Bnm3轉錄激活物控制植物胚胎發生和再生過程的用途的製作方法

2023-05-01 10:21:56 3

專利名稱：Bnm3轉錄激活物控制植物胚胎發生和再生過程的用途的製作方法
背景技術：
典型的被子植物種子由三個主要成分構成，胚、胚乳和母體種皮。種子發育起自一雙受精事件，在該事件中一個精細胞核與一個卵細胞核融合形成胚，第二個精細胞核與兩個中央細胞核融合形成胚乳。胚發育本身可分成三個發育階段，胚發育第一個階段是細胞分裂和形態發生階段，其用於建立成熟植物的主要組織類型和器官系統。第二個階段包括快速細胞擴增階段，其特徵在於合成貯藏儲備，以在萌發和早期幼苗發育過程中維持胚。在胚發育的最後階段，胚成粉狀並進入發育停止期或稱休眠期。所有上述事件通常在種子保持附著在母體植物中時發生。
許多植物物種能在不受精中產生胚，這一無性胚發育過程可天然發生，例如在Bryophyllum(Yarborough，1923)和Malaxis(Taylor，1967)的葉緣上，或在無融合生殖植物的胚珠內(Koltunow，1995)。無融合生殖是指在不存在卵細胞受精時從母體胚珠組織產生種子的現象。無性胚發育也可從配子體或體細胞組織經體外誘導(Mordhorst等，1997)，或者如最近所述，可通過基因表達的遺傳修飾而誘導(Ogas等，1997；Lotan等，1998)。
已觀察到無融合生殖的三種主要機制，即倍數孢子形成、無孢子生殖和不定胚生殖。每種機制根據產生胚的細胞的來源以及在胚珠發育過程中起始無融合生殖過程的時間而不同。倍數孢子形成和無孢子生殖被認為是無融合生殖的配子體形式，因為它們涉及二倍體胚囊的形成。不定胚生殖不涉及有絲分裂衍生的胚囊的產生。
在倍數孢子形成中，大孢子母細胞不進行正常減數分裂，而是有絲分裂產生二倍體胚囊，而非正常的單倍體胚囊。胚囊細胞之一作為卵細胞起作用並孤雌生殖分裂(不經受精)形成胚。在某些物種中，胚囊的未還原的極性核可融合形成種子的營養性組織胚乳(自動胚乳生成)，而另一些物種中需要傳粉而進行胚乳生成(假受精)。
在無孢子生殖型無融合生殖中，孤雌胚從另外的細胞即無孢子生殖原始細胞中產生，該細胞是從珠心中分化而來。與倍數孢子形成物種的大配子母細胞一樣，無孢子生殖原始細胞進行有絲分裂產生二倍體胚囊。無孢子生殖胚不是衍生自大配子母細胞，並因此可在一單個胚珠中與有性衍生的胚共存。在無孢子生殖物種中很少發生胚乳的自動產生，因此無孢子生殖型無融合生殖依賴於減數分裂衍生的胚囊的極性核的受精來產生胚乳。
對於不定胚生殖，胚直接從孢子體胚珠組織如珠被或珠心中經孤雌生殖而形成。來自顯示不定胚生殖的物種的種子通常含有多個無性胚並也可含有單個有性胚。顯示不定胚生殖的物種也依賴於在相同胚珠內存在減數分裂衍生的胚囊以形成胚乳。
在大多數植物物種中，無融合生殖性狀似乎在一單顯性基因座的控制下，這一基因座可編碼一或多個發育調控物，如轉錄因子，其在有性生殖植物中能起始基因表達級聯，導致胚囊和/或胚胎發生，但是其在無融合生殖植物中異時或異位表達(Peacock，1995；Koltunow，1993；Koltunow等，1995)。
無融合生殖對於作物改進是一有價值的性狀，因為無融合生殖種子產生克隆子代並因此可用於遺傳固定雜交品系。雜交種子的生產是一費力而昂貴的程序，因為它涉及遺傳學純種親本品系的保持，不同的花粉共同和雄性不育品系的使用，以及品系分離。通過無融合生殖生產種子避免了這些問題，因為一旦產生雜種，其可克隆保持，因此無需保持和雜交不同的親本品系。無融合生殖種子的應用也提供了繁殖營養生殖作物的更經濟的方法，因為其不需使用扦插或組織培養技術繁殖品系，降低了易於通過營養生殖組織傳遞的疾病傳播，並且在許多物種中降低了繁殖體的大小，使得降低運輸和種植成本。
儘管無融合生殖在許多植物物種中發生，但是僅有很少的作物物種是無融合生殖的。通過從野生親緣物種中漸滲雜交(Ozias-Akins等，1993；WO97/10704；WO97/11167)或通過相關但發育趨異的有性物種間的雜交(WO98/33374)而將無融合生殖性狀引入作物物種的嘗試未能得到有市場價值的產物。其它的途徑集中在可用於鑑別或操作無融合生殖過程的基因序列的鑑別上(WO97/43427；WO98/36090)，但是這些途徑沒有導致產生常規生產無融合生殖植物的方法。
也已經嘗試誘變途徑將有性繁殖植物如擬南芥(擬南芥屬)轉變成無融合生殖植物(Peacock等，1995)。例如，已經鑑別了若干隱性「受精不依賴性種子」(fis)突變體，其在不發生受精作用的情況下可以低頻率起始部分胚和/或胚乳(Chaudhury等，1997)。但是，需要修改一些參數以用fis)突變體獲得真正的二倍體無融合生殖種子。
從許多配子體和體細胞植物組織培養物中可誘導形成無性衍生的胚(Yeung，1995)。通過用植物生長調節劑如植物生長素或植物生長素與細胞激動素聯合處理體細胞組織培養物可從中獲得體細胞胚。通過加入植物生長調節劑或通過簡單的應力處理可以從胚珠(雌核發育)和花葯(雄核發育，花粉或小孢子胚胎發生)的配子體組織培養物誘導形成胚。
已鑑別了幾種可用於誘導有效體外胚生成的突變體，這些突變體包括具有改變的枝分生組織的隱性擬南芥屬突變體，例如primordiatiming(pt)，clavata(clv)1和clv3，其示出幼苗在存在植物生長素而萌發時增強胚胎發生愈傷組織形成(Mordhorst等，1998)。已示出兩種擬南芥屬基因LEAFY COTYLEDON(LEC1；WO98/37184，Lotan等，1998)和pickle的改變的表達在不添加生長調節劑時也促進體細胞胚的生成。LEC1基因編碼CCAAT盒結合轉錄因子(CBF)的HAP3亞基的同系物，LEC1基因控制合子胚發育的許多方面，包括乾燥耐受性和子葉同一性。在lec1突變體背景中LEC1基因的異位過表達導致產生2種轉基因品系，其偶爾在葉上形成胚樣結構。這些胚樣結構表達基因，如編碼種子貯藏蛋白和油體蛋白的基因，這些基因正常情況下在發育胚中優先表達。含有隱性突變體PICKLE基因的植物產生增厚的初級根分生組織。當將根組織與植物其它部分分開並置於不含生長調節劑的基本培養基上時，突變的pickle根產生胚形成愈傷組織(Ogas等，1997)。突變的pickle根顯示發育種子的形態學特徵，如油體，並且與LEC1過表達植物一樣，積累在發育種子中優先表達的基因。
無融合生殖種子的有效產生似乎僅可通過鑑別並隨後修飾發育調控物如轉錄因子而實現，已知發育調控物激活基因表達級聯導致有性繁殖和無融合生殖植物中的胚胎發生。本發明通過提供產生無融合生殖種子的方法而實現這一需求，本發明方法包括異位過表達含有胚表達AP2結構域的轉錄因子BNM3或其同系物。
本發明的一個目的是克服現有技術的不足。
上述目的通過主權利要求特徵的組合而實現，從屬權利要求進一步公開了本發明的優選實施方案。
根據本發明，提供了一種分離的DNA分子，其包含的核苷酸序列·在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO5或6，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域，雜交；·在嚴格條件下與SEQ ID NO1或3，不包括AP2重複1-接頭一AP2重複2區域，雜交；·包含SEQ ID NO1，3，5或6的至少27個連續核苷酸；或者·與SEQ ID NO1，3，5或6的核苷酸序列具有至少70％的相似性。
本發明還涉及一種分離的DNA分子，其在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO1，3，5或6，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域雜交，並包括編碼一種蛋白質的核酸序列，其中該蛋白質當以足夠水平存在於植物細胞時能使細胞胚胎發生，或者增加植物細胞的再生能力，或者同時使細胞胚胎發生並增加植物細胞的再生能力。本發明包括上述分離的DNA分子，其包含在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO1的1-2014位核苷酸、SEQ ID NO3的1-2011位核苷酸、SEQ ID NO5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO6的2026-5035位核苷酸，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域，雜交的核苷酸序列。本發明還包括一種載體，其包含上述定義的分離的DNA分子，其中該分離的DNA分子在指導所述DNA在植物細胞中表達的調控元件的控制下。調控元件可以是組成型、誘導型、組織特異性或發育活性調控元件。
本發明還包括轉化的植物細胞、轉化的植物或得自轉化的植物的種子，其均包含上述定義的載體。
本發明涉及一種由一種分離的DNA分子編碼的分離的蛋白質，該分離的DNA分子在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO1，3，5或6的核苷酸序列，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域雜交，其中該蛋白質當以足夠水平存在於植物細胞時能使細胞胚胎發生，或者增加植物細胞的再生能力。本發明還包括由一種分離的DNA分子編碼的蛋白質，該分離的DNA分子在中等或嚴格條件下與SEQ IDNO5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO6的2026-5035位核苷酸，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域，雜交，或者在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO1或3的核苷酸序列雜交。本發明還包括編碼SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO7定義的蛋白質的分離的DNA分子。本發明還涉及與SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO7的胺基酸序列有至少70％同源性的蛋白質，或者包括SEQ ID NO2的序列的約30-541個胺基酸，或者包括SEQ ID NO4的序列的約30-561個胺基酸。
本發明還涉及產生無性衍生的胚的方法，包括i)用包含一種分離的DNA分子的載體轉化植物細胞，該分離的DNA分子在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO1，3，5或6的核苷酸序列，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域雜交，並且編碼一種蛋白質，該蛋白質當以足夠水平存在於植物細胞時能使植物細胞胚胎發生，或者增加植物細胞的再生能力，或者該分離的DNA分子包含-核苷酸序列，該核苷酸序列在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO6的2026-5035位核苷酸，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域，雜交，或者在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO1或3的核苷酸序列雜交；ii)培養所述植物細胞產生轉化的組織；iii) 確定轉化的組織中存在所述分離的DNA分子；和iv)分析轉化的組織中的無性胚形成。
本發明還涉及上述方法，其中分析步驟(步驟iv)涉及分析體細胞胚、配子體衍生胚、不定胚生殖、倍數孢子形成，或者分析胚囊的單倍體孤雌生殖。
本發明還包括生產無融合生殖植物的方法，包括
i)用包含一種分離的DNA分子的載體轉化植物細胞，該分離的DNA分子在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO1的1-2014位核苷酸、SEQ IDNO3的1-2011位核苷酸、SEQ IDNO5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO6的2026-5035位核苷酸，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域雜交，並且編碼一種蛋白質，該蛋白質當以足夠水平存在於植物細胞時能使植物細胞胚胎發生，或者增加植物細胞的再生能力；ii)確定轉化的組織中存在所述分離的DNA分子；和iii)分析轉化的組織中的無性胚形成。
本發明還涉及上述方法，其中分析步驟(步驟iii)涉及分析無性衍生的胚、體細胞胚、配子體衍生胚、不定胚生殖、倍數孢子形成，或者分析胚囊的單倍體孤雌生殖。
本發明還涉及一種產生無性衍生的胚的方法，包括i)用包含一種分離的DNA分子的載體瞬時轉化植物細胞，該分離的DNA分子在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO1的1-2014位核苷酸、SEQ ID NO3的1-2011位核苷酸、SEQ IDNO5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO6的2026-5035位核苷酸，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域雜交，並且編碼一種蛋白質，該蛋白質當以足夠水平存在於植物細胞時能使植物細胞胚胎發生，或者增加植物細胞的再生能力；ii)培養瞬時轉化的植物細胞以產生瞬時轉化的組織；iii)分析瞬時轉化的組織中的無性胚形成。
本發明還涉及上述方法，其中分析步驟(步驟iii)涉及分析無性衍生的胚、體細胞胚、配子體衍生胚、不定胚生殖、倍數孢子形成，或者分析胚囊的單倍體孤雌生殖。
本發明還涉及一種修飾植物的再生能力的方法，包括i)用包含一種分離的DNA分子的載體轉化植物細胞，該分離的DNA分子在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO5或SEQ IDNO6雜交並且編碼一種蛋白質，該蛋白質當以足夠水平存在於植物細胞時能使植物細胞胚胎發生，或者增加植物細胞的再生能力，或者該分離的DNA分子包含一種核苷酸序列，該核苷酸序列在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO6的2026-5035位核苷酸，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域雜交，或者在嚴格條件下與SEQ ID NO1的1-2014位核苷酸或SEQ IDNO3的1-2011位核苷酸定義的核苷酸序列雜交；ii)培養轉化的植物細胞產生轉化的組織；和iii)分析轉化的組織與野生型組織相比增強的再生能力。
本發明還包括上述方法，其中步驟iii)包括在不存在生長調節劑時進行分析。
本發明還涉及修飾植物的再生能力的方法，包括i)用包含一種分離的DNA分子的載體瞬時轉化植物細胞，該分離的DNA分子在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO5或SEQID NO6雜交並且編碼一種蛋白質，該蛋白質當以足夠水平存在於植物細胞時能使植物細胞胚胎發生，或者增加植物細胞的再生能力，或者該分離的DNA分子包含一種核苷酸序列，該核苷酸序列在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO6的2026-5035位核苷酸，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域雜交，或者在嚴格條件下與SEQ ID NO1或3定義的核苷酸序列雜交；ii)培養瞬時轉化的植物細胞產生瞬時轉化的組織；和iii)分析轉化的組織與野生型組織相比增強的再生能力。
本發明還包括上述方法，其中步驟iii)包括在不存在生長調節劑時進行分析。
本發明還涉及一種選擇轉化的植物的方法，包括i)用包含一種分離的DNA分子的載體轉化正常非再生的植物，該分離的DNA分子在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO5或SEQ ID NO6雜交並且編碼一種蛋白質，該蛋白質當以足夠水平存在於植物細胞時能使植物細胞胚胎發生，或者增加植物細胞的再生能力，或者該分離的DNA分子包含一種核苷酸序列，該核苷酸序列在中等或嚴格條件下與SEQ IDNO5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO6的2026-5035位核苷酸，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域雜交，或者在嚴格條件下與SEQ ID NO1或3定義的核苷酸序列雜交；ii)確定轉化的植物是否能在該正常非再生植物不再生的條件下再生。
本發明還涉及一種分離的DNA分子，其包含一種DNA序列，該DNA序列與SEQ ID NO5的1-1619位核苷酸或SEQ ID NO6的1-2025位核苷酸至少有約70％相似性，或者包含SEQ ID NO5的1-1619位核苷酸或SEQ ID NO6的1-2025位核苷酸內的至少22個連續核苷酸。本發明範圍內還包括一種載體，其包含與一種感興趣基因可操縱連接的上述定義的分離的DNA分子，其中該分離的DNA分子指導該感興趣基因在植物細胞內的表達。感興趣的基因可以異源於該分離的DNA分子。感興趣的基因可選自藥物活性蛋白、抗體、工業酶、蛋白添加劑、營養藥、貯藏蛋白、動物飼料和動物飼料添加劑。本發明還包括包含上述定義的載體的轉化的植物細胞、轉化的植物或得自轉化的植物的種子。
另外，本發明包括指導感興趣的基因在植物的發育胚中表達的方法，包括用含有一分離的DNA分子的載體轉化所述植物，該分離的DNA分子與SEQ ID NO5的1-1619位核苷酸或SEQ ID NO6的1-2025位核苷酸至少有約70％相似性，或者包含SEQ ID NO5的1-1619位核苷酸或SEQ ID NO6的1-2025位核苷酸內的至少22個連續核苷酸。
本發明還涉及一種生產感興趣的蛋白質的方法，包括i)用至少一種載體轉化植物以產生轉化的植物，所述載體包含一種分離的DNA分子，該分離的DNA分子在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO5或SEQ ID NO6雜交並且編碼一種蛋白質，該蛋白質當以足夠水平存在於植物細胞時能使植物細胞胚胎發生，或者增加植物細胞的再生能力，或者該分離的DNA分子包含一種核苷酸序列，該核苷酸序列在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO6的2026-5035位核苷酸，不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區域雜交，或者在嚴格條件下與SEQ ID NO1或3定義的核苷酸序列雜交；ii)確定轉化的植物中存在所述分離的DNA分子；和iii)培養轉化的植物以生產感興趣的蛋白質，其中感興趣的蛋白質的表達由所述分離的DNA的表達產物而誘導。
本方法還包括用第二個載體轉化植物，該第二個載體包含在調控元件控制下的編碼感興趣的蛋白質的核苷酸序列，其中該調控元件由所述分離的DNA的表達產物而誘導。另外，本方法還可用於生產感興趣的蛋白質，其中該感興趣的蛋白質是一種天然蛋白質。
本發明的概述不需描述本發明的所有特徵，本發明還可體現在所述特徵的亞結合中。


圖1示出培養溫度對歐洲油菜(Brassica napus)的分離的小孢子和花粉的發育結局的影響。在25℃或更低溫度培養的晚期單核小孢子和早期雙核花粉持續分裂並形成有功能的花粉粒(配子體)，而在32℃培養的相同小孢子和花粉經歷無數孢子體分裂，導致形成單倍體胚(胚胎發生)。在25℃培養1天隨後在32℃培養的晚期單核小孢子和早期雙核花粉可經歷配子體分裂，但是不形成胚或成熟花粉粒(非胚胎發生)。
