以重組的三股螺旋支架為基礎的複合物的製作方法

2023-04-27 02:07:16 2

專利名稱：：以重組的三股螺旋支架為基礎的複合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有支架(scaffold)的蛋白質複合物(proteincomplex),且特別涉及具有三股螺旋(triple-helix)支架的蛋白質複合物，其可用於抗腫瘤、感染性疾病與免疫調節(immunomodulatory)的用途。
背景技術：
：基於蛋白質的結合試劑在治療或診斷應用上具有多種用途。抗體就是個極佳的範例，許多單克隆抗體(mAbs)(以下簡稱mAbs)已經成功地用於治療癌症、感染性疾病和炎性疾病(inflammatorydiseases)(Adamsda/"Nat.Biotechnol.2005Sep;23(9):1147-57.)。通過重組DNA技術，包括嵌合化(chimerization)和人源化(humanization)，增強了鼠科動物mAbs的功效與安全性。然而使用CDR(互補決定區，以下筒稱CDR)移植來進行鼠科動物jnAbs人源化時，通常使其結合親和力低於鼠科動物的對應物(counterpart)。抗體的親和力是抗體作為治療劑成功與否的關鍵因素。具有高親和力的抗體可使抗體與天然的配體對靶向受體有效地竟爭以減少劑量、毒性與花費。親和力也影響抗體的藥物動力學，例如在靶向組織與宿主循環之內的分布與分泌。在體內有效的單克隆抗體的必要條件是對靶向抗原具有強的親和力且對非相關蛋白質沒有非特異性的結合。抗原結合位點的多聚化(multimerization)已被證實是增加抗體與抗原結合的整體強度的有效方式，其中抗體與抗原結合的整體強度被定義為抗體親和力(antibodyavidity)(功能性親和力(functionalaffmity))(Milleraa/.，JImmunol170:4854-4861，2003;Rhei誕cker"a/.，JImmunol157:2989-2997,1996;Shopes,JImmunol148:2918-2922,1992;Shuford"a/"Science252:724-727，1991;Wolffs/"JImmunol148:2469-2474,1992)。在體內它們具有增強的抗月中瘤活性(Liu"a/.,IntImmimopharmacol6:791-799,2006;Wolff""/.,CancerRes53:2560-2565,1993)。由於免疫球蛋白G(IgG)(以下簡稱IgG)分子結構的二價性質，常用的和經過改造的IgG不能用來結合同時結合兩個以上的不同抗原。因此需要多價或多特異性(multi-specific)的蛋白質結合試劑。在一些實例中，為了減少促有絲分裂副作用(mitogenicityside-effect),需要通過改造Fc區來避免效應功能(effectorfunction),例如依賴於抗體的細胞介導的細另包毒性(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)以及依賴於4卜體的細月包毒性(complementdependentcytotoxicity,CDC)。例如，鼠矛+動物抗-人類CD3單克隆抗體(正純種系(Orthoclone)OKT3，莫羅莫那-CD3(Muromonab-CD3))作為以人類T細胞上的T-細胞受體/CD3複合物為靶標的強有力免疫抑制試劑。它用來預防或治療同種異體移植排斥(allograftrejection)已有二十年的時間(Cosimi"a/"NEnglJMed305:308-314,1981;Group,NEnglJMed313:337-342，1985;Kung"a/"Science206:347-349,1979)。然而進行這種治療的一個主要缺點是細胞因子，例如TNF-a、IL-2和IFN-y的全身釋放，其導致一系列有害的促有絲分裂作用(mitogeniceffects),包4舌感冒樣症狀(flu-likesymptoms)、呼吸窘迫(respiratorydistress)、神經症狀(neurologicalsymptoms)和急性腎小管壞死(acutetubularnecrosis)(Abramowicza/.，Transplantation47:606-608,1989;Chatenouda/.:NEnglJMed320:1420-1421,1989;Goldman"Transplantation50:158-159:1990;Toussaint"a/"Transplantation48:524-526,1989)。因為OKT3和其它抗-CD3mAbs的促有絲分裂作用依賴於與帶有Fc受體的細胞(FcR-positivecell)(例如單核細胞)結合從而發生廣泛的TCR/CD3交聯(cross-linking)，因此最近有許多研究都希望通過改變與FcR的結合，來開發抗-CD3抗體的非促有絲分裂作用形式(nonmitogenicforms)。由以上說明可知，目前亟需一種具有高親和力、低促有絲分裂作用和體內高穩定性的蛋白質結合試劑。
發明內容本發明提供了具有高親和力、低有絲分裂作用和體內高穩定性的以蛋白質複合物為基礎的結合i式劑(proteincomplex-basedbindingreagent)。本發明i式劑也可為多價的(multi-valenyt)或多特異性的(multi-specific)。在一方面，本發明涉及分離的重組蛋白質複合物，其包含第一融合多肽鏈，包含第一支架區和一該第一支架區一端框內(in-frame)融合的第一異源性(heterologous)區、第二融合多肽鏈，包含第二支架區，以及第三融合多肽鏈，包含第三支架區。上述第一、第二與第三支架區互相比對(align)以形成三股螺旋巻曲。而且上述第一支架區域與第一異源性區框內融合且在相同的多肽鏈上。上述異源性區可包含酶促結構域或螢光蛋白質的序列。螢光蛋白質的例子包括GFP和dsRed及其變體(variant)。酶促結構域的例子包括穀胱甘肽S-轉移酶(glutathioneS-transfemse)、螢光素酶(luciferase)、(3-半乳糖普酶(p-galactosidase)與(3-內醯胺酶((3-lactamase)。上述異源性區可包括與結合配偶體(bindingpartner)結合的結合區(例如，配體(ligand)結合區、配體、受體、親和標記物或蛋白聚糖)。"結合配偶體"意指對於感興趣的靶向化合物的一部分(例如，蛋白質)具有特異性的、共價或非共價的親和性的任何分子。結合配偶體的例子包括抗原/抗體配對物、蛋白質/抑制物配對物、受體/配體配對物(例如，細胞表面或細胞核受體/配體配對物)、酶/底物配對物(例如，激酶(kinase)/底物配對物)、凝集素(lectin)/,灰水化合物(carbohydrate)配對物、寡聚的(oligomeric)或異源寡聚的(heterooligomeric)蛋白質配對物、DNA結合蛋白/DNA結合位點的配對物和RNA/蛋白質配對物。結合區的例子也包括親和標記物的序列，例如，組氨酸-才示"i己4勿(histidine-tag)、myc才示"i己4勿(myctag)或血;疑素才示i己4勿(hemagglutintag)。上述第一異源性區可包含免疫球蛋白的一個或多個CDR。因此異源性區可包含抗體的抗原結合部分，例如VH區和Fab。在實施例中第一異源性區包含抗原結合片段或單鏈抗體的序列，例如對簇命名3(ClusterDesignation3,CD3)(以下簡稱CD3)或表皮生長因子受體(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)(以下簡稱EGFR)特異的序列。上述第一多肽鏈還可包含與上述第一支架區另一端框內融合的第二異源性區。如上述第一支架區，第二異源性區也可包含與結合配偶體結合的結合區。第一和第二異源性區可彼此相同或不同。它們可與相同的結合配偶體或兩個不同的結合配偶體結合。例如，第一異源性區和第二異源性區可分別包含第一單鏈抗體和第二單鏈抗體的序列，上述兩抗體分別與CD3與EGFR特異性結合。在上述蛋白質複合物中，第二融合多肽鏈可以包含與上述第二支架區一端框內融合的第三異源性區、框內融合至第二支架區另一端的第四異源性區或框內融合至該兩端的兩個區。同樣地，前述第三融合多肽鏈可包含框內融合至第三支架區一端的第五異源性區或框內融合至第三支架區另一端的第六異源性區或兩者皆有。如同上述第一和第二異源性區，其它四個異源性區中的每一個均可包含與結合配偶體結合的結合區。全部六個異源性區可彼此相同或不同。因此它們可與1、2、3、4、5或6個結合配偶體結合。換句話說，此蛋白質複合物可以是一、二、三、四、五或六價。為了讓第一、第二與第三支架區形成三股螺旋巻曲，三個支架區的每一個均包含一個或多個三股螺旋重複序列，每個重複序列包含下列式子的序列(Xl-X2-X3)n,其中XI是甘氨酸(Gly)殘基，X2或X3是任何胺基酸殘基，優選為亞氨基S吏脯氨酸或羥脯氨酸(hydroxproline);以及n大於或等於5。例如，第一、第二或第三支架區可包含(GPP)u)或人類補體Clq、膠原凝集素(collectin)或膠原蛋白多肽鏈的一個或多個三股螺旋重複序列。在實施例中，前述第一、第二與第三融合多肽基本上相同，彼此具有至少75%(例如在75%與100%之間任何數量，包括乃。/。與100%)的序列同一性。通過三個相同的融合多肽形成的複合物為同源三聚體(homotrimer)。上述三個融合多肽可以是"功能等同物(fonctionalequivalent)"。"功能等同物，，意指常見多肽的多肽衍生物，例如，具有一個或多個點突變、插入(insertion)、缺失(deletion)、截短(truncation)的蛋白質、其融合蛋白或上述的組合，並且其基本上保持形成三股螺旋的能力以及異源性區的活性，例如與配體結合。異源性多肽、核酸或基因可源自不同物種，或者即使它們來自相同物種，它們也從在最初的形式上經過基本的修飾。兩個融合區或序列彼此是異源的，即使在天然存在的蛋白質或核酸中它們也並不相互連接。例如並非是天然存在的人類迷你膠原蛋白(minicollagen)(第XXI型)、膠原凝集素家族蛋白或補體lq(Clq)—部分的多肽序列對於人類蛋白質的區而言是異源的。本發明的另一特色是分離的重組融合多肽，其包括(i)用來形成三股螺旋巻曲的支架區和(ii)框內融合至上述支架區一端的第一異源性區或框內融合至上述支架區另一端的第二異源性區。所述支架區可以包含一個或多個前述三股螺旋重複序列，例如人類Clq或膠原蛋白多肽鏈的重複序列。異源性區可包含上述結合區之一併且可以通過許多本
技術領域：
