用玻璃覆蓋的生物學試劑的製備的製作方法

2023-05-01 08:10:11 1

專利名稱：：用玻璃覆蓋的生物學試劑的製備的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物學材料和試劑以玻璃狀、多孔狀態長期貯存。特別地，其涉及使用多孔板製備這些材料和試劑和其貯存的方法。
背景技術：
：少數生物學活性材料足夠穩定，從而它們可在室溫下進行分離、純化且然後在溶液中貯存。一般地，將生物學試劑貯存在保持在4。C、-20。C或-7CTC的甘油溶液中。可將它們散裝(mbulk)貯存，然後在使用前與其他試劑組合。在製備用於生物學樣品的便利和有效的測試的試劑中，經常重要的是獲得均勻、預估量(discreetamount)的乾燥的化學摻合物。用於穩定生物學試劑的載體或填充物的一種類型是形成玻璃的填充材料。將生物學試劑溶液併入形成玻璃的填充材料(所述材料是水溶性或水溶脹性物質)。然後將它們乾燥以產生固定和穩定生物學試劑的玻璃狀組合物。關於用於穩定生物學試劑的形成玻璃的填充材料參見US5,098,893、US5,200,399和US5,240,843。碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖或麥芽三糖是重要的形成玻璃的物質組。可使用其他多羥基化合物例如碳水化合物衍生物如山梨糖醇和經化學修飾的碳水化合物。另一類重要的形成玻璃的物質是合成的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醯胺或聚乙烯亞胺。形成玻璃的物質的另外的實例包括糖類共聚物例如由GEHealthcare在註冊商標FIC0L1JM下銷售的那些糖類共聚物。FICOLL具有5,000至1,000,000的分子量且包含通過醚橋鍵與雙功能基團連接的蔗糖殘基(US3,300,474)。此種基團可以是2、3或更多個碳原子但通常不超過10個碳原子的亞烷基。雙功能基團用於將糖殘基連接在一起。此種聚合物可以例如通過糖與卣代醇或雙環氧(bis-epoxy)化合物的反應來製備。碳水化合物聚合物的玻璃狀基質中的經穩定的生物學材料可以通過冷凍乾燥(Treml等人US5,593,824;Franks和HatleyUS5,098,893)或通過真空乾燥(Walker等人US5,565,318)來製備。這些水溶性試劑方便地用於複雜的分子生物學應用。該方法具體用於由以單次使用的等分試樣分配的酶、核苷酸和其他組分組成的試劑系統。玻璃狀基質的重建遞送用於應用(包括DNA擴增和DNA測序)的經緩沖的酶。目前在市場上存在許多乾燥的分子生物學產品。然而，這些產品中的一些通過相當麻煩且包括大量的手工勞動的方法來製備。其他產品當乾燥時需要冷凍。存在對用於產生環境溫度乾燥的試劑的改進方法的需要。發明概述在本發明的第一方面，提供了產生乾燥的試劑製劑的方法。該方法包括步驟提供至少一種經緩衝的生物學試劑的水溶液；將形成玻璃的填充材料與經緩衝的試劑溶液混合來形成其中填充材料的濃度足以促進玻璃狀多孔組合物形成的混合物；將預先確定量的混合物分配入多孔容器的孔；將容器中的混合物乾燥以形成乾燥的試劑製劑；其中所述試劑製劑是水溶性的且具有對於室溫穩定性是足夠的Tg。混合物優選是均一的溶液。在本發明的一個實施方案中，將乾燥的試劑製劑收集入試劑瓶中以用於延長的室溫貯存。在本發明的另一個實施方案中，將乾燥的試劑貯存於多孔容器中以進行延長的貯存，用密封帶密封容器的頂部。任選地，密封帶是熱激活的。根據本發明的多孔容器可以是二氧化矽塑模(silicamould)或聚苯乙烯板。當多孔容器是聚苯乙烯板時，本發明還包括在凍幹前將聚苯乙烯板置於金屬塑模上，從而各聚苯乙烯板孔的外壁與所述金屬塑模的孔緊密接觸以進行有效的熱傳遞。我們發現這改進了乾燥方法且產生了具有提高的完整性的乾燥的試劑。在本發明的另一個方面，本發明提供了根據上述方法製備的乾燥的生物學試劑組合物。根據本發明製備的試劑組合物是水溶性的且具有對於持室溫穩定性是足夠的Tg。優選地，試劑組合物具有結構完整性。生物學試劑組合物能夠在短於1分鐘，優選30秒內完全溶解在25)il水溶液中。試劑組合物優選具有低於10%的含溼量。試劑組合物可具有至少一種當於室溫下在水溶液中單獨存在時不穩定的試劑。試劑組合物還可包含多種當在室溫下於水溶液中存在時相互之間可以反應或可以不反應的試劑。因此，本發明的目的和優點是提供乾燥的生物學試劑組合物和產生所述組合物的方法。根據下列描述，本發明的這些和其他目的以及優點將變得顯而易見。