圖2示出SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的DNA序列的對比，用黑體字示出了ATG翻譯起始密碼子和TAG翻譯終止密碼子。相同胺基酸用符號(*)代表，缺口由符號(-)示出。
圖3示出由SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的DNA序列編碼的預測蛋白質序列的對比。用黑體字示出了第一個AP2結構域重複(重複1)和第二個AP2結構域重複(重複2)的胺基酸序列。相同胺基酸用星號(*)代表，錯配由在序列對比下面的點(.)示出。
圖4示出歐洲油菜基因組中兩個BNM3基因的存在。在高嚴格條件下將Topas基因組DNA與BNM3A cDNA片段雜交。在這些條件下BNM3A cDNA與兩個DNA片段雜交，這些片段相應於BNM3A和BNM3B基因。分子量標記(λDNA HindIII限制片段)的位置在圖的左側標出。用於消化DNA的限制酶在印跡上面示出。
圖5示出由SEQ ID NO1的DNA編碼的預測的蛋白質序列(BNM3A)與其它AP2結構域蛋白質的預測的蛋白質序列的對比。起自第208位並跨越第1個AP2結構域重複(AP2結構域重複1)、第2個AP2結構域重複(AP2結構域重複2)和兩個重複之間的接頭區(接頭)的BNM3A的胺基酸序列與含有兩個AP2結構域的其它蛋白質的胺基酸序列進行對比。這一區域的胺基酸相似性從APETALA2的53％至ZMMHCF1的80％。相同胺基酸用符號(*)代表，缺口由符號(-)示出。蛋白質名稱在左邊列出並縮寫如下ANT，AINTEGUMENTA(登錄號U41339)；ZM，ZMMHCF1(登錄號Z47554)；GL15，GLOSSY15(登錄號U41466)；AP2，APETALA2(登錄號U12546)。
圖6示出用BNM3A cDNA片段在提取自所示組織的RNA上進行的凝膠印跡分析的結果。RNA凝膠印跡含有5微克(a)或20微克(b，c)總RNA。圖6A示出在小孢子胚培養物中BNM3的表達模式。RNA是在收集時(花粉0d)、在32℃培養4天後(+胚)、在25℃培養4天後(花粉4d)、在25℃培養1天隨後在32℃培養3天後(-胚)的晚期單核小孢子和早期雙核花粉以及在發育的球形期、心期、魚雷期的小孢子衍生胚、21天子葉(21d子葉)、28天子葉(28d子葉)和42天子葉(42d子葉)中提取出來。在胚胎發生的小孢子和發育的小孢子衍生胚中檢測到BNM3表達，但是在組織培養之前收集的發育的小孢子和花粉中和非胚胎發生搖瓶中未檢測到。曝光時間是7天。圖6B示出BNM3基因表達在發育的種子中檢測到。種子在不同的傳粉後天數(DAP)收集，這些時間點在發育中大致相應於球形期(7d)，心期(14d)，魚雷期(18d)，早期子葉(21d)，中期子葉(28d，35d)和晚期子葉(42d)。圖6C示出在非種子組織中未檢測到BNM3基因表達。根和葉是從14天溫室生長的植物中收集，完整的花以及切割的花葯和雌蕊從即將開花的開放花芽中收集。小芽和大芽示出分別指長度小於5mm或大於5mm的閉合花芽。長角果是在傳粉後16天收集。曝光時間14天。
圖7示出用含有在修飾的POLYUBIQUITIN啟動子(B)和含有AMB翻譯增強子的雙倍增強的35S啟動子(A，C-E)控制下的BNM3基因的構建體轉化的歐洲油菜和擬南芥屬植物的表型。圖7A示出Brassica T1幼苗的葉緣上的胚結構。圖7B示出在擬南芥屬T2幼苗的葉柄上的胚結構。圖7C示出在擬南芥屬T1幼苗的子葉上的胚結構。圖7D示出擬南芥屬T1子葉的離軸側掃描電鏡圖。觀察到胚的雙極性以及從初生胚表面出現的次生胚(星號)。圖7E示出圖7C所示T1幼苗的一個子葉的半薄切片。觀察到存在胚的所有主要器官和組織元件，以及在苗端分生組織和子葉側翼的新胚發育。
圖8示出用含有在修飾的POLYUBIQUITIN啟動子控制下的BNM3B基因的構建體轉化的擬南芥屬植物具有增加的再生能力。圖8A示出在含有生長調節劑的培養基上的野生型和轉基因葉和下胚軸外植體。圖8B示出在含有生長調節劑的培養基上的野生型和轉基因根。圖8C示出在不含生長調節劑的培養基上的野生型和轉基因葉和下胚軸外植體。圖8D示出在不含生長調節劑的培養基上的野生型和轉基因根外植體。
圖9示出BNM3的擬南芥屬直向同源物AtBBM基因的鑑定。圖9A示出在約8kb的重疊擬南芥生態型C24基因組DNA上AtBBM序列的位置以及所選擇的限制酶的位點。該單個擬南芥屬BNM3同系物的預測蛋白質編碼區位於基因組序列的3426-6435位。預測的編碼區的外顯子由限制圖譜上的黑框示出。在7479位的垂直箭頭示出IXR3(Irregular xylem3)序列的起點。水平尺單位為kb。圖9B示出擬南芥屬AtBBM基因組克隆和通過用歐洲油菜BNM3 cDNA探針經DNA凝膠印跡分析鑑別的擬南芥屬同系物是相同的。用(A)所示限制酶消化來自擬南芥屬生態型Landsberg erecta(L)和Columbia(C)的基因組DNA並與全長BNM3A cDNA探針(SEQ IDNO1)雜交。(A)中所示限制圖譜與雜交限制片段模式的比較表明在中等嚴格清洗條件(0.2×SSC，0.1％SDS，25℃)下，全長BrassicacDNA探針檢測到一個擬南芥屬同系物。分子量標記(kb)在印跡右側示出。
以下描述的是舉例示出的優選實施方案，其並非對實施本發明所需的特徵組合的限制。
經減數篩選分離在歐洲油菜栽培品種Topas小孢子胚胎發生誘導期間優先表達的基因。發現有包含6個獨特的DNA序列的7個獨立cDNA克隆在製備自胚胎發生和非胚胎發生小孢子培養物的cDNA文庫中差異表達。如本文所述鑑定了幾個這種BNM(代表歐洲油菜小孢子胚，Brassica napus microspore embryo)克隆，即BNM3A(SEQID NO1)和BNM3B(SEQ ID NO3)。BNM3A和BNM3B分別編碼SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示胺基酸序列。還獲得了包括調控區(SEQ ID NO5的核苷酸1-1619)的BNM3A基因組序列(SEQ ID NO5)。也鑑別了稱為AtBBM的BNM3基因的擬南芥屬直向同源物。AtBBM的基因組序列如SEQ ID NO6所示，而其預測的胺基酸序列如SEQ ID NO7所示。
本文所用術語「再生」是指一種形態發生應答，其導致產生衍生自一個單細胞或一組細胞的新組織、器官、胚、整個植物或整個植物的片段。再生可通過愈傷組織時期間接進行，也可無需間插的愈傷組織時期之間進行。「再生能力」是指植物細胞進行再生的能力。
「胚胎發生細胞」是指已經完成了從體細胞或配子體細胞向無需進一步施加刺激物而產生胚的狀態過渡的細胞。
「調控元件」包括發育調控的、組織特異性的、誘導型和組成型調控元件。發育調控的或控制其所控制的基因的差異表達的調控元件在某些器官或器官的組織的發育過程中的特異時間在該器官或組織內被激活。但是某些發育調控的調控元件可在特異的發育階段在某些器官或組織內優先活化，它們也可以發育調控的方式或以基礎水平在植物的其它器官或組織中活化，這種調控元件被認為是「組織特異性的」。調控元件可以見於基因編碼區的上遊、之中、下遊或其組合。
誘導型調控元件是能應答誘導物而直接或間接激活一或多個DNA序列或基因的轉錄的調控元件。在不存在誘導物時，DNA序列或基因不轉錄。典型地，與激活轉錄的誘導型調控元件特異結合的蛋白質因子以非活性形式存在，其隨後通過誘導物而直接或間接轉變為活性形式。誘導物可以是化學製劑，如蛋白質、代謝物、生長調節劑、除草劑或酚化合物，或者是通過熱、冷、鹽或毒性元素直接施加的生理學應力，或通過病原體或致病因子如病毒而間接施加的生理學應力。含有誘導型調控元件的植物細胞可通過外部施加誘導物至細胞或植物而暴露於誘導物，施加方式如噴霧、灑水、加熱或類似方法。
組成型調控元件指導基因在植物的各個部分並在植物發育期間持續表達。已知的組成型調控元件的例子包括與CaMV 35S轉錄物相關的啟動子(Odell等，1985，自然313810-812)，與水稻肌動蛋白基因(Zhang等，1991，植物細胞31155-1165)以及丙糖磷酸異構酶1(Xu等，1994，植物生理學106459-467)基因相關的啟動子，與玉米遍在蛋白1基因相關的啟動子(Cornejo等，1993，植物分子生物學29637-646)，與擬南芥屬遍在蛋白1和6基因相關的啟動子(Holtorf等，1995，植物分子生物學29637-646)，與菸草翻譯起始因子4A基因相關的啟動子(Mandel等，1995，植物分子生物學29995-1004)。
「感興趣的基因」是指欲在轉化的植物中表達的任何基因。這種感興趣的基因可包括但不限於編碼藥物活性蛋白如生長因子、生長調節物、抗體、抗原、用於免疫接種的其衍生物等的基因。這種蛋白包括但不限於白介素、胰島素、G-CSF，GM-CSF，hPG-CSF，M-CSF或其組合、幹擾素如幹擾素-α、幹擾素-β、幹擾素-τ、凝血因子如因子VIII、因子IX或tPA或其組合。感興趣的基因也可編碼工業酶、蛋白補劑、營養藥或用作飼料、食品或飼料和食品的附加值產品。這種蛋白的例子包括但不限於蛋白酶、氧化酶、植酸酶幾丁質酶、轉化酶、脂酶、纖維素酶、木聚糖酶、參與油生物合成的酶等。其它蛋白補劑、營養藥或附加值產品包括天然或修飾的種子貯藏蛋白等。
本發明還涉及含有與本發明的調控元件可操縱連接的感興趣的DNA的嵌合基因構建體。任何外源基因或感興趣的基因可根據本發明使用和操作以獲得外源基因的表達。
感興趣基因的表達的激活也可在一調控元件的控制下，該調控元件本身被BNM3蛋白激活。非限制性的例子如感興趣的基因可與napin啟動子融合，而napin啟動子可被BNM3誘導。另外，感興趣的基因可在一或多個由BNM3誘導的啟動子的控制下在體細胞組織中表達，從而如以下將詳細描述的，體細胞組織發育成包括胚胎發生細胞的類似種子的結構，這些類似種子的結構產生感興趣基因的產物。
本發明的嵌合基因構建體還可包括3′非翻譯區。3′非翻譯區是指包含一DNA區段的基因的部分，該DNA區段含有多腺苷酸化信號和任何能實現mRNA加工或基因表達的調控信號。多腺苷酸化信號通常特徵在於能將聚腺苷酸序列段添加到mRNA前體的3′末端。多腺苷酸化信號通常通過存在與規範形式的5′AATAAA-3′的同源性而鑑別，當然常有變化。合適的3′區的例子是3′轉錄非翻譯區，其含有農桿菌根瘤誘導(Ti)質粒基因如胭脂氨酸合酶(Nos基因)和植物基因如大豆貯藏蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)基因的多腺苷酸化信號。因此來自本發明構建體的結構基因的3′非翻譯區可用作構建在植物中表達的嵌合基因。
如果需要，本發明的嵌合基因構建體還可進一步包括增強子，即翻譯或轉錄增強子。這些增強子區是本領域技術人員熟知的，並可包括ATG起始密碼子和相鄰序列。起始密碼子可以與編碼序列同一讀框以保證完整序列的翻譯。翻譯控制信號和起始密碼子可以來自包括天然和合成的各種來源。翻譯起始區可從轉錄起始區的來源提供，或者從結構基因提供。該序列還可衍生自選擇用於表達基因的調控元件，並可以特異修飾以增加mRNA的翻譯。
為了有助於鑑別轉化的植物細胞，可進一步操作本發明的構建體以包括植物選擇標記。有用的選擇標記包括提供對抗生素如慶大黴素、潮黴素、卡那黴素等的抗性的酶。類似地，可產生由顏色變化如GUS(β-葡糖醛酸酶)、螢光或發光鑑別的化合物的酶如螢光素酶也是有用的。
本發明還包括含有本發明的基因或嵌合基因構建體的轉基因植物，其包含BNM3基因，得自BNM3的調控元件，或與組成型、發育調控或誘導型調控元件可操縱相關的來自BNM3的編碼區，或其組合。從植物細胞再生完整植物的方法是本領域已知的。通常，轉化的植物細胞在合適的培養基中培養，當使用選擇標記來促進轉化的植物細胞的鑑別時，該培養基可含有選擇劑如抗生素。當形成愈傷組織後，可根據已知方法採用合適植物激素促進枝形成，並將枝轉移至生根培養基進行植物再生。隨後可使用該植物從種子或用營養繁殖技術建立重複代。本發明的構建體可用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電穿孔、biolistics等導入植物細胞，這些技術綜述例如參見Weissbach and Weissbach，《植物分子生物學方法》，紐約學術出版社，VIII，pp421-463(1988)；Geiersonand Corey，《植物分子生物學》，第2版(1988)；Miki and Iyer，植物基因轉移基礎知識，見《植物代謝》，第2版，DT.Dennis，DH Turpin，DD Lefebrve，DB Layzell編輯，Addison Wesly，Langmans Ltd.，倫敦，561-579頁(1997)。本發明還包括包含基因或嵌合基因構建體的合適載體。
從歐洲油菜小孢子胚培養中已分離了一類基因，這些基因被發現是胚胎發生的重要調節物，因為當它們在植物營養組織中異位表達時能誘導形成無性衍生胚的形成。以下這些基因被稱為BNM3基因(代表歐洲油菜小孢子胚，Brassica napus microspore embryo)，SEQID NO1示出BNM3A的cDNA，SEQ ID NO3示出BNM3B的cDNA，BNM3A基因組序列在SEQ ID NO5中給出。BNM3A的調控區位於SEQ ID NO5的核苷酸1-1619。SEQ ID NO1和3的DNA編碼的預測的蛋白質序列分別如SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示。
在擬南芥屬中已鑑別了BNM3基因的直向同源物，以下稱為AtBBM。SEQ ID NO6示出了AtBBM的基因組序列。AtBBM的調控區位於SEQ ID NO6的1-2025位核苷酸。預測的胺基酸序列見SEQIDNO7。
BNM3翻譯產物含有兩個拷貝的AP2結構域，它們由接頭區分開(圖3，SEQ ID NO2以及SEQ ID NO4的胺基酸208-378，SEQ IDNO5的核苷酸2694-4252，SEQ ID NO6的核苷酸2938-4416)，其在以下稱為「AP2結構域」或「AP2結構域重複1-接頭-AP2結構域重複2」。據認為AP2結構域介導蛋白質-蛋白質相互作用。許多含有AP2結構域的蛋白質結合DNA的能力與潛在的核定位信號及可作為轉錄激活物的酸性區的存在偶聯，提示這些蛋白質是轉錄因子。BNM3的AP2結構域重複1-接頭-AP2結構域重複2顯示與AtBBM的AP2結構域有約99％的同源性(BNM3和AtBBM之間有95％核苷酸相似性)，與其它含AP2蛋白質有高程度相似性，例如與ANT大約85％相似性(76％核苷酸相似性)，與MOE17(染色體3)有約85％相似性(78％核苷酸相似性，如果對比中包括內含子，例如來自SEQ ID NO5的AP2區，則在第2個AP2結構域內的285bp區域MOE17顯示約63％核苷酸相似性)，ZMMHCF1有約88％相似性，與GLOSSY15有66％相似性。但是在兩個AP2結構域之外，BNM3序列和這些其它含AP2蛋白質的相似性顯著降低。
「BNM3」或「BNM3基因」是指SEQ ID NO1，3，5或6所公開的寡核苷酸序列，或其片段、衍生物或突變體，或者顯示至少如下同源性或相似性的寡核苷酸序列i)與不包括AP2結構域重複1-接頭-AP2結構域重複2區域的SEQ ID NO1，3，5或6公開的序列的片段或衍生物至少有70％同源性或相似性，該AP2結構域重複1-接頭-AP2結構域重複2區域由SEQ ID NO1的核苷酸741-1257，SEQ ID NO3的核苷酸672-11 88，SEQ ID NO5的核苷酸2694-4252或SEQID NO6的核苷酸2938-4416編碼區內的相應序列限定(由SEQID NO5的核苷酸2694-4252或SEQ ID NO6的核苷酸2938-4416限定區域由7個內含子打斷，見圖9)；或者ii)與包括AP2結構域重複1-接頭-AP2結構域重複2的SEQIDNO1，3，5或6公開的全長序列有至少70％同源性或相似性。
這種同源性的確定可用寡核苷酸序列對比算法計算，該算法例如但不限於BLAST(GenBank URLwww.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/，使用預設參數程序blastn；資料庫nr；Expect10；filter預設；對比成對；查詢遺傳密碼標準(1))，或FASTA，同樣使用預設參數。使用序列相似性搜索，AtBBM顯示與全長BNM3有約85％同源性，因此AtBBM是一種BNM3基因。另外，BNM3基因也可根據其與本發明公開的序列雜交的能力確定。因此，「BNM3」或「BNM3基因」也包括iii) 長度超過約15個核苷酸，優選20-25個核苷酸的寡核苷酸，其在高嚴格條件下，例如但不限於在65℃、5×SSC用凝膠印跡雜交(Southern雜交)，隨後在0.1×SSC、65℃清洗條件，與不包括編碼上述定義的AP2結構域(AP2結構域重複1-接頭-AP2結構域重複2)的區域的任何SEQ ID NO1，3，5或6或者SEQ ID NO1，3，5或6的序列的片段或衍生物結合；或iv) 基本上全長的核苷酸序列，或長度超過約1000個核苷酸的核苷酸序列，其在中等或高嚴格條件下，例如但不限於分別在25℃、0.2×SSC，0.1％SDS或在65℃、5×SSC用凝膠印跡雜交(Southern雜交)，隨後在0.2×SSC、0.1％SDS、65℃清洗條件，與不包括編碼上述定義的AP2結構域(AP2結構域重複1-接頭-AP2結構域重複2)的區域的SEQ ID NO1或3或者SEQ ID NO1或3的序列的長度超過約1000個核苷酸的片段或衍生物結合。
在中等嚴格條件下，全長BNM3 cDNA僅與AtBBM的片段雜交(見圖9B)，因此，AtBBM是一種BNM3基因。AtBBM基因組克隆的序列分析表明IRREGULAR XYLEM3(IXR3)基因的5，末端位於潛在的ArBBM編碼區的下遊(位置7479，圖9A)。IXR3以前已示出定位於染色體5的標記物nga 106(33.26cM)和mi438(33.34cM)之間的150kb區(Taylor等，1999)。這一數據表明Brassica BNM3基因的擬南芥屬直向同源物由一定位於染色體5的單基因編碼。與AtBBM高度相似的序列TAMU BAC克隆T10B6(登錄號AP002073；Nakamura，2000年5月18日)也已被定位於染色體5。
「BNM3基因」也包括這樣DNA分子，其包含SEQ ID NO1，3，5或6的至少27個連續核苷酸，或位於SEQ ID NO5的核苷酸1-1619或SEQ ID NO6的核苷酸1-2025的調控區內的至少22個連續核苷酸。所定義的BNM3的片段可用作探針以鑑別一生物體內與BNM3調控或編碼區相關的核苷酸，或者用作引物以擴增這些核苷酸序列。另外，包含SEQ ID NO1，3，5或6的序列的至少27個連續核苷酸、優選超過30個至35個核苷酸，並且編碼如下的蛋白質或其活性片段的分子也被認為是BNM3基因，所述蛋白質當以足夠水平存在於植物細胞時使細胞胚胎發生，或增加植物細胞的再生能力，或同時使細胞胚胎發生並增加植物細胞的再生能力。優選地，BNM3基因包含SEQ ID NO1或3的約50-1981位核苷酸，SEQ ID NO5的編碼區(1620-4858)的約50-3538位核苷酸，或SEQ ID NO6的編碼區(2025-5035)的約50-3009位核苷酸。
得自歐洲油菜和擬南芥屬的基因組BNM3序列的特徵在於包括8個內含子，這些內含子在SEQ ID NO5的核苷酸1846-2298、2720-2952、3036-3160、3170-3314、3404-3553、3628-3797、3849-3961和4039-4148，以及SEQ ID NO6的核苷酸2249-2578、2994-3220、3304-3420、3429-3521、3611-3770、3845-3969、4020-4151和4229-4310。SEQ ID NO5和6的起始密碼子分別位於核苷酸1620和2026，而終止密碼子分別在位置4856和5035發現。