已知方法例如噬菌體展示篩選(phagedisplayscreening)來獲得。分離的多肽或蛋白質複合物意指基本上無自然相關的分子，即由乾重計算具有至少75%(即在75%與100%之間的任何數量，包括75%與100%)的純度的多肽或蛋白質複合物。純度可用任何適當的標準方法，例如通過柱層4斤(columnchromatography)、聚丙丈希醯胺；疑月交電；永(polyacrylamidegelelectrophoresis)或高效液相層析(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分析來測量。本發明的分離多肽或蛋白質複合物可由自然來源分離或用重組DNA技術製造。本發明也涉及分離的核酸，此分離的核酸包含編碼上文所述融合多肽的序列或此序列的互補序列。核酸指DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)、或DNA或RNA的類似物。DNA或RNA的類似物可由核苷酸類似物合成。此核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優選雙鏈DNA。組核酸片段相同的核酸。因此該用語包含，例如(a)DNA,其具有天然存在的基因組DNA分子的一部分序列，但不與在生物體的基因組中天然存在於其兩側的編碼序列鄰接；(b)核酸，其以某種方式被引入載體(vector)或原核細胞或真核細胞的基因組中，由此所形成的分子不與任何天然存在的載體或基因組DNA相同；(c)分離的分子，例如cDNA、基因組片段、通過聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)所產生的片段或限制性片段(restrictionfragment);和(d)重組核苷酸序列，其為雜合基因(即編碼融合蛋白質的基因)的一部分。上述核酸可用來表達本發明多肽。為此目的，可將上述核酸連接至適合的調控序列以產生表達載體。載體是指核酸分子，其具有將另一核酸轉移到其連接處的能力。載體具有自主性複製(autonomousreplication)或整合入宿主DNA的能力。載體的例子包括質粒(plasimd)、噬菌粒(cosmid)或病毒載體。本發明載體包含核酸，其為適合於在宿主細胞內表達該核酸的形式。優選所述載體包含與待表達的核酸序列可操作連接的一個或多個調控序列，其。"調控序列"包括啟動子(promoter)、增強子(enhancer)和其它表達控制元件(例如多腺苷酸化信號(polyadenylationsignal))。調控序列包括那些指導核苷酸序列的組成型表達和組織特異性調控和/或可誘導的序列。對表達載體的設計可依據下列因素，如對被轉染宿主細胞的選擇、所需蛋白質表達的程度與諸如此類。可將表達載體SI入宿主細胞以製造本發明多肽。包含上述核酸的宿主細胞也在本發明範圍內。例子包括大腸桿菌(5.co/0細胞、昆蟲細胞(例如使用果蠅(Dmw;Ma)S2細胞或杆狀病毒(baculovirus)細胞)、酵母細胞或哺乳動物細胞(例如小鼠骨髓瘤(myeloma)NS0細胞)。請參閱，例如Goeddel,(1990)GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA。為了製造本發明的融合多肽，在一定條件下在培養基中培養宿主細胞以表達本發明核酸所編碼的多肽，並從被培養的細胞或該細胞的培養基中純化上述多肽。或者，可在體外轉錄與翻譯本發明的核酸，例如使用T7啟動子調控序列和T7聚合酶。為了製造本發明的蛋白質複合物，可一定條件下培養包含分別編碼上述第一、第二與第三融合多肽的第一、第二與第三核酸的宿主細胞，以表達上述三個核酸所編碼的多肽並且在所表達的多肽之間形成三股螺旋巻曲，以及從培養的細胞或該細胞的培養基中純化上述蛋白質複合物。優選上述宿主細胞為真核細胞(eukaryoticcell),其包含使脯氨酸殘基羥基化(hydroxylate)的酶活性。為了讓本發明上述和其它的目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉優選實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下附圖簡述圖1顯示蛋白質複合物，其具有來自人類XXI型膠原蛋白的迷你膠原蛋白三股螺旋巻曲支架。三股螺旋巻曲的六個末端分別框內融合至六個具有單鏈抗體(scFv)的VL與VH區的Fv片段區。圖2A顯示具有三股螺旋巻曲支架的蛋白質複合物，其三個N末端分別與三個單鏈抗體OKT3(抗-CD3)、528(抗-EGFR)和erb—scFv(抗-EGFR)框內融合，而第2B圖顯示該蛋白質複合物的Western印跡的照片。將穩定轉染的果蠅S2細胞的培養基在非還原狀態下進行SDS-PAGE電泳，之後以抗XXI型膠原蛋白(3E2)C末端的單克隆抗體作免疫印跡。T:鍵間雙硫^睫三體；Mt:包含鍵間雙硫鍵三體的單體。圖3顯示具有三股螺旋巻曲支架的蛋白質複合物。上述三股螺旋巻曲支架的三個N末端與三個OKT3單鏈抗體框內融合；三個C末端與三個528單鏈抗體框內融合。圖4A和4B顯示不同形式抗體的示意圖圖4A顯示膠原蛋白支架抗體scFv-Col(左圖)，其包含氨基末端scFv、人類IgG鉸鏈(hinge)區、膠原蛋白區(GPP、和XXI型膠原蛋白羧基末端NC1區；NSPD-scFv(右圖)，其包含表面活性蛋白D(surfactantproteinD,SPD)、在羧基末端的膠原凝集素和scFv。圖4B由左到右分別顯示免疫球蛋白G(IgG)、嵌合的(scFv-Fc)和單鏈抗體(scFv),以及它們各自的大致分子量。灰色區顯示Vh與Vl片段；虛線鏈間雙硫鍵。主要組件符號說明101-迷你膠原蛋白401~鉸鏈區403~(GPP)IO的膠原蛋白區405~膠原蛋白XXI型的NC1區或其它靶向的結合區407~膠原凝集素的N端區409~膠原凝集素的膠原蛋白樣(collagen-like)區411-膠原凝集素的a螺旋頸部區域實施方式本發明是因(至少一部分)意外發現與人類三股螺旋巻曲支架區域框內融合的異源性蛋白質結合區域保留了結合活性，並且所得的的融合多肽形成了三股螺旋巻曲。圖1顯示了本發明蛋白質複合物的例子。如該圖所示，三股螺旋巻曲蛋白質複合物的六個末端分別與六個異源性蛋白質的結合區，即單鏈抗體(scFv)的Fv片段框內融合。本發明的蛋白質複合物較常用抗體有許多優點。一方面而言，當上述六個區的兩個或多個彼此相同時，蛋白質複合物可具有2-6個對結合配偶體(例如抗原)特異的結合區，而常用抗體只具有兩個這種區。換句話說，不像常用抗體對於抗原只有二價，此蛋白質複合物可以是二、三、四、五或六價的。因而，可將其製造為具有各種比常用抗體高的親和力。因為4交高的親和力，所以比起常用抗體而言，它比常用抗體需要較少量的蛋白質複合物及較短的反應時間來達到期望的目標，例如療效(therapeuticeffects),由此降低治療成本並減少副作用(例如，非期望的免疫反應)。在另一方面，當上述六個區的兩個或多個互相不同時，本發明的蛋白質複合物可以具有2-6個對2-6個不同結合配偶體特異的結合區。將不同特異性的結合配偶體組合成為一個單元，具有將多種結合配偶體集合在一起的能力，因此用在治療、組織重構(tissuereconstruction)和在納米平的活性蛋白質結構(activeproteinmachinery)(例如多亞基酶)的裝配上具有令人滿意的應用。為了在人體內使用，本發明的蛋白質複合物優選為人源(humanorigin)的。例如，其可包含人源化單鏈抗體序列，該序列與人源的螺旋巻曲支架的，如人類Clq、膠原凝集素家族蛋白質或膠原蛋白多肽鏈的螺旋巻曲支架框內融合。因為人類Clq與膠原蛋白兩者在血液中都非常穩定，所以此蛋白質複合物比起一般治療型鼠源抗體而言更加穩定。膠原蛋白是在哺乳類動物中存在的最大量的蛋白質，其為包含重複的三聯體的序列甘氨酸(Gly)-Xl-X2的細胞外基質蛋白(extracellularmatrixprotein),這種三聯體的出現允許三條膠原蛋白多肽鏈(a-鏈)摺疊成三股螺旋構象。在三聯體的序列甘氨酸-Xl-X2中，X2位置的胺基酸常為脯氨酸，為了穩定膠原蛋白的三股螺旋結構，常通過膠原蛋白多肽鏈的翻譯後修飾將脯氨酸4-羥基化(hydroxylated)。缺少脯氨酸羥基化，膠原蛋白的必需的三股螺旋構象在低於生理溫度(physiologicaltemperature)時是熱不穩定的(thermallyunstable)(BergandProckop,BiochemBiophysResCommim52:115-120,1973;Rosenblooma/.,ArchBiochemBiophys158:478-484,1973)。許多具有膠原蛋白三股螺旋區(collagenousdomain)的膠原蛋白樣蛋白質出現於人類血清中，在防護傳染性生物上扮演先天性免疫系統(innateimmunesystem)的角色。這些包括補體蛋白質Clq、膠原凝集素家族蛋白質-甘露糖結合凝集素(mannosebindinglectin,MBL)、表面活'性蛋白(surfactantprotein)A禾口D(SP-A和SP-D)。而這些膠原蛋白樣蛋白質共同的結構特徵為由膠原蛋白區的三股螺旋集合構成的多聚化(multimeric)蛋白質亞基(unit),且三聚體分子互相堆集或鏈間形成二硫鍵交聯。因此，這些"防禦膠原蛋白"分子的結合區的功能性親和力通過多聚化(multimerization)而大幅度增力口。本發明的蛋白質複合物或多肽可以通過重組技術獲得。可將編碼此複合物的多肽的核酸引入合適的宿主細胞中，並且在一定條件下表達由前述核酸編碼的多肽，以允許表達該多肽以及在多肽間形成三股螺旋巻曲。為了促進三股螺旋巻曲支架的形成，可在宿主細胞中共表達(co-express)脯氨醯4-羥化酶(prolyl4-hydroxylase,P4HA)，其為在膠原蛋白的生物合成中的關鍵酶。異源蛋白質的結構域可包含抗體或其片段(例如其抗原結合片段)。在此處所使用"抗體"意指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即抗原結合部分。其指包括最少一個優選兩個重(heavy，H)鏈可變區(VH)，以及至少一個優選兩個輕(light,L)鏈可變區(VO的蛋白質。可將Vh和Vl區更進一步細分為超變區和較保守的散布區，前者稱為"互補決定區(complementaritydeterminingregion)""(CDR)"區，後者稱為框架區(frameworkregion)。已經明確定義互補決定區和框架區的範圍(參閱KabatWa/.(1991)S^we"ceso//VoWrao//wmwwo/ogZca//wtemst,屍,￡c/Wow，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242,andChothia"(1987)J.Mol.Biol.196:卯1-917)。每個Vh和Vl由三個CDR和四個FR組成，從氨基末端到羧基末端的排列順序為FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗體還可包含重鏈和輕鏈的恆定區(constantregion),由此分別形成重鏈和輕鏈的免疫球蛋白鏈。重鏈恆定區包含三個結構域CH1、CH2和CH3。輕鏈恆定區包含結構域CL。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原反應的結合區。抗體的恆定區通常介導抗體與宿主組織或因子，包括免疫系統的多種細胞(例如效應細胞(effectorcell))和經典補體系統的第一種組分Clq的結合。此處使用的"免疫球蛋白"指由一個或多個多肽組成、基本上由免疫球蛋白基因編碼的蛋白質。已知的人類免疫球蛋白基因包括k、;La(IgAl和IgA2)、Y(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、5和p的恆定區基因和無數的免疫球蛋白可變區基因。全長免疫球蛋白的"輕鏈"(約25KDa或214個胺基酸)由在NH2末端的可變區基因(約110個胺基酸)和在COOH末端的k或X恆定區基因來編碼。而全長免疫球蛋白的"重鏈"(約50KDa或446個胺基酸)相似地由可變區基因(約116個胺基酸)，及其它上述恆定區基因，例如Y(編碼約330個胺基酸)來編碼。抗體的"抗原結合片段"(或"抗體部分"或"片段")指全長抗體的一個或多個片段,其保留特異性結合至抗原(例如EGFR.或CD3多肽或其片段)的能力。抗體的抗原結合片段包括，但不限於(i)Fab片段，由VL、VH、CL和Cm結構域組成的單價片段；(ii)F(ab，)2片段，包含由二硫鍵在其鉸鏈區(hingeregion)連結兩個Fab片段的二價片段；(iii)由Vh和Cm結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂(singlearm)的Vl和VH結構域組成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward"a/.，(1989)A^m341:544-546)，其包含VH結構域；(vi)分離的互補決定區(CDR)以及(vii)VL或VH結構域。更進一步，雖然Fv片段的兩個結構域V]^和VH是由各自的基因編碼的，但使用重組方法可將它們連接，通過人工接頭可將它們製備成單鏈蛋白質，其中Vl與VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)，參閱，例如Bird"a/.(1988)242:423-426;andHustone/a/.(1988)屍roc.Ato/.爿cad6W.85:5879-5883)。此種單鏈抗體也包括在抗體的"抗原結合片段"範圍內。這些抗體片段可用本