然而，該描述僅僅是優選實施方案。因此，應當依賴權利要求來估計本發明的整個範圍。附圖描述圖1顯示用於按照本發明的實施方案製備乾燥的試劑製劑的方法的方法工作流程。圖2顯示，從左上角開始用於按照本發明的實施方案製備乾燥的試劑製劑的方法的384孔聚苯乙烯板；右上角顯示具有l千萬拷貝至1000拷貝的起始濃度的不同量的入DNA作為模板的標準曲線，包括無模板對照；左下角從384孔聚苯乙烯板製備的貯存在塑料瓶中的乾燥的試劑製劑餅/立方塊(cube);右下角顯示乾燥的試劑製劑成功地用於XDNA實時qPCR擴增反應的擴增圖。圖3顯示，從左上角開始用於按照本發明的實施方案製備千燥的試劑製劑的方法的96孔二氧化矽塑模；右上角顯示具有1千萬個拷貝至1000個拷貝的起始濃度的不同量的XDNA作為模板的標準曲線，包括無模板的對照；左下角從96孔二氧化矽塑模製備的貯存在塑料瓶中的乾燥的試劑片劑；右下角顯示乾燥的試劑製劑成功地用於XDNA實時qPCR擴增反應的擴增圖。圖4顯示包含PCR製劑的96孑LPCR板在凍幹前進入金屬支架(metalholder)。圖5顯示不同形式的按照本發明的的實施方案製備的室溫穩定的PCR試劑。左上角瓶中的乾燥的PCR混合物。右上角96孔板中的乾燥的PCR混合物。左下角384孔板中的乾燥的PCR混合物。右下角96孔穿孔板(perforatedplate)中的乾燥的PCR混合物。圖6顯示按照本發明的實施方案製備的乾燥的PCR試劑的穩定性。乾燥的PCR混合物用於XDNA的qPCR。對於(l)'溼'製劑珠混合物(左上方)、(2)使用當前規程製備的乾燥的餅(右上方)和(3)來自GEHealthcare的puRetaqReady-To-Go(RTG)PCR珠(左下方)，注意到相似的性能。右下方一式三份進行的上述三個反應的Ct值和PCR效率。新形式和pureTaq珠的Ct值和PCR效率值是相當的。圖7顯示按照本發明的實施方案製備的乾燥的PCR試劑的穩定性。將乾燥的PCR混合物於4(TC和室溫(RT)下貯存8天。將乾燥的試劑用於XDNA的qPCR，具有相似的性能。左上角於RT下貯存的乾燥的PCR試劑餅(reagentcake)。右上角於4CTC下貯存的乾燥的PCR試劑餅。左下角於RT下貯存的puReTaq珠(GEHealthcare)。右下角於4(TC下貯存的puReTaq珠。圖8顯示一式兩份進行的上述四個反應的Ct值和PCR效率。當前形式和pureTaq珠的Ct值和PCR效率值在40。C和室溫下是相當的。圖9顯示按照本發明的一個實施例的實時PCR反應的結果。左上圖使用凍幹的試劑包括TaqMan引物和探針的實時PCR。左下圖凍幹的試劑對照(TaqMan引物和探針未凍幹，其他試劑如實施例1中一樣進行凍幹)。右上圖商業puReTaqRTG珠對照(所有其他試劑未進行凍時，^有等量的模板DNA:的反應落在標準曲線上(右下圖:；"X，，表示"未知的")。圖10顯示Phi29DNA聚合酶以凍幹的形式是穩定的。進行使用凍幹的試劑或"溼"混合物進行的全基因組擴增測定。在即使使用已在40。C下貝i存35天的凍幹的試劑的情況下，檢測到強烈的擴增。圖U顯示與常規的"溼"試劑盒(RocheIVT)相比，使用凍幹的IVT試劑(A、B、C)進行的DNA模板的成功轉錄。ntc:無模板對照。發明詳述7生物學試劑許多生物學試劑適合通過本發明的方法來貯存。本發明的生物學試劑組合物特別適合用於進行許多種有益地或必需地對血漿或稀釋的血漿進行的分析程序。分析程序通常需要將血漿與一種或多種試劑球(reagentsphere)組合，從而在血漿中發生可與血漿的特定組分或特徵的測量相關的一些光學上可檢測的變化。優選，血漿將經歷導致可通過常規分光光度計、螢光計、光檢測器等測量的改變的顏色、螢光、發光等的反應或其他變化。在一些情況下，可進行免疫測定和其他特異性結合測定。可對其應用本發明的其他類別的生物學試劑是蛋白質和肽，包括其衍生物例如糖蛋白。此種蛋白質和肽可以是任何酶、轉運蛋白(transportprotein)(例如血紅蛋白、免疫J求蛋白、激素、血液埃是固因子(bloodclottingfactor)和藥理活性蛋白或肽)。可對其應用本發明的另一種類別的生物學試劑包括核苷、核苷酸(例如脫氧核苷酸、核糖核苦酸和雙脫氧核苦酸)、二核苷酸、寡核苦酸和還有酶輔因子，無論這些是否是核苷酸。酶底物通常也是可對其應用本發明的生物學試劑。用於在貯存中穩定的生物學試劑可從天然來源，動物、植物、真菌或細菌分離，或可通過從通過發酵和人工培養生長的細胞產生和從其分離。此種細胞可以是或可以不是遺傳轉化的細胞。