類異戊二烯的製備的製作方法

2023-04-26 12:07:16

專利名稱：類異戊二烯的製備的製作方法
技術領域：
本發明提供了有效製備類異戊二烯的組合物和方法等。本發明還提供了用於進行 該方法的核酸、酶、表達載體和遺傳改良的宿主細胞。本發明還提供了從遺傳改良的宿主細 胞以高產率製備類異戊二烯的發酵方法。
背景技術：
類異戊二烯在自然界中無處不在。它們組成了超過40，000個不同產物的多樣化 家族，其中的許多產物對活生物體是至關重要的。類異戊二烯可以保持細胞流動性、電子傳 遞、和其他代謝功能。大量的天然和合成的類異戊二烯可用作藥物、化妝品、香水、顏料和著 色劑、殺真菌劑、防腐劑、營養藥品、和精細化工中間體。類異戊二烯產物典型地由重複的五碳異戊烯基焦磷酸(IPP)單元構成，儘管已經 報導了不規則的類異戊二烯和多萜。在自然界中，類異戊二烯通過它們的前體IPP及其異 構體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的連續縮合而合成。這些前體的兩條途徑是已知的。除 了植物之外的真核生物一般使用甲羥戊酸依賴(MEV)途徑來將乙醯輔酶A(乙醯-CoA)轉 化成IPP，其隨後異構成DMAPP。原核細胞(除了一些例外)通常僅使用甲羥戊酸-非依賴性 的或脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑來生成IPP和DMAPP。植物同時使用MEV途徑和DXP途 徑。參見 Rohmer 等(1993) Biochem. J. 295 :517_524 ；Lange 等(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(24) :13172-13177 ;Rohdich 等(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1158-1163。傳統上，通過從自然資源例如植物、微生物和動物中的提取來製備類異戊二烯。但 是，由於許多顯著的限制，通過提取獲得的產量通常非常低。首先，大多數類異戊二烯在自 然界中僅以很少的量積累。其次，來源生物一般並不適合大規模培養，而大規模培養是製備 商業可接受數量的期望的類異戊二烯所必需的。第三，提取類異戊二烯所需的某些有毒溶 劑需要特殊的操作和處理程序，因此使得類異戊二烯的商業化製備變得複雜。MEV和DXP代謝途徑的闡明使得類異戊二烯的生物合成製備變得可行。例如，已 經對微生物進行了工程改造以過量表達一部分或全部甲羥戊酸途徑，用於製備命名為紫穗 槐-4，11- 二烯的類異戊二烯(美國專利號7，172，886和7，192，751)。其它努力集中在對 甘油醛-3-磷酸和丙酮酸的整體的平衡，或增加1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs) 和 IPP 異構酶(idi)的表達。參見 Farmer 等(2001) Biotechnol. Prog. 17 :57_61 ；Kajiwara 等(1997)Biochem. J. 324 :421_426 ；和 Kim 等(2001)Biotechnol. Bioeng. 72 :408_415。然而，鑑於許多商業應用需要非常大量的類異戊二烯產物，對製備比當前技術可 得到的量甚至更多的類異戊二烯的表達系統和發酵程序仍然存在需求。實現微生物代謝向 類異戊二烯生成的最佳轉向需要對引入的生物合成途徑適當地進行工程改造，以有效地將碳導入類異戊二烯的生成並同時在持續時間段內防止代謝中間產物的有毒水平的形成。本 發明提供了符合該需要並提供了相關益處的組合物和方法。發明概述 本發明提供了高效製備類異戊二烯的組合物和方法。合適的類異戊二烯的非限制 性例子包括半萜(源自1個異戊二烯單元)，例如異戊二烯；單萜(源自2個異戊二烯單 元)，例如月桂烯；倍半萜(源自3個異戊二烯單元)，例如紫穗槐_4，11- 二烯；二萜(源自 四個異戊二烯單元)，例如紫杉烯；三萜(源自6個異戊二烯單元)，例如鯊烯；四萜(源自 8個類異戊二烯)，例如β _胡蘿蔔素；和多萜(源自多於8個異戊二烯單元)，例如聚異戊 -~ 火布ο一方面，提供了用於製備類異戊二烯化合物的方法，其中該方法包含(a)獲得多個能夠生成類異戊二烯化合物的宿主細胞，其包含了整合進染色體的 外源核酸序列，該序列編碼MEV或DXP途徑的酶；(b)在一定條件下，在培養基中培養該宿主細胞，其中該宿主細胞使用乙醇作為碳 源並生成類異戊二烯化合物；和(c)從該培養基中回收類異戊二烯化合物。