「BNM3調控區」是指顯示調控BNM3基因的表達(正向調控，例如增強子或啟動子區，或負向調控，例如沉默子區)並與BNM3基因可操縱連接的寡核苷酸序列。典型地，BNM3調控區包括BNM3基因起始位點上遊的核苷酸，但是位於基因的其它區域內的序列也可顯示調控性質並被認為是BNM3調控區，例如但不限於位於內含子中的序列。BNM3調控區的非限制性例子包括·與BNM3基因可操縱連接的顯示調控功能的序列，例如但不限於位於BNM3基因起始位點上遊或位於內含子中的調控區，或其片段、衍生物或突變體；·SEQ ID NO5的約核苷酸1-1619，或其片段或衍生物；·SEQ ID NO6的約核苷酸1-2025，或其片段或衍生物；·在高嚴格條件下，例如但不限於在約65℃、5×SSC與凝膠印跡雜交，隨後在0.1×SSC、65℃清洗條件，與SEQ ID NO5的約1000-1619位或SEQ ID NO6的約1500-2025位核苷酸序列或其片段或衍生物結合的核苷酸序列；·在中等或高嚴格條件下，例如但不限於分別在約25℃、0.2×SSC、0.1％SDS或65℃、5×SSC與凝膠印跡雜交，隨後在0.1×SSC、65℃清洗條件，與SEQ ID NO5的約1-1000位或SEQ ID NO6的約1-1500位核苷酸序列或其片段或衍生物結合的核苷酸序列；·如用寡核苷酸序列對比(例如但不限於BLAST或FASTA搜索，使用預設參數，見上述)確定的顯示與SEQ ID NO5的約1000-1619或SEQ ID NO6的約1500-2025位核苷酸序列或其至少約22個核苷酸的片段有至少70％相似性的核苷酸序列。
「BNM3蛋白」是指一種使植物細胞胚胎發生、或增加植物細胞的再生能力或同時使細胞胚胎發生並增加植物細胞再生能力，並且由如上所述BNM3基因編碼的蛋白質或其生物活性片段。優選地，BNM3蛋白包括SEQ ID NO2的序列的約30-579位胺基酸，或SEQID NO4的序列的約30-579位胺基酸，或SEQ ID NO7的約30-581位胺基酸。但是，BNM3蛋白也可定義為是一種與不包括AP2重複1-接頭-AP2重複2區(SEQ ID NO2和3的胺基酸208-378，SEQID NO7的胺基酸205-375)的SEQ ID NO2，4或7有至少70％同源性的蛋白質。
序列資料庫的搜索表明BNM3翻譯產物含有兩個拷貝的AP2結構域(圖3；BNM3A見SEQ ID NO2，BNM3B見SEQ ID NO4，AtBBM見SEQ ID NO7)。AP2結構域首先在APETALA2中鑑別，但是隨後在許多種不同功能的蛋白質中被鑑別，APETALA2是調節分生組織同一性、花器官特異性、種皮發育和花同源異型基因表達的擬南芥屬蛋白(Jofuku等，1994)。
AP2結構域通常長度為58-68個胺基酸並含有18個胺基酸的保守中心核心，其特徵是能夠形成兩親性α螺旋，該結構被認為介導蛋白質-蛋白質相互作用。許多含有AP2結構域的蛋白質結合DNA的能力與存在潛在核定位信號和可作為轉錄激活物的酸性區相伴，提示這些蛋白質作為轉錄因子起作用。
已鑑別了兩類系統發育不同的AP2結構域蛋白，即具有單個AP2結構域的蛋白質(類似EREBP)，和具有兩個AP2結構域的蛋白質(類似AP2，(Zhou，1997))。由本發明的基因編碼的蛋白質代表後一類蛋白質的獨特成員。
因此，本發明的一個方面提供了分離的DNA分子，其包括一編碼含有兩個AP2結構域的蛋白質的序列。當所述蛋白質以足夠水平存在於植物細胞時，使植物細胞胚胎發生、或增加植物細胞的再生能力或同時使細胞胚胎發生並增加植物細胞再生能力。
用Northem(圖6)分析在小孢子衍生胚發育、種子發育或非種子組織發育過程中的BNM3表達表明BNM3基因在胚胎發生小孢子培養物、小孢子衍生胚和種子中優先表達。BNM3轉錄物在所測試的任何非種子組織中未檢測到。
BNM3 mRNA在誘導經歷胚胎發生的小孢子培養物以及隨後的小孢子衍生胚發育的球形期、心期、魚雷期和子葉期中檢測到(例如圖6A)。RNA還在傳粉後14天(14 DAP)的相應於胚發育心期的發育種子中檢測到。在胚發育早期(21 DAP)和子葉中期(28 DAP)BNM3表達增加，隨後保持恆定(圖6B)。
BNM3的組成型表達導致在植物的營養結構如子葉、葉柄、葉緣和苗端分生組織上形成體細胞胚(圖7)。在這些實驗中，將BNM3eDNA置於兩個不同的組成型啟動子構建體控制下，一個是修飾的向日葵POLYUBIQUITIN啟動子構建體，一個是含有AMV翻譯增強子的雙倍增強的35S啟動子構建體，但是應理解的是任何合適的組成型啟動子可用於此目的。這種BNM3衍生的異位胚含有在發育的合子胚中發現的所有器官系統和組織層，即這些胚是雙極性的(圖7E)，由軸、下胚軸和胚根區、條根分生組織和子葉組成。另外，每個器官系統含有在合子胚中發現的三個特異組織層(表皮、基本薄壁組織和維管束原組織)的特徵性放射排列。BNM3基因在發育的異位胚中的持續表達導致胚形成過程的重複，從而在預先存在的胚的表面持續形成新胚(圖7E)。
BNM3的組成型表達導致植物在存在添加的生長調節劑時體外再生枝的能力增加。來自異位表達BNM3的轉基因植物的根外植體與得自野生型植物的根外植體相比在存在激素時枝再生增加至少5倍(圖8A，B)。與野生型相比轉基因外植體中枝也發育的更快。野生型葉和下胚軸外植體的起始應答是在葉柄切口末端產生愈傷組織(圖8B)，隨後沿葉柄長度形成愈傷組織。相反，來自轉基因品系的外植體立即從葉柄的切口末端產生新枝(圖8B)或根。起始產生根的外植體最終也產生枝。
組成型表達BNM3的轉基因外植體也能在不存在添加的生長調節劑時再生。這些外植體當置於不含生長調節劑的培養基上時，從葉和下胚軸外植體的切口末端或從根外植體的瘤狀結構再生枝(圖8C，D)。在所有情況下，再生枝發育、生根、開花並結種。相反，置於不含生長調節劑的培養基上的野生型葉和下胚軸外植體偶爾在葉柄的切口末端產生愈傷組織或根，但是從這些結構不形成枝(圖8C，D)。
本發明範圍還包括BNM3的表達可被用於在轉化的植物或植物細胞中起始發育級聯。這一級聯可以是表達BNM3的DNA載體在轉化的植物中的穩定整合的結果，但是這種級聯也可以是BNM3的瞬時表達的結果，並且不需要BNM3載體穩定整合入植物細胞。這些瞬時途徑可用於誘導體細胞胚胎發生，配子體衍生胚胎發生或增加植物或植物細胞的再生能力。
BNM3基因異位表達的植物展示出如下的有利品質
·形成無性衍生胚；·組織外植體再生能力增加；·組織外植體在不存在添加的植物生長調節劑時能再生；和·種子成分在異位表達BNM3的非種子器官中表達。
另外，異位表達至少一種BNM3基因的植物可用於利用種子特異性調控元件生產重組蛋白。
為了如下所述利用BNM3，有利的是獲得高水平BNM3轉錄物和/或BNM3蛋白以獲得表型高度外顯的植物。這可以通過用遺傳元件如內含子、轉錄增強子或翻譯增強子而獲得，其已知增強基因或蛋白質表達水平。
本發明的BNM3序列可有各種用途，包括但不限於胚過程控制，再生過程控制，調控序列用於定向基因表達的用途，BNM3序列用作轉化植物或胚胎發生細胞的選擇標記的用途。這些用途在以下更詳細地描述。BNM3序列控制胚胎發生過程的用途如本文所述，BNM3基因在胚發育的起始和保持中起重要作用。BNM3基因以在植物界許多不同成員中發現。從這些基因獲得的調控區可用於利用本領域已知方法控制BNM3或其衍生物或片段或者任何感興趣基因的轉錄。
BNM3基因的異位表達足以誘導在植物營養組織上回反(recurrent)形成無性衍生胚(見實施例4)。根據所用啟動子，BNM3基因的異位過表達可用於產生體細胞或配子體胚。體細胞或配子體胚可通過在組成型調控元件控制下表達BNM3基因而獲得，如實施例5所示；或者還可通過在組織特異性或發育調控的元件、來自植物或非植物基因的誘導型元件控制下或通過瞬時表達而表達BNM3基因來獲得。在這一方面，還可採用化學誘導系統(例如見Gatz andLenk，1998，引入本文作參考)，或使用不產生BNM3基因的穩定整合的方法的瞬時表達，或直接使用BNM3蛋白如DNA或蛋白質微粒轟擊。
當回反胚胎發生不是一希望性狀時，優選的是用誘導型、組織特異性或發育調控的元件進行的BNM3表達的時間和/或空間限制。用於將BNM3限制於一特殊發育階段或細胞類型的調控元件根據應用而選擇。例如，可用於表達BNM3而產生小孢子衍生胚的調控元件包括但不限於下述基因的調控元件，這些基因為I類低分子量熱休克誘導型基因GMHSP17.3B(Zarsky等，1995，該文獻引入本文作參考)，或小孢子/花粉表達的基因如NTM19(Custers等，1997，EP790,311，該文獻引入本文作參考)，BCP1(Xu等，1995，該文獻引入本文作參考)，LAT52(Twell等，1989，該文獻引入本文作參考)，BNM1(Treacy等，1997，該文獻引入本文作參考)和APG(Roberts等，1993，該文獻引入本文作參考)。
可用於表達BNM3以產生體細胞胚的調控元件的例子包括但不限於由通常用於誘導組織培養物體細胞胚胎發生的植物生長調節劑激活的基因的調控元件。非限制性具體例子包括細胞激動素誘導的IB6和CKI1基因(Brandstatter and Kieber，1998；Kakimoto，1996，該文獻引入本文作參考)和植物生長素誘導的元件DR5(Ulmasov等，1997，該文獻引入本文作參考)。但是應理解的是其它調控元件可用於在植物中表達BNM3。
另外，適合指導BNM3的表達而獲得不定胚生殖的基因調控元件的例子包括但不限於得自如下基因的調控元件，如胚珠和胚表達的SERK基因(Schmidt等，1997，該文獻引入本文作參考)，胚珠表達的AGL11基因(Roundsley等，1995，該文獻引入本文作參考)，珠心表達的NUC1基因(Doan等，1996；WO98/08961，該文獻引入本文作參考)，或內珠被表達的基因FBP7(Angenent等，1995，該文獻引入本文作參考)和SC4(US申請09/059,909，1998年4月13日申請，該申請引入本文作參考)基因。
根據本發明的一個方面，提供了一種在植物中有效產生小孢子衍生胚的方法，該方法包括i)用由在合適的調控元件控制下的BNM3基因及任選地用於選擇轉化子的標記基因組成的載體構建體或分離的DNA轉化感興趣的植物如歐洲油菜(用本領域公知的轉化技術，例如DeBlock等，1989，Clough and Bent 1998，Vergunst等，1998，Klein等，1987，該文獻引入本文作參考)，所示合適的調控元件可以是組成型、組織特異性、發育調控的或誘導型的；ii)選擇轉化的植物；iii) 產生異位表達BNM3基因或BNM3蛋白的品系；iv)從轉基因品系中分離小孢子和花粉，並培養小孢子和花粉以誘導胚胎發生。
胚胎發生可用任何合適的方案誘導，例如但不限於在28℃-35℃、優選32℃培養小孢子和花粉約4天，然後將胚胎發生細胞或胚轉移至約25℃。使用上述方法，異位過表達BNM3的歐洲油菜栽培品種比從不異位表達BNM3的野生型植物製備小孢子或花粉時觀察到的胚胎發生細胞或胚的百分率增加。
用於表達BNM3產生小孢子衍生胚的調控元件的例子包括但不限於下述基因的調控元件，所述基因如I類低分子量熱休克誘導型基因GMHSP17.3B(Zarsky等，1995，該文獻引入本文作參考)，或小孢子/花粉表達的基因如NTM19(Custers等，1997，EP790,311，該文獻引入本文作參考)，BCP1(Xu等，1995，該文獻引入本文作參考)，LAT52(Twell等，1989，該文獻引入本文作參考)，BNM1(Treacy等，1997，該文獻引入本文作參考)和APG(Roberts等，1993，該文獻引入本文作參考)。誘導型調控元件也是有用的，例如但不限於四環素誘導型啟動子(Gatz 1997，該文獻引入本文作參考)，類固醇誘導型啟動子(Aoyama and Chua 1997，該文獻引入本文作參考)和乙醇誘導型啟動子(Slater等1998，Caddick等1998，該文獻引入本文作參考)。
以類似的方式，通過將BNM3蛋白引入植物(例如通過biolistics；Klein等1987)並選擇顯示增加的小孢子胚胎發生的植物，也可在植物中產生小孢子衍生胚。
本發明還提供了有效體外產生體細胞胚的方法，該方法涉及i)用含有在合適的調控元件控制下的BNM3基因的載體構建體採用本領域已知的轉化技術(例如但不限於DeBlock等，1989，Clough and Bent 1998，Vergunst等，1998，該文獻引入本文作參考)轉化植物如擬南芥屬，或者可用本領域已知方法(例如biolistics；Klein等1987)用含有在合適的調控元件控制下的BNM3基因的載體構建體瞬時轉化植物細胞，以及任選地，將用於選擇轉化子的標記基因轉化至幾種擬南芥屬中；ii)選擇轉化的植物，和iii) 在含有或不含合適生長調節劑例如但不限於2，4-D(例如Mordhorst等，1998)的培養基中，體外培養來自所選擇的轉化的植物的所需外植體，例如但不限於根、葉或幼苗，以產生直接胚胎發生或胚胎發生愈傷組織；和iv)將胚、或非胚胎發生愈傷組織或者胚和非胚胎發生愈傷組織轉移至合適培養基以產生胚、或小植物或胚和小植物。
例如，當將上述方法的結果與用許多擬南芥屬生態型體外產生的體細胞胚比較時，從異位過表達BNM3的轉基因品系中起始的定向胚胎發生或胚胎發生愈傷組織的頻率比野生型對照中高。
可用於表達BNM3以產生體細胞胚的調控元件的例子包括但不限於由通常用於誘導組織培養物體細胞胚胎發生的植物生長調節劑激活的基因的調控元件。非限制性具體例子包括細胞激動素誘導的IB6和CKI1基因(Brandstatter and Kieber，1998；Kakimoto，1 996，該文獻引入本文作參考)，和植物生長素誘導的元件DR5(Ulmasov等，1997，該文獻引入本文作參考)。誘導型調控元件也是有用的，例如但不限於四環素誘導型啟動子(Gatz 1997，該文獻引入本文作參考)，類固醇誘導型啟動子(Aoyama and Chua 1997，該文獻引入本文作參考)，和乙醇誘導型啟動子(Slater等1998，Caddick等1998，該文獻引入本文作參考)。
胚發育的異位起始是無融合生殖的關鍵步驟之一。如實施例4所示，BNM3基因的異位表達足以在非胚形成組織中起始胚形成。因此BNM3基因可通過在發育胚珠的孢子體或配子體組織中表達而用於起始還原或非還原胚囊細胞的不定胚生殖或孤雌生殖。
通過在孢子體胚珠組織如珠心、內珠被或位於發育的胚囊相鄰或鄰近的其它組織中表達BNM3而實現不定胚生殖，該方法包括i)用本領域已知方法用一載體構建體轉化所需植物(見如上方法)，該載體構建體由在合適調控元件控制下的BNM3基因和任選地用於選擇轉化子的標記基因組成，該調控元件可以是組成型、誘導型或發育調控的；ii)選擇轉化的植物；iii)將轉化的植物去雄；iv)用攜帶一或多個顯性選擇標記例如GUS或卡那黴素抗性的花粉對轉化的植物傳粉；和v)分析克隆子代的產生。
當將上述方法的結果與用攜帶顯性選擇標記的花粉對野生型擬南芥屬植物的傳粉作用相比時，得自這一雜交的所有F1胚均遺傳了顯性標記，而衍生自異位過表達BNM3基因或蛋白的植物胚是通過有性胚形成而克隆衍生，並且未遺傳顯性選擇標記。
適合指導BNM3的表達以獲得胚囊成分的不定胚生殖、倍數孢子形成或單倍體孤雌生殖的基因調控元件的具體例子包括胚珠表達的SERK基因(Schmidt等，1997，該文獻引入本文作參考)，減數分裂表達的AtDMC1基因(Klimyuk and Jones，1997；WO98/28431，該文獻引入本文作參考)，胚珠表達的AGL11基因(Roundsley等，1995，該文獻引入本文作參考)，珠心表達的NUC1基因(Doan等，1996；WO98/08961，該文獻引入本文作參考)，和內珠被表達的基因FBP7(Angenent等，1995，該文獻引入本文作參考)和SC4(美國申請09/059,909，1998年4月13日申請，引入本文作參考)基因。另外，誘導型系統也是有用的，例如但不限於四環素誘導型啟動子(Gatz 1997，該文獻引入本文作參考)，類固醇誘導型啟動子(Aoyamaand Chua 1997，該文獻引入本文作參考)，和乙醇誘導型啟動子(Slater等1998，Caddick等1998，該文獻引入本文作參考)。胚囊相比的孤雌生殖需要在雌性配子體或其前體的一或多個細胞中有活性的調控元件。當種子發育依賴於胚乳的存在時，減數分裂衍生的極性核是希望的。BNM3序列控制再生過程的應用異位過表達BNM3基因的植物顯示出在不存在生長調節劑時具有增加的再生能力和再生完整植物的能力(見實施例5)。BNM3基因表達因此可體內或體外用於增強或誘導植物組織再生能力。用於表達BNM3的調控元件部分取決於用於再生的靶組織。為獲得植物組織的再生，可通過表達在組成型調控元件例如但不限於35S控制下的BNM3基因，或者可通過表達在組織特異性或發育調控的元件、來自植物或非植物基因的誘導型元件(例如Gatz and Lenk，1998，引入本文作參考)控制下的BNM3基因，或者通過不產生BNM3基因的穩定整合或直接利用BNM3蛋白的瞬時表達方法(例如DNA或蛋白質的微粒轟擊)而實現。可以使用化學誘導系統(見GatzandLenk，1998)或應答用於誘導再生的植物生長調節劑如細胞激動素(Brandstatter and Kieber，1998；Kakimoto，1996)或植物生長素(Ulmasov等，1997)的基因或在組織外植體的傷口部位表達的基因(Xu等，1993)的調控元件。
另外的應用是BNM3基因用作回收轉基因植物的選擇標記。這種應用的一個非限制性例子為將幼苗例如擬南芥屬生態型C24幼苗的根與含有以下兩個雙向構建體的單個根瘤農桿菌菌株共栽培(參照Vergunst等，1998；只是所有步驟均在不存在添加的生長調節劑的情況下進行)·第一個雙向載體攜帶報導基因融合體，例如但不限於35SGUS；·第二個雙向載體含有在合適調控元件控制下的BNM3基因。
BNM3基因表達在上述構建體整合進擬南芥屬基因組中時被激活，基於在野生型外植體不能再生的條件(例如但不限於缺乏生長調節劑)下再生的能力而選擇轉基因植物。在許多情況中，攜帶BNM3基因的T-DNA和攜帶感興趣基因的T-DNA將整合在不連鎖的基因座中。因此，含有導入的BNM3序列的T-DNA及其相關的再生能力增加表型將通過簡單的分離而進入後代植物(Daley等，1998)。但是，如本領域技術人員了解的，其它方法如不產生BNM3基因穩定整合或直接利用BNM3蛋白的瞬時表達方法也可採用。BNM3序列定向基因表達至胚中的應用由於BNM3基因在發育胚中優先表達(見實施例3)，所以本發明的另一應用是利用BNM3調控區將至少一種異源感興趣基因的表達定向為在發育胚中，以用於任何目的，例如但不限於改變胚和種子性狀如種子存活性或大小，種子組分的組成，抗病性或產生高價值產品如疫苗抗體、生物藥物或其它特殊化學品。BNM3表達用作胚胎發生細胞的標記的應用如實施例3和4所示，BNM3基因表達在植物胚胎發生的最早期被檢測到，並且其本身即足以激活轉導級聯，導致胚發育。因此BNM3基因表達是植物細胞進入胚胎發生途徑對於特異標記。
BNM3表達與體外和體內胚形成細胞分裂相關，因此可用於確定體外改變組織的胚形成能力的培養條件。在不存在形態學上類似胚的結構時，具有胚胎發生能力的細胞或僅經歷有限次數胚形成分裂的細胞很難被鑑別。但是，這些細胞可基於BNM3表達而被鑑別。在這種應用中，用含有與報導基因例如但不限於GUS(Jefferson等，1987)，Luciferase(Ow等，1987)或GFP(Haselhoffand Amos，1995)融合的BNM3調控區的載體轉化感興趣的植物，在體外條件培養在胚中具有高水平報導基因表達的純合轉基因品系，基於報導基因在培養的組織中的表達鑑別胚胎發生細胞和促進或增強胚胎發生細胞形成的培養條件。