本發明的另一個發展是在玻璃試劑球中貯存反應系統的超過一種試劑。這可用於將需要在例如測定或診斷試劑盒中一起使用的材料。在單個玻璃狀製劑中貯存試劑以對於最終的用途方便的形式提供它們。例如，如果測定需要底物或輔因子和酶的組合，那麼可將兩種或所有這三種物質以需要的濃度比貯存在玻璃狀試劑球中和準備好用於測定。如果貯存多種試劑，則可將它們在水性乳劑中混合在一起，然後一起併入玻璃中。備選地，可單個地將它們併入分開的玻璃中，所述分開的玻璃之後^皮混合在一起。當作為單個組合物(其可以是混合在一起的兩種玻璃)貯存多種試劑時，一種或多種試劑可以是蛋白質、肽、核香、核苷酸或酶輔因子。試劑還可能可以是更簡單的種類。例如，標準測定程序可能需要丙酮酸鹽和NADH存在於一起。兩者都可以以可接受的穩定性單獨貯存。然而，當一起置於水溶液中時，它們開始反應。如果以需要的比例一起置於玻璃狀試劑球中時，它們不反應，且玻璃可被貯存。關於反應，我們是指任何生物化學反應。本發明的優選生物學試劑是提供試劑系統以檢測、擴增、修飾或測序核酸的酶和輔因子。此種酶包括但不限於DNA聚合酶(例如克列諾(Klenow))、T7DNA聚合酶或各種熱穩定性DNA聚合酶例如TaqDNA聚合酶；AMV或鼠逆轉錄酶、T4DNA連接酶、T7、T3、SP6RNA聚合酶、p莖菌體Phi29DNA聚合酶和限制性內切酶。輔因子包括核苷酸、寡核普酸、DNA、RNA、對於酶活性必需的鹽(例如鎂、鉀和鈉)以及緩沖能力所需要的鹽。緩衝鹽提供了正確的pH範圍且有助於穩定性。可使用的一些緩衝劑包括TrispH7.6-8.3。可使用根據下文中的實施例1的規程估計任何潛在的生物學試劑。因此，使得合適的生物學試劑在試劑球中穩定，如通過功能性測試如實施例1中的功能性測試所確定的。形成玻璃的填充材料可用於本發明的形成玻璃的填充材料的實例包括碳水化合物例如FICOLLtm、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、松三糖、DEXTRANtm和甘露糖醇；蛋白質例如BSA、明膠和膠原；以及聚合物例如PEG和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。形成玻璃的填充材料優選是FICOLLTM聚合物、BSA、蔗糖、DEXTRAN或其組合。用於本發明的最優選形成玻璃的填充材料是FICOLLtm聚合物。製劑通過迭代法(iterativeprocess)確定生物學試劑、形成玻璃的填充材料和水的高粘性混合物的製劑。首先，人們確定系統希望的終使用濃度。濃度通常以體積摩爾濃度來表示。各生物學試劑可具有不同的配方。第二，將這些濃度轉變成重量/劑量基礎(basis)(對於固體)和體積/劑量基礎(對於液體)。第三，選擇高粘性混合物的百分比固體濃度和希望的混合物體積的初始值。55%的固體濃度已顯示表現良好。高於62%的固體濃度，混合9物太粘以至不能分配。如果乳劑是希望的，低於52%的固體濃度，混合物太稀，且乾燥為透明和硬的。如果半乳劑是希望的，且允許10%的更低限度。關於"％的固體"，我們是指(固體重量乘以100)除以(液體重量+固體重量)。如果允許形成玻璃的材料進入溶液，則混合物將乾燥為硬的和玻璃狀的。因此，希望的混合物是乳劑而非溶液。關於乳劑，我們是指飽和的混合物，從而存在兩相，固相和液相。例如，本發明是生物學試劑/緩衝液中的形成玻璃的填充材料的半乳劑。固體的存在給乳劑提供了不透明至白色。當乾燥時，高粘性乳劑仍然形成玻璃，但可在表面獲得小孔以便水通過，且加速乾燥的試劑製劑的溶解。乳劑應當具有白色。如果其是透明的，其最可能將乾燥為硬的和玻璃狀的，且從而，將是無孔的。關於孔隙度，我們是指乾燥的製劑試劑包含幫助所述製劑溶解的氣泡的袋。優選孔隙度允許製劑在大約2分鐘或更少的時間內溶解。本發明的另一種形式提供了特徵在於為半乳劑的形成玻璃的填充材料和生物學試劑/緩沖液的混合物。關於該混合物，我們是指具有至少一些乳劑性質的混合物。本發明的半乳劑可通過使用上述迭代法使固體濃度達到大約10%至大約50%來形成。然後分配和乾燥半乳劑來形成乾燥的試劑製劑。第四，人們計算可使用來自第二步驟的每劑量形成玻璃的材料的克數可產生的劑量的數目。第五，使用劑量的數目和來自第二步驟的重量/劑量比，人們確定其他組分的重量/體積。最後，使用在第五步驟中確定的重量和體積，人們計算終混合物的百分比固體。如果混合物的終百分比固體在希望的範圍外，則人們使用另一個初始值重複第三至第六步驟直至終值在正確的範圍內。可使用根據上述的迭代法的規程估計任何潛在的形成玻璃的材料。