在一些實施方案中，被宿主細胞作為碳源消耗的乙醇是由宿主細胞生成的。在其 它實施方案中，被宿主細胞作為碳源消耗的乙醇是外源提供給培養基的。另一方面，提供了用於製備類異戊二烯化合物的方法，其包含(a)獲得多個能夠生成類異戊二烯化合物的宿主細胞；(b)在乙醇含量等於或大於約1克每升培養基的培養基中，培養該宿主細胞至少 四小時；和(c)從該培養基中回收類異戊二烯化合物。又一方面，提供了用於製備類異戊二烯化合物的方法，其包含(a)獲得多個能夠生成類異戊二烯化合物的酵母細胞；(b)通過向培養基提供碳源，培養該酵母細胞以形成生物量；(c)將該細胞保持在一定條件下至少四小時，在該條件下，該酵母細胞的乙醇消耗 率等於或大於約0.01克乙醇每克細胞乾重每小時；和(d)從該培養基中回收類異戊二烯化合物。在一些實施方案中，宿主細胞使用MEV途徑生成類異戊二烯化合物。在其它實施 方案中，宿主細胞使用DXP途徑生成類異戊二烯化合物。在其它實施方案中，宿主細胞在氧氣限制條件下培養或維持至少一段時間。在又 一些實施方案中，宿主細胞在磷酸鹽限制條件下培養或維持至少一段時間。通過引用的納入本說明書中提及的所有公開物和專利申請都以相同的程度通過引用納入本文，就 如同每個獨立的公開物或專利申請被特別且單獨地說明通過引用納入本文一樣。附圖簡要描述

圖1是生成異戊烯基焦磷酸(「IPP」)的甲羥戊酸(「MEV」)途徑的示意圖。圖2是生成異戊烯基焦磷酸(「IPP」)和二甲基烯丙基焦磷酸(「DMAPP」)的1_脫 氧-D-木酮糖5-二磷酸(「DXP」)途徑的圖解說明。Dxs是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶；Dxr是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(也稱作IspC) ； IspD是4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合成酶；IspE是4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合成酶； IspF是2C-甲基-D-赤蘚糖醇2，4-環二磷酸合成酶；IspG是1-羥基-2-甲基_2_(E)-丁 烯基4-二磷酸合成酶(IspG)；而且ispH是異戊烯基/ 二甲基烯丙基二磷酸合成酶。圖3是異戊烯基焦磷酸(「IPP」)和二甲基烯丙基焦磷酸(「DMAPP」)轉化成香 葉基焦磷酸(「GPP」)、法尼西基焦磷酸(「FPP」)、和香葉基香葉基焦磷酸(「GGPP」)，以 及合成各種類異戊二烯的示意圖。圖 4 顯示 了 DNA 片段 ERG20-PGAL_tHMGR(A)、ERG 13-PGAL_tHMGR(B)、 IDIl-PGAL-tHMGR(C)、ERG10-PGAL-ERG12(D)、ERG8-PGAL-ERG19 (E)、GAL745 1021-HPH-GAL11637 至 2587 (F)、GAL80—50 至—iNatR-GALSO1309 至 1358 (G)、和 GALl1 至 48-NatR-GALl1500 至 1550 (H)的圖譜。圖5顯示了質粒pAM404的圖譜。圖6顯示了菌株Y337在碳限制下使用葡萄糖給料或葡萄糖/乙醇混合給料的細 胞生長和紫穗槐-4，11-二烯(AD)的生成。圖7A顯示了 CO2控制給料算法的圖表。圖7B顯示了使用乙醇脈衝給料時菌株 Y293的二氧化碳演化速率、底物遞送、生長、和紫穗槐_4，11- 二烯的生成。圖8顯示了菌株Y293在碳限制下使用濃縮葡萄糖給料供初始生長，接著使用乙醇 給料供紫穗槐_4，11- 二烯生成的細胞生長和紫穗槐_4，11- 二烯的生成。圖9A到9E顯示了菌株Y677在油酸甲酯存在或缺乏下在補料分批、僅用乙醇給料 的限碳發酵中的乙醇生成/消耗、給料速率、生長、碳演化和氧氣利用率、以及法呢烯的生 成。圖IOA到IOD顯示了菌株Y283在不同程度的氧氣限制下的溶解氧濃度、生長、乙 醇生成/消耗、和紫穗槐_4，11- 二烯的生成。圖IOE到IOG顯示了菌株Y352在不同程度的氧氣限制下的生長、乙醇生成/消耗、 和法呢烯的生成。圖11顯示了搖瓶中的菌株Y337在碳限制下在不同濃度的KH2PO4T每個細胞的紫 穗槐-4，11-二烯生成率。