技術領域：
常見的技術獲得，並以與對完整抗體相同的方式來篩選應用。適當的抗體可以是單克隆抗體。在其它實施例中，抗體可以重組製備，例如由噬菌體展示或組合方法(combinatorialmethod)來製備。產生抗體的謹菌體展示和組合方法是本4支術領域已知的(參閱，例如Ladner"a/.U.S.PatentNo.5,223,409;Kang"a/.InternationalPublicationNo.WO92/18619;Dowera/.InternationalPublicationNo.WO91/17271;Wintera/.InternationalPublicationWO92/20791;MarklandWa/.InternationalPublicationNo.WO92/15679;BreitlingWa/.InternationalPublicationWO93/01288;McCaffertyda/.InternationalPublicationNo.WO92/01047;Garrardda/.InternationalPublicationNo.WO92/09690;Ladnera/.InternationalPublicationNo.WO90/02809;Fuchs"a/.(1991)S/a/rec/wo/ow9:1370-1372;Hayda/.(1992)//wwJw"6oci孫6n'cfomos3:81-85;Husea/.(1989)iS"".ewce246:1275-1281;Griffths"a/.(1993)￡M^9712:725-734;Hawkins"a/.(1992)/Mo/226:889-896;Clackson"a/,(1991)A^fwe352:624-628;Gram"a/.(1992)iWAS"89:3576-3580;Garrad(1991)說o/r"/wo/ogv9:1373-1377;Hoogenboom"a/.(1991)19:4133-4137;和Barbas"a/.(1991)屍M4S88:7978-7982)。在一個實施例中，抗體是完全人類抗體(例如，在小鼠中製造的抗體，此小鼠經基因工程改造來製造源自人類免疫球蛋白序列的抗體)或非人類抗體，例如嚙齒類動物(小鼠或大鼠)、山羊、靈長類動物(例如猴子)、駱駝(cameloid)的抗體。非人類抗體優選為嚙齒類動物(小鼠或大鼠)的抗體。製造嚙齒類動物抗體的方法已為本
技術領域：
公知。可以通過使用攜帶人類免疫球蛋白基因的轉基因小鼠來製造人類單克隆抗體，而不是使用小鼠的系統。使用感興趣的抗原免疫的這些轉基因小鼠的脾細胞(splenocytes)被用來製造雜交瘤(hybridoma),其分泌對人類蛋白質的表位(epitope)具有特異性親和力的人類mAbs(參閱，例如Wooda/.InternationalApplicationWO91/00906，Kucherlapati"a/.PCTpublicationWO91/10741;Lonberg"a/.InternationalApplicationWO92/03918;KayWa/.InternationalApplication92/03917;Lonberg,N."a/.1994Ato匿368:856-859;Green,L丄.e/11994淑群7:13-21;Morrison"1994iVoc.淑/.jcadSc/.81:6851-6855;Bruggemanda/.1993Tear/附mzmo/7:33-40;Tuaillon"a/.1993iW^S90:3720-3724;Bruggemana/.1991￡wrJ/mw畫/21:1323-1326)。抗體的變異區或其一部分，例如CDR，可在非人類生物(例如，大鼠或小鼠)中產生。可使用嵌合的、CDR移植的和人源化的抗體。在本發明中包括在非人類生物(例如，大鼠或小鼠)中產生並經過修飾(例如在可變框架(variableframework)或恆定區)以降低在人類的抗原性(antigenicity)的抗體。可用本發明
技術領域：
公知的重組DNA技術來製造嵌合抗體(chimericantibody)。例如用限制性酶消化編碼鼠(或其它物種)的單克隆抗體分子的Fc恆定區基因，將編碼鼠Fc的區域移除，然後取代為編碼人類Fc恆定區的基因的等同部分(見，Robinsona/"InternationalPatentPublicationPCT/US86/02269;Akira，dEuropeanPatentApplication184,187;Taniguchi，M.,EuropeanPatentApplication171,496;Morrisone/1a/"EuropeanPatentApplication173,494;Neubergera/.,InternationalApplicationWO86/01533;Cabilly&<3/.U.S.PatentNo.4,816,567;Cabillye/o/,,EuropeanPatentApplication125,023;Betterda/.(1988Sc/e"ce240:1041-1043);Liu"a/.(1987)/W^S84:3439-3443;LiuWa/.，1987，/mmimo/.139:3521-3526;Sun"a/.(1987)iW^S"84:214-218;Nishimuraw1987,C""c./飢47:999-1005;Wood"a/.Wa/(1985)A^/z^e314:446-449;andShawa/.,1988,J!TVaWC認w嵐80:1553-1559)。人源化或CDR移植的抗體中(免疫球蛋白的重或輕鏈的)至少一個或兩個但一般為全部三個接受者(recipient)CDR被供者CDR取代。抗體可被非人類CDR的至少一部分取代或只有CDR中的一些被非人類的CDR取代。只需取代結合人源化抗體或人源化抗體片段所需數量的CDR。優選的供者為嚙齒類動物抗體，例如大鼠或小鼠的抗體，以及接受者為人類框架(framework)或人類共有框架(consensusframework)。一般而言，提供CDR的免疫球蛋白稱為"供者"以及提供框架的免疫球蛋白稱為"接受者(acceptor)"。在一個實施例中，供者免疫球蛋白是非人類(例如大鼠)的。接受者框架是天然存在(例如人類)或共有的框架，或有約85%或更高，優選90%、95%、99%或更高同15一性的序列。此處所使用的"共有序列(consensussequence)"指在相關序列的家族中最常出現的胺基酸(或核苷酸)所形成的序列(參閱，例如Winnaker，FromGenestoClones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany1987)。在蛋白質家族中，在共有序列中的每個位置被此家族在那個位置最常出現的胺基酸所佔據。若兩個胺基酸出現的頻率相同，兩者中的任一個都可包含在共有序列中。"共有框架"指在共有免疫球蛋白序列中的框架區。可通過本
技術領域：
已知的方法將抗體進行人源化。通過取代不直接參與抗原結合的Fv可變區序列為來自人類Fv可變區的等同序列，可產生人源化抗體。用於產生人源化抗體的常用方法由Morrison,S.L.，1985,Sc/^ce229:1202-1207、Oia。/.,1986,5/orec/zw々w^4:214、Queena/.US5,585,089、US5,693,761和US5,693,762提供，其內容引入本文作為參考。那些方法包括分離、操縱和表達核酸序列，其中所述核酸序列編碼來自至少一條重鏈或輕鏈之一的免疫球蛋白Fv可變區的全部或一部分。此種核酸的來源在本
技術領域：
中是眾所周知的，以及例如可從雜交瘤中獲得，其中此雜交瘤產生抗感興趣的多肽或其片段的抗體。可克隆(clone)重組DNA至適當的表達載體，其中此重組DNA編碼人源化抗體或其片段。也可將人源化抗體融合至支架，在人源化抗體中，特定的胺基酸已被取代、缺失或增加。優選的人源化抗體在框架區中具有胺基酸取代，如為了改善與抗原的結合。例如人源化抗體具有框架殘基，其與供者的框架殘基或除了接受者的框架殘基之外的其它胺基酸相同。為了產生此種抗體，人源化免疫球蛋白鏈的經過選擇的少量受者框架殘基可用對應的供者胺基酸取代。優選的取代位置包括鄰接於CDR或能與CDR相互作用的胺基酸殘基。從供者選擇胺基酸的標準描述於US5,585,089中，其內容引入本文作為參考。將抗體人源化的其它技術描述在Padlane/。/.EP519596Al中。本發明也包括核酸，其編碼形成本發明的蛋白質複合物的融合多肽。可中分離(例如RT-PCR)核酸。可將核酸與表達載體功能性連接。可使用經核酸或載體轉化(transformed)的細胞來製備本發明的融合多肽或蛋白質複合物。用以製備抗體的有用的細胞包括昆蟲細胞和哺乳動物細胞(例如，CHO或'淋巴細月包(lymphaticcell))。可將本發明的蛋白質複合物和有療效的部分(therapeuticmoiety)結合，所述有療效的部分例如細胞毒素(cytotoxin)、治療劑(therapeuticagent)或放射性離子(radioactiveion)。細胞毒素或細月包毒劑(cytotoxicagent)包括任何對細月包有害的試劑，例子包括紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasinB)、短桿菌素D(gramicidinD)、溴化乙錠(ethidiumbromide)、依米丁(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、鬼臼乙叉戒(etoposide)、鬼臼p塞p分戒(tenoposide)、長春新械(vincristine)、長春減(vinblastine)、秋水仙減(colchicin)、阿黴素(doxorubicin)、柔紅黴素(daunombicin)、二鞋基蒽二酉同(dihydroxyanthracindione)、鹽酸米託蒽醒(mitoxantrone)、光神黴素(mithramydn)、it線菌素D(actinomycinD)、l匿脫氬睪酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、噤呤黴素(puromycin)、美登素(maytansinoids),例如，美登醇(maytansinol)(見，USPatentNo.5,208,020)、CC-1065(見USPatentNos.5,475,092,5,585,499，5，846,545)與其類似物或同源物。治療試劑包括但不限於，抗代謝劑(aritimetabolites)(例如，氨甲蝶呤(methotrexate)、6-巰基噤呤(6-mercaptopurine)、6-闢^鳥噤呤核苷(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧咬氨烯咪胺(5-fluorouracildecarbazine))、》克4匕劑(alkylatingagents)(例i口,氮芥(mechlorethamine)、石克噴妥苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil),CC-1065、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)與洛莫司汀(lomustine，CCNU)、cyclothosphamide、白消安(busulfan)、二;臭甘露酉享(dibromomannitol)、鏈脲菌素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycinC)與順-二氯二氨4白(cis-dichlorodiamineplatinum(II)(DDP)順鍋(cispktin)))、蒽環類(anthracyclines)(例如，柔紅黴素(daunorubicin)(之前稱為道諾黴素(daunomycin)))、抗生素(例如，更生黴素(dactinomycin)(之前稱為放線菌素)、博來黴素(bleomycin)、光神黴素與氨茴黴素(anthramycin,AMC))以及抗有絲分裂劑(anti-mitoticagents)(例如'長春新鹼)、長春鹼、紫杉醇與美登素。