因此，合適的形成玻璃的材料產生了具有可接受的硬度、大小、形狀、Tg、孔隙度、溶解性和穩定性的試劑製劑。多孔容器用於製備乾燥的試劑製劑的多孔容器的實例包括聚苯乙烯板、二氧化矽塑模等。優選，多孔板是具有使得能夠使用用於應用例如PCR的標準熱循環儀的標準尺寸和版面設計的多孔板。通常，多孔容器包括兩個區域，孔區和邊界。邊界可以是任何大小、形狀或厚度，但優選形成具有與標準96孔或384孔商業微量滴定板的外部大小相似的外部大小的多孔平臺，其大小為寬度大約85.5mm乘長度127.75mm。通常，板包括許多排列在網格中的空洞。這些空洞稱為孔且用作個別反應的反應容器，或用於個別樣品的貯存容器。孔將以二維線性陣列排列在多孔平臺上。然而，孔可以以任何類型的陣列例如幾何或非幾何陣列提供。孔的數目可以是在這些範圍內的96的倍數，優選是乘以96的整數的平方。商業板中的孔通常經設計具有標準的間隔。96孔板具有12列和8行，相鄰的孔的中心之間間隔9mm。384孔板具有24列和16行，相鄰的孔的中心之間間隔4.5mm。1536孔板具有48列和32行，相鄰的孔的中心之間間隔為2.25mm。也使用構成上述格式的一半的微量滴定板。還可獲得的是在相鄰的孔的中心之間具有相似間隔的孔帶。具有這些尺寸的多孔容器可與自動機器學(robotics)和儀器例如多孔平臺轉位器(translocator)和讀數器(如它們在本領域內所稱呼的)相容。用於製備多孔平臺的材料將通常為聚合物，因為這些材料使它們適合於大多數製備技術。優選，選擇已知具有低螢光或其他性質的聚合物。材料可以顯著地促進通過本領域內已知的和將來開發的模塑法例如鑲嵌造型或注模法來進行板的製備。聚合物板的備選是96孔和384孔形式的二氧化矽塑模。如下文中的實施例所顯示的，96孔穿孔二氧化矽模塑的板可用於分配和凍幹試劑。此處的優點是在凍幹後應當可容易地從塑模取出乾燥的試劑。混合和分配如下製備一般製劑(與實施例一樣使用DNA標記製劑)在使用前，通常對所使用的所有試劑進行高壓滅菌或過濾滅菌(優選0.25pm的濾器)。製備製劑，且將其在冰上貯存直至分配。對於200ml(足以用於20,000個單劑製劑)DNA標記製劑，將各15g的Ficoll400和Ficoll70和20g;^三糖加入大約90ml無菌水，且在攪拌板上混合直ii至溶解。將50ml20X濃縮DNA標記緩沖液(200mMTrispH7.5、200mMMgCl2、1MNaCl)與10m110mg/mlBSA溶液一起加入。加入各1ml的100mMATP、GTP和TTP。一旦所有試劑存在於溶液中，就將製劑在冰上或在冷凍的條件下貯存直至其用於分配。緊在使用前，加入400Ku克列諾片段DNA聚合酶(原液的最低濃度應當為100Ku/ml以使甘油濃度在終製劑中保持低於1%)。同樣緊在使用前，加入1200A260個單位的d(N)9引物。在向製劑中加入前，引物應當在65。C下加熱7分鐘，且快速在冰上冷卻。在加入酶和引物後，終體積應當使用無菌水調至200ml。終溶液的密度將為1.14g/ml。試劑均一溶液的每分配的劑量的終體積通常小，例如5-30^1，優選10|Lil，以當試劑製劑溶解於工作溶液中時允許產生10-100w的工作體積。將預先確定量的均一溶液分配入多孔容器的各個孔，通常使用液體分配自動裝置(robot)(96孔/384孔針)。以4pl至20|ul,但優選10^tl的體積分配溶液。乾燥方法可通過冷凍乾燥或凍乾乾燥分配的樣品。合適的乾燥程序產生具有可接受的硬度、大小、形狀、Tg、孔隙度、溶解性和穩定性的試劑製劑。一般的成功的冷凍乾燥的概況在下面示於表1中。表1tableseeoriginaldocumentpage13乾燥的優選方法是經由凍幹。分配的試劑在96或384孔聚苯乙烯板中進行了成功的乾燥。令人驚訝地，當將聚苯乙烯薄壁板置於配備的金屬板支架且與其直接接觸時，乾燥方法更好地進行且與在無金屬支架的情況下乾燥的板相比，沒有觀察到乾燥的試劑的泡沫或絮片(圖l和4)。聚苯乙烯孔(管)的外壁與金屬板支架的金屬孔的直接接觸間接地增加了金屬架子的接觸面積，這反過來獲得了至樣品的更好的熱傳遞。在另一方面，對於各孔，二氧化矽塑模具有厚壁和平底，且二氧化矽塑模中的凍幹法在不使用金屬支架的情況下合理地良好進行。這可能歸因於塑模與冷凍乾燥器架子的更好的接觸以及二氧化矽的熱傳遞性質。優選凍幹的概況在下面示於表2中。注意，在進行下列程序前，將樣品在-46。C下於冷凍乾燥器中冷凍1小時。表2tableseeoriginaldocumentpage14加熱後溫度(。