圖12顯示了菌株Y337在碳和磷酸鹽限制下使用葡萄糖給料的補料分批發酵器給 料㈧和細胞生長⑶和紫穗槐_4，11-二烯生成(C)。圖13顯示了菌株Y337在碳和磷酸鹽限制下使用葡萄糖/乙醇混合給料的細胞生 長㈧和紫穗槐_4，11- 二烯生成⑶。圖14圖示了長度為100個核苷酸的基因組位點特異性序列的生成，所述序列作 為啟動子_基因-FRT-Kan-FRT盒的側翼可用於異源核苷酸序列在大腸桿菌(Escherichia coli)基因組中的整合。圖15顯示了質粒pAM618的圖譜。發明詳細描述定義除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語均具有本領域普通技術人員常規 理解的含義。在此提及的一些術語應被定義為具有以下含義
術語「可選的」或「可選地」指隨後描述的特徵或結構可以存在或不存在，或者隨 後描述的事件或情況可以發生或不發生，且該描述包括特定特徵或結構存在的情況和該特 徵或結構不存在的情況，或者特定事件或情況發生的情況和該事件或情況不發生的情況。
本文使用的術語「代謝途徑」指分解代謝途徑或合成代謝途徑。合成代謝途徑涉 及自較小分子構成較大分子，是需要能量的過程。分解代謝途徑涉及較大分子的分解，通常 釋放能量。本文使用的術語「甲羥戊酸途徑」或「MEV途徑」指將乙醯輔酶A轉化成IPP的生 物合成途徑。MEV途徑在圖1中圖示說明。本文使用的術語「脫氧木酮糖5-磷酸途徑」或「DXP途徑」指將甘油醛-3-磷酸和 丙酮酸轉化成IPP和DMAPP的途徑。DXP途徑在圖2中圖示說明。
本文的詞語「焦磷酸」與「二磷酸」可互換使用。術語「表達載體」或「載體」指核酸，其轉導、轉化或感染宿主細胞，從而導致該細 胞生成並非該細胞天然生成的核酸和/或蛋白，或以該細胞非天然具有的方式表達核酸和
/或蛋白。術語「內源性」指天然存在(例如存在於未重組的宿主細胞中)的物質或過程。術語「用於生成異戊烯基焦磷酸的酶途徑」指任何能夠生成異戊基焦磷酸的途徑， 包括但不限於甲羥戊酸途徑或DXP途徑。術語「核酸」指任何長度的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核苷酸)的聚合形式。因 此，該術語包括但不限於單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA，基因組DNA，cDNA, DNA-RNA雜合體， 或者包含嘌呤和嘧啶鹼基或者其它天然的、化學或生物化學修飾的、非天然的或者衍生的 核苷酸鹼基的聚合物。術語「操縱子」指兩個或多個鄰近的核苷酸序列，其各自編碼基因產物例如RNA或 蛋白，並且其表達被一種或多種控制元件(例如啟動子)協同調控。術語「基因產物」指DNA編碼的RNA (反之亦然)，或者由RNA或DNA編碼的蛋白， 其中基因將典型地包含一種或多種編碼蛋白的核苷酸序列，並且可能也包含內含子和其它 非編碼的核苷酸序列。術語「蛋白」指任何長度的胺基酸的聚合形式，其可以包含編碼和非編碼胺基酸， 化學或生物化學修飾的或者衍生的胺基酸，以及具有修飾過的肽骨架的多肽。本文使用的術語「異源核酸」指符合以下條件中的至少一項的核酸(a)該核酸對 給定宿主細胞來說是外來的(「外源的」)(即，在該細胞中非天然存在的)；(b)該核酸包含 天然存在於給定宿主細胞中的核苷酸序列(即，對細胞是「內源性的」)，但該核苷酸序列在 細胞中以非天然數量(例如，多於預期或多於天然存在的數量)生成；(c)該核酸包含在序 列上與內源性核苷酸序列不同的核苷酸序列，但該核苷酸序列編碼相同的蛋白(具有相同 或基本上相同的胺基酸序列)，而且在細胞中以天然數量(例如，多於預期或多於天然存在 的數量)生成；或者(d)該核酸包含兩種或更多種核苷酸序列，這些核苷酸序列彼此在自然 界中未被發現具有相同的聯繫(例如，該核酸是重組的)。「轉基因」指被外源引入到宿主細胞中的基因。其可以包含內源或外源、或異源性 核酸。術語「重組宿主」(也被稱作「遺傳修飾的宿主細胞」或「遺傳修飾的宿主微生物」)指包含本發明提供的異源核酸的宿主細胞。術語「外源核酸」指被外源引入到宿主細胞中的核酸，且因此該核酸不是通常或天然地在自然界中的給定的細胞中發現和/或由其生成的。術語「調控元件」指轉錄和翻譯控制序列，例如啟動子、增強子、多聚腺苷酸信號、 終止子、蛋白降解信號等，其在宿主細胞中提供和/或調節編碼序列的表達和/或編碼的多 肽的生成。術語「轉化」指在引入新核酸後，在細胞中引起的永久或短暫的遺傳改變。