相關的應用是BNM3基因作為無融合生殖物種的標記，以鑑別正在形成無性衍生胚的個體細胞。在這一應用中，使用衍生自BNM3基因序列的RNA探針經mRNA原位雜交，使用抗BNM3蛋白的抗體經免疫細胞化學，經用含有BNM3調控區和報導基因的融合基因的DNA構建體轉化植物，或經本領域技術人員已知的任何類似技術鑑別進入自發胚途徑的細胞。信號轉導成分的鑑別激活BNM3基因表達或被BNM3基因表達激活的信號轉導成分可通過鑑別與BNM3基因及其蛋白產物相互作用的蛋白質和DNA序列而闡明。這些信號轉導成分可用本領域技術人員已知技術鑑別，這些技術包括但不限於·誘變以鑑別BNM3增加功能(gain-of-function)表型的基因內和/或基因外抑制因子或增強子；·酵母單雜交體篩選(yeast one hybrid screens)以分離與BNM3調控區結合影響BNM3基因表達的蛋白質；·在酵母中遺傳選擇以鑑別是BNM3結合的直接靶的基因；·DNA陣列或蛋白質組以鑑別在BNM3信號轉導級聯中激活的基因；和·酵母雙雜交體篩選(yeast two hybrid screens)以鑑別與BNM3相互作用影響下遊靶基因的表達的蛋白質。
分析信號轉導成分和信號傳導成分的技術是熟知的(參見例如Meijer等(1998)，Lipshutz等(1999)，和Anderson and Anderson(1998))。
過表達在強組成型調控元件如，例如但不限於花椰菜花葉病毒35S啟動子的控制下的BNM3基因的植物顯示異位胚形成，經器官發生的增加的再生或其組合(實施例4和5)。。BNM3異位過表達誘導胚形成和增加再生過程的能力可用於鑑別胚形成或再生能力改變的突變體。在這一應用中，製備由在足以啟動異位胚形成或增加的再生表型的調控元件控制下的BNM3蛋白編碼區組成的載體構建體，並導入感興趣的植物中，鑑別具有高外顯性的異位胚形成、增加的再生表型或其組合的純合轉基因品系。這些品系通過本領域技術人員熟知的任何技術誘變，這些技術可包括EMS誘變，快中子誘變，轉座子誘變或T-DNA誘變。隨後篩選誘變的植物的異位胚形成或再生表型的改變。這些改變包括例如但不限於在不存在添加的生長調節劑時促進異位無性胚形成或再生能力的消除或增強。異源蛋白質表達系統導致在轉基因植物非種子器官中胚胎發生和器官發生的信號轉導途徑的遺傳控制可通過異位表達BNM3基因而激活。與異源啟動子結合的BNM3基因的表達可用於產生改變的種子成分包括例如蛋白質、油和其它代謝物。所需器官的生物轉化作用也可包括改變例如飼料作物葉的營養價值，或者其可用於產生作物的替代用途。應用被BNM3表達起始的信號轉導級聯誘導的啟動子可在非種子器官中表達高價值重組蛋白。這種啟動子的一個例子是napin啟動子，其得自2S種子貯藏蛋白napin。從BNM3誘導的級聯起始的蛋白質的產生可在顯示比種子高的生物量的器官中實現。因此，這一技術可用於產生替代植物作為作物。
因此，本發明進一步涉及一種二元(binary)系統，其中BNM3蛋白與胚表達調控序列(靶序列)直接或間接結合，並激活嵌合基因構建體在任何植物細胞、組織或器官中的轉錄。因此，BNM3可用於直接或間接激活嵌合基因構建體的轉錄。這一途徑涉及BNM3直接與來自胚表達基因的至少一種靶序列相互作用，或通過起始胚胎發生信號級聯間接相互作用，該信號級聯激活轉錄因子，使之與至少一種靶序列結合併激活其轉錄。這一二元系統可用於在體細胞中表達具有在種子中表達的性質的蛋白質。
在這一應用中，產生含有在組成型調控元件例如但不限於35S啟動子控制下的BNM3基因(35SBNM3)的轉基因植物，以產生BNM3激活品系。BNM3表達可通過RNA凝膠印跡分析在BNM3激活品系各種組織中證實。鑑別了具有高水平BNM3表達的穩定純合激活品系。可檢查過表達BNM3的體細胞組織對其它胚表達基因，如arabin(Guerche等，1990)，cruciferin(Pang等，1988)或oleosin的表達，或檢查正常情況下為種子的特徵的形態學性質，如脂或蛋白質體的存在。
也產生了與用於產生上述BNM3激活品系相同物種的轉基因植物，其含有與感興趣基因融合的胚表達啟動子，以產生感興趣品系的基因。為有助於描述這一實施方案，感興趣品系的基因表達報導基因如GUS，這種品系的非限制性例子包括歐洲油菜2S albumin種子貯藏蛋白基因BngNAP1GUS融合體(Baszczynski等，1994)或SERKGUS融合體(Schmidt等，1997；非種子表達的報導基因構建體如BNM1GUS(Treacy等，1997)可用作陰性對照)。證實每一構建體對感興趣基因在感興趣品系的這些基因的特異器官和組織中的表達的可靠性。創建具有高水平感興趣基因表達的穩定純合品系。
含有BNM3激活品系的轉基因品系和感興趣基因品系雜交並收集後代種子。檢查BNM3基因表達，和本例中的GUS活性，其它胚表達基因的表達以及轉化的組織的形態學特徵。在非種子組織中BNM3表達通常激活胚發育和感興趣基因(例如GUS)的表達，但是在不存在形態學可辨別的胚時感興趣基因的表達的激活也可觀察到。在不存在形態學可辨別的胚時感興趣基因的表達提供了BNM3與靶序列的直接相互作用的原始證據。
BNM3與靶序列的直接相互作用也可用BNM3在植物原生質體中的瞬時表達以及與感興趣基因融合的胚表達啟動子(即感興趣基因構建體)的瞬時共表達而證實。通過電穿孔將35SBNM3 DNA和感興趣基因構建體導入衍生自非種子細胞如葉肉細胞的原生質體中，幾個小時後檢查感興趣基因的表達以證實靶序列的激活。BNM3與靶序列的直接相互作用可進一步通過單獨共導入靶序列作為競爭DNA而證實。
為了確定來自不同植物物種的組織是否可以由BNM3反式激活，可以將35SBNM3 DNA和報導基因(例如但不限於GUS)構建體經微粒轟擊導入植物體細胞組織。如果BNM3與靶序列直接相互作用，則報導基因的表達應與BNM3在所有物種和組織中的瞬時表達平行。
BNM3-靶序列相互作用的直接證據也可通過分離在細菌、昆蟲或酵母中表達的BNM3蛋白而獲得。用市售表達系統使BNM3在細菌、昆蟲或酵母中表達，並分離純化。用BNM3-靶序列如胚表達靶序列進行凝膠遷移率變動分析(Gustavson等，1991)，以證實BNM3與BNM3-靶序列直接結合。也可進行足跡分析以定位BNM3結合區。與BNM3結合的靶序列的片段隨後可被亞克隆並用作上述瞬時分析中BNM3結合的競爭劑。
下述描述舉例示出本發明的優選實施方案，其不是限制實施本發明所需的特徵的組合。
本發明將在下述實施例中進一步描述，但是應理解的是這些實施例僅是舉例目的，而不應用作以任何方式限制本發明範圍。
離心收集培養10天以下的小孢子和花粉樣品。含有球形期、心期、魚雷期和子葉期小孢子衍生胚的較長時間樣品通過各種孔徑的尼龍篩過濾收集，如Ouellet等(1992)所述。所有其它植物組織從溫室培養材料中收集。種子材料通過在開花1天後手工傳粉並在不同傳粉後天數(DAP)收集發育的種子而獲得。核酸分離和分析用氯化銫/異硫氰酸胍程序(Ouellet，1992)或TRIZOL試劑(Gibco-BRL)分離總RNA。基本上如Sambrook等(1989)所述通過含有0.62M甲醛的1.5％瓊脂糖凝膠每泳道分離5-20微克總RNA，隨後毛細管轉移至Hybond-N尼龍膜(Amersham)上而進行RNA凝膠印跡分析。聚(A)+RNA通過寡(dT)-纖維素層析(Sambrook，1989)從總RNA中分離出。
如Fobert等(1991)從葉組織中分離基因組DNA並用標準程序(Sambrook，1989)經特定的限制酶消化。提供將10微克DNA在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳隨後毛細管轉移至Hybond-N膜上進行DNA凝膠印跡分析。
部分1.2kb BNM3A cDNA插入片段用作DNA和RNA凝膠印跡的探針。根據Hybond-N方案在65℃進行與凝膠印跡的雜交。最終清洗條件是0.1×SSC，65℃。扣除探針構建和cDNA文庫篩選從在32℃培養4天以誘導胚胎發生的晚期單核小孢子和早期雙核花粉(胚胎發生樣品)中分離聚(A)mRNA，並用於合成第一鏈cDNA(Riboclone cDNA試劑盒，Promega)。隨後將該cDNA與5倍過量(重量)的來自已在25℃培養1天隨後在32℃培養3天以失活胚胎發生的晚期單核小孢子和早期雙核花粉(非胚胎發生樣品；Pechan等，1991)的聚(A)+RNA雜交。扣除雜交基本上如Sambrook等(1989)所述進行。扣除後回收的單鏈cDNA用隨機引物試劑盒(BRL)用[α-32P]dCTP標記並用作扣除探針篩選構建自上述相同胚胎發生樣品的λ噬菌體cDNA文庫(Boutilier，1994)。用隨機引物標記的第一鏈非胚胎發生探針和隨機引物標記的napin種子貯藏蛋白cDNA探針(pN2；Crouch，1994)，經扣除探針篩選來自約1.5×105個噬斑形成單位的文庫的3份尼龍濾膜影印物(Hybond-N)。napinmRNA在胚胎發生小孢子文庫中是主要形式(Boutilier，1994)，因此從後續篩選步驟中除去與napin探針雜交的噬斑。選擇與扣除探針雜交但不與非胚胎發生或napin探針雜交的噬斑，並用扣除探針和非胚胎發生cDNA探針進行兩輪後續差異篩選。分離來自選擇的λ克隆的DNA(Sambrook，1989)，用EcoRI和XbaI部分消化，並亞克隆進pGEM-4Z(Promega)。
鑑別了包含六個獨特基因的7個cDNA，其中一個包含一截短的BNM3A cDNA。通過嚴格篩選構建自10日齡歐洲油菜栽培品種Topas的球形期至心期小孢子衍生胚的mRNA的cDNA文庫(UniZAPII cDNA合成試劑盒，Stratagene)的約2.5×105個噬斑形成單位，隨後獲得兩個不同的全長BNM3 cDNA克隆。通過體內切除將這些BNM3 cDNA插入序列拯救進入Bluescript SK(-)(Stratagene)。歐洲油菜基因組DNA序列的分離用Universal Genome Walker試劑盒(Clonetech)分離位於BNM3ATG起始密碼子上遊的基因組DNA片段。構建未克隆的銜接子連接的歐洲油菜栽培品種Topas基因組DNA片段的集合體，並用於經巢式PCR分離BNM3基因組序列。初始PCR利用由廠商供應的外部銜接子引物(AP1)和具有如下序列的BNM3特異引物5』-GAGGCAGCGGTCGGATCGTAACAGTACTCT-3』 (SEQ IDNO8)巢式PCR利用廠商供應的巢式銜接子引物(AP2)和具有如下序列的BNM3特異引物5』-CATAAGGAGAGAGAGAAAAGCCTAACCAGT-3』(SEQ ID NO9).
隨後將初始PCR混合物稀釋1∶50並用作巢式PCR的模板。初始和巢式PCR均依照廠商推薦進行。將巢式PCR產物克隆進pGEMT-Easy載體(Promega)並測序。鑑別了相應於BNM3A和BNM3B cDNA的5』非翻譯基因組區的PCR產物。
用Pfu聚合酶(Stratagene)和下述引物組合經PCR從歐洲油菜栽培品種Topas基因組DNA中分離跨越BNM3A ATG翻譯起始和TAG翻譯終止密碼子的基因組DNA序列，所述引物組合為5』-ACCAAGAACTCGTTAGATC-3』 (SEQ ID NO10)；和5』-AACGCATATAACTAAAGATC-3』 (SEQ ID NO11)。
在標準PCR條件下使用引物。將PCR產物克隆進pGEMT-Easy載體並測序。DNA凝膠印跡分析和在擬南芥屬中的定位用20種不同限制性內切酶消化500ng擬南芥屬基因組DNA(生態型Columbia和Landsberg erecta)，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離並用標準方法印跡在Hybond N+尼龍膜(Amersham)上。將印跡與相應於以下任一種的32P[dATP]隨機引物標記的探針(Megaprime，Amersham)雜交(1.5M NaCl，65℃)1)BNM3A cDNA(SEQ ID NO1)的大約第1個405bp，或2)BNM3A cDNA(SEQ ID NO1)的大約最後1200個核苷酸，然後在低嚴格(2×SSC，0.1％SDS，65℃)或中等嚴格(0.2×SSC，0.1％SDS，25℃)條件下清洗。
用CfoI限制性內切酶在生態型Columbia和Landsberg erecta之間鑑別一限制片段長度多態性(RFLP)。將這一RFLP用於用Lister和Dean重組近交(RI)品系(Lister和Dean，1993)定位擬南芥屬BNM3同系物在擬南芥屬基因組上的位置。來自100個產生自生態型Columbia和Landsberg erecta之間的雜交的重組inbred品系的DNA用CfoI消化，轉移至Hybond N+尼龍膜，與BNM3A cDNA雜交(如上)並在低嚴格條件下清洗。得到的RFLP數據送至Nottingham擬南芥屬寄存中心的RI資料庫，以確定圖譜位置(Lander等，1987)。結果在實施例2-2中討論。擬南芥基因組DNA序列的分離用截短的BNM3A cDNA探針(SEQ ID NO1的約最後1200個核苷酸)篩選3個基因組當量的擴增擬南芥屬生態型C24基因組λ噬菌體文庫(Lambda-GEM 11，Promega)。印跡與32P-[dATP]隨機引物標記的探針(上述)雜交並在低嚴格條件(2×SSC，0.1％SDS，65℃)下清洗。最初鑑別了7個λ噬菌體。隨後在低嚴格條件下與衍生自歐洲油菜BNM3 cDNA的5』末端(SEQ ID NO1的核苷酸1-405)的探針雜交後鑑別了3個含有BNM3基因(SEQ ID NO6)的擬南芥屬同系物的潛在的全長λ噬菌體克隆。從這3個噬菌體中的每一個鑑別包含約8.0kb重疊序列的各個克隆，亞克隆進pBR322並測序。用於植物轉化的質粒的構建以下描述了含有在POLYUBIQUITIN或花椰菜花葉病毒35S啟動子的控制下的BNM3 cDNA的質粒載體的構建。質粒pRAP2TUBI含有在質粒pRAP2T中的修飾的Helianthus annus POLYUBIQUITIN啟動子(Binet等，1991)。質粒pRAP2T由pUCAP質粒(van Engelen等，1995)和插入Sac I和EcoRI限制位點中的胭脂氨酸合酶(nos)終止子。包含POLYUBIQUITIN UbB1的啟動子的5』末端至第一個外顯子的3』末端的該啟動子PCR片段用M13反向引物和包括導入的NcoI和BamHI限制位點的UBIQ-3』引物5』-CCATGGATCCAGAGACGAAGCGAAAC-3』(SEQ ID NO12)從該載體擴增。用PstI和BamHI消化該POLYUBIQUITIN啟動子片段，凝膠純化並連接進pRAP2T的PstI和BamHI位點，產生載體pRAP2TUBIHa。全長BANM3B cDNA用EcoRI和XhoI限制酶消化，用Klenow酶平端化，凝膠純化並連接進pRAP2TUBI的SmaI位點，製備質粒pKB1S。含有修飾的POLYUBIQUITIN啟動子、BNM3BcDNA和nos終止子的AscI/PacI DNA限制片段凝膠純化，連接進AscI/PacI消化的二元載體pBINPLUS(van Engelen等，1995)，產生質粒pKBBIN1S。
含有在雙倍增強35S啟動子和AMV翻譯增強子控制下的BNM3A cDNA的載體的構建如下所述。含有來自質粒pBI525(Datla等，1993)的雙35S啟動子和AMV翻譯增強子的Hind III/XbaI DNA限制片段連接進Hind III/XbaI消化的pRAP2T，產生質粒pRAP2T35S。通過定點誘變將一NcoI位點導入BNM3A cDNA克隆中。用於誘變的BNM3ANCO1引物的序列為5』-ACTCCATGGATAATAACTGGTTAGGC-3』(SEQ IDNO13).第2個引物BNM3AHINDIII5』-AAATTCTCAAGCTTTGGTCCATCTTG-3』(SEQ ID NO14)與BNM3ANCO1引物一起應用以擴增BNM3A cDNA的305bp片段。用NcoI和HindIII消化這一PCR片段，並與NcoI/KpnI切割的pRAP2T35S和含有HindIII位點下遊的BNM3A cDNA區域的HindIII/KpnI片段連接，產生載體p35SBNM3。用AscI和PacI限制酶消化p35SBNM3，凝膠純化含有雙35S啟動子、AMV翻譯增強子、BNM3A cDNA和nos終止子的片段，並與AscI/PacI消化的二元載體pBINPLUS連接，產生質粒p35SBNM3BIN。
將pKBBIN1S和p35SBNM3BIN質粒轉移進攜帶無毒Ti質粒pMP90的根瘤農桿菌C58Cl菌株，並用於轉化實驗。植物轉化擬南芥生態型C24用作轉化實驗中的受體。用Clough和Bent(1998)描述的花沾方法或Vergunst等(1998)描述的根轉化方法轉化植物。
通過小孢子衍生胚的根瘤農桿菌介導的轉化產生轉基因歐洲油菜栽培品種「Topas」。以約每毫升1000個胚的密度培養小孢子衍生胚5周。在含有9％蔗糖的B5培養基中將農桿菌的過夜培養物稀釋100倍。在黑暗下緩慢振蕩將胚與稀釋的細菌於24℃共培養48小時，然後將胚轉移至補加350mg/L cefotaxim和200mg/L萬古黴素的NLN13培養基，在25℃於黑暗下培養至少2周。
在弱光下於25℃在補加2％蔗糖、cefotaxim(200mg/L)和萬古黴素(100mg/L)的固體B5上萌發胚約2周。分離來自萌發的胚的發育好的下胚軸，並轉移至補加100mg/L卡那黴素的新鮮萌發培養基。在此培養基上2周後，在補加卡那黴素(25mg/L)的相似培養基上傳代培養外植體。選擇1個月後可見綠色的推定為轉基因的次生胚。顯微鏡術在含有4％仲甲醛的0.1M磷酸緩衝液pH7.0中於4℃固定所有植物材料過夜。在0.1M磷酸緩衝液中清洗樣品，然後在直至100％乙醇的梯度乙醇系列中脫水。用於掃描電子顯微鏡術的樣品在液體CO2(Balzers CPD020)中進行臨界點乾燥，並用導電碳膠固定在SEMstub上。用Polaron E5100濺射塗布機將樣品用30nm鈀/金。用加速電壓為15kV的JEOL JSM 5200掃描電子顯微鏡觀察樣品，用OrionFramegrabber獲得數字圖像。光學顯微鏡術的樣品包埋在Technovit7100(Kulzer)中。切片在於1％四硼酸鈉中的1％甲苯胺藍中染色10秒鐘，用水洗，並在Euparal中製成標本。用索尼3 CDD相機記錄數字圖像。再生實驗將野生型和轉基因擬南芥屬種子進行表面消毒，置於含有20％蔗糖的1/2MS培養基(1/2MS-20)平板上，並使平板傾斜60℃角於21℃生長。萌發10天後收穫八個野生型幼苗和來自7個不同轉基因品系中每一個的八個幼苗，並分離成根、下胚軸和葉外植體。這一材料然後分成兩批。一半的外植體繼續在含有20％葡萄糖的B5培養基(B5-20)上培養，每2周將外植體轉移至新鮮B5-20培養基。其餘外植體在含有誘導根再生的植物生長調節劑(Vergunst等，1998)的B5-20上培養。首先將這些外植體置於愈傷組織誘導培養基(CIM；高植物生長素/細胞激動素比例)上2天，隨後轉移至枝誘導培養基(SIM；高細胞激動素/植物生長素比例)進行其餘培養期間的培養。每2周將外植體轉移至新鮮SIM培養基。實施例1從歐洲油菜分離和鑑定BNM3基因用扣除篩選途徑分離在歐洲油菜栽培品種Topas小孢子胚胎發生誘導期間優先表達的基因(