放射性離子包括但不限於碘(iodine)、釔(yttrium)與鐠(praseodymium)。可利用綴合物(conjugate)來修飾已知的生物反應，藥物部分(drugmoiety)不應限於常用的化療試劑。例如，藥物部分可以是具有所需生物活性的蛋白質或多肽。這種蛋白質可包括，例如毒素，如相思豆毒素(abrin)、蓖麻蛋白A(ricinA)、孑艮單月包菌夕卜毒素(pseudomonasexotoxin)或白"娛毒素(diphtheriatoxin);蛋白質，例如月中瘤壞死因子(tumornecrosisfactor)、a-幹擾素(gi-interferon)、f3-幹擾素(f3-interferon)、4申經生長因子(nervegrowthfactor)、血小板衍生的生長因子(plateletderivedgrowthfactor)、組織纖溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator);或生物應答調節齊'J(biologicalresponsemodifier),例如，淋巴因子(lymphokines)、白細胞介素-1(interleukin-1,"IL-1，，)、白細胞介素-2(interleukin-2，"IL-2")、白細胞介素-6(interleukin-6，"IL-6")、粒細月包-巨p藍細月包集落刺5敫因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,"GM-CSF")、粒細胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor,"G-CSF")或其它生長因子。前述蛋白質與綴合物依據其異源性結合區的特異性，可用來治療多種紊舌L(disorder),包4舌癌症、.炎')"生疾病(inflammationdisea.se)、i^i射疾病(metabolismdisease)、纖維化疾病(fibrosisdisease)和心血管疾病(cardiovasculardisease)。因此本發明以治療此種紊亂為特徵，例如，通過把有效量(effectiveamount)的本發明蛋白質複合物施用給需要的受試者。可確定被治療的患者具有以紊亂為特徵的情況或是處於此風險中。此方法可單獨進行或與其它藥物或治療聯合。因為本發明蛋白質複合物具有多特異性的特點，可以用其來連接在一^L情況下並不互相結合的分子或細胞。此特徵特別對於基於細胞的療法(cell-basedtherapy)有用。在一個實施例中，蛋白質複合物中的異源性區通過與位於細月包毒性細J包(cytotoxiccell)上的效應抗原(effectorantigen)特異性結合而能夠活化細胞毒性細胞(例如細胞毒性T細胞(cytotoxicTcell)),而其它細胞(malignantcell)上的靶向抗原。用這種方式，蛋白質複合物可用來治療因病原體或有害細胞所導致的紊亂。經由本發明蛋白質複合物與細胞毒素性細胞上作為效應抗原的CD3抗原結合，可活化細胞毒性細胞。其它淋巴樣細胞(lymphoidcell)相關的效應抗原包括人類CD16抗原、NKG2D抗原、NKp46抗原、CD2抗原、CD28抗原、CD25抗原、CD64抗原和CD89抗原。與這些效應抗原結合會活化效應細胞，例如，單核細月包(monocyte)、嗜中性粒細胞(neutrophilicgranulocyte)和樹突細胞(dendriticcell)。這些被活化的細胞之後會給靶向細胞施加細胞毒性或細胞凋亡作用(apoptoticeffect)。靶向抗原是獨特地表達在與疾病情況相關的靶向細胞上的抗原，但是它在細胞健康的情況下不表達或表達程度低或是不可檢測。這些與惡性細胞相關的耙向抗原的例子包括EpCAM、CCR5、CD19、HER-2neu、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1(粘液素(mucin))、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5.sub.AC、MUC5.sub.B、MUC7、.beta.hCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神經節糖苷CD3(gangliosideGD3)、9-0-乙醯-GD3、GM2、GloboH、巖藻糖基GM1、PolySA、GD2、碳酸酐酶(CarboanhydraseIX(MN/CAIX))、CD44v6、SonicHedgehog(Shh)、Wue-l、漿細胞抗原(PlasmaCellAntigen)、膜結合(membrane-bound)IgE、黑色素瘤硫酸蛋白多糖(MelanomaChondroitinSulfateProteoglycan(MCSP))、CCR8、TNF-a前體、STEAP、間皮素(mesothelin)、A33抗原、前列腺生殖細月包抗原(ProstateStemCellAntigen(PSCA》、Ly-6;橋粒核心糖蛋白4(desmoglein4)、E-鈣粘附素新表位(E-cadherinneoepitope)、月臺JL乙醯月旦石威受體(FetalAcetylcholineReceptor)、CD25、CA19-9標誌(marker)、CA-125標誌和第II型繆勒管抑制物質受體(MuellerianInhibitorySubstance(MIS)Receptortype11)、sTn(唾液酸化Tn抗原(sialylatedTnantigen;TAG-72))、FAP(纖維母細胞活化抗原(fibroblastactivationantigen))、內皮唾(液)酸蛋白(endosialin)、EGFRvIII、LG、SAS和CD63。"治療"定義為將組合物施用於患者，其目的為治癒、減輕、緩和、治療、預防或改善紊亂、紊亂的症狀、繼發於紊亂的疾病狀態或易患疾病的誘因(predisposition)。"有效量"為能夠例如上述在被治療的受試者產生醫療滿意結果的組合物的量。在體內途徑，將有療效的組合物(例如，包含本發明蛋白質複合物的組合物)施用於受試者。一般而言，將複合物懸浮於可藥用的(pharmaceuticallyacceptable)載體(carrier)(例如生理鹽水)中，將其以口服、靜脈內(intravenous)專lT注、或皮下(subcutaneous)、月幾肉內(intramuscular)、錄口蟲朱〗莫下月空(intrathecal)、腹腔內(intraperitoneal)、直腸內(intrarectal)、陰道內(intravaginal)、鼻內(intranasal)、胃內(intragastrical)、氣管內(intratracheal)或月申內(intrapulmonary)注射或才直入的方式施用。所需劑量取決於所選擇的施用途徑;配製劑的性質；受試者疾病的性質；受試者的體型、體重、表面積、年齡和性別；所施用的其它藥物和主治醫師的決定。適當的劑量範圍在0.01-100.0mg/kg。基於現有組合物(composition)的多樣化和多種施用途徑有不同功效的觀點，預期劑量需求是多樣性的。例如，預期口服施用比靜脈內注射施用需要較高的劑量。如本發明領域公知的，可利用標準經驗程序(standardempiricalroutines)來調整這些劑量水平的多樣性達到最佳。通過將組合物包裹(encapsulate)在常用的適當載體(vehicle)(例如多聚《鼓粒(polymericmicroparticles)或植入裝置(implantabledevices))中,可提高傳送的效率，特別是對於口服傳送而言。本發明的範圍也包括藥學組合物，其包含可藥用的載體和有效量的本發明蛋白質複合物。可使用此藥學組合物來治療上述的紊亂。可藥用的載體包括溶劑、分散介質(dispersionmedium)、包衣(coating)、抗菌劑與抗真菌劑、和等滲透壓劑與延遲吸收(absorptiondelaying)劑。可利用常用方法將所述組合物配製成用於不同施用方式的劑型(dosageform)。可在體內和體外評價本發明組合物的功效。對於在體內的研究，可注射組合物到動物(例如，小鼠模型)，以及之後記錄其治療功效。根據這個結果，可確定適當的劑量範圍和施用方式。下面的實施例僅僅是為了舉例說明的目的，絕不是為了從任何角度限制本發明的其它公開。無需更多細節，可以相信本領域技術人員能夠根據本文的公開，最大程度地實施本發明。所有引用的出版物都全文引入本文作為參考。實施例1對M13噬菌體展示文庫(phagedisplaylibrary)進行篩選以鑑定與EGFR特異性結合的人類單鏈可變片段(scFv)。鑑定一些克隆(clone)。在通過Western印跡和酶聯免疫分析(Enzyme-linkedimmunoassay,ELISA)(以下簡稱ELISA)確認後，選出一個克隆erb一scFv作進一步的實驗。獲得編碼erb一scFv的cDNA,通過標準方法將其連接到表達載體。erb—scFv的多肽序列為序列識別號l(SEQIDNO:l),編碼該序列的核苷酸序列為序列識別號2(SEQIDNO:2)。SEQIDNO:1ArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValSerAspIleGlyAlaSerGlySerAlaThrSerTyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrlleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysSerThrThrThrPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrVaISerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerThrAspIleGlnGySerGlySerGly丁hrAspPheThrLeuThrlleSerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrAlaAspTyrProThrThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLysArgSEQIDNO:2CCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG21之後將表達載體在昆蟲細胞系果蠅S2(Dmso;/n7aS2)中表達。純化抗-EGFR的erb—scFv並進行Western印跡分析和ELISA,來確認其抗EGFR的特異性。進行RT-PCR來從雜交瘤細胞系中獲得cDNA，所述cDNA編碼抗-CD3單克隆抗體OKT3的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(V。。之後，將兩個cDNA連接以產生編碼OKT3的V『VL融合蛋白質的融合序列。此融合蛋白質的序列為序列識別號3(SEQIDNO:3)，編碼該序列的cDNA序列為序列識別號4(SEQIDNO:4)。