遺傳改 變(「修飾」)可以通過將新DNA整合進宿主細胞的基因組中，或者短暫或穩定地將新DNA 保持為游離元件來實現。在真核細胞中，永久的遺傳改變一般通過將DNA引入到細胞基因 組中來實現。在原核細胞中，永久的遺傳改變可以被引入到染色體中，或可藉由染色體外元 件例如質粒和表達載體，其可以包含一個或多個選擇標記，以幫助在重組的宿主細胞中維 持所述遺傳改變。術語「可操作地連接」指一種並置，其中所描述的組成部分之間的關係允許它們以 其預期的方式發揮功能。例如，如果啟動子影響一段核苷酸序列的轉錄或表達，則該啟動子 是與該核苷酸序列可操作地連接的。本文的術語「宿主細胞」和「宿主微生物」可互換使用，用於指在其中可以插入或 已經插入異源核酸的任何古細菌、細菌或真核的活細胞。該術語也涉及原始細胞的後代，它 們由於自然的、意外的或蓄意的突變，在形態學上或在基因組或總DNA互補方面可與原始 的親代不一定完全一致。術語「合成」在用於描述核酸時指化學合成的寡核苷酸結構單元退火形成基因片 段，其隨後經酶組裝構成完整的基因。通過「化學手段」合成核酸指核苷酸成分在體外組裝。當術語「天然」被用於核酸、細胞或生物體時，指在自然界中發現的核酸、細胞或生 物。例如，存在於可從天然來源中分離且未被人在實驗室中有意修飾過的非病源性(無病) 生物體中的多肽或多核苷酸序列是天然的。當術語「天然存在」被用於核酸、酶、細胞或生物體時，指在自然界中發現的核酸、 酶、細胞或生物體。例如，存在於可從天然來源中分離且未被人在實驗室中有意修飾過的生 物體中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。當用於蛋白、多肽或酶時，術語「生物活性片段」指該蛋白或多肽或酶的功能性部 分。功能性等價物可能具有變體胺基酸序列，其可能是例如密碼子冗餘和功能對等的結果， 密碼子冗餘和功能對等已知天然發生在核酸序列和其編碼的蛋白內。或者，功能性等價的 蛋白或肽可以通過應用重組DNA技術構建，其中，基於對被交換的胺基酸的性質考慮，可工 程改造蛋白質的結構變化。本文的術語「類異戊二烯」、「類異戊二烯化合物」、「類異戊二烯產物」、「萜烯」、「萜 烯化合物」、「萜類」和「萜類化合物」可互換使用。它們指能夠源自於IPP的化合物。除非上下文另外明確指示，單數形式「一個」、「和」、以及「該」包含複數的指代。因 此，例如，提及「 一個表達載體」時包含了單個表達載體和多個表達載體，而提及「該宿主細 胞」時包含了提及一個或多個宿主細胞，等等。進一步指出，撰寫權利要求可以排除任何可 選的元素。就這點而言，本聲明意在作為「唯一」、「僅」等這樣的排他性術語與所引用的權 利要求元素聯合使用，或使用「否定」限制的在先基礎。
除非另外指出，本文提供的實施方案不限定於特定的序列、表達載體、酶、宿主微 生物或過程，因為它們可以依照本領域普通技術人員基於本文教導的理解而變化。本文使 用的術語的目的僅僅是描述特定的實施方案，而不意在進行任何限定。IPP 途徑 本發明提供的宿主細胞包含或利用MEV途徑、DXP途徑或兩者同時，以合成IPP和 它的異構體DMAPP。本文提供的是包含至少一種整合進染色體的異源核酸序列的宿主細胞， 該異源核酸序列編碼MEV或DXP途徑的酶。在其它實施方案中，該宿主細胞包含至少一種 異源核酸序列，該異源核酸序列編碼多個MEV或DXP途徑的酶。在另一些實施方案中，該宿 主細胞包含多種異源核酸序列，該異源核酸序列編碼MEV途徑的全部酶。在又一些實施方 案中，該宿主細胞包含多種異源核酸序列，該異源核酸序列編碼DXP途徑的全部酶。一般而言，除植物以外的真核生物僅使用MEV類異戊二烯途徑將乙醯輔酶A轉化 成IPP，IPP隨後異構成DMAPP。原核生物(除了一些例外)，使用甲羥戊酸非依賴性或DXP 途徑經由分叉點來分別生成IPP和DMAPP。植物同時使用MEV和DXP途徑來合成IPP。MEV 途徑MEV途徑的示意圖如圖1所示。一般而言，該途徑包含六個步驟。在第一步中，兩分子的乙醯輔酶A經酶催化結合形成乙醯乙醯輔酶A。已知催 化該步驟的酶是，例如，乙醯輔酶A硫解酶(也被稱作乙醯輔酶A乙醯基轉移酶)。核 苷酸序列的示例性例子包括但不限於以下GenBank登錄號以及該序列所源自的生物 (NCC_00913 區域2324131. · 2325315 ；大腸桿菌(Escherichia coli))、(D49362 ；脫氮副球 菌(Paracoccus denitrificans))、禾口(L20428 ；酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。