圖1)。在扣除探針構建期間使用兩種類型的小孢子培養物胚胎發生的和非胚胎發生的。通過將晚期單核小孢子和早期雙核花粉進行4天32℃熱應力處理獲得胚胎發生培養物。通過在25℃培養相同晚期單核小孢子和早期雙核花粉起始群1天，隨後在32℃培養3天獲得非胚胎發生樣品(Pechan等，1991)。聚(A)mRNA分離自胚胎發生樣品並用於合成第一鏈cDNA，然後將該cDNA與過量的分離自非胚胎發生小孢子/花粉樣品的聚(A)+RNA雜交。回收富集在胚胎發生樣品中存在但在非胚胎發生樣品中不存在或僅以低得多的水平存在的序列的非雜交單鏈cDNA，放射性標記，並用作扣除探針篩選衍生自上述胚胎發生樣品的cDNA文庫。選擇與扣除探針雜交但不與衍生自非胚胎發生樣品的探針雜交的噬斑，並進行隨後兩輪差異篩選。發現了包含在胚胎發生樣品和非胚胎發生樣品中差異表達的6個獨特DNA序列的7個不同cDNA克隆。其中之一42A1，後來重新命名為BNM3A(代表Brassicanapusmicrospore embryo，歐洲油菜小孢子胚)的克隆被進一步鑑定。實施例2-1BNM3基因編碼AP2結構域類別的轉錄激活物的新成員用富集在胚胎發生小孢子和花粉中表達的基因的扣除探針篩選胚胎發生小孢子cDNA文庫後分離到一個BNM3 cDNA克隆BNM3A。該cDNA克隆的大小(1.2kb)與在RNA凝膠印跡上檢測的轉錄物的大小(2.2kb)的不同表明這一克隆不是全長cDNA。從10日齡歐洲油菜小孢子胚cDNA文庫中分離了兩個更長的cDNA克隆，一個相應於最初分離的克隆的全長cDNA，BNM3A(SEQ ID NO1)，和一個新克隆BNM3B(SEQ ID NO3)。這些DNA序列的對比示於圖2。這兩個BNM3 cDNA克隆長度分別為2011和1992個核苷酸，在核苷酸水平相似性為97％，僅在長度和其5′和3′非翻譯區稍有不同。兩個cDNA均潛在編碼579個胺基酸的多肽(預計分子量為63.9kDa，pI為5.7)，其在胺基酸水平相似性為97％(圖3)。
BNM3基因的基因組複雜性由BNM3 cDNA與含有歐洲油菜基因組DNA的凝膠印跡的雜交確定(圖4)。BNM3 cDNA在嚴格條件下與兩個DNA片段雜交，這兩個雜交片段代表兩個BNM3基因，BNM3A和BNM3B。歐洲油菜是衍生自二倍體B.rapa和B.oleracea基因組的雜交的雙倍體物種，因此這兩個BNM3序列可能衍生自每一親本二倍體祖先的一個單拷貝基因座。
序列資料庫檢索發現BNM3翻譯產物含有兩個拷貝的AP2結構域(圖3)。AP2結構域首先在調節分生組織同一性、花器官特化、種皮發育和花同源異型基因表達的擬南芥屬蛋白APETALA2(AP2)中鑑別(Jofuku等，1994；WO98/07842)，從那時起已在具有不同功能的多種蛋白質中鑑別。
這些功能從激活參與應力(Zhou，1997；Stockinger，1997)和乙醇應答(Ohme-Takagi，1995)的基因至葉、花和胚珠發育的調控(Moose，1996；Jofuku，1994；Elliot，1996；Klucher，1996)。AP2結構域是一56-68個胺基酸重複基序，含有至少兩個保守區含保守YRG胺基酸基序的高度鹼性YRG元件，和RAYD元件。RAYD元件含有18個胺基酸的保守中央核心，其預計形成兩親性α-螺旋，該結構被認為介導蛋白質-蛋白質相互作用。一些含有AP2結構域的蛋白質的結合DNA的能力與推定的核定位信號和可作為轉錄激活物的酸性區的存在偶聯，提示這些蛋白質起轉錄因子的功能。
已鑑別了兩個系統發育不同類別的AP2結構域蛋白，其由一個AP2結構域(類EREBP)或由一接頭區連接的兩個AP2結構域(類AP2)組成(Zhou，1997)。BNM3屬於後一類。檢索具有相應於BNM3的兩個AP2結構域和接頭區的區域的資料庫揭示BNM3最接近於擬南芥屬AINTEGUMENTA(ANT；Elliot，1996；Klucher，1996)和Zeamays ZMMHCFl含AP2蛋白質(ZM；Daniell，1996)。圖5示出BNM3的兩個AP2結構域與含有兩個AP2結構域的其它蛋白質的AP2結構域的序列對比。在這一區域BNM3與ANT有85％的胺基酸序列相似性，與ZMMHCFl有88％相似性，但與AP2和GLOSSY15在這一區域僅有66％胺基酸相似性。在BNM3蛋白的第一個AP2結構域內的10個胺基酸插入使得這三個蛋白與其它含AP2結構域的蛋白質進一步區分開(Elliot，1996)。BNM3，AINTEGUMENTA和ZMMHCF1蛋白在其氨基末端區還共享一小的疏水性胺基酸基序，LG/SFSLS，但在其AP2結構域和接頭之外的DNA或胺基酸序列沒有顯示顯著相似性。這些結果表明BNM3序列編碼獨特的AP2結構域蛋白質家族的成員。
BNM3B cDNA和胺基酸序列與ANT或ZMMHCF-1序列的配對對比顯示對於BNM3B核苷酸序列-其與ANT cDNA有56％相同性(在ANT的1905個核苷酸基礎上)，與ZMMHCF1 cDNA有58％相同性(在ZM的1773個核苷酸序列基礎上)；對於BNM3B胺基酸序列BNM3B蛋白與ANT蛋白有41％相同性(在ANT的555個胺基酸序列基礎上)，與ZMMHCF1蛋白有46％相同性(在ZM的485個胺基酸序列基礎上)。實施例2-2歐洲油菜BNM3基因由單個擬南芥直向同源物在低和中等嚴格條件下與一些歐洲油菜BNM3A cDNA(SEQ IDNO1)探針雜交的擬南芥屬基因組DNA的DNA凝膠印跡分析顯示在擬南芥屬基因組中有一個歐洲油菜BNM3基因的同系物。用CfoI限制性內切酶在生態型Columbia和Landsberg erecta之間也鑑別了一RFLP。這一RFLP用於將該單個BNM3同系物定位在擬南芥屬基因組的染色體5上的約34cM處(Lister and Dean，1993)。
篩選擬南芥屬基因組文庫的3個基因組等價物鑑別了含有推定的全長擬南芥屬BNM3同系物(AtBBM)的3個λ克隆。對這三個AtBBM克隆進行的序列分析表明它們是相同的(SEQ ID NO6)。圖9A和9B分別示出分離的擬南芥屬基因組克隆的限制片段模式和在擬南芥屬基因組DNA與Brassica BNM3A cDNA雜交後獲得的限制片段模式。兩個圖的對比表明擬南芥屬AtBBM基因組克隆和用異源探針經DNA凝膠印跡分析鑑別的同系物是相同的。AtBBM基因組克隆的序列分析也將IRREGULAR XYLEM3(IXR3)基因的5』末端定位於推定的AtBBM編碼區的下遊(位置7479，圖9A)。先前已示出IXR3定位於染色體5的標記nga106(33.26cM)和mi438(33.34cM；Taylor等，1999)之間的150kb區域。總結這些數據表明Brassica BNM3基因的擬南芥屬直向同源物由定位於染色體5的單基因編碼。一種與AtBBM非常相似的序列TAMU BAC克隆T10B6(登錄號AP002073；Nakamura，2000年5月18日)也位於染色體5。
Brassica BNM3A基因組克隆(SEQ ID NO5)和擬南芥屬AtBBM基因組克隆(SEQ ID NO6)的結構對比表明在這兩個序列之間預計的內含子/外顯子交界是高度保守的。兩個序列均預計含有9個外顯子和8個內含子序列。
AtBBM基因(SEQ ID NO6)的DNA序列與兩個Brassica cDNA序列(SEQ ID NO1和SEQ ID NO3)的比較示出這三個序列在整個推定的蛋白編碼區內有85％的相似性，在跨越兩個AP2結構域和這兩個AP2結構域之間的接頭區的546個核苷酸內有95％相似性。在跨越兩個AP2結構域和這兩個AP2結構域之間的接頭區的區域內，與其它相關AP2結構域編碼基因如ANT以及位於染色體3上的克隆MOE17的序列(登錄號AB025629)的核苷酸相似性分別為76％和78％。ANT和染色體3上的序列均不顯示與AP2結構域編碼區之外的AtBBM有顯著的DNA相似性。
AtBBM的預測胺基酸編碼序列和兩個Brassica cDNA序列(SEQID NO1和SEQ ID NO3)之間的相似性在完整蛋白編碼序列內約為80％，在跨越兩個AP2結構域和這兩個AP2結構域之間的接頭區的182個胺基酸區域內約為99％。在跨越兩個AP2結構域和這兩個AP2結構域之間的接頭區的胺基酸區域中，與ANT和位於染色體3上的克隆MOE17上的AP2結構域序列的胺基酸相似性約為85％。這兩個蛋白質序列與該蛋白的AP2結構域之外的AtBBM無顯著相似性。實施例3BNM3基因在發育胚中優先表達用RNA凝膠印跡分析(圖6)確定小孢子衍生胚發育、種子發育過程中和非種子組織中的BNM3基因表達模式。分析顯示BNM3基因在發育胚中優先表達。
RNA凝膠印跡分析顯示在誘導經歷胚胎發生的小孢子培養物中以及在隨後的小孢子衍生胚發育的球形期、心期、魚雷期和子葉期檢測到BNM3 mRNA(圖6A)。在非胚胎發生的小孢子培養物中，在新鮮分離的小孢子和花粉中或在培養繼續配子體發育的小孢子和花粉中未檢測到BNM3 mRNA(圖6A)。發育種子的RNA凝膠印跡分析顯示BNM3表達首先在相應於胚發育心期的傳粉後14天(14DAP)檢測到。在胚發育早期(21DAP)和子葉中期(28DAP)期間BNM3表達增加，之後保持恆定(圖6B)。在所測試的任何非種子組織中未檢測到BNM3轉錄物，反映出在這些組織中的轉錄物水平非常低或不存在。實施例4在營養組織中表達BNM3促進無性胚形成為確定歐洲油菜BNM3蛋白的功能，將BNM3 cDNA置於兩個不同組成型啟動子構建體的控制下並導入擬南芥屬，這兩個構建體為修飾的向日葵POLYUBIQUITIN啟動子構建體(以下稱為UBIBNM3)和含有AMV翻譯增強子的雙倍增強的35S啟動子構建體(以下稱為35SBNM3)。轉化子表型分析表明BNM3 cDNA的異位過表達促進體細胞胚在營養結構如子葉、葉柄、葉緣和苗端分生組織上的形成(圖7)。當BNM3基因在更強的雙倍增強的35S啟動子-AMV翻譯增強子控制下表達時，與使用POLYUBIQUITIN啟動子相比，產生異位胚的轉化子的頻率以及異位胚表型外顯率均增加。因此，需要高閾值水平的蛋白產物以增加異位胚表型的頻率和外顯率。
BNM3衍生的異位胚含有在發育的合子胚中發現的所有器官系統和組織層。BNM3衍生的異位胚是雙極性的(圖7D和7E)，並由軸組成，該軸包含下胚軸和胚根區，條根分生組織和子葉(圖7E)。另外，每個器官系統含有在合子胚中發現的三層特化組織層(表皮、基本薄壁組織和維管束原組織)的特徵性放射排列(圖7E)。BNM3基因在發育的異位胚中的持續表達導致胚形成過程的重複，結果是新胚持續在預先存在的胚的表面形成(圖7D和7E)。這些結果提供了結論性證據，即單基因BNM3的表達足以起始信號轉導級聯，導致完全分化的無性衍生胚的形成。實施例5BNM3表達增加植物組織的再生能力我們檢查了BNM3基因表達對擬南芥屬植物在存在或不存在添加的生長調節劑時體外再生枝的能力的作用。將來自10日齡野生型擬南芥屬和在POLYUBIQUITIN啟動子控制下表達BNM3的轉基因擬南芥屬品系的幼苗的葉、根和下胚軸外植體置於含有生長調節劑的培養基上以首先誘導愈傷組織形成，隨後枝器官發生。來自轉基因品系的根外植體顯示在存在激素情況下枝再生比野生型根外植體增加至少5倍(圖8A)。這些枝在轉基因外植體中也比在野生型中發育快。野生型葉和下胚軸外植體通過在葉柄切口端產生愈傷組織而發生應答(圖8B)。相反，來自轉基因品系的外植體葉柄切口端立即產生新枝(圖8B)或者產生根。最初產生根的轉基因外植體最終也產生枝。
轉基因外植體也能在不存在添加的生長調節劑時再生。置於不含生長調節劑的培養基上的野生型葉和下胚軸外植體在葉柄切口端偶爾產生愈傷組織或根，但是從這些結構不再生枝(圖8C，D)。野生型根成熟並在與側根交界處形成增厚的根瘤狀結構，但不再進一步發育。相反，置於不含生長調節劑的培養基上的轉基因外植體從葉和下胚軸外植體的切口端再生枝或者從根外植體的根瘤狀結構再生枝(圖8C，D)。
所有引述文獻引入本文作參考。
本發明已參照優選實施方案描述，但是本領域技術人員顯而易見的是在本文所述本發明範圍內可做出各種變化和修改。
參考文獻Anderson，N.L.和Anderson，N.G.(1998)，蛋白質組和蛋白質組學新技術、新概念和新名詞，電泳19，1853-1861Angenent，G.C.，Franken，J.，Busscher，M.，van Dijken，A.，van Went，J.L.，Dons，H.J.M.and van Tunen，A.J.(1995).參與Petunia的胚珠發育的一個新的MADS核基因類別，Plant Cell 7，1569-1582.
Aoyama，T.and Chua，N.H.(1997).轉基因植物中糖皮質激素介導的轉錄誘導系統，Plant J.2，397-404.
Baszczynski，C.L.，and Fallis，L.(1990).編碼新的歐洲油菜napin基因的基因組克隆的分離和核苷酸序列，Plant Mol.Biol.14，633-635.
Binet，M.N.，Lepetit，M.，Weil，J.H.and Tessier，L.H.(1991).由瞬時表達分析向日葵聚遍在蛋白啟動子，Plant Sci.79，87-94.
Boutilier，K.A.，Gines，M.J.，Demoor，J.M.，Huang，B.，Baszczynski，C.L.，Iyer，V.N.and Miki，B.L.(1994).napin基因的BmnNAP亞家族的表達與Brassica小孢子胚胎發生的誘導平行，Plant Mol.Biol.26，1711-1723.
Brandstatter，I.and Kieber，J.J.(1998).與細菌誘導調控物相似的兩個基因在擬南芥屬中由細胞激動素快速而特異地誘導，Cell 10，1009-1019.
Caddick，M.X.，Greenland，A.J.，Jepson，I.，Krause，K.P.，Qu，N.，Riddell，K.V..Salter，M.G.，Schuch，W.，Sonnewald，U.，and Tomsett，A.B.(1998).用於操縱碳代謝的植物乙醇誘導基因開關.Nature Biotech.16，177-180.
Chaudury，A.M.，Letham.D.S.，Craig，S.and Dennis，E.S.(1993).具有更高細胞激動素水平和改變的胚胎發生模式、更快的營養生長、組成型光形態發生和早熟開花的amp-1-a突變體，Plant J.4，907-916.
Chaudhury，A.，Ming，L.，Miller，C.，Craig，S.，Dennis，E.S.，and Peacock，W.J.(1997).擬南芥中受精不依賴性種子發育，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4223-4228.
Clough，S.J.and Bent，A.F.(1998).花沾用於擬南芥的農桿菌介導轉化的簡化方法.Plant J.16，735-743.
Custers，J.B.M，Oldenhof，M.T.，Schrauwen，J.A.M.，Cordewener，J.H.G.，Wullems，G.J.and van Lookeren Campagne，M.M.(1997)小孢子特異性啟動子在菸草中的分析.Plant Mol.Biol 35，689-699.
Crouch，M.L.，Tenbarge，K.M.，Simon，A.E.and Ferl，R.(1983).歐洲油菜種子貯藏蛋白的cDNA克隆來自核苷酸序列分析的證據，即napin的兩個亞基均從前體多肽中裂解而來.J.Mol.Appl.Genet.2-273-283.
Daley，M.，Knauf，V.C.，Summerfelt，K.R.and Tumer，J.C.(1998).產生不含標記的轉基因植物的方法用含有兩個二元質粒的一個根瘤農桿菌進行的共轉化.Plant Cell Rep.17，489-496.
Daniell，T.J.，Fordham-Skelton，A.P.，Vergani，P.and Edwards，R.(1996).通過互補克隆大腸桿菌的L-異天冬醯胺基甲基轉移酶缺陷突變體分離編碼APETALA-2類結合結構域的玉米cDNA(登錄號Z47554)(PGR 96-013).PlantPhys.110，1435.
Datla，R.S.S.，Bekkaoui，F.，Hammerlindl，J.K.，Pilate，G.，Dunstan，D.I.andCrosby，W.L.(1993).用AMV RNA4非翻譯前導序列改進的在植物中的高水平組成型外源基因表達.Plant Sci.94，139-149.
DeBlock，M.DeBrower，D.and Tenning，P.(1989).用根瘤農桿菌轉化歐洲油菜和Brasica oleracea以及bar和neo基因在轉基因植物中的表達.Plant Physiol.91694-701.
Dellaert，L.M.W(1981)，X-光和快中子誘導的突變體譜的比較在擬南芥(L.)中的實驗，Heynh.Arabidopsis Inf Ser.，18，16-36.
Doan，D.N.P.，Linnestad，C.，and Olsen，O.-A.(1996).從大麥胚乳多核細胞和周圍珠心細胞層中分離分子標記.PlantMol.Biol.31877-886.
Elliot，R.C.，Betzner，A.S.，Huttner，E.，Oakes，M.P.，Tucker，W..Q.J.，Gerentes，D.，Perez，P.and Smyth，D.R.(1996).INTEGUMENTA在胚珠發育和花器官生長中有多效作用的擬南芥屬APETALA2類基因.Plant Cell 8，155-168.
Federoff，N.，Furtek，D.，and Nelson O.(1984).用轉座控制元件Ac經簡便通用程序克隆玉米中的青銅基因座.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，3825-3829.
Feldman，K.A.，Marks，M.D.，Christianson，M.L.，and Quatrano，R.S.(1989).由T-DNA插入誘變產生的擬南芥屬矮型突變體.Science 243，1351-1354.
Fobert，P.R.，Miki，B.L.，and Iyer，V.N.(1991).由T-DNA介導的融合揭示的植物中基因調控信號的檢測，Plant Mol.Biol.17，837-851.
Gatz，C.(1997).基因表達的化學控制.Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，89-108.
Gatz，C.and Lenk，I.R.P.(1998).應答化學誘導物的啟動子.Trends Plant Sci.3，352-358.
Guerche，P.，Tire，C.，Grossi De Sa，F.，De Clercq，A.，Van Montagu，M.andKrebbers.E.(1990).擬南芥屬2S清蛋白基因的差異表達以及增加基因家族大小的作用.Plant Cell 2，69-478.
Gustavsson，H.O.，EllerStrom，M.，Stulberg，K.，Ezcurra l.，Koman，A.，Hoglund，A.，Rask，L.and Josefsson.L.-G.(1991).napin啟動子中的獨特的序列元件在體外與歐洲油菜DNA結合蛋白相互作用.Physiol.Plant 82，205-212.
Haseloff，J.and Amos，B.(1995).植物中的GFP.Trends Genet.11，328-329.
Jefferson R.A.and Bickiiell，R.(1996).無融合生殖的潛在影響分子遺傳學途徑.《植物分子遺傳學影響》，B.W.S.Sobral，ed(BostonBirklianser)，pp.87-101.
Jefferson，R.A.，Kavanagh，T.A.and Bevan，M.W.(1987).GUS融合體在高等植物中作為敏感通用基因融合標記的β-葡糖醛酸酶.EMBO J.6.3901-3907.
Jofuku，K.D.，den Boer，B.G.W，van Montagu M.and Okamuro，J.K.(1994).由同源異型基因APETALA2控制的擬南芥屬花和種子發育.Plant Cell 6，1211-1225.