SEQIDNO:3ValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuAlaArgProGlyAlaSerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrArgTyrThrMetHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIleGlyTyrlleAsnProSerArgGlyTyrThrAsnTyrTyrAspAspHisTyrCysLeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleValLeuAlaSerSerSerValSerTyrMetAsnTrpTyrGlnGlnLysSerGlyThrSerProLysGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlleSerGlyMetGluAlaGluAspAlaAlaThGluLeuLysArgGACCAAGCTGGAGCTGAAACGA進行相同的步驟來獲得編碼抗-EGFR單克隆抗體528的VH和的cDNA,和編碼抗-EGFR的抗體528的VH-VL融合蛋白質的融合序列。單克隆抗體528和EGFR在細胞膜上，例如在人的表皮樣癌(epidermoidcarcinoma)A431細胞上結合。528單鏈抗體的多肽序列為序列識別號5(SEQIDNO:5),編碼該序列的cDNA序列為序列i。、別號6(SEQIDNO:6)。SEQIDNO:5ValLysLeuGlnGluSerGlySerGluMetAlaArgProGlyAlaSerValLysLeuPr0CysLysAlaSerGlyAspThrPheThrSerTyrTrpMetHisTrpValLysGlnArgHisGlyHisGlyProGluTrpIleGlyAsnlleTyrProGlySerGlyGlyThrAsnTyrAlaGluLysPheLysAsnLysValThrLeuThrValAspArgSerSerArgThrValTyrMetHisLeuSerArgLeuThrSerGluAspPheAlaValTyrTyrCysThrArgSelyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerMetThrGlnThrPrLrgSerSerGlnArplyrLeuUinArgProGlyGlnSerProLysLeuLeuIleTyrLysValSerAspArgPheSerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLysIleSerArgValGluAlaGluAspLeuGlylleTyrTyr(ThrLysLeuGluSEQIDNO:6GCGGGGGGACCAAGCTGGAA編碼上述抗-EGFRscFv03、0KT3Vh-Vl和抗-EGFR抗體528VH-VL的cDNA分別與人類迷你膠原蛋白XXIcDNA框內融合，所述cDNA在5'末端包含短鉸鏈序列並在3'末端包含組氨酸標籤序列。人類迷你膠原蛋白XXI的多肽及其cDNA序列分別為序列識別號7(SEQIDNO:7)和序列識別號8(SEQIDNO:8)。SEQIDNO:7GlyGlyArgGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProArgSroGlyArgAspGlyValProGlyLeuValGlyValProGlyArgProGlyValArgGlyLeuLysGlyLeuProGlyArgAsnGlyGluLysGlySerGlnGlyPheGlyTyrProGlyGluGlnGlyProProGlyProProGlyProGluGlyProProGlylleSerLysGlIleGlnGlyGlnProGlyProProGlylleCysAspProSerLeuCysPheSerVallleAlaArgArgAspProPheArgLysGlyProAsnTyrSerLeuAspAspSerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGly(注Pro^脯氨酸或羥基脯氨酸殘基)SEQIDNO:8ATCACCATAGCAGCGGC將產生的三個表達載體共轉染(co-transfected)到果蠅S2(Z)mw/M"52)細胞中。在殺稻瘋菌素(blasticidin)存在時培養這些細胞，以篩選出抗殺稻瘕菌素的細胞。收集細胞培養上清並通過Western印跡和ELISA來篩選出有抗EGFR和CD3的活性的抗體。發現一些克隆的細胞穩定地表達三股螺旋複合物。這些三股螺旋複合物，如人類迷你膠原蛋白XXI是^l氐抗熱與胃蛋白酶(p印sin)的。更重要的是，它們特異地與EGFR和CD3結合。實施例2在此實施例中，生成三個融合多肽OKT3—scFv-Col、erb—scFv-Col和erb—NSPD-scFv。噬菌體文庫的篩選通過篩選人類單摺疊的(singlefold)scFv噬菌體展示文庫(TomlinsonI+J;由I.M.TomlinsonandG.Winter,MRCLaboratoryofMolecularBiology,Cambridge,UK友情提供)，來分離erb噬菌粒(phagemid),該erb噬菌粒包含結合表皮生長因子受體月包夕卜區(epidermalgrowthfactorreceptorextracellulardomain,EGFR-ECD)的可變區片段(variablefragment)(scFv)。使用免疫管(immunotube)(Maxisorp;Nunc,Roskilde，Denmark)來進行篩選，其中所述免疫管用10嗎經純化的重組EGF受體(EGFR-ECD;ResearchDiagnostics,Inc.)的胞外區包被(coated)。根據製造商使用手冊進行封閉(blocking)、淘選(panning)、清洗、洗脫(elution)和^皮洗脫的嗟菌4立的再擴增(reamplification)。重組質體的構建從erb噬菌粒將編碼erb的scFv的cDNA通過PCR進行擴增。通過來自OKT3雜交瘤(ATCC,CRL-8001)的逆轉錄產物，獲得鼠的IgG2a抗-CD3mAb(OrthoPharmaceuticalCorporation)的編碼序列。根據公開的核香酸序列通過RT-PCR獲得OKT3mAb的V^和VH的cDNA。通過用甘氨酸接頭(glycine-linker)(GGGS)3連接Vh和V^鏈，來生成erb和OKT3的scFvPCR融合物。為了生成scFv-Col，scFv-Col的編碼區在N末端(N-terminal)包含scFv核苷酸序列並在C末端(C-terminal)包含合成膠原蛋白支架基因，該膠原蛋白支架基因編碼EPKSCDKTHTCPPCPRSIP(GPP)10GICDPSLCFSVIARRDPFRKGPNY的肽序列，其包含人類IgG的鉸鏈區、膠原蛋白結構域(collageneousdomainX用下劃線標記)和XXI型膠原蛋白的NC1區。合成的M^原蛋白支架多肽及其cDNA的序列分別為序列識別號9(SEQIDNO:9)和序列識別號10(SEQIDNO:10)。SEQIDNO:9yProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlvProProGlvProProGlyProProGWProProGlyProProGlylleCysAspProSerLeuCysPheSerVallleAlaArgArgAspProPheArgLysGlyProAsnTyrSEQIDNO:10CTAT此合成的序列(SEQIDNO:10)通過重疊的PCR以及將兩側具有Notl和Xhol位點的PCR產物克隆到表達載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的相同位置來製備。將erb與OKT3的scFv在Ascl與Notl位點框內克隆到包括上述C末端膠原蛋白支架的構建體(construct)中，以分別製備erb—scFv-Col和OKT3—scFv-Col的表達構建體(expressionconstruct)。之後生成erb一NSPD-scFv。NSPD-scFv的編碼區包含人類表面活性蛋白質D(SPD)(膠原凝集素家族的成員)的N末端254個胺基酸和在C末端的scFv。人類表面活性蛋白質D多肽的N末端254個胺基酸與其cDNA序列分別為序列識別號ll(SEQIDNO:ll)與序列識別號12(SEQIDNO:12)SEQIDNO:11GluAlaGluMetLysThrTyrSerHisArgThrMetProSerAlaCysThrLeuValMetCysSerSerValGluSerGlyLeuProGlyArgAspGlyArgAspGlyArgGluGlyProArgGlyGluLysGlyAspProGlyLeuProGlyAlaAlaGlyGlnAlaGlyMetProGlyGlnAlaGlyProValGlyProLysGlyAspAsnGlySerValGlyGluProGlyProLysGlyAspThrGlyProSerGlyProProGlyProProGlyValProGlProGlyProLysGlyGluAlaGlyProLysGlyGluValGlyAlaProGlyMetGlnGlySerAlaGlyAlaArgGlyLeuAlaGlyProLysGlyGluArgGlyValProGlyGlnGlySerProGlyAlaArgGlyProProGlyLeuLysGlyAspLysGlylleProGlyAspLysGlyAlaLysGlyGluSerGlyLeuProAspValAlaSerLeuArgGlnGlLysValGluLeuPheSEQIDNO:12將N末端SPDcDNA克隆到表達載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的Nhel和Ascl位點之間。將erb的scFv框內克隆至包含上述N末端SPD的構建體的Ascl和Xhol位點，以製備erb—NSPD-scFv的表達構建體。每個erb—scFv-Col、erb—NSPD-scFv和OKT3—scFv-Col的開放讀碼框(openreadingframe)包含編碼N末端前導序列(leadersequence)和以分泌、檯r測和純化為目的的C末端wye表位/多聚組氨酸(polyhistidine)標籤的序列。表一為通過上述表達構建體編碼的多種重組的蛋白質/抗體。表1.本研究中使用的多種抗體分子的綜述tableseeoriginaldocumentpage29膠原蛋白支架抗體抗體的表達與純化為了生成重組的蛋白質複合物/抗體,根據製造商使用手冊使用Effectene(Qiagen)將前述構建體轉染到小鼠骨髓瘤(myeloma)NSO細胞。在用均黴素(hygromycin)(400ng/ml)選擇4周後，將每個穩定的克隆在搖瓶(shakerflask)內以2xl05細胞/ml的起始接種密度在包含2%胎牛血清的化學確定的培養基(chemically-defmedmedium)HyQCDM4NS0(Hyclone)中培養。於37。C在150rpm維持培養5天。向那些帶有編碼蛋白質的表達構建體的細胞，每天將抗壞血酸鈉(Sodiumascorbate)(80jug/ml)加入培養基中，其中上述蛋白質包含前述抗體區域與膠原蛋白支架區，即膠原蛋白支架抗體(CSA)。為了純化erb—scFv、erb一scFv-Fc、erb一scFv-Col或OKT3—scFv-Col蛋白質或蛋白質複合物，將約2L的每種過濾細胞培養基以60ml/小時的流速上樣至用50mM的Tris-HCl緩衝溶液(pH8)平衡的T-凝膠柱(1.5x8cm,Pierce)。在以相同的緩衝溶液清洗後，以50mM的醋酸鈉緩衝溶液(pH4)洗脫重組的蛋白質或蛋白質複合物。在280nm監測其UV吸收，並將其洗脫的高峰部分以60ml/'J、時的流速上樣到硫酸鋅-帶電荷(charged)螯合的SepharoseHighTrap柱(l-ml柱床體積，GEHealthcare),該柱用包含0.5MNaCl的50mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH8)平衡。