在MEV途徑的第二步中，乙醯乙醯輔酶A與另一分子的乙醯輔酶A經酶催化縮合 形成3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A (HMG-CoA)。已知催化該步驟的酶是，例如，HMG-CoA合 成酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(NC_001145，補體19061. . 20536 ；釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae))、(X96617 ；酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、 (X83882;擬南芥(Arabidopsisthaliana))、(AB037907 ；淺灰北裡孢菌(Kitasatospora griseola))、(BT007302 ；智人(Homo sapiens))、和(NC_002758，位點標籤SAV2546，基因 ID 1122571 ；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))。在第三步中，HMG-CoA經酶催化轉化成甲羥戊酸。已知催化該步驟的酶是，例 如，HMG-CoA還原酶。核苷酸序列的示例性例子，包括但不限於(NM_206548 ；黑腹果蠅 (Drosophila melanogaster))、(NC_002758，位點標籤 SAV2545，基因 ID 1122570 ；金黃色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、(NM_204485 ；原雞(Gallus gallus))、(AB015627 ； 鏈黴菌屬(Sti^ptomyces sp. )K03988)、(AF542543 ；漸尖菸草(Nicotiana attenuata))、 (AB037907 ；淺灰北裡孢菌(Kitasatospora griseola))、(AX128213，提供的序列編碼截短 的HMGR ；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、和(NC_001145 補體(115734. . 118898 ； 酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。在第四步中，甲羥戊酸被酶催化磷酸化，形成甲羥戊酸5-磷酸。已知催化該步驟 的酶是，例如，甲羥戊酸激酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(L77688 ；擬南芥 (Arabidopsis thaliana))禾口(X55875 ；酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。在第五步中，第二個磷酸基團經酶催化添加到甲羥戊酸5-磷酸上，形成甲羥戊酸5-焦磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，磷酸甲羥戊酸激酶。核苷酸序列的示例性 例子，包括但不限於(AF429385 ；巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis))、(NM_006556 ；智 人(Homo sapiens))、和(NC_001145，補體 712315. . 713670 ；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。在第六步中，甲羥戊酸5-焦磷酸被酶催化轉化成IPP。已知催化該步驟的酶是，例如，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(X97557 ；釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)) > (AF290095 ；屎腸球菌(Enterococcus faecium))、禾口 (U49260 ；智人(Homo sapiens))。如果IPP要被轉化成DMAPP，那麼需要第七步。已知催化該步驟的酶是，例如，IPP 異構酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(NC_000913，3031087. . 3031635 ；大腸杆 菌(Escherichia coli))禾Π (AF082326 ；雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis))。如果 需要轉化成DMAPP，IPP異構酶的增加表達將確保IPP向DMAPP的轉化不成為整個途徑的限