Kakimoto，T.(1996).CK17，用於細胞激動素信號轉導的組氨酸激酶同系物.Science 274，982-985.
Keller.W.A.，Fan，Z.，Pechan，P.，Long，N.，Grainger，J.(1987).培養歐洲油菜的分離的小孢子的有效方法.Proceedings ofthe 7th Intemational Rapeseed CongressPoznan，Poland.Vol.1，152-157.
Klein，T.M.，Wolf，E.D.，Wu，R.and Sanford，J.C.(1987).用於將核酸輸送進活細胞的高速微粒.Nature 327，70-73Klimyuk，V.I.and Jones，J.D.G.(1997).AtDMCl，酵母DMC 1基因的擬南芥屬同系物鑑定、轉座子誘導等位基因變異和減數分裂相關表達.Plant J.11，1-14.
Klucher，K.M.，Chow，H.，Reiser，L.and Fischer，R.L.(1996).胚珠和雌配子體發育所需的擬南芥屬AINTEGUMENTA基因與花同源異型基因APETALA2相關，Cell 8，137-153.
Koltunow，A.M.，Bicknell，R.A.and Chaudhury，A.M.(1995).無融合生殖不經受精產生遺傳學相同種子的分子策略.Plant Physiol.108，1345-1352.
Koltunow，A.M.(1993).不需胚珠的減數分裂或受精形成的胚囊和胚，PlantCell 5.1425-1437.
Komeef，M.，Hanhart，C.J.and Thiel，F.(1989).A genetic and phenotypicdescription of擬南芥eceriferum(cer)突變體的遺傳學和表型描述.J.Hered.80，118-122.
Lander，E.S.，Green，P.，Abrahamson，J.，Barlow，A.，Day，M.J.，Lincoln，S.E.，and Newber，L.(1987).Mapmaker用於構建實驗和天然群體的初級遺傳連鎖圖的交互式計算機包，Genetics 121，174-181.
Lighmer J.，and Caspar，T.(1988)，擬南芥屬的種子誘變，見《擬南芥屬方案》，J.M.Martinez-Zapater and J.Salinas eds(Totowa，USAHumana Press).
Lipshultz，R.J.，Fodor， S.P.A.，Gingeras，T.R.and Lockhart，D.J.(1999).高密度合成寡核苷酸探針，Nature Genetics 21，20-24.
Lister，C.，and Dean，C.(1993).用於定位擬南芥RFLP和表型標記的重組近交品系.Plant Journal 4，745-750.
Lotan，T.，Ohto，M.，Matsudaira Yee，K.，West，M.A.L.，Lo，R.，Kwong，R.W，Yamagishi，K，Fischer，R.L.，Goldberg，R.B.and Harada，J.J.(1998).擬南芥屬LEAFY COTYLEDONI足以誘導營養細胞中的胚發育.Cell 93，1195-1205.
Meijer，A.H.，Ouwerkerk，P.B.F.and Hoge，J.H.C.(1998).用於通過酵母的遺傳選擇而克隆轉錄因子和鑑別靶位點的載體.Yeast 14，1407-1415.
Moose，S.P.and Sisco，P.H.(1996).Glossy 15，玉米中調控葉表皮細胞相同性的APETALAZ類基因.Genes Dey.10，3018-3027.
Mordhorst，A.P.，Toonen，M.A.J.and de Vries，S.C.(1997).植物胚胎發生.Crit.Rey.Plant Sci.16，535-576.
Mordhorst，A.P.，Voerman，K.J.，Hartog，M.V.，Meijer，E.A.，van Went，J.，Koomneef，M.，and de Vries，S.C.(1998).擬南芥中體細胞胚胎發生由抑制分生組織細胞分裂的基因的突變促進.Genetics 149，549-563.
Ogas，J.，Cheng，J.-C.，Sung，R.Z.and Somerville，C.(1997).在擬南芥泡菜突變體中由赤黴素調控的細胞分化.Science 277，91-94.
Ohme-Takagi，M.and Shinshi，H.(1995).與乙烯應答元件相互作用的乙烯誘導的DNA結合蛋白.PlantCell7，173-182.
Oldenhof，M.T.，de Groot，P.F.M.，Visser，J.H.，Schrauwen，J.A.M.and Wullems，G.J.(1996).來自菸草的小孢子特異基因的分離和鑑定.Plant Mol.Biol.31，213-225.
Ouellet T.，Rutledge，R.G.and Mikl，B.L.(1992).歐洲油菜乙醯羥酸合酶多基因家族成員具有不同的表達模式，Plant J.2，321-330.
Ow，D.W.，Jacobs，J.D.and Howell，S.H.(1987).用螢火蟲螢光酶基因作為啟動子活性的報導基因確定的花椰菜花葉病毒355 ANA啟動子的功能區.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，4870-4874.
Ozias-Akins，P.，Lubbers，E.L.，Hanna，W.W.and McNay，J.W(1993).Pennisetum中無融合生殖模式繁殖的傳遞該性狀和分子標記的共遺傳.Theor.Appl.Genet.85，632-638.
Pang，P.，Pruitt，R.and Meyerowitz，E.(1988).擬南芥12S貯藏蛋白基因的分子克隆、基因組結構、表達和進化.Plant Mol.Biol.11，805-820.
Peacock，WJ.，Ming，L.，Craig，S.，Dennis，E.，Chaudury，A.M.(1995).擬南芥屬中無融合生殖基因的誘變程序，見作物改良的誘導突變和分子技術進展研討會論文集，(ViennaInternational Atomic Energy Agency)，pp，117-125.
Pechan，P.M.，Bartels，D.，Brown，D.C.W and Schell，J.(1991).與小孢子胚胎發生的誘導相關的Brassica信使RNA和蛋白質改變.Planta 184，161-165.
Roberts，M.R.，Foster，G.D.，Blundell，R.P.，Robinson，S.W，Kumar.A.，Draper，J.and Scott，R.(1993).花葯特異性擬南芥基因的配子體和孢子體表達.Plant J.3，111-120.
Rounsley，S.D.，Ditta，G.S.and Yanofsky，M.F.(1995).MADS盒基因在擬南芥屬發育中的多種作用.Plant Cell 7，159-1269.
Salter，M.G.，Paine.J.A，Riddell，K.V.，Jepson，1.，Greenland，A.J.，Caddick.M.X.，Tomsett，A.B.(1998).用於轉基因植物的乙醇誘導的alc基因表達系統的鑑定.Plant Joumal 16，127-132.
Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Mamatis，T.(1989).分子克隆實驗手冊，第2版(Cold Spring HarborCold Spring Harbor Laboratory Press).
Schmidt.E.D.L.，Guzzo，F.，Toonen，M.A.J.and de Vries，S.C.(1997).含有富亮氨酸重複的類似受體的激酶表示體細胞植物細胞能形成胚.Development.1 24，2049-2062.
Shure，M.，Wessler，S.，and Fedorogg，N.，玉米中Waxy基因座的分子鑑定和分離.Cell.1 983 Nov，35.225-33.
Stockinger，E.J.，Gilmour，S.J.and Thomashow，M.F.(1997).擬南芥CBF 1編碼與C-重複/DRE結合的含AP2結構域的轉錄激活物，其是一種順式DNA調控元件，應答低溫和缺水而刺激轉錄.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，1035-1040.
Taylor，R.L.(1967).Malaxis paludosa的葉狀胚.Can.J.Bot.45，1553-1556.
Taylor，N.G.，Scheible，W.R.，Cutler，S.，Somerville，C.R.，and Tumier，S.R.(1999).擬南芥屬的不規則xylem3基因座編碼次生細胞壁合成所需的纖維素合酶.Plant cell 11，769-779.
Treacy，B.K.，Hattori，J.，Prud′homme，I.，Barbour，E.，Boutilier，K.，Baszczynski，C.L.，Huang，B.，Johiison，D.A.and Miki，B.L.(1997).Bmnl，一種Brassica花粉特異性基因.Plant Mol.Biol.34，603-611.
Twell，D.，Wing，R.，Yamaguchi.J.and McCormick，S.(1989).來自菸草的花葯特異性基因的分離和表達.Mol.Gen.Genet.217，240-245.
Ulmasov，T.，Murfett，J.，Hagen，G.and Guilfoyle，T.(1997).Aux/IAA蛋白阻遏含有天然和高活性合成植物生長素應答元件的報導基因的表達.Plant Cell 9，1963-1971.
van Engelen，F.A.，Molthoff，J.W..Conner，A.J.，Nap，J.P.，Pereira，A.andStiekema，WJ.(1995).pBINPLUS，一種基於pBINI 9的改進的植物轉化載體.Transgenic Res.4，288-290.
Vergunst，A.C.，de Waal，E.C.and Hooykaas，PJ.J.(1998).根瘤農桿菌介導的根轉化，見《擬南芥屬方案》，J.M.Martinez-Zapater and J.Salinas，eds(Totowa，USAHumaiia Press).
Xu，D.，McElroy，D.，Thomburg，R.W.and Wu，R.C.S.(1993).在轉基因水稻植物中通過創傷、茉莉酮酸甲酯和脫落酸對馬鈴薯pin2啟動子的系統誘導.PlantMol.Biol.22，573-588.
Xu，H.，Anox，R.B.，Taylor，P.E.and Singh，M.B.(1995).Bcpl，一種擬南芥屬雄性可育性所需的基因.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，2106-2110.
Yarbrough，J.A.(1932).Bryophyllum calicyinum的葉狀胚的解剖學和發育研究.Amer.J.Bot.19，443-453.
Yeung，E.C.(1995).體細胞胚胎發生的結構和發育模式，見《植物的體外胚胎發生》，T.A.Thorpe，ed(Dordrecht Kluwer Academic Publishers)，pp.205-247.
ZarSky，V.，Gatrido，D.，Eller，N.，Tupy，J.，Vicente，O.，Schffl，F.and Heberle-Bors，E.(1995)小熱休克蛋白的表達在飢餓誘導菸草花粉胚胎發生過程中被激活.Plant Cell Environ.18，139-147.
Zhou，J.，Tang，X.and Marin，G.B.(1997).賦予對番茄細菌斑點病的抗性的Pto激酶與結合病原相關基因的順式元件的蛋白質相互作用，EMBO J.16，3207-3218.
序列表110植物研究國際公司由加拿大農業及農產品部代表的對加拿大行使權力的女王陛下120BNM3轉錄激活物控制植物胚胎發生和再生過程的用途13008-887547W0140141150EP 99201745.9-21061511999-06-0216014170PatentIn Ver.2.121012112014212DNA213Brassica napus4001gttcatctct cttctttaag accaaaacct ttttctcctc ctcttcatgc atgaacccta 60actaagttct tcttctttta ccttttacca agaactcgtt agatcactct ctgaactcaa 120tgaataataa ctggttaggc ttttctctct ctccttatga acaaaatcac catcgtaagg 180acgtctactc ttccaccacc acaaccgtcg tagatgtcgc cggagagtac tgttacgatc 240cgaccgctgc ctccgatgag tcttcagcca tccaaacatc gtttccttct ccctttggtg 300tcgtcgtcga tgctttcacc agagacaaca atagtcactc ccgagattgg gacatcaatg 360gttgtgcatg caataacatc cacaacgatg agcaagatgg accaaagctt gagaatttcc 420ttggccgcac caccacgatt tacaacacca acgaaaacgt tggagatgga agtggaagtg 480gctgttatgg aggaggagac ggtggtggtg gctcactagg actttcgatg ataaagacat 540ggctgagaaa tcaacccgtg gataatgttg ataatcaaga aaatggcaat gctgcaaaag 600gcctgtccct ctcaatgaac tcatctactt cttgtgataa caacaacgac agcaataaca 660acgttgttgc ccaagggaag actattgatg atagcgttga agctacaccg aagaaaacta 720ttgagagttt tggacagagg acgtctatat accgcggtgt tacaaggcat cggtggacag 780gaagatatga ggcacattta tgggataata gttgtaaaag agaaggccaa acgcgcaaag 840gaagacaagt ttatttggga ggttatgaca aagaagaaaa agcagctagg gcttatgatt 900tagccgcact caagtattgg ggaaccacca ctactactaa cttccccatg agcgaatatg 960aaaaagaggt agaagagatg aagcacatga caaggcaaga gtatgttgcc tcactgcgca 1020ggaaaagtag tggtttctct cgtggtgcat cgatttatcg tggagtaaca agacatcacc 1080aacatggaag atggcaagct aggataggaa gagtcgccgg taacaaagac ctctacttgg 1140gaacttttgg cacacaagaa gaagctgcag aggcatacga cattgcggcc atcaaattca 1200gaggattaac cgcagtgact aacttcgaca tgaacagata caacgttaaa gcaatcctcg 1260aaagccctag tcttcctatt ggtagcgccg caaaacgtct caaggaggct aaccgtccgg 1320ttccaagtat gatgatgatc agtaataacg tttcagagag tgagaatagt gctagcggtt 1380ggcaaaacgc tgcggttcag catcatcagg gagtagattt gagcttattg caccaacatc 1440aagagaggta caatggttat tattacaatg gaggaaactt gtcttcggag agtgctaggg 1500cttgtttcaa acaagaggat gatcaacacc atttcttgag caacacgcag agcctcatga 1560ctaatatcga tcatcaaagt tctgtttcgg atgattcggt tactgtttgt ggaaatgttg 1620ttggttatgg tggttatcaa ggatttgcag ccccggttaa ctgcgatgcc tacgctgcta 1680gtgagtttga ttataacgca agaaaccatt attactttgc tcagcagcag cagacccagc 1740agtcgccagg tggagatttt cccgcggcaa tgacgaataa tgttggctct aatatgtatt 1800accatgggga aggtggtgga gaagttgctc caacatttac agtttggaac gacaattaga 1860aaaaatagtt aaagatcttt agttatatgc gttgttgtgt gctggtgaac agtgtgatac 1920tttgattatg tttttttctt tctctttttc tttttcttgg ttaatttctt aagacttatt 1980tttagtttcc attagttgga taaattttca gact 20142102211579212PRT213Brassica napus4002Met Asn Asn Asn Trp Leu Gly Phe Ser Leu Ser Pro Tyr Glu Gln Asn1 5 10 15His His Arg Lys Asp Val Tyr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Val Val Asp20 25 30Val Ala Gly Glu Tyr Cys Tyr Asp Pro Thr Ala Ala Ser Asp Glu Ser35 40 45Ser Ala Ile Gln Thr Ser Phe Pro Ser Pro Phe Gly Val Val Val Asp50 55 60Ala Phe Thr Arg Asp Asn Asn Ser His Ser Arg Asp Trp Asp Ile Asn65 70 75 80Gly Cys Ala Cys Asn Asn Ile His Asn Asp Glu Gln Asp Gly Pro Lys85 90 95Leu Glu Asn Phe Leu Gly Arg Thr Thr Thr Ile Tyr Asn Thr Asn Glu100 105 110Asn Val Gly Asp Gly Ser Gly Ser Gly Cys Tyr Gly Gly Gly Asp Gly115 120 125Gly Gly Gly Ser Leu Gly Leu Ser Met Ile Lys Thr Trp Leu Arg Asn130 135 140Gln Pro Val Asp Asn Val Asp Asn Gln Glu Asn Gly Asn Ala Ala Lys145 150 155 160Gly Leu Ser Leu Ser Met Asn Ser Ser Thr Ser Cys Asp Asn Asn Asn165 170 175Asp Ser Asn Asn Asn Val Val Ala Gln Gly Lys Thr Ile Asp Asp Ser180 185 190Val Glu Ala Thr Pro Lys Lys Thr Ile Glu Ser Phe Gly Gln Arg Thr195 200 205Ser Ile Tyr Arg Gly Val Thr Arg His Arg Trp Thr Gly Arg Tyr Glu210 215 220Ala His Leu Trp Asp Asn Ser Cys Lys Arg Glu Gly Gln Thr Arg Lys225 230 235 240Gly Arg Gln Val Tyr Leu Gly Gly Tyr Asp Lys Glu Glu Lys Ala Ala245 250 255Arg Ala Tyr Asp Leu Ala Ala Leu Lys Tyr Trp Gly Thr Thr Thr Thr260 265 270Thr Asn Phe Pro Met Ser Glu Tyr Glu Lys Glu Val Glu Glu Met Lys275 280 285His Met Thr Arg Gln Glu Tyr Val Ala Ser Leu Arg Arg Lys Ser Ser290 295 300Gly Phe Ser Arg Gly Ala Ser Ile Tyr Arg Gly Val Thr Arg His His305 310 315 320Gln His Gly Arg Trp Gln Ala Arg Ile Gly Arg Val Ala Gly Asn Lys325 330 335Asp Leu Tyr Leu Gly Thr Phe Gly Thr Gln Glu Glu Ala Ala Glu Ala340 345 350Tyr Asp Ile Ala Ala Ile Lys Phe Arg Gly Leu Thr Ala Val Thr Asn355 360 365Phe Asp Met Asn Arg Tyr Asn Val Lys Ala Ile Leu Glu Ser Pro Ser370 375 380Leu Pro Ile Gly Ser Ala Ala Lys Arg Leu Lys Glu Ala Asn Arg Pro385 390 395 400Val Pro Ser Met Met Met Ile Ser Asn Asn Val Ser Glu Ser Glu Asn405 410 415Ser Ala Ser Gly Trp Gln Asn Ala Ala Val Gln His His Gln Gly Val420 425 430Asp Leu Ser Leu Leu His Gln His Gln Glu Arg Tyr Asn Gly Tyr Tyr435 440 445Tyr Asn Gly Gly Asn Leu Ser Ser Glu Ser Ala Arg Ala Cys Phe Lys450 455 460Gln Glu Asp Asp Gln His His Phe Leu Ser Asn Thr Gln Ser Leu Met465 470 475 480Thr Asn Ile Asp His Gln Ser Ser Val Ser Asp Asp Ser Val Thr Val485 490 495Cys Gly Asn Val Val Gly Tyr Gly Gly Tyr Gln Gly Phe Ala Ala Pro500 505 510Val Asn Cys Asp Ala Tyr Ala Ala Ser Glu Phe Asp Tyr Asn Ala Arg515 520 525Asn His Tyr Tyr Phe Ala Gln Gln Gln Gln Thr Gln Gln Ser Pro Gly530 535 540Gly Asp Phe Pro Ala Ala Met Thr Asn Asn Val Gly Ser Asn Met Tyr545 550 555 560Tyr His Gly Glu Gly Gly Gly Glu Val Ala Pro Thr Phe Thr Val Trp565 570 575Asn Asp Asn21032112011212DNA213Brassica napus4003ttcttctttt accttttacc aagaactcgt tagatcattt tctgaactcg atgaataata 60actggttagg cttttctctc tctccttatg aacaaaatca ccatcgtaag gacgtctgct 120cttccaccac cacaaccgcc gtagatgtcg ccggagagta ctgttacgat ccgaccgctg 180cctccgatga gtcttcagcc atccaaacat cgtttccttc tccctttggt gtcgtcctcg 240atgctttcac cagagacaac aatagtcact cccgagattg ggacatcaat ggtagtgcat 300gtaataacat ccacaatgat gagcaagatg gaccaaaact tgagaatttc cttggccgca 360ccaccacgat ttacaacacc aacgaaaacg ttggagatat cgatggaagt gggtgttatg 420gaggaggaga cggtggtggt ggctcactag gactttcgat gataaagaca tggctgagaa 480atcaacccgt ggataatgtt gataatcaag aaaatggcaa tggtgcaaaa ggcctgtccc 540tctcaatgaa ctcatctact tcttgtgata acaacaacta cagcagtaac aaccttgttg 600cccaagggaa gactattgat gatagcgttg aagctacacc gaagaaaact attgagagtt 660ttggacagag gacgtctata taccgcggtg ttacaaggca tcggtggaca ggaagatatg 720aggcacattt atgggataat agttgtaaac gagaaggcca aacgcgcaaa ggaagacaag 780tttatttggg aggttatgac aaagaagaaa aagcagctag ggcttatgat ttagccgcac 840tcaagtattg gggaaccacc actactacta acttccccat gagcgaatat gagaaagaga 900tagaagagat gaagcacatg acaaggcaag agtatgttgc ctcacttcgc aggaaaagta 960gtggtttctc tcgtggtgca tcgatttatc gtggagtaac aagacatcac caacatggaa 1020gatggcaagc taggatagga agagtcgccg gtaacaaaga cctctacttg ggaacttttg 1080gcacacaaga agaagctgca gaggcatacg acattgcggc catcaaattc agaggattaa 1140ccgcagtgac taacttcgac atgaacagat acaacgttaa agcaatcctc gaaagcccta 1200gtcttcctat tggtagcgcc