先以20mM的咪唑(imidazole)清洗，之後在相同的緩衝溶液中用0.25M的咪唑洗脫出結合的蛋白質或蛋白質複合物。最後的製備物用50mM,pH7.0的Hepes緩衝溶液進行透析。之後使用具有MOPS的10%NuPAGEbis-Tris聚丙烯醯胺凝膠或7%SDS/Tris-醋酸聚丙烯醯胺凝膠、以醋酸鈉作為電泳緩衝溶液(ru皿ingbuffer)(Invitrogen)進行SDS-PAGE。之後用考馬斯亮藍(Coomassiebrilliantblue)R-250染色蛋白質。通過利用Chemilmager5500(AlphaInnotech，SanLeandro,CA)及AlphaEaseFC(v.4.0;AlphaInnotech)軟體的光密度測量法(densitometry)來定量蛋白質帶(band)的密度。為了驗證三股螺旋的性質，將經純化的erb—scFv-Col(lmg/ml)在DTT缺無或存在的情況下於37。C培養1小時。將來自經DTT處理過的樣本的整分(aliquot),進一步與50mMN-乙基順丁烯二醯亞胺(N-ethyl-maleimide,NEM)於室溫反應30分鐘，以永久地防止游離巰基(sulfhydryl)和三聚體的再形成。取等量的每個樣本的蛋白質在7。/。SDS/Tris-醋酸聚丙烯醯胺凝膠中、以醋酸鈉作為電泳緩衝溶液進行電泳。用考馬斯藍(Coomassieblue)作凝膠染色。發現經純化的CSA為同源三聚體(homotrimer)或鏈間二硫鍵六聚體(heximer),在輕微的還原環境其可被分離成兩個三聚體。測試erb一scFv-Col的三聚體結構的熱穩定性。在含有2M尿素(urea)的50mMTris-HCl(pH8)中，經純化的erb—scFv-Col於室溫在缺無或存在10mM三(2-羧乙基)磷化氫(tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)時進行處理。於室溫將還原的樣本用50mM的NEM進行烷基化(alkylate)。與SDS凝膠上樣緩衝溶液(loadingbuffer)混合之前將取等量蛋白質的每份樣本於35、45、55、65、75與85。C加熱10分鐘。於非還原狀態下將樣本在10%NuPAGEbis-Tris聚丙烯醯胺凝膠並在MOPS緩衝溶液中進行電泳。以考馬斯藍(Coomassieblue)進行凝膠染色。結果顯示erb一scFv-Col三聚體具有高度熱穩定性。在經65°C處理10分鐘之後仍然保留多於50%的三聚體。且發現了erb一scFv-CoI膠原蛋白結構域的三聚體結構被脯氨醯羥基化(prolylhydroxylate)。結合研究使用BIAcoreXbiosensor(BIACORE,Inc.,Uppsala,Sweden)於運行緩衝液(runningbuffer)HBS-EP(10mMHEPES,pH7.4，150mMNaCl,3mMEDTA,0.005%表面活性劑P20)中測量erb抗體的變體對EGFR-ECD的結合動力學。簡單來說，將EGFR-ECD經由胺綴合(aminecoupling)固定於CI感應晶片達到1700應答單位(responseunits,RU)的程度，並且以10|11/分鐘的流速注入不同濃度的純化抗體。通過注入5^110mM甘氨酸-鹽酸(glycine-HCl)(pH3.5)再生(regenerate)表面。在每個濃度取得感應譜(sensorgram)並使用程序BIAEvaluation3.2來洗脫感應譜。將結合數據填入1:1Langmuir結合模型來計算親和力常數^)，其被定義為分離率(dissociationrate)(k血》/結合率(associationrate)(k。J的比值。結果顯示於表2。表2.erb抗體的多種形式與固定化的EGFR-ECD結合的結合動力學tableseeoriginaldocumentpage31如表2所示，erb—scFv—Col對EGFR-ECD的結合親和力幾乎分別為二價(erb—scFv-Fc)和一i"介(erb—scFv)mAb對應物(counterpart)的20和10004咅。穩定性與藥物動力學(Pharmacokinetic)分析為了進行血清穩定性的分析，通過於37。C與人類血清溫育來測量erb—scFv—Col、erb—scFv-Fc或erb—scFv的erb抗體的多種形式的穩定性。通過定量ELISA來測量在溫育時間的不同時期之後保留的活化抗-EGFR的量。使用重組EGFR-ECD(作為捕捉試劑(capturereagent))和抗-c-m少c的mAb(9E10,SigmaChemicalCo.),之後再用HRP偶聯的親合純化的多克隆山羊抗小鼠IgG和化學發光底物(chemiluminescentsubstrate)(PierceBiotechnology,Inc.)進行ELISA。為了作藥物動力學分析，使用三隻BALB/c棵鼠來分析erb_scFv—Col清除率(clearance)。簡單而言，在事先採血之後，給每隻小鼠皮下(subcutaneously,s.c.)注射25|ig(2mg/體重Kg)的erb—scFv一Col。在接下來的70小時中，收集周期性的血液樣本並通過ELISA來評估它們的erb—scFv—Col含量。結果發現此蛋白質相當穩定。T細胞增殖(proliferation)分析與混合淋巴細胞反應(MixedLymphocyteReaction)進行5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)細胞增殖分析。簡單地說，在96孔平底組織培養盤(flatbottomtissuecultureplate)中，將人類外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell)以2乂105糹田胞/孑匕在100^包含10%FBS的RPMI-1640培養基中，於37。C在存在10倍連續稀釋的OKT3(eBioscience,Inc.)或OKT3—scFv-Col時培養66小時。之後將細胞與lOpM的BrdU脈衝6小時。在移除培養基後，固定細胞，並用FixDenat一步變性DNA。之後將細胞與過氧化物酶(peroxidase)標記的抗-BrdU抗體(anti-BrdUPOD,Fab片段)在室溫一起培養1.5小時。使用微滴板發光計(microplate-luminometer)(Hidex,CHAMELEON4企測平臺，Finland)來進行化學發光檢測和定量。用單向混合淋巴細胞反應如下評估T細胞增殖和免疫抑制(immunosuppression)。乂人兩個#:康的供者(刺者(stimulator)和反應者(responder))獲得人類外周血單個核細胞。於37。C在包含5%C02的潮溼空氣中，用25jig/ml絲裂黴素C(Sigma-Aldrich)在完全培養基(RPMI1640,補充了10%人類AB血清(humanABserum)、2mM穀氨醯胺(glutamine)、50nM2-硫基乙醇(2-mercaptoetha加l)、和青黴素(penicillin)以及鏈黴素(streptomycin)各100單位/ml)處理刺激者或反應者的細胞30分鐘，接著在RPMI1640培養基中清洗三次。將反應者細胞單獨培養或與經絲裂黴素C處理的刺激者或經絲裂黴素C處理的反應者的細胞以1:1的比例混合，在200pl的完全培養基中以2xl05細胞/孔進行培養。在置入反應者細胞後，立即將純化的OKT3—scFv-Col或OKT3以不同濃度加入培養基中。5天後將培養的細胞與lOpM的BrdU脈衝，並在24小時後收穫細胞。之後以上述方法進行細胞增殖分析。結果發現，雖然表現出對刺激T細胞增殖上的可忽略的促有絲分裂活性，OKT3—scFv-Col對於免疫抑制性T細胞的增殖是較有效的。細胞因子測量將人類外周血單個核細胞在O.lml包含10%FBS的RPMI-1640培養基中以2xl05細胞/孔，於37。C在10倍稀釋的OKT3(eBioscience,Inc.)或OKT3—scFv-Col存在下進行培養。於不同的時間點收集上清，並使用人類細胞因子免疫分析試劑盒(eBioscience,Inc.)來測量多種細胞因子。結果表明，與鼠的OKT3mAb相較而言，OKT3一scFv-Co1的施用導致可忽略的細胞因子釋放。抗體替代分析(replacementassay)所有如下方法都在4。C進行。將人類T細胞以lxl(^細胞/ml的密度懸浮於FCM緩衝溶液(磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate-bufferedsaline)與2%FBS和0.1%疊氮化鈉(sodiumazide))中。用小鼠全IgG(totalIgG)(2pg/ml,JacksonImmunoResearchLaboratories)處理細月包30分鐘，之後與連續稀釋的OKT3—scFv-Col或OKT3抗體一起溫育1小時。直接加入固定飽和量(通過流式細胞術(cytometry)測定)的FITC-偶聯的OKT3(0.25jug/ml，購自eBioscience,Inc.)。在溫育1小時後，將細胞用FCM緩衝溶液清洗並通過流式細胞術在FACScan(BectonDickinson,SanJose,CA)上進行免疫螢光分析。結果顯示為最大螢光強度的抑制百分比，其定義為通過在缺乏封閉抗體(blockingantibodies)的情況下用OKT3-FITC染色T細胞所獲得的平均螢光強度。結果表明OKT3_scFv-Col與人類CD3+T細胞的結合強於天然的鼠的OKTmAb。使用人類IgG作為標準品，通過Bradford分析(Coomassieplus試劑，來自PierceBiotechnology,Inc.)來測量蛋白質濃度。對於胺基酸分析，將純化的erb—scFv-Col用50mM醋酸進行透析，在6NHC1於1l(TC進行水解24小時之後，在WatersPico'Tag系統內進行胺基酸分析。這些結果證明膠原蛋白支架抗體在抗腫瘤與免疫調節(immunomodulatory)的應用上對於治療性抗體的設計而言是理想的結構。可以任何方式來組合本說明書公開的所有特徵。本說明書公開的每項特徵可以用其相同、等同或類似目的的特徵來替代。因此，除非另外說明，所公開的每項特徵都只是一系列等同或類似特徵中的一個例子。本發明雖然披露了如上的優選實施例，然而它們並非用於限制本發明，任何本領域技術人員，可作一些不背離本發明精神和範圍的變動與修改。因此本發明的保護範圍應以權利要求限定的範圍為準。