C)真空(毫託)時間(分鐘)注釋281002000保持貯存我們成功地在基於聚苯乙烯和二氧化矽的板或塑模中製備了片劑、圓柱體和立方體形式的穩定的生物學試劑。我們的技術允許溫度敏感性蛋白質和核酸分子穩定化成在環境溫度下穩定的單劑形式。單劑形式(珠或餅)可包含預先分配的特異性測定所需的緩沖劑、鹽、去汙劑和核苷酸等，在所述測定中使用所述分子。這些酶和組合可用於許多種分子生物學應用，包括但不限於PCR、RT-PCR、實時PCR、全基因組擴增、體外轉錄和cDNA合成應用。我們的方法消除了對將試劑混合物冷凍滴入液氮中或冷凍滴至冷表面上的需要，然而乾燥的試劑保持良好的結構完整性。方法在製備過程中具有更少的步驟。當正確密封時，乾燥的試劑製劑可直接貯存在板或塑才莫中，且這顯著地減少了製備和包裝成本。備選地，可以作為片劑從二氧化矽塑才莫和作為立方塊從polyfiltronics96孔板取出乾燥的試劑，然後將其貯存在密封的容器即加蓋的瓶子。板或塑模的密封可通過下述實現帽、帶、熱激活帶等。在本發明的一個實施方案中，板的密封通過使用AbGene，sThermo-Seal和Easy-Peel片的熱激活密封來實現。本發明的試劑製劑是室溫穩定的。關於"室溫穩定的"，我們是指製劑可在22。C下貯存超過6個月，其與在笫一次乾燥試劑後測量的活性相比，有少於20%的酶活性丟失。本發明的試劑製劑具有至少l(TC的玻璃化轉變溫度(Tg)。試劑製劑一般的Tg是40。C。至少40。C的Tg將保證在室溫(22。C)下的穩定性。優選Tg是45。C。玻璃化轉變溫度是這樣的溫度，即高於該溫度，玻璃狀材料的粘性快速降低且玻璃狀材料轉變成橡膠，然後轉變成在甚至更高的溫度下轉變成流體的可變形的塑料。玻璃化轉變溫度用作製劑的穩定性的重要指標。在低於Tg的溫度或接近其時，樣品保持為穩定的玻璃。當溫度上升高於Tg時，樣品成為橡膠且較不穩定。Tg使用差示掃描量熱法來進行測量。將2-5mg(l-2個粉碎的球)樣品置於鋁鍋中。通過以10。C/分鐘的速率使樣品經歷從0。C至IO(TC的受控溫度程序來確定樣品的Tg。測量流至樣品和從樣品流出的熱並且將其表示為基線中的變動(shift)。Tg表示為在該基線變動的中點的溫度。一般的孔隙度允許球在1分鐘或更短的時間內溶解在20pl水中。優選孔隙度將允許在30秒或更短的時間內溶解。我們製備用玻璃覆蓋的(glassified)生物學試劑製劑的方法提供了幾個優點。製備方法大大簡化。將試劑混合物直接分配入多孔板的孔，所迷多孔板具有與商業微量滴定板相同的標準版式。這消除了對在液氮中或在冷表面上冷凍試劑滴的需要。然後冷凍分配的混合物，在孔中凍幹，且也可將其貯存在孔中。這消除了對將珠或餅從乾燥鍋轉移至貯存容器的需要。因為可將乾燥的組合物貯存在多孔板中，所以所述組合物可用於自動化的隨後工作流程中。自動機器學系統可用於處理板。此外，製備的組合物在環境溫度下是穩定的。這節省了運輸成本(無乾冰運輸)，消除了對冷藏箱貯存的需要和縮短了試劑製備時間(無融化)。其為隨後的用戶提供了方便。可將大多數測定相關性組分預先分配和穩定入單劑形式。其節省了用戶時間和用於製備試劑的主混合物(mastermix)的塑料消費品成本。其還提供了增加的再現性和可靠性，因為其減少了汙染的危險和誤差。使用預先分配的反應物製備組合物。這使樣品處理和移液步驟減少至最少，從而減少了由用戶產生的汙染的危險和移液誤差。實施例本實施例僅提供用於舉例說明的目的，且不應當解釋為限定由所附權利要求限定的本發明的範圍。在本說明書的下面和其他地方提供的所有參考文獻都併入本文作為參考。實施例1:於384孔聚苯乙烯板中進行的乾燥的PCR混合物的製備按照標準規程製備生物學試劑製劑，在本情形中為用於PCR的試劑混合物。簡而言之，10pl球的製劑包含25mMTris-HCl(pH9.0於室溫下)、125mMKCl、3.75mMMgCl2、0.5mMdNTP、0.6mg/mlBSA、3.5個單位的rTaqDNA聚合酶以及包括合成的聚合物Ficoll400(6.25%)、Ficoll70(6.25%)和第二碳水化合物松三糖(10%)的形成玻璃的填充材料。在使用前通常將所有試劑高壓滅菌或過濾滅菌。製備試劑並且將其在冰上貯存直至混合和分配入聚苯乙烯板或二氧化矽塑^t。終製劑由形成玻璃的填充材料、BSA、dNTP和rTaqDNA聚合酶以及上述鹽組成。試劑均一溶液的每劑量終體積為10(il。這允許25(il的PCR工作體積。使用自動移液器將試劑分配入384板聚苯乙烯板。將384孔板置於預先冷卻(-46i:)的Vertis冷凍千燥器的頂部進行大約60分鐘來冷凍試劑。