gcaaaacgtc tcaaggaggc taaccgtccg gttccaagta 1260tgatgatgat cagtaataac gtttcagaga gtgagaataa tgctagcggt tggcaaaacg 1320ctgcggttca gcatcatcag ggagtagatt tgagcttatt gcagcaacat caagagaggt 1380acaatggtta ttattacaat ggaggaaact tgtcttcgga gagtgctagg gcttgtttca 1440aacaagagga tgatcaacac catttcttga gcaacacgca gagcctcatg actaatatcg 1500atcatcaaag ttctgtttca gatgattcgg ttactgtttg tggaaatgtt gttggttatg 1560gtggttatca aggatttgca gccccggtta actgcgatgc ctacgctgct agtgagtttg 1620actataacgc aagaaaccat tattactttg ctcagcagca gcagacccag cattcgccag 1680gaggagattt tcccgcggca atgacgaata atgttggctc taatatgtat taccatgggg 1740aaggtggtgg agaagttgct ccaacattta cagtttggaa cgacaattag aaataatagt 1800taaagatctt tagttatatg cgttgttgtg tggtgttgaa cagtttgata ctttgattat 1860gttttttttt ctctttttca ttttgttggt tagtttctta agacttattt tttgtttcca 1920ttagttggat aaattttcgg acttaagggt cacttctgtt ctgacttctg tctaatacag 1980aaaagttttc ataaaaaaaa aaaaaaaaaa a20112104211579212PRT213Brassica napus4004Met Asn Asn Asn Trp Leu Gly Phe Ser Leu Ser Pro Tyr Glu Gln Asn1 5 10 15His His Arg Lys Asp Val Tyr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Val Val Asp20 25 30Val Ala Gly Glu Tyr Cys Tyr Asp Pro Thr Ala Ala Ser Asp Glu Ser35 40 45Ser Ala Ile Gln Thr Ser Phe Pro Ser Pro Phe Gly Val Val Val Asp50 55 60Ala Phe Thr Arg Asp Asn Asn Ser His Ser Arg Asp Trp Asp Ile Asn65 70 75 80Gly Cys Ala Cys Asn Asn Ile His Asn Asp Glu Gln Asp Gly Pro Lys85 90 95Leu Glu Asn Phe Leu Gly Arg Thr Thr Thr Ile Tyr Asn Thr Asn Glu100 105 110Asn Val Gly Asp Gly Ser Gly Ser Gly Cys Tyr Gly Gly Gly Asp Gly115 120 125Gly Gly Gly Ser Leu Gly Leu Ser Met Ile Lys Thr Trp Leu Arg Asn130 135 140Gln Pro Val Asp Asn Val Asp Asn Gln Glu Asn Gly Asn Ala Ala Lys145 150 155 160Gly Leu Ser Leu Ser Met Asn Ser Ser Thr Ser Cys Asp Asn Asn Asn165 170 175Asp Ser Asn Asn Asn Val Val Ala Gln Gly Lys Thr Ile Asp Asp Ser180 185 190Val Glu Ala Thr Pro Lys Lys Thr Ile Glu Ser Phe Gly Gln Arg Thr
195 200 205Ser Ile Tyr Arg Gly Val Thr Arg His Arg Trp Thr Gly Arg Tyr Glu210 215 220Ala His Leu Trp Asp Asn Ser Cys Lys Arg Glu Gly Gln Thr Arg Lys225 230 235 240Gly Arg Gln Val Tyr Leu Gly Gly Tyr Asp Lys Glu Glu Lys Ala Ala245 250 255Arg Ala Tyr Asp Leu Ala Ala Leu Lys Tyr Trp Gly Thr Thr Thr Thr260 265 270Thr Asn Phe Pro Met Ser Glu Tyr Glu Lys Glu Val Glu Glu Met Lys275 280 285His Met Thr Arg Gln Glu Tyr Val Ala Ser Leu Arg Arg Lys Ser Ser290 295 300Gly Phe Ser Arg Gly Ala Ser Ile Tyr Arg Gly Val Thr Arg His His305 310 315 320Gln His Gly Arg Trp Gln Ala Arg Ile Gly Arg Val Ala Gly Asn Lys325 330 335Asp Leu Tyr Leu Gly Thr Phe Gly Thr Gln Glu Glu Ala Ala Glu Ala340 345 350Tyr Asp Ile Ala Ala Ile Lys Phe Arg Gly Leu Thr Ala Val Thr Asn355 360 365Phe Asp Met Asn Arg Tyr Asn Val Lys Ala Ile Leu Glu Ser Pro Ser370 375 380Leu Pro Ile Gly Ser Ala Ala Lys Arg Leu Lys Glu Ala Asn Arg Pro385 390 395 400Val Pro Ser Met Met Met Ile Ser Asn Asn Val Ser Glu Ser Glu Asn405 410 415Ser Ala Ser Gly Trp Gln Asn Ala Ala Val Gln His His Gln Gly Val420 425 430Asp Leu Ser Leu Leu His Gln His Gln Glu Arg Tyr Asn Gly Tyr Tyr435 440 445Tyr Asn Gly Gly Asn Leu Ser Ser Glu Ser Ala Arg Ala Cys Phe Lys450 455 460Gln Glu Asp Asp Gln His His Phe Leu Ser Asn Thr Gln Ser Leu Met465 470 475 480Thr Asn Ile Asp His Gln Ser Ser Val Ser Asp Asp Ser Val Thr Val485 490 495Cys Gly Asn Val Val Gly Tyr Gly Gly Tyr Gln Gly Phe Ala Ala Pro500 505 510Val Asn Cys Asp Ala Tyr Ala Ala Ser Glu Phe Asp Tyr Asn Ala Arg515 520 525Asn His Tyr Tyr Phe Ala Gln Gln Gln Gln Thr Gln Gln Ser Pro Gly530 535 540Gly Asp Phe Pro Ala Ala Met Thr Asn Asn Val Gly Ser Asn Met Tyr545 550 555 560Tyr His Gly Glu Gly Gly Gly Glu Val Ala Pro Thr Phe Thr Val Trp565 570 575Asn Asp Asn21052114873212DNA213Brassica napus220221內含子222(1846)..(2298)220221內含子222(2720)..(2952)220221內含子222(3036)..(3160)220221內含子222(3170)..(3314)220221內含子222(3404)..(3553)220221內含子222(3628)..(3797)220221內含子222(3849)..(3961)220221內含子222(4039)..(4148)220221misc_特徵222(1620)..(1622)223起始密碼子220221misc_特徵222(4856)..(4858)223終止密碼子4005atctctccac cgattcgtta cccagtgctt gaaaatatga tgactacgaa tcaattaaat 60ggagaagctc cactgcttgt gtaggtggaa gctcaagcaa caaccggaaa cctcggcgtt 120atcgggagtt agcatcgtta tttgccaaaa tttccgccgc agagatgaaa cgattcaaga 180gaaaccctca aataggttag ccataaaaca gtgaattagt atgatttaag agataagaag 240agaagatgag ttcaagaaaa gaaatactca catctattta tactgtttac acaccgcctt 300tcagatctaa gcaaagcatt gaagatgaat cgtggaggag agttaatagg atttaacaca 360aagccattaa ccaaaccgtt gcaggtcggg agacgaaccg caaaagtcac gcctagccgt 420cgcacgaaga ggagcgatga atttcgtttt ctcgctgcag tcgtattagg gatagacgga 480gctcattatc gttgggccgg aaacacttct aatctcacag cccatgaaca cactaaagaa 540cgaaaccgaa aatgtttgaa gtttaatgaa acgtgcggtt tgccttatgg acacatgtca 600ttacgatatg aaatgattta tctacgtgga tcataggtgt ctctctaagg agagagcaaa 660cctatacttt atataaatag atttgtatca ttctaagagg tgtttaagat ttttgcataa 720atattaaaaa aaaatacaaa tttttatgta attagttttg gttacataaa ataacattaa 780ataaaattaa ttcaaccaat aaaaaaatac ggtattttat aattggtcaa aaataaaaat 840aaaacattaa atttcaccta gaattacgag aatgtcactt attttgaaac aaaatcaaaa 900tctttaaaca tcaattaaac tgatacggat ggagtatata tctttacaga gaacatatat 960atatgttttt cttgtaagcg tccatctctt cttagtcatg tagttcaaat accagctgca 1020gtaaaaccat gaatatttga atttgttgta aaatattcga agcgactact gcacgtttgg 1080aagcaaaacg ccaaacgcaa tcgctcgctc ggtcataggg tcacacatac acatgtgact 1140agcattatgg gtcttaattc aacagcgagt gattttggga tttattatta gttctcgtgt 1200tactctcact ttaacacaaa gtcactaacc ttatttacac atgaagagag gtttgaaagg 1260gcttttgact gattaattat aatgtattaa accaaactag aattaagaga ttaggcattg 1320aattacatta ccaccaccac ccaccattca aaccgaccaa tacatctcca cagttttcaa 1380gtaaaacaac ttttttttgt tgttccttcg gaatttaaat aaatattcgt ttatataaat 1440gcgcatgata tgacgcctcg gaagaaatga aacattatat ctttgacttt tcttctccta 1500gttcatctct cttctttaag accaaaacct ttttctcctc ctcttcatgc atgaacccta 1560actaagttct tcttctttta ccttttacca agaactcgtt agatcactct ctgaactcaa 1620tgaataataa ctggttaggc ttttctctct ctccttatga acaaaatcac catcgtaagg 1680acgtctactc ttccaccacc acaaccgtcg tagatgtcgc cggagagtac tgttacgatc 1740cgaccgctgc ctccgatgag tcttcagcca tccaaacatc gtttccttct ccctttggtg 1800tcgtcgtcga tgctttcacc agagacaaca atagtcactc ccgaggttat tgttttagaa 1860ctacttgttt ttttttgatt tgtttatttg tttagtttcc tcttcttcca atgcgtagaa 1920caaagaccaa tacacacgca cgcatactag ccctattttt tccttgggct tatttatcga 1980tttcatttat tttgagaata tcaatgtgtg gggtttgatg tttgtttgca tatagtaata 2040ctaaaacata tgccagttat acatagattt tttttaaaga tatacatgga tatgaaatga 2100aatttgacat ttcctccttt attcaatatc ataatatgat cacatacatg tgtacctttt 2160gatttgtata tttgtttctt acagttgaag gagagaataa ccaaataccc atttgtatat 2220tatagatcgg tgatgaaaag taaatttaac aaattatgat aatataggcc attaatcttt 2280gatttttttt ctttatagat tgggacatca atggttgtgc atgcaataac atccacaacg 2340atgagcaaga tggaccaaag cttgagaatt tccttggccg caccaccacg atttacaaca 2400ccaacgaaaa cgttggagat ggaagtggaa gtggctgtta tggaggagga gacggtggtg 2460gtggctcact aggactttcg atgataaaga catggctgag aaatcaaccc gtggataatg 2520ttgataatca agaaaatggc aatgctgcaa aaggcctgtc cctctcaatg aactcatcta 2580cttcttgtga taacaacaac gacagcaata acaacgttgt tgcccaaggg aagactattg 2640atgatagcgt tgaagctaca ccgaagaaaa ctattgagag ttttggacag aggacgtcta 2700tataccgcgg tgttacaagg tgcccttcat ttatttaatt aaaatgtgta aaatgtcgct 2760tgaattgtta tcttcttggt aaagtctggg acattgatct aatggctctg ttgcgagagt 2820gctaccgaat ggtccttgat atatagtatc aaagagagat attgttatta tgggcttata 2880tagaataata catatatata tatatataca tggtagctgt tgatgacatg tatgttcgta 2940ttaaatgata aggcatcggt ggacaggaag atatgaggca catttatggg ataatagttg 3000taaaagagaa ggccaaacgc gcaaaggaag acaaggtata tatatattca ttgataattt 3060gatcatattt tcatacacga tttactttca aactaatata ggtttttcga tcattgttca 3120tgtttttatc aaaatttgca cctggtggtt gtcttctcag tttatttggg taagtaattt 3180attataaatt ggacgaagct gtgatgggta aatctaaatt atataatcaa atttgtttat 3240tttttgtgta tacattcatt atataatcaa aatagcgata cgatctacat tcaattgttg 3300tctatatcat gcaggaggtt atgacaaaga agaaaaagca gctagggctt atgatttagc 3360cgcactcaag tattggggaa ccaccactac tactaacttc cccgtaagtc aatcaatgtt 3420gtacaagatt tcataactta gaaccaattt tattcttttt ttataagatg ctattatctt 3480attattaatt gccatgttta tatcgttaca tttattacaa taaaaagtac ttttggtttg 3540atataatatg tagatgagcg aatatgaaaa agaggtagaa gagatgaagc acatgacaag 3600gcaagagtat gttgcctcac tgcgcaggta tataatggaa cttctgatat tattgcatat 3660ggcatctatt attatacatg tatattagta ttttatatat agaacccatc acgctcacgt 3720ttatatttaa aaatatgtcc gtattcacgt cagattatca gcatacacct atatataata 3780gacattaaaa tatgcaggaa aagtagtggt ttctctcgtg gtgcatcgat ttatcgtgga 3840gtaacaaggt attcatacag agagaacgaa tcctattttg ttacgtacat atatatataa 3900aaatataatt ataagatatc acattttata ttatgaatat ttcttctaat gggtccaaaa 3960gacatcacca acatggaaga tggcaagcta ggataggaag agtcgccggt aacaaagacc 4020tctacttggg aacttttggt acgtttagtc ttctcttact aaacttcaca atcaaatcta 4080taacaaaaga tatcaactaa aaactacaac atatatctaa gtaagctgta catatattat 4140atatgaaggc acacaagaag aagctgcaga ggcatacgac attgcggcca tcaaattcag 4200aggattaacc gcagtgacta acttcgacat gaacagatac aacgttaaag caatcctcga 4260aagccctagt cttcctattg gtagcgccgc aaaacgtctc aaggaggcta accgtccggt 4320tccaagtatg atgatgatca gtaataacgt ttcagagagt gagaatagtg ctagcggttg 4380gcaaaacgct gcggttcagc atcatcaggg agtagatttg agcttattgc accaacatca 4440agagaggtac aatggttatt attacaatgg aggaaacttg tcttcggaga gtgctagggc 4500ttgtttcaaa caagaggatg atcaacacca tttcttgagc aacacgcaga gcctcatgac 4560taatatcgat catcaaagtt ctgtttcgga tgattcggtt actgtttgtg gaaatgttgt 4620tggttatggt ggttatcaag gatttgcagc cccggttaac tgcgatgcct acgctgctag 4680tgagtttgat tataacgcaa gaaaccatta ttactttgct cagcagcagc agacccagca 4740gtcgccaggt ggagattttc ccgcggcaat gacgaataat gttggctcta atatgtatta 4800ccatggggaa ggtggtggag aagttgctcc aacatttaca gtttggaacg acaattagaa 4860aaaatagtta aag487321062115151212DNA213Arabidopsis thaliana220221內含子222(2249)..(2578)220221內含子222(2994)..(3220)220221內含子222(3304)..(3420)220221內含子222(3429)..(3521)220221內含子222(3611)..(3770)220221內含子222(3845)..(3969)220221內含子222(4020)..(4151)220221內含子222(4229)..(4310)220221misc_特徵222(2026)..(2028)223起始密碼子220221misc_特徵222(5033)..(5035)223終止密碼子4006tctcaaactc atccatctga ttttaataac agttttttct tctttttctt ttgttgtttt 60ttaccacttt tctttctttt tctcattttc tacttacttc cagatttttc attttcctat 120ttttggtcac acgctcttgt cagttgtaga tatcttcatc tacaggtgtt tccttttatt 180ttcagatgga atctcaatct acaggtgttt ctcacttcaa taaattacgg cccccaaaaa 240atttagtttt tgtatttaca agaaacatag cataatatga tacatatggt tttgaagtac 300tgttttttac acaaaacttt gattataaaa cctcagccgt tctttcgtat ttagaattta 360aacgcatgca atgaagtcat tcgtgaatga tatataaata gtttgtttat ttgttatata 420tcgtcccgcc ccggatcaaa acctaaagta agtgaataaa attttctttt gtagagataa 480gaaaatttgt accgcgtatc gaaaatgtaa aacctatttt aatttctaga tctactaatt 540gggtttgagg tattgaaata attgggtacc aaaggtttgg ggtactatat ataaaaagca 600gataagaaca aattgttagg aaaaaataat atgattttgt aggtaccgag gcaattctag 660aacgtgtgtt ggtggtgtgt tagatattgc aggcataata atggaagaag tgaaattata 720ttacaattaa ataggaagac gagaatccat tgaatcatat cttaccagtc caaacttttt 780ttaagtatat aaatctttga aagagtataa acccatgcac atgcccactt tcgtctcatt 840gatccatgtg tataccctat agtttcctcc ctaattactc taattcccct aaatcatttt 900ttaatttgat acaattagtc ggataagctc aaactacttt actattggtg cttagcatgt 960acagtacata tctagcatcc gaaccctact agccatccac atcttatgta cataattatg 1020actgttttaa gtactttttt actttcgttt acaatgtttg tttgaaaatt tgaggcgttt 1080tttactggtt gaactgtagc cactaagaca ctaagacttc aaaattcaaa taggaaaatc 1140tatactttta caatatcttt gcatgtcaaa ttatttttaa cgtggttata cattttgcct 1200aagatttaga gtacattcat aataacaaca ataaaatatt tctatatata gtaggtttag 1260tgaagttact atatgagata gttcatcgca ttgatcacgt ctgatgcgaa tcacatatcc 1320tatatctagt tgaacatatg tttcgtggaa gacaggaacc atctcttaga cccgcacttc 1380aaaatatcac aaaacacgaa accatgaatc ttttgagttt gttaaaaaat actaaaagtg 1440acgagttcgc gtttggaaaa aatgccaaac taaatcgctg gctcgtgtca tacgttcaca 1500catacacatg tctctaagag acacagcatc attggtctta aatcgacaac gagtgagttt 1560ttggactttt acctattggt cctcgacatg tttacccatt tttgtcattt acatttaaca 1620ttttatacgc atgaagagag agagacagaa agcagagatt tgaaatggtt tttgactgat 1680taattaaagt gtcatcaaaa caaattggga ttacgagatt atccagttga aacgacatta 1740ctacccctac ccttcaaacc gaccaataca