33序列表〈nO>財團法人工業技術研究院(IndustrialTechnologyResearchInstitute)以重組的三:股螺旋支架為基礎的複合物12<170〉Patentlnversion3.3<210〉1242PRT人<400〉1Met1AlaGluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuVal510GinPro15GlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSer202530SerTyrAlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGly354045LeuGluTrpValSerAsplieGlyAla5055SerGlySerAlaThrSerTyrAlaAsp60SerValLysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLys657075LeuTyrLeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAla8590TyrCysAlaLysSerThrThrThrPheAsp100105LeuValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySer115120TyrTrpGlyGlyGly125Gin110GlyAsnThr80ValTyr95GlyThrGlySerGlyGlyGlyGlySerThrAsplieGinMetThrGinSerProSerSer130135140LeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSer145150155160GinSerlieSerSerTyrLeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLys165170175AlaProLysLeuLeulieTyrAspAlaSerAlaLeuGinSerGlyVal180185190ProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThr195200205lieSerSerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGin210215220TyrAlaAspTyrProThrThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulie225230235240LysArg〈210〉2726<212〉畫<213〉人<400〉2atggccgaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctg60agactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgc120caggctccagggaaggggctggagtgggtctcagatattggtgcttctggttctgctaca180tcttacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacg240ctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaa300tctactactacttttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagcggtgga360ggcggttcaggcggaggtggcagcggcggtggcgggtcgacggacatccagatgacccag420tctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagt480cagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctc540ctgatctatgatgcatccgctttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtgga600tctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttac660tactgtcaacagtatgctgattatcctactacgttxggccaagggaccaaggtggaaatc720犯acgg7263<211〉240PRT<213〉人<400〉3ValGinLeu1ValLysMetMetHisTrp35TyrlieAsn50AspLysAla65GinGinSerGlyAlaGluLeuAlaArgPro10Ser205CysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr25ValLysGinArgProGlyGinGlyLeu40ProSerArgGly55ThrLeuThrThr70GinLeuSerSerLeuThrSei:85ArgTyrTyrAspAspHis100ThrValThr115GlyGlyGly130VaJSerSerTyrGlyTyrAspGluCysGly120ThrAsnTyrAsn60LysAspSer90AlaValLeu105Asp丁yrGlyGlySerTrpGlyGlu45GinSerSerSerThr75TyrGlyGly125GlyAla15ArgTyr30TrplieLysPheAlaTyrTyrCys95GinGly110SerThrGlyLysMet80AlaThrGlyGlySerGlySerA印lieValLeuThrGinSerProAlalieMet135140SerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSerAlaSerSer145150155160SerValSerTyrMetAsnTrpTyrGinGinLysSerGly丁hrSerPro165170175LysArgTrplieTyrAspThrSerLysLeuAlaSerGlyValProAla180185190HisPheArgGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSer195200205GlyMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGinGinTrpSer210215220SerAsnProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluLeuLysArg225230235240〈210〉4720〈212〉DNA<213〉人〈400〉4gtccagctgctgcaaggcttggacagggtccag犯gttcacaactgagcagatcattactggcggttcagccagcaatcaagtgtaagtttatgacacatacctcttactcagc站tggaagcagtcaggctggctacactggaatggataggac卿gcgcctgacatcgccttgactsgcgg鄉tggtgtctgcatcacatgaactgccaaactggcctctcacaatgtagtaacccggctgaactgctttactaggtggatacattcacattgacttgaggactctctggggcc犯ctctggcggttcc娜gg鄧gtaccagcagttctggagtccagcggcatgattcacgttcgcaagacctgtacacgatgcaatcctagccacagacaaatgcagtctattgggaccacggggcggatcggaaggtcaccaaagtcaggcacctgctcactgaggctgaagggctcggggsgggcctcagt3Ctgggt犯3gtggttataccctccagcacactgtgcaagtcaccgtctcacattgtgcttgacctgcagcctcccccaatcaggggcagatgctgccacCC肌gCtgg3gaagatgtccacagaggccttaattacaatagcctacatgatattatgatctc鄉tggsaacccagtcttgccagctcaaagatggatttgggtctgggttattactgcgctgaaacga60120180240300360420■540600660720〈210〉5239PRT<213〉人<400〉5ValLysLeuGinGluSerGlySerGluMetAlaArgProGlyAlaSer151015ValLysLeuProCysLysAlaSerGlyAspThrPheThrSerTyrTrp202530MetHisTrpValLysGinArgHisGlyHisGlyProGluTrplieGly354045AsnlieTyrProGlySerGlyGlyThrAsnTyrAlaGluLysPheLys505560AsnLysValThr65HisLeuSerArgArgSerGlyGly100ValThrValSer115GlyGlyGlySer130GlyAspGinAla145AsnAsnGlylieSerProLysLeu180ProAspArgPhe195lieSerArgVal210GlySerHisHis225LeuThrVal70LeuThrSer85ProTyrPheSerGlyGlyMetThrGin135SerlieSer150ThrTyrLeu165LeulieTyrSerGlySerGluAlaGlu215ProProThr230AspArgSerSerArgThrValTyr75GluAspPheAsp105Phe90TyrGlyGly120SerAlaValTyrTrpGlyGlyGlyGinTyrCys95GlyThr110Gly125GlySerThrProLeuSerLeuProValSerLeu140Ser155CysArgSerSerGinAsnlieValGluTrpTyr170LeuGinArgLysVal185GlySer200AspLeuPheGlySerAspArgPheAspProGly175SerGly190Met80ThrThrGlyLeuHis160GinValGlyGlyGlyThrlieGly235Phe205ThrLeuLysTyr220TyrCysPheGinThrLysLeuGlu<210〉6717〈212〉DNA人〈400〉6gtcaagctgcaggagtcagggtctgagatggcgaggcctggagcttcagtgaagctgccc60tgcaaggcttctggcgacacattcaccagttactggatgcactgggtgaagcagaggcat120ggacatggccctgagtggatcggaaatatttatccaggtagtggtggtactaactacgct180gagaagttcaagaacaaggtcactctgactgtagacaggtcctcccgcacagtctacatg240cacctcagcaggctgacatctgaggactttgcggtctattattgtacaagatcggggggt300ccctacttctttgactactggggcca站ggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggc360ggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgatgacccaaactccactctccctg420cctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagaacattgtacat480aataatggaatcacctatttagaatggtacctgcaaaggccaggccagtctccaaagctc540ctgatctacaaagtttccgaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtgga600tcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtagaggctgaggatctgggaatttat660tactgctttcaaggttcacatcatcctcccacgttcggcggggggaccaagctggaa717〈210〉7164<212〉PRT〈213〉人7GlyGlyArgGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProPro151015CysProArgSerlieProGlyProProGlyProlieGlyProGluGly202530ProArgGlyLeuProGlyLeuProGlyArgAspGlyValProGlyLeu354045ValGlyValProGlyArgProGlyValArgGlyLeuLysGlyLeuPro505560GlyArgAsnGlyGluLysGlySerGinGlyPheGlyTyrProGlyGlu65707580GinGlyProProGlyProProGlyProGluGlyProProGlylieSer859095