然後按照前述表2中描述的方法，使冷凍的試劑經歷第一和隨後的第二乾燥過程。通過簡單地用粘合蓋或帽或熱密封裝置(thermoseal)覆蓋板來將包含乾燥的試劑的板貯存在作為完整包裝的包含乾燥劑的可再密封袋中。備選地，將乾燥的試劑作為乾燥的試劑片劑或立方塊從板取出，然16後將其貯存在瓶中，且將瓶貯存在包含千燥劑的可再密封的袋中。通過XDNA的實時PCR擴增和將擴增概況與商業產品(puReTaqRTG珠(beads);GEHealthcare)的擴增概況比較來測試乾燥的試劑組合物的穩定性。用於測試的引物是SEQIDNO:1(5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3')和SEQIDNO:2(5'隱GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-3')。實時PCR擴增的結果示於圖2。在圖2中，384孔聚苯乙烯板示於左上側，其用於製備乾燥的試劑組合物。將乾燥的試劑片劑貯存在塑料瓶(左下側)和於室溫下於包含乾燥劑的可再密封的袋中貯存大約1周。包含乾燥的試劑的384孔板示於左上側，其用粘合密封裝置覆蓋。人DNA模板的不同稀度的標準曲線示於右上側。XDNA的不同稀度的實時擴增曲線示於右下側。最後，實時PCR擴增反應的成功證明乾燥的試劑組合物是穩定的。實施例2:於96孔二氧化矽塑衝莫中進行的乾燥的PCR混合物的製備按照實施例1製備生物學試劑製劑和形成玻璃的填充材料並且將它們混合在一起。使用自動移液器將大約20^試劑混合物分配入96孔二氧化矽塑模(圖3,左上側)。將二氧化矽塑模置於預先冷卻的(-46。C)Vertis冷凍乾燥器中進行大約60分鐘來冷凍試劑。然後按照前述表2中所描述的方法使冷凍的試劑經歷第一和隨後的第二乾燥過程。可通過簡單地用粘合密封裝置覆蓋和通過將板置於包含乾燥劑的鋁袋中來將乾燥的試劑貯存在作為完整包裝的塑模中。備選地，作為千燥的試劑餅從塑模取出乾燥的試劑，然後將其貯存在包含乾燥劑的瓶中。通過根據實施例1的XDNA的實時PCR擴增和將擴增概況與商業產品(puReTaqRTG珠；GEHealthcare)的擴增概況比較來測試千燥的試劑組合物的穩定性。結果示於圖3。在圖3中，96孔二氧化矽塑模示於左上側，其用於製備乾燥的試劑組合物。在進行XDNA功能測試前在包含乾燥劑的可再密封的袋中將乾燥的試劑立方塊貯存在塑料瓶(左下側)中進行1周。XDNA模板的不同稀度的標準曲線示於右上側。人的不同稀度的實時PCR擴增圖示於右下側。總之，實時PCR擴增反應的成功證明乾燥的試劑組合物是穩定的。實施例3:於96孔聚苯乙板中進行的乾燥的PCR混合物的製備按照實施例1製備生物學試劑製劑和形成玻璃的填充材料並且將它們混合在一起。使用液體分配自動裝置分配10nl試劑混合物(圖1,左下側)。將96孔板置於96孔金屬支架上(圖4)。將與金屬支架一起的96孔板置於預先冷卻的(-46。C)Vertis冷凍乾燥器中進行大約60分鐘來冷凍試劑。然後按照前述表2中所描述的方法使冷凍的試劑經歷第一和隨後的第二乾燥過程。可通過簡單地用粘合密封裝置或帽或熱密封裝置在熱封機的幫助下覆蓋板來將乾燥的試劑貯存在作為完整包裝的96孔板中。使用新製備的"溼"製劑和與puReTaqRTG珠一起的乾燥的試劑進行XDNA實時PCR功能測試。將密封的板在室溫下或在40。C的培養箱中於包含乾燥劑的袋中貯存8天。通過XDNA的實時PCR擴增(根據實施例1)和將擴增概況與商業產品(puReTaqRTG珠；GEHealthcare)的擴增概況比較來測試乾燥的試劑組合物的穩定性。結果示於圖6、7和8。圖6顯示使用96孔乾燥的PCR餅進行的XqPCR和與"溼"製劑和pureTaqRTG珠的比較。該圖顯示4務照本發明的實施方案製備的乾燥的PCR試劑的穩定性。使用始於1千萬個拷貝至IO個拷貝的不同濃度的XDNA作為模板連同無模板的對照進行實時PCR擴增。對於當前形式(右上方)、puReTaqRTG珠(左下方)和'溼'製劑(左上方)，在Ct值和PCR效率(右下方的表)方面注意到相似的性能。圖7顯示按照本發明的實施方案製備的乾燥的PCR試劑的穩定性。將乾燥的PCR混合物在40。C或室溫(RT)下貯存8天，然後用於XDNA的qPCR。按照本發明製備的試劑，與商業puReTaqRTG珠相比，獲得相似的性能。左上角於RT下貯存的乾燥的PCR試劑餅。右上角於40。C下貯存的乾燥的PCR試劑餅。左下角於RT下貯存的puReTaqRTG珠。右下角於40。C下貯存的puReTaqRTG珠。