基因均為非侵襲性給藥，因此目的基因可根據需要儘可能多地給藥。
現在參照下面的實例具體解釋本發明。然而，請注意本發明不以任何方式受限於這些實施例。
材料方法製備HVJ脂質體製劑將10mg幹脂質(磷脂醯絲氨酸、磷脂醯膽鹼、與膽固醇1∶4.8∶2的混合物)與含HGF基因(100μg)-HMG1(高遷移率1組核蛋白，25μg)的200μl平衡鹽溶液(137μM NaCl，5.4μM KCl，10μM Tris-HCl；pH7.6)經強烈攪拌及超聲處理而混合，形成脂質體。純化的仙臺病毒(Z株)用UV(110爾格/mm2/秒)照射3分鐘。將脂質體懸浮液與仙臺病毒(HVJ)混合，4℃加熱10分鐘，然後37℃加熱30分鐘。棄去游離的HVJ，從而得到HVJ脂質體試劑。
實驗動物給藥組糖尿病大鼠中的局部缺血大鼠(DM-大鼠)對照大鼠正常大鼠中的局部缺血大鼠HVJ脂質體製劑的給藥方法大鼠(6周齡；每組6隻動物)經腹膜內給予鏈脲黴素而激發糖尿病，通過外科切除這種糖尿病大鼠一條腿的股骨動脈，造成下肢局部缺血。
將含有HGF基因的HVJ脂質體製劑注入下肢骨骼肌。
檢測詳述給予脂質體製劑後，通過都卜勒雷射影像僅(LDI)利用雷射散射分析監測下肢血流，以此作為側支(bypass)循環的形成和血流改善效果的指徵。取局部缺血下肢相對於正常下肢的彩色直方圖平均值為灌注比。
下肢局部缺血部位毛細血管密度通過鹼性磷酸酶(ALP)染色檢測，比較糖尿病性下肢缺血大鼠組與對照下肢缺血大鼠組的結果。另外，比較了HGF基因治療組與未用HGF基因治療組的結果。
參考例1糖尿病大鼠下肢局部缺血部位的HGF表達狀態大鼠(6周齡；每組6隻動物)經腹膜內給予鏈脲黴素而激發糖尿病。通過外科切除這種糖尿病大鼠，以及作為對照的正常大鼠(6周齡；每組6隻動物)的一條腿之股骨動脈，造成下肢局部缺血。
一周後，用都卜勒雷射影像儀測定局部缺血部位的灌注比。局部缺血部位或糖尿病性下肢局部缺血大鼠的灌注比遠低於對照組下肢缺血大鼠的灌注比(見圖1)。
3周和5周後再次測量下肢灌注比，得到相同的結果。即糖尿病性下肢缺血大鼠的下肢灌注比遠低於對照組大鼠下肢灌注比(見圖1)。
糖尿病性下肢局部缺血大鼠的缺血部位肌肉中內部HGF濃度顯著低於對照組下肢局部缺血大鼠的。這個結果表示，由於肌肉中內部HGF的減少，糖尿病患者的血管再生能力很差。故糖尿病性下肢局部缺血大鼠幾乎沒有血管再生並且不形成側支循環(見圖2)。
實驗1針對糖尿病性下肢局部缺血大鼠的HGF基因治療效果(I)
大鼠(6周齡；每組6隻動物)經腹膜內給予鏈脲黴素而激發糖尿病。通過外科切除這種糖尿病大鼠一條腿之股骨動脈，造成下肢局部缺血。之後，將含有HGF基因(50μg)的HVJ脂質體製劑注射至下肢局部缺血部位的肌肉中。
3周後，用都卜勒雷射影像僅(LDI)監測局部缺血部位的灌注比。糖尿病性下肢缺血大鼠給予HGF之後，相對於對照組下肢缺血大鼠和未如上述給藥的糖尿病性下肢缺血大鼠組，缺血部位的灌注比顯著增加。
以對照組下肢局部缺血大鼠的灌注比為100％，HGF基因未處理組糖尿病性下肢缺血大鼠的灌注比為67％，HGF基因處理組糖尿病性下肢缺血大鼠的灌注比為129％。圖3顯示了結果(見圖1)。
實驗2針對糖尿病性下肢局部缺血大鼠的HGF基因治療效果(II)經過上述處理的糖尿病性下肢局部缺血大鼠和對照組下肢局部缺血大鼠接受HGF基因治療。5周後，取每一動物的下肢缺血部位的骨骼肌，進行ALP染色並比較每單位面積的血管數。HGF基因未處理組糖尿病性下肢缺血大鼠的血管計數顯著少於對照組下肢局部缺血大鼠的血管計數，但HGF基因處理組糖尿病性下肢缺血大鼠的血管計數顯著增加。結果見表4。
參考例2葡萄糖濃度和HGF的添加對血管內皮細胞之MMP-1產生的影響在各含0,25mM和50mM葡萄糖的三種無血清培養基中培養血管內皮細胞(衍生自人的主動脈)。培養24小時後，檢測培養上清中MMP-1的濃度。
將每種樣品與下組比較，該組在添加葡萄糖之前30分鐘時加入100ng/ml HGF。
上清中MMP-1濃度隨葡萄糖濃度的減少而明顯減少，並且顯示給予HGF可以抑制MMP-1的減少。結果見圖5。