LysGluGlyProProGlyAspProGlyLeuProGlyLysAspGlyAsp100105110HisGlyLysProGlylieGinGlyGinProGlyProProGlylieCys115120125AspProSerLeuCysPheSerVallieAlaArgArgAspProPheArg130135140LysGlyProAsnTyrSerLeuAspAspSerSerHisHisHisHisHis145150155160HisSerSerGly8<211〉492〈212〉DNA人<400〉8ggcggccgcgattcctgggcgg卿卿tg犯aggcctaccaaggtcctcccaggagacccaaccaggccgatccgttcacatagcagcgagcccaaatccacctggtccgtgttcctggcagg朋gaaactggtccccccaggtctcccCCCC3ggC2Ltg肌犯gg3CCgcttgtg3C3肌g3taggcccaattagtgggtaggtcc卿gtggcaaagatctgcgacccaactcacacatgagggtcccagtccctggacgggagcc卿ggccctcctggg卿ccatgtcactatgttctagacgacagcccaccgtggaggatteccgtccaggtgtggtttgggtagaataagcaagaaaacctggttagtgtaatgcagccatcacccaagatcttggtttgccacagaggattatcctggagaaag犯ggtcctaatccaagggtgccagaagatcaccatcac60120180240300360420480492〈210〉9〈211〉73〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉9GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProArg151015SerlieProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGly202530ProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyPro354045ProGlylieCysAspProSerLeuCysPheSerVallieAlaArgArg505560AspProPheArgLysGlyProAsnTyr657010219DNA人工序列<400〉10gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaagatctattcctggg60ccacctggtcccccaggtcctccaggacccccagggcccccaggcccccccgggccgcct120ggacccccagggccaccaggccccccaggcatctgcgacccatcactatgttttagtgta180attgccagaagagatccgttcagaaaaggaccaaactat219<210〉11254PRT人<400〉11MetLeuLeuPheLeuLeuSerAlaLeuValLeuLeuThrGinProLeu151015GlyTyrLeuGluAlaGluMetLysThrTyrSerHisArgThrMetPro202530SerAlaCysThrLeuValMetCysSerSerValGluSerGlyLeuPro354045GlyArgAspGlyArgAspGlyArgGluGlyProArgGlyGluLysGly505560AspProGlyLeuProGlyAlaAlaGlyGinAlaGlyMetProGlyGin65707580AlaGlyProValGlyProLysGlyA印AsnGlySerValGlyGluPro85恥95GlyProLysGlyAspThrGlyProSerGlyProProGlyProProGly100105110ValProGlyProAlaGlyArgGluGlyProLeuGlyLysGinGlyAsn115120125lieGlyProGinGlyLysProGlyProLysGlyGluAlaGlyProLys130135140GlyGluValGlyAlaProGlyMetGinGlySerAlaGlyAlaArgGly145150155160LeuAlaGlyProLysGlyGluArgGlyValProGlyGluArgGlyVal165170175ProGlyAsnThrGlyAlaAlaGlySerAlaGlyAlaMetGlyProGin180185190GlySerProGlyAlaArgGlyProProGlyLeuLysGlyAspLysGly195200205lieProGlyAspLysGlyAlaLysGlyGluSerGlyLeuProAspVal210215220AlaSerLeuArgGinGinValGluAlaLeuGinGlyGinValGinHis225230235240LeuGinAlaAlaPheSerGinTyrLysLysValGluLeuPhe245250<210〉12〈211〉762DNA人〈400〉12atgctgctctgcagaaatgaagctcagtgggctggcccaggacactgggcggtcccctgggctgggcccactcgcaggccggggcagcagccgggattgacttccagatgctccaggctgtcctcctctcagacctactcagagtggcctgggaccc鄉ttgggcccaacaagtggaccggaagc郷gct卿gg卿ggtctgctggttgcttctctctttctctcatgcactggtcccax:a^g犯CELgcctggtcgctttgccaggaagggga認ttccaggacctgaacataggaEiggtgccccagcgaggtgtcagccatgggtaggcattcctg鄉cagcaggtat已ag^actgctcacacatgcccagtggatggacggggctgcagggcggctctgttgcccggtgtgccctca鵬caggcatgcaggcctggtgagcccccagggaagg卿ca卿gttgaggcctgttgagctctagcccctgggcttgcaccctatgggag卿幼gC3gggatgagaacctggctggtccagcagccaggcccgctcggcagggtggsgtcccgtccaggtgcgagca犯gggtacagggacatcCtaCCtgg￡L￡Lggtcatgtgtgggccctcgggcctggacaatgg犯g卿3ggcaagaggctggaaacacacaggggacccaga犯gtgggagtacagcac6012018024030036042048054060066072076權利要求1.重組蛋白質複合物，其包含第一融合多肽鏈，包含第一支架區和與該第一支架區一端融合的第一異源性區；第二融合多肽鏈，包含第二支架區；以及第三融合多肽鏈，包含第三支架區；其中該第一、第二與第三支架區互相排列以形成三股螺旋巻曲。2.如權利要求1所述的重組蛋白質複合物，其中該異源性區包含結合區。3.如權利要求2所述的重組蛋白質複合物，其中該結合區包含配體結合區、配體、受體、親和標記物或蛋白聚糖。4.如權利要求2所述的重組蛋白質複合物，其中該結合區包含免疫球蛋白的一個或多個互補決定區。5.如權利要求4所述的重組蛋白質複合物，其中該結合區包含抗原結合片段的序列。6.如權利要求5所述的重組蛋白質複合物，其中該抗原結合片段與CD3或EGFR特異性結合。7.如權利要求5所述的重組蛋白質複合物，其中該抗原結合片段包含單鏈抗體的序列。8.如權利要求1所述的重組蛋白質複合物，其中該第一融合多肽鏈還包含與該第一支架區另一端融合的第二異源性區。9.如權利要求8所述的重組蛋白質複合物，其中該第一異源性區包含第一單鏈抗體的序列，該第一單鏈抗體與CD3特異性結合。10.如權利要求8所述的重組蛋白質複合物，其中該第二異源性區包含第二單鏈抗體的序列，該第二單鏈抗體與EGFR特異性結合。11.如權利要求8所述的重組蛋白質複合物，其中該第二融合多肽鏈包含與該第二支架區一端融合的第三異源性區。12.如權利要求11所述的重組蛋白質複合物，其中該第二融合多肽鏈還包含與該第二支架區另一端融合的第四異源性區。13.如權利要求12所述的重組蛋白質複合物，其中該第三融合多肽鏈包含與該第三支架區一端融合的第五異源性區。14.如權利要求13所述的重組蛋白質複合物，其中該第三融合多肽鏈包含與該第三支架區另一端融合的第六異源性區。15.如權利要求1所述的重組蛋白質複合物，其中該第一、第二或第三支架區包含一個或多個三股螺旋重複序列，每個重複序列包含下式的序列(Xl-X2-X3)n，其中XI是Gly殘基，X2或X3是任何胺基酸殘基，n大於或等於5。16.如權利要求15所述的重組蛋白質複合物，其中該第一、第二或第三支架區包含Clq、膠原凝集素或膠原蛋白多肽鏈的一個或多個三股螺旋重複序列。17.如權利要求15所述的重組蛋白質複合物，其中X3是脯氨酸或羥脯氨酸殘基。18.如權利要求15所述的重組蛋白質複合物，其中每個重複序列都包含(GPP)K)的序列。19.如權利要求1所述的重組蛋白質複合物，其中該異源性區包含酶區域或螢光蛋白質的序列。20.如權利要求1所述的重組蛋白質複合物，其中該第一、第二與第三融合多肽基本相同。21.重組融合多肽，其包含支架區，用於形成三股螺旋巻曲，和與該支架區域一端融合的第一異源性區。22.如權利要求21所述的重組融合多肽，其中該支架區包含一個或多個三股螺旋重複序列，每個重複序列包括下式的序列(Xl-X2-X3)n，其中Xl是Gly殘基，X2或X3是任何胺基酸殘基，並且n大於或等於5。23.如權利要求22所述的重組融合多肽，其中X3是脯氨酸或羥脯氨酸殘基。24.如權利要求21所述的重組融合多肽，其還包含與該支架區另一端融合的第二異源性區域。25.如權利要求21所述的重組融合多肽，其中該支架區包含Clq、膠原凝集素或膠原蛋白多肽鏈的一個或多個三股螺旋重複序列。26.如權利要求21所述的重組融合多肽，其中該異源性區包含配體結合區、配體、受體或多糖。27.如權利要求21所述的重組融合多肽，其中所述異源性區通過噬菌體展示篩選獲得。28.分離的核酸，其包含編碼權利要求21所述的融合多肽的序列或其互補序列。29.宿主細胞，其包含權利要求28所述的核酸。30.如權利要求29所述的宿主細胞，其中該細胞是哺乳動物或昆蟲的細胞。31.如權利要求30所述的宿主細胞，其中該哺乳動物的細胞為小鼠骨髓瘤NS0細胞。32.表達載體，其包含權利要求28所述的核酸。33.產生融合多肽的方法，其包括在允許多肽表達的情況下培養權利要求29所述的宿主細胞，其中該多肽由核酸編碼，以及從培養的細胞或該細胞的培養基中純化該多肽。34.產生權利要求1所述的蛋白質複合物的方法，包括在允許表達由三種核酸編碼的多肽並在它們之間形成三股螺旋巻曲的情況下在培養基中培養宿主細胞，該宿主細胞包含編碼第一融合多肽鏈的第一核酸，該第一融合多肽鏈包含第一支架區和與第一支架區的一端融合的第一異源性區域；編碼第二融合多肽鏈的第二核酸，該第二融合多肽鏈包含第二支架區；和編碼第三融合多肽鏈的第三核酸，該第三融合多肽鏈包含第三支架區；以及從培養的細胞或該細胞的培養基中純化該蛋白質複合物。35.如權利要求34所述的產生蛋白質複合物的方法，其中該宿主細胞為真核細胞，其包含使脯氨酸殘基羥基化的酶活性。全文摘要本發明披露了一種蛋白質複合物，其包括形成三股螺旋捲曲的融合多肽鏈，每條鏈具有支架區和異源性區。本發明也披露了相關的分離的融合多肽、核酸、載體、宿主細胞及製備方法。文檔編號C12P21/02GK101311193SQ200710104159公開日2008年11月26日申請日期2007年5月21日優先權日2007年5月21日發明者周民元,李秀娟,範佳玉,黃娟娟申請人:財團法人工業技術研究院