圖8顯示當前形式試劑和pureTaqRTG珠在室溫和40°C下的Ct值和PCR效率。實施例4:用於實時PCR測定的乾燥的試劑的製備實時PCR成為日益普遍的用於基因表達分析的測定平臺。用於檢測實時PCR中擴增的產物的一個方法使用與^t板的特定部分同源的雙標記單鏈(ss)DNA探針。該探針上的螢光修飾用作報導分子(reporter)(FAM)和猝滅劑(TAMRA)。在單鏈模板存在的情況下，探針與模板退火，但由於報導分子染料與猝滅劑染料的緊密相鄰而不發出螢光信號。當TaqDNA聚合酶乂人才莫^1擴增DNA時，酶的5，-3，外切核酸酶活性切割與模板退火的標記的探針，從而釋放猝滅劑染料，從而允許報導分子發螢光。然後通過實時儀器記錄螢光信號。我們在本文中證明PCR引物和TaqMan探針一起可在賦形劑存在的情況下進行凍幹，並且與其中引物和探針未進行凍幹的反應相比可用於實時PCR而無功能損失。用於製備用於測定P-肌動蛋白的2.5x濃縮製劑的製劑包括25mMTrispH9、125mMKC1、3.75mMMgCl2、0.6mg/mlBSA、0.5mMdNTPs、0.25U/|ulrTaq、0.05%Tween20、0.05%NP-40、1.5^Mp-肌動蛋白正向引物(SEQIDNO:3:5，國TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3')、1.5jaM卩-肌動蛋白反向引物(SEQIDNO:4:5，-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3，)、1|3-肌動蛋白探針(SEQIDNO:5:5，-FAM-ATGCCC_N(TAMRA)CCCCCATGCCATCCTGCGTp陽3')、6.25%Ficoll70、6.25%Ficoll400和10%松三糖。將10微升等分試樣的製劑移液入96孔板，然後進行凍幹。將單一乾燥的餅和變化的量的人基因組DNA模板在25込l的終體積中進行再水化。使用ABI7900FastRealTime儀進行實時PCR反應。將反應與上述不包含引物和探針的相似製劑進行比較。對於這些在後的反應，在PCR反應設置期間加入了引物和探針。此外，可商購獲得的puReT叫RTG珠用作另外的對照。圖9顯示這些反應的結果。左上圖使用凍幹的試劑(包括TaqMan引物和探針)的實時PCR。左下圖凍幹的試劑對照(引物和探針不包括在凍幹的製劑中，但在實時PCR反應之前加入)。右上圖商業puReT叫RTG珠對照(所有其他試劑未進行凍幹)。所有反應產生等價的擴增概況、R值和斜率。當puReTaqRTG反應用於產生標準曲線而將其他反應視為未知的時，具有等量的模板DNA的反應落在標準曲線上(右下圖)。我們的結果證明TaqMan引物和探針易於進行RTG整合。實施例5:包含Phi29DNA聚合酶的乾燥的試劑的製備Phi29DNA聚合酶廣泛地用於全基因組擴增以及滾環擴增。我們將組擴增的製劑中進行凍幹。我們的分析證明凍幹的製劑在進行全基因組擴增中具有與"溼"製劑相同的活性。GenomiPhiHY(HighYield)DNA擴增試劑盒(GEHealthcare)包括通過等溫鏈置換擴增進行全基因組擴增所必需的所有組分。用於GenomiPhi反應的原材料可以是純化的DNA或非純化的細胞裂解物。DNA的微克量可以在僅僅少數小時內從納克量的原材料產生。來自GenomiPhiHY反應的一般DNA產量為每50|lU反應40-50pg,平均產物長度大於10kb。由於酶的校對3，-5，外切核酸酶活性，DNA複製極其精確。將包含Phi29DNA聚合酶、隨機六聚體、dNTP和GenomiPhiHY反應緩沖劑以及穩定劑Ficoll70、Fico11400、松三糖和BSA的GenomiPhi反應混合物作為2X混合物製備。將10pi體積等分試樣的混合物分配入12孔PCR帶管(striptube)。使用VirTis冷凍乾燥器將分配的產物凍幹成餅。將乾燥的產物在室溫或4(TC下貯存35天。使用低至10ng的人基因組DNA,用這些產物成功地進行全基因組擴增。在第O時間和在RT或4(TC下貯存35天後，將這與使用新製備的混合物進行的全基因組擴增進4於比4交。圖10顯示使用凍幹試劑或"溼"混合物進行的全基因組擴增測定的結果。將10ng的人基因組DNA用作模板材料，在30。C下進行90分鐘的擴增反應。預期應當在90分鐘內產生大於4pg的DNA。使用PicoGreen測定，即使用已在40。C下貯存35天的凍幹的試劑也檢測到強烈的擴增。Phi29DNA聚合酶以凍幹的形式被成功地穩定化。