參考例3HGF對血管內皮細胞的影響(與血管生成相關的轉錄因子ETS-1的改變)
血管內皮細胞的培養如參考例2所述進行，並檢測所述細胞中轉錄因子ETS-1 mRNA的表達。以對照組內皮細胞的ETS-1 mRNA作為100％，HGF處理組的血管內皮細胞以葡萄糖依賴方式減少。另一方面，HGF處理組血管內皮細胞與對照組相比，ETS-1 mRNA的表達水平相同或更高(P＜0.01)。結果見圖6。
如上所述，血管內皮細胞在高葡萄糖濃度下MMP-1(血管再生所必需的一種基質裂解酶)表達減少，轉錄因子ETS-1(其在血管再生過程中表達並增加)mRNA的表達減少。
結果表明，在高葡萄糖濃度條件下，幾乎不發生血管再生。另一方面，血管內皮細胞在高濃度葡萄糖條件下加入HGF，MMP-1表達和ETS-1mRNA的表達顯著增加。因此，這些結果表明HGF使血管生成更容易。
產業適用性糖尿病引起下肢局部缺血的治療製劑以HGF基因做為有效成分，它可以使伴有HGF表達減少之糖尿病缺血疾病的患處特有的不良血管再生得到改善，並且顯示了顯著的血管再生效應。所以，它可通過增加局部缺血患處的血流而使病情好轉。而且，本發明的治療製劑可以根據病人病情多次給藥，從而刺激血管生成。所以，根據這些效應，本發明的治療製劑有可能治療糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神經病和糖尿病缺血性心肌梗塞。
權利要求
1.一種糖尿病缺血疾病的治療製劑，它包含肝細胞生長因子(HGF)作為有效成分。
2.權利要求1的治療製劑，其用於缺血部位給藥。
3.權利要求1或2的治療製劑，其中所述糖尿病性局部缺血疾病選自糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神經病或糖尿病缺血性心肌梗塞。
4.權利要求3的治療製劑，其中所述糖尿病性局部缺血疾病是糖尿病性下肢局部缺血。
5.權利要求1-4中任何一項的治療製劑，其用於向缺血部位的肌肉中給藥。
6.權利要求1-5中任何一項的治療製劑，其中所述HGF基因為仙臺病毒(HVJ)-脂質體的形式。
7.權利要求1-6中任何一項的治療製劑，需要時可重複給藥。
8.權利要求1-7中任何一項的治療製劑，其中HGF基因的給藥量至少為50μg。
9.一種治療糖尿病性局部缺血疾病的方法，其包括將HGF基因轉移至人體內。
10.權利要求9的方法，其中將HGF基因給藥至局部缺血部位。
11.權利要求9或10的方法，其中糖尿病性局部缺血疾病選自糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神經病或糖尿病缺血性心肌梗塞。
12.權利要求11的方法，其中所述糖尿病性局部缺血疾病為糖尿病性下肢局部缺血。
13.權利要求9-12中任何一項的方法，其中將HGF基因給藥於局部缺血部位的肌肉中。
14.權利要求9-13中任何一項的方法，其中所述HGF基因為仙臺病毒(HVJ)-脂質體的形式。
15.權利要求9-14中任何一項的方法，其中HGF基因可根據需要重複給予。
16.權利要求9-15中任何一項的方法，其中HGF基因的給藥量至少為50μg。
17.HGF基因在製備糖尿病性局部缺血疾病的治療製劑中的應用。
18.權利要求17的應用，其中糖尿病性局部缺血疾病選自糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神經病或糖尿病缺血性心肌梗塞。
19.權利要求18的應用，其中所述糖尿病性局部缺血疾病為糖尿病性下肢局部缺血。
20.權利要求17-19中任何一項的應用，其中所述HGF基因為仙臺病毒(HVJ)-脂質體的形式。
21.權利要求17-20中任何一項的應用，其中HGF基因的給藥量至少為50μg。
全文摘要
在糖尿病缺血部位給予HGF(肝細胞生長因子)基因可以促進糖尿病缺血部位的血管生成,並因此使局部缺血疾病康復。
文檔編號A61K9/127GK1339973SQ00803835
公開日2002年3月13日 申請日期2000年10月26日 優先權日1999年10月29日
發明者森下竜一, 荻原俊男 申請人:醫學基因生物科學株式會社