tctccacatt tttcaagtaa atattttttc 1800tttctgaatt taattgcaaa attctctaaa tgcgcataat atgtcgcctc ggaagaaatg 1860aacattatat ttttgacttt tcttcttctt cttcctcttc tctcttcatt taacaccaaa 1920acctttttct ttctcctctt catgcatgaa ccctaactaa gttctttttc ctattcttct 1980tctctcatct atcacaagga gtagttagaa tattatatga actcgatgaa taactggtta 2040ggcttctctc tctctcctca tgatcaaaat catcaccgta cggatgttga ctcctccacc 2100accagaaccg ccgtagatgt tgccggaggg tactgttttg atctggccgc tccctccgat 2160gaatcttctg ccgttcaaac atcttttctt tctcctttcg gtgtcaccct cgaagctttc 2220accagagaca ataatagtca ctcccgaggt ttgtgtttta aaaatattta ttttatcttt 2280gtttttgtta ttttttcccc ttcttccaat gcatagaaca aagaccaaga ctcacgcacg 2340tagccctatt tttgtttttc attgtttatc gatttcatct cttttgagaa tttccatgag 2400tggggtttag tgtttgttca catgatcaca tctcatgaat ttaaacttag taaaacatga 2460aactagacat ttattttgta cccttttatc cttataaaat gaaaattcca tttcgtatat 2520tatagatcgg tgatgaatca aacccaacgt tggggatcgc tttgtttttt gtctatagat 2580tgggacatca atggtggtgc atgcaataca ttaaccaata acgaacaaaa tggaccaaag 2640cttgagaatt tcctcggccg caccaccacg atttacaata ccaacgagac cgttgtagat 2700ggaaatggcg attgtggagg aggagacggt ggtggtggcg gctcactagg cctttcgatg 2760ataaaaacat ggctgagtaa tcattcggtt gctaatgcta atcatcaaga caatggtaac 2820ggtgcacgag gcttgtccct ctctatgaat tcatctacta gtgatagcaa caactacaac 2880aacaatgatg atgtcgtcca agagaagact attgttgatg tcgtagaaac tacaccgaag 2940aaaactattg agagttttgg acaaaggacg tctatatacc gcggtgttac aaggttaatt 3000tcattgatct atgtatattt ttattgtgct taaattgtga ttttcttggt attgtttggg 3060acattctaat ggttcggttg agagagagtg caacggaatg tctctcaatg tatattaaag 3120agaaacatta attagtgtac atgggtttat atatacaata atacgtcata tatatggtat 3180gctcttgatc atagtatata atgtttgaat ttaatgtcag gcatcggtgg acaggtagat 3240acgaggcaca tttatgggac aatagttgca aaagagaagg ccagactcgc aaaggaagac 3300aaggtactat atatataaag ctaatttttt aattttcatt taccatttat tttcaaacta 3360atttaggttt tcttttcatg tgtttcatca aaatttgcac ctgatggctc tcttttcagt 3420ttatctgggt aagttcttga ttttaagcta taaattaata atagatgact attaaatcta 3480ttctaagcaa aatataattg ttgtgttatc tgatcctaca ggaggttatg acaaagaaga 3540aaaagcagct agggcttacg atttagccgc actaaagtat tggggaccca ccactactac 3600taacttcccc gtatgttaat taatcaataa tatatacata aattcctaac ttctaaccaa 3660ttttagtctg aataatgcca atctcttaaa ctagtattat cttactatta actgtcatgt 3720ttatattgtt acaataaaaa ttagtaatgt tggttggata taatattcag ttgagtgaat 3780atgagaaaga ggtagaagag atgaagcaca tgacgaggca agagtatgtt gcctctctgc 3840gcaggtacag aatgaaactc ttgaatttat tgcattttag aaacccatca cgtatatatt 3900tattaaaata tatcgtaaca ttgaataaat cattatttgg aaagatataa gaaacatgta 3960aatatgcagg aaaagtagtg gtttctctcg tggtgcatcg atttatcgag gagtaacaag 4020gtacgtataa tccatctaga tatggaacga atactagtgt ttcattattt tttttgatgt 4080atacataata attgtcatac aatactatta atctaatcta attaatattt cctttaaaat 4140ggttccaaaa ggcatcacca acatggaagg tggcaagcta ggatcggaag agtcgccggt 4200aacaaagacc tctacttggg aactttcggt acattttcca ataaaatcta tatactataa 4260gatattaaat atacacaaat atatctaagt gaatcataca aattatgtag gcacacagga 4320agaggctgct gaggcttatg acattgcagc cattaaattc agaggattaa gcgcagtgac 4380taacttcgac atgaacagat acaatgttaa agcaatcctc gagagcccga gtctacctat 4440tggtagttct gcgaaacgtc tcaaggacgt taacaatccg gttccagcta tgatgattag 4500taataacgtt tcagagagtg caaataatgt tagcggttgg caaaacactg cgtttcagca 4560tcatcaggga atggatttga gcttattgca gcaacagcag gagaggtacg ttggttatta 4620caatggagga aacttgtcta ccgagagtac tagggtttgt ttcaaacaag aggaggaaca 4680acaacacttc ttgagaaact cgccgagtca catgactaat gttgatcatc atagctcgac 4740ctctgatgat tctgttaccg tttgtggaaa tgttgttagt tatggtggtt atcaaggatt 4800cgcaatccct gttggaacat cggttaatta cgatcccttt actgctgctg agattgctta 4860caacgcaaga aatcattatt actatgctca gcatcagcaa caacagcaga ttcagcagtc 4920gccgggagga gattttccgg tggcgatttc gaataaccat agctctaaca tgtactttca 4980cggggaaggt ggtggagaag gggctccaac gttttcagtt tggaacgaca cttagaaaaa 5040taagtaaaag atcttttagt tgtttgcttt gtatgttgcg aacagtttga ttctgttttt 5100ctttttcctt tttttgggta attttcttat aacttttttc atagtttcga t 51512107211581212PRT213Arabidopsis thaliana4007Met Asn Asn Trp Leu Gly Phe Ser Leu Ser Pro His Asp Gln Asn His1 5 10 15His Arg Thr Asp Val Asp Ser Ser Thr Thr Arg Thr Ala Val Asp Val20 25 30Ala Gly Gly Tyr Cys Phe Asp Leu Ala Ala Pro Ser Asp Glu Ser Ser35 40 45Ala Val Gln Thr Ser Phe Leu Ser Pro Phe Gly Val Thr Leu Glu Ala50 55 60Phe Thr Arg Asp Asn Asn Ser His Ser Arg Asp Trp Asp Ile Asn Gly65 70 75 80Gly Ala Cys Asn Thr Leu Thr Asn Asn Glu Gln Asn Gly Pro Lys Leu85 90 95Glu Asn Phe Leu Gly Arg Thr Thr Thr Ile Tyr Asn Thr Asn Glu Thr100 105 110Val Val Asp Gly Asn Gly Asp Cys Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly115 120 125Gly Ser Leu Gly Leu Ser Met Ile Lys Thr Trp Leu Ser Asn His Ser130 135 140Val Ala Asn Ala Asn His Gln Asp Asn Gly Asn Gly Ala Arg Gly Leu145 150 155 160Ser Leu Ser Met Asn Ser Ser Thr Ser Asp Ser Asn Asn Tyr Asn Asn165 170 175Asn Asp Asp Val Val Gln Glu Lys Thr Ile Val Asp Val Val Glu Thr180 185 190Thr Pro Lys Lys Thr Ile Glu Ser Phe Gly Gln Arg Thr Ser Ile Tyr195 200 205Arg Gly Val Thr Arg His Arg Trp Thr Gly Arg Tyr Glu Ala His Leu210 215 220Trp Asp Asn Ser Cys Lys Arg Glu Gly Gln Thr Arg Lys Gly Arg Gln225 230 235 240Val Tyr Leu Gly Gly Tyr Asp Lys Glu Glu Lys Ala Ala Arg Ala Tyr245 250 255Asp Leu Ala Ala Leu Lys Tyr Trp Gly Pro Thr Thr Thr Thr Asn Phe260 265 270Pro Leu Ser Glu Tyr Glu Lys Glu Val Glu Glu Met Lys His Met Thr275 280 285Arg Gln Glu Tyr Val Ala Ser Leu Arg Arg Lys Ser Ser Gly Phe Ser290 295 300Arg Gly Ala Ser Ile Tyr Arg Gly Val Thr Arg His His Gln His Gly305 310 315 320Arg Trp Gln Ala Arg Ile Gly Arg Val Ala Gly Asn Lys Asp Leu Tyr325 330 335Leu Gly Thr Phe Gly Thr Gln Glu Glu Ala Ala Glu Ala Tyr Asp Ile340 345 350Ala Ala Ile Lys Phe Arg Gly Leu Ser Ala Val Thr Asn Phe Asp Met355 360 365Asn Arg Tyr Asn Val Lys Ala Ile Leu Glu Ser Pro Ser Leu Pro Ile370 375 380Gly Ser Ser Ala Lys Arg Leu Lys Asp Val Asn Asn Pro Val Pro Ala385 390 395 400Met Met Ile Ser Asn Asn Val Ser Glu Ser Ala Asn Asn Val Ser Gly405 410 415Trp Gln Asn Thr Ala Phe Gln His His Gln Gly Met Asp Leu Ser Leu420 425 430Leu Gln Gln Gln Gln Glu Arg Tyr Val Gly Tyr Tyr Asn Gly Gly Asn435 440 445Leu Ser Thr Glu Ser Thr Arg Val Cys Phe Lys Gln Glu Glu Glu Gln450 455 460Gln His Phe Leu Arg Asn Ser Pro Ser His Met Thr Asn Val Asp His465 470 475 480His Ser Ser Thr Ser Asp Asp Ser Val Thr Val Cys Gly Asn Val Val
485 490 495Ser Tyr Gly Gly Tyr Gln Gly Phe Ala Ile Pro Val Gly Thr Ser Val500 505 510Asn Tyr Asp Pro Phe Thr Ala Ala Glu Ile Ala Tyr Asn Ala Arg Asn515 520 525His Tyr Tyr Tyr Ala Gln His Gln Gln Gln Gln Gln Ile Gln Gln Ser530 535 540Pro Gly Gly Asp Phe Pro Val Ala Ile Ser Asn Asn His Ser Ser Asn545 550 555 560Met Tyr Phe His Gly Glu Gly Gly Gly Glu Gly Ala Pro Thr Phe Ser565 570 575Val Trp Asn Asp Thr580210821130212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4008gaggcagcgg tcggatcgta acagtactct 30210921130212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4009cataaggaga gagagaaaag cctaaccagt 302101021119212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物40010accaagaact cgttagatc192101121120212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物40011aacgcatata actaaagatc 202101221126212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物40012ccatggatcc agagacgaag cgaaac262101321126212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物40013actccatgga taataactgg ttaggc 262101421126212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物40014aaattctcaa gctttggtcc atcttg2權利要求
1.一種分離的DNA分子，其包含在中等或嚴格雜交條件下與選自除AP2結構域重複1-接頭-AP2結構域重複2區域之外的SEQID NO1，3和5或其片段或衍生物的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
2.權利要求1的分離的DNA分子，其中所述的分離的DNA分子包含選自SEQ ID NO1，3和5的核苷酸序列的至少27個連續核苷酸。
3.權利要求1的分離的DNA分子，其中所述的分離的DNA分子包含與選自SEQ ID NO1，3和5的核苷酸序列或其片段或衍生物的同源性至少為70％的核苷酸序列。
4.一種分離的DNA分子，其包含一編碼蛋白質的核酸序列，其中所述蛋白質當以足夠水平存在於植物細胞中時使所述細胞胚胎發生，或增加所述植物細胞的再生能力，或者同時使所述植物細胞胚胎發生並增加所述植物細胞的再生能力，所述分離的DNA分子與選自SEQ ID NO1，3和5的核苷酸序列或其片段或衍生物有至少70％的同源性。
5.權利要求4的分離的DNA分子，其包含在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO5的核苷酸1620-4873或其片段或衍生物雜交的核苷酸序列。
6.權利要求4的DNA分子，其包含在中等或嚴格條件下與SEQID NO1的核苷酸序列或其片段或衍生物雜交的核苷酸序列。
7.權利要求4的DNA分子，其包含在中等或嚴格條件下與SEQID NO3的核苷酸序列或其片段或衍生物雜交的核苷酸序列。
8.權利要求6的DNA分子，其中所述DNA編碼由SEQ ID NO2定義的蛋白質。
9.權利要求7的DNA分子，其中所述DNA編碼由SEQ ID NO4定義的蛋白質。
10.一種包含權利要求1-9任一項的分離的DNA分子的載體，其中所述分離的DNA分子由指導所述DNA在植物細胞中表達的調控元件控制。
11.權利要求10的載體，其中所述調控元件是一種組成型調控元件。
12.權利要求10的載體，其中所述調控元件是一種誘導型調控元件。
13.權利要求10的載體，其中所述調控元件是一種組織特異性調控元件。
14.權利要求10的載體，其中所述調控元件是一種發育活性的調控元件。
15.包含權利要求10-14任一項的載體的轉化的植物細胞。
16.包含權利要求10-14任一項的載體的轉化的植物。
17.得自權利要求16的轉化的植物的種子。
18.一種由權利要求4-9任一項的分離的DNA分子編碼的分離的蛋白質。
19.產生無性衍生胚的方法，包括i)用權利要求10-14任一項的載體轉化植物細胞；ii)培養所述植物細胞產生轉化的組織；iii)選擇存在所述分離的DNA分子的所述轉化組織；和iv)分析所述轉化的植物中的無性胚產生。
20.權利要求19的方法，其中分析步驟涉及分析不定胚生殖。
21.權利要求19的方法，其中分析步驟涉及分析體細胞胚。
22.權利要求19的方法，其中分析步驟涉及分析配子體胚。
23.權利要求19的方法，其中分析步驟涉及分析胚囊中單倍體孤雌生殖。
24.權利要求19的方法，其中分析步驟涉及分析倍數孢子形成。
25.修飾植物再生能力的方法，包括i)用權利要求10-14任一項的載體轉化植物細胞；ii)培養所述植物細胞產生轉化的組織；iii)分析所述轉化的植物組織與野生型組織相比再生作用的增強。
26.權利要求25的方法，其中培養所述轉化的植物細胞的步驟，或者分析所述轉化的植物組織的步驟，或者培養所述轉化的植物細胞的步驟和分析所述轉化的植物組織的步驟在不存在生長調節劑的情況下進行。
27.選擇轉化的植物的方法，包括i)用權利要求10-14任一項的載體轉化正常條件下非再生的植物；ii)確定所述轉化的植物是否能在所述正常條件下非再生的植物不再生的條件下再生。
28.權利要求1的分離的DNA分子，其包含與SEQ ID NO5的核苷酸1-1619或其片段有至少約70％相似性的DNA序列。
29.權利要求1的分離的DNA分子，其包含SEQ ID NO5的核苷酸1-1619內的至少22個連續核苷酸。
30.包含與感興趣的基因可操縱相連的權利要求28或29的分離的DNA分子的載體，其中所述分離的DNA分子指導所述感興趣基因在植物細胞中的表達。
31.權利要求30的載體，其中所述感興趣的基因與所述分離的DNA分子是異源的。
32.權利要求31的載體，其中所述的感興趣的基因選自藥物活性蛋白、抗體、工業酶、蛋白補劑、營養藥、貯藏蛋白、動物飼料和動物飼料補劑。
33.包含權利要求30、31或32的載體的轉化的植物細胞。
34.包含權利要求30、31或32的載體的轉化的植物。
35.得自權利要求34的轉化的植物的種子。
36.指導感興趣的基因在植物的發育胚中表達的方法，包括用權利要求30、31或32的載體轉化所述植物。
37.權利要求4、5、6或7任一項的核苷酸序列作為選擇標記的用途。
38.一種產生無性衍生胚的方法，包括i)用權利要求10-14任一項的載體瞬時轉化植物細胞，或將權利要求18的蛋白質導入所述植物細胞，以產生修飾的植物細胞；ii)培養所述修飾的植物細胞以產生組織；和iii)分析所述組織中的無性胚形成。
39.權利要求38的方法，其中分析步驟涉及分析不定胚生殖。
40.權利要求38的方法，其中分析步驟涉及分析體細胞胚。
41.權利要求38的方法，其中分析步驟涉及分析配子體胚。
42.權利要求38的方法，其中分析步驟涉及分析胚囊的單倍體孤雌生殖。
43.權利要求38的方法，其中分析步驟涉及分析倍數孢子形成。
44.修飾植物的再生能力的方法，包括i)用權利要求10-14任一項的載體瞬時轉化植物細胞，或將權利要求18的蛋白質導入所述植物細胞，以產生修飾的植物細胞；ii)培養所述修飾的植物細胞以產生組織；和iii)分析所述組織與野生型組織相比再生作用的增強。
45.權利要求44的方法，其中培養所述修飾的植物細胞的步驟，或者分析所述組織的步驟，或者培養所述修飾的植物細胞的步驟和分析所述組織的步驟在不存在生長調節劑的情況下進行。
46.產生無融合生殖植物的方法，包括i)用權利要求10-14任一項的載體轉化植物以產生轉化的植物；ii)選擇存在所述分離的DNA分子的所述轉化的植物；和iii)分析所述轉化的植物中無性胚的產生。
47.權利要求46的方法，其中分析步驟涉及分析不定胚生殖。
48.權利要求46的方法，其中分析步驟涉及分析體細胞胚。
49.權利要求46的方法，其中分析步驟涉及分析配子體胚。
50.權利要求46的方法，其中分析步驟涉及分析胚囊的孤雌生殖。
51.修飾植物的再生能力的方法，包括i)用權利要求10-14任一項的載體瞬時轉化植物細胞，或將權利要求18的蛋白質導入所述植物細胞；ii)培養所述植物細胞形成組織；和iii)分析所述組織與野生型組織相比再生作用的增強。
52.權利要求51的方法，其中培養所述植物細胞的步驟，或者分析所述組織的步驟，或者培養所述植物細胞的步驟和分析所述組織的步驟在不存在生長調節劑的情況下進行。
53.選擇修飾的植物的方法，包括i)用權利要求10-14任一項的載體瞬時轉化正常條件下非再生的植物，或將權利要求18的蛋白質導入所述正常條件下非再生的植物，以產生所述修飾的植物；和ii)確定所述修飾的植物是否能在所述正常條件下非再生的植物不再生的條件下再生。
54.一種分離的DNA分子，其包含編碼由兩個AP2 DNA結合結構域組成的蛋白質的序列，當所述蛋白質以足夠水平在植物細胞中表達時其能使所述細胞胚胎發生，或增加所述植物細胞的再生能力，或使所述細胞胚胎發生並增加所述植物細胞的再生能力。
55.生產感興趣的蛋白質的方法，包括i)用至少一種載體轉化植物以產生轉化的植物，所述至少一種載體選擇權利要求10-14任一項的載體；ii)選擇存在所述分離的DNA分子的所述轉化的植物；和iii)培養所述轉化的植物以生產所述感興趣的蛋白質，其中所述感興趣的蛋白質的表達由所述分離的DNA的表達產物誘導。
56.權利要求55的方法，其中所述轉化的植物用第二種載體轉化，該載體包含在調控元件控制下的編碼所述感興趣的蛋白質的核苷酸序列，所述調控元件由所述分離的DNA的表達產物誘導。
57.權利要求55的方法，其中所述感興趣的蛋白質是一天然蛋白。
58.權利要求55或56的方法，其中所述感興趣的蛋白質選自藥物活性蛋白、抗體、工業酶、蛋白補劑、營養藥、貯藏蛋白、涉及油生物合成的酶、動物飼料和動物飼料補劑。
59.權利要求4-7任一項的分離的DNA分子，其中所述的分離的DNA分子編碼與SEQ ID NO2的胺基酸至少70％相似的蛋白質。
60.權利要求4-7任一項的分離的DNA分子，其中所述的分離的DNA分子編碼與SEQ ID NO4的胺基酸至少70％相似的蛋白質。
61.權利要求18的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質包含SEQ IDNO2的胺基酸序列的約30-541個胺基酸。
62.權利要求18的分離的蛋白質，其中所述的蛋白質包含SEQ IDNO4的胺基酸序列的約30-561個胺基酸。
63.一種分離的DNA分子，其包含在嚴格條件下與除AP2結構域重複1-接頭-AP2結構域重複2區域外的SEQ ID NO6雜交的核苷酸序列。
64.權利要求4的分離的DNA分子，其包含在中等或嚴格條件下與SEQ ID NO6的核苷酸1620-4873或其片段或衍生物雜交的核苷酸序列。
65.權利要求64的分離的DNA分子，其中所述DNA編碼SEQ IDNO7的蛋白質。
66.包含權利要求63-65任一項的分離的DNA分子的載體，其中所述分離的DNA分子在指導所述DNA在植物細胞中的表達的調控元件的控制下。
67.權利要求66的載體，其中所述調控元件是一種組成型調控元件。
68.權利要求66的載體，其中所述調控元件是一種誘導型調控元件。
69.權利要求66的載體，其中所述調控元件是一種組織特異性調控元件。
70.權利要求66的載體，其中所述調控元件是一種發育活性的調控元件。
71.包含權利要求66-70任一項的載體的轉化的植物細胞。
72.包含權利要求66-70任一項的載體的轉化的植物。
73.得自權利要求72的轉化的植物的種子。
74.一種由權利要求65的分離的DNA分子編碼的分離的蛋白質。
全文摘要
本發明提供了在誘導小孢子胚胎發育過程中獲得的基因,由此基因編碼的蛋白質使植物細胞進行胚胎發生,並增加植物細胞的繁殖能力。本發明還公開了這一基因的調控區,及其用於指導感興趣的基因在合適宿主細胞中表達的用途。
文檔編號C12N15/09GK1367831SQ00811196
公開日2002年9月4日 申請日期2000年6月2日 優先權日1999年6月2日
發明者基姆·布萊利耶, 泰蕾茲·韋萊, 揚·屈斯泰, 服部次郎, 布賴恩·米基, 米希爾·范盧克倫康帕涅 申請人:植物研究國際公司, 由加拿大農業及農產品部代表的對加拿大行使權力的女王陛下