實施例6:用於體外轉錄的乾燥的試劑的製備轉錄是由所有類型的細胞常規進行的至關重要的生物學過程，在該過程中使用DNA模板，利用依賴DNA的RNA聚合酶例如T7RNA聚合酶製備RNA。體外轉錄(IVT)是在試管中在細胞外進行的產生由終端用戶選擇的轉錄物的該相同過程。然後可將所得的RNA分子用於蛋白質的體外翻譯或雜交反應例如RNA印跡、DNA印跡、樣t陣列分析和顯微注射。我們成功地產生了凍幹的環境溫度穩定的IVT試劑，其中將除去模板的RNA生產所需要的所有組分在賦形劑存在的情況下進行凍幹。這極大地簡化了IVT反應，從而使終端用戶只需要加入才莫板DNA和水來;^士臺&^。用於產生凍幹的試劑的IVT製劑包括40mMTrispH8.0、0mMMgCl2、4mM亞精胺、10mMDTT、50|ug/mlBSA、10mMNaCl、0.5mMATP、0.5mMCTP、0.5mMGTP、0.5mMUTP、2URNAGuard、10UT7RNA聚合酶(GEHealthcare)、6.25%Ficoll400、6.25%Ficoll70、10%松三糖。將製備的製劑以25^tl的等分試樣分配入8孔帶管，然後按照實施例1和表2進行凍幹。使用來自RocheSP6/T7IVT試劑盒的對照DNA測試乾燥的試劑餅。使用RocheSP6/T7IVT試劑盒平行進行IVT反應。如所預期的，使用凍幹的試劑以及Roche試劑盒產生大約1000個鹼基對的轉錄物(圖11)。因此，轉錄所必需的試劑在賦形劑存在的情況下被成功地凍幹，且其可在DNA才莫板存在的情況下在正確的反應體積中進行再水化來產生RNA轉錄物。儘管已顯示和描述了本發明的優選實施方案，但在本領域內^艮顯然的是，可在不背離本發明的教導的情況下，進行變化和修飾。上述描述於現有技術在它們的正確的觀點中考慮時，本發明的實際範圍意欲在下列權利要求中進行限定。權利要求1.製備乾燥的試劑製劑的方法，其包括步驟(a)提供至少一種經緩衝的生物學試劑的水溶液；(b)將形成玻璃的填充材料與經緩衝的試劑溶液混合來形成其中填充材料的濃度足以促進玻璃狀多孔組合物形成的混合物；(c)將混合物以基本上均勻的滴的形式分配入多孔容器的孔中，其中單個滴分配入各個孔；(d)乾燥所述容器中的滴以形成試劑製劑；其中所述試劑製劑是水溶性的且具有對於室溫穩定性是足夠的Tg。2.權利要求1的方法，其還包括將乾燥的滴收集入用於乾燥的試劑的延長的貯存的試劑瓶。3.權利要求1的方法，其還包括用密封帶或熱密封裝置密封多孔容器以進行乾燥的試劑的延長的貯存。4.權利要求3的方法，其中所述密封帶是熱激活的。5.權利要求l的方法，其中所述多孔容器是二氧化矽塑模。6.權利要求l的方法，其中所述多孔容器是聚苯乙烯板。7.權利要求6的方法，其中所述聚苯乙烯板是96孔板。8.權利要求6的方法，其中所述聚苯乙烯板是384孔板。9.權利要求6的方法，其還包括，在所述乾燥步驟之前，將所述聚苯乙烯板置於金屬塑模上，其中所述多孔聚苯乙烯板的每一個孔的外壁與所述金屬塑模的孔緊密接觸。10.權利要求l的方法，其中所述乾燥步驟通過凍幹來實現。11.權利要求l的方法，其中所述至少一種經緩沖的生物學試劑是用於生物學測定的測定混合物。12.權利要求1的方法，其還包括在所述乾燥步驟之前冷凍所述分配的混合物。13.包含根據權利要求1的方法製備的乾燥的試劑製劑的試劑組合物。14.權利要求13的試劑組合物，其中所迷乾燥的試劑製劑包含足夠的用於單次測定的生物學試劑。15.權利要求11的方法，其中所述測定混合物包括除了擴增模板和引物外的用於PCR所必需的所有試劑。16.權利要求11的方法，其中所述測定混合物包括除了模板外的用於體外轉錄所必需的所有試劑。17.權利要求11的方法，其中所述測定混合物包括除了模板外的用於全基因組擴增所必需的所有試劑。18.權利要求11的方法，其中所述測定混合物包括除了模板外的用於實時PCR測定所必需的所有試劑。全文摘要本發明涉及製備乾燥的試劑製劑的方法，該方法包括步驟提供至少一種經緩衝的生物學試劑的水溶液；將形成玻璃的填充材料與經緩衝的試劑溶液混合來形成其中填充材料的濃度足以促進玻璃狀多孔組合物形成的混合物；將混合物以基本上均勻的滴的形式分配入多孔容器的孔中，其中單個滴分配入各個孔；乾燥容器中的滴來形成試劑製劑。試劑製劑是水溶性的且具有對於室溫穩定性是足夠的Tg。文檔編號A61K9/14GK101516337SQ200780034507公開日2009年8月26日申請日期2007年9月13日優先權日2006年9月18日發明者J·W·法喬斯,M·D·皮爾斯,R·波納卡申請人:通用電氣醫療集團生物科學公司