速步驟。DXP 途徑DXP途徑的示意圖如圖2所示。一般而言，DXP途徑包含七個步驟。在第一步中， 丙酮酸與D-甘油醛3-磷酸縮合生成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化該步驟的酶 是，例如，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶。核苷酸序列的示例性例子，包括但不限於 (AF035440 ；大腸桿菌(Escherichia coli))、(NC_002947，位點標籤 PP0527 ；惡臭假單胞 菌(Pseudomonas putida)KT2440)、(CP000026，位點標籤 SPA2301 ；腸道副傷寒沙門氏菌 (Salmonella entericaParatyphi)，參見 ATCC 9150)、(NC_007493，位點標籤 RSP_0254 ；球 形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides) 2. 4. 1)、(NC_005296，位點標籤 RPA0952 ；沼澤紅假 單胞菌(Rhodopseudomonas palustris) CGA009)、(NC_004556，位點標籤 PD1293 ；蒂梅丘拉 苛養木桿菌 l(Xylella fastidiosa Temeculal))、和(NC_003076，位點標籤 AT5G11380 ；擬
(arabidopsis thaliBriB))。在第二步中，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸被轉化成2C-甲基-D-赤蘚糖 醇-4-磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。 核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(AB013300 ；大腸桿菌(Escherichiacoli)), (AF148852 ；擬南芥(Arabidopsis thaliana))、(NC_002947,位點標籤 PP1597 ；惡臭 假單胞菌(Pseudomonas putida)KT2440)、(AL939124，位點標籤 SC05694 ；天藍色鏈黴 菌(Sti^ptomyces coelicolor) A3 (2))、(NC_007493，位點標籤 RSP_2709 ；球形紅細菌 (Rhodobacter sphaeroides) 2. 4. 1)、和(NC_007492，位點標籤 Pfl_1107 ；螢光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens)PfO-l)。在第三步中，2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸被轉化成4-二磷酸胞苷-2C-甲 基-D-赤蘚糖醇。已知催化該步驟的酶是，例如，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合成 酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(AF230736 ；大腸桿菌(Escherichia coli))、 (NC_007493,位點標籤 RSP_2835 ；球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides) 2. 4. 1)、 (NC_003071，位點標籤AT2G02500 ；擬南芥(Arabidopsis thaliana))、和(NC_002947，位點 標籤 PP1614 ；惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) KT2440)。在第四步中，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇被轉化成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇-2-磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，4-二磷酸胞苷-2C-甲 基-D-赤蘚糖醇激酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(AF216300;大腸桿菌 (Escherichia coli))和(NC_007493，位點標籤 RSP_1779 ；球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides) 2. 4. 1)。在第五步中，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇-2-磷酸被轉化成2C-甲 基-D-赤蘚糖醇2，4_環二磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，2C-甲基-D-赤蘚糖 醇2，4_環二磷酸合成酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(AF230738 ；大腸杆 菌(Escherichia coli))、(NC_007493，位點標籤 RSPJO7I ；球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides) 2. 4. 1)、和(NC_002947，位點標籤 PP1618 ；惡臭假單胞菌 Pseudomonas putida)KT2440)。 在第六步中，2C-甲基-D-赤蘚糖醇2，4_環二磷酸被轉化成1_羥基_2_甲 基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，1-羥基-2-甲基-2-(E)_ 丁 烯基-4-二磷酸合成酶。核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(AY033515 ；大腸杆 菌(Escherichia coli))、(NC_002947，位點標籤 PP0853 ；惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) KT2440)、和(NC_007493，位點標籤 RSP_2982 ；球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides) 2. 4. 1)。在第七步中，1-羥基-2-甲基-2- (E) - 丁烯基-4- 二磷酸被轉化成IPP或它的異構 體DMAPP。已知催化該步驟的酶是，例如，異戊基/ 二甲基烯丙基二磷酸合成酶。核苷酸序列 的示例性例子包括但不限於(AY062212 ；大腸桿菌(Escherichia coli))和(NC_002947， 位點標籤 PP0606 ；惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) KT2440)。在一些實施方案中，宿主細胞的自身代謝過程和本發明提供的IPP生成所涉及的 過程之間的「串擾」(或幹擾)被最小化或完全消除。例如，當宿主微生物僅依靠DXP途徑 來合成IPP，且引入MEV途徑來提供額外的IPP時，串擾被最小化或完全消除。這樣的宿主 生物將不會改變MEV途徑的酶的表達或加工與MEV途徑相關的中間產物。僅依賴或主要依 賴DXP途徑的生物包括，例如，大腸桿菌(Escherichia coli)。在一些實施方案中，宿主細胞僅通過MEV途徑或者通過MEV途徑與DXP途徑的結 合來生成IPP。在其他實施方案中，宿主的DXP途徑是功能失活的，因此宿主細胞僅通過異 源引入的MEV途徑生成IPP。可以通過阻止DXP途徑中的一種或多種酶的基因表達或將所 述酶滅活使得DXP途徑功能失活。宿主細胞本發明提供的供使用的合適的宿主細胞的示例性例子包括所有古細菌、原核或真 核細胞。古細菌細胞的例子包括但不限於屬於以下屬的細菌氣火菌屬(Aeropyrum)、古 丸菌屬(Archaeoglobus)、鹽桿菌屬(Halobacterium)、甲燒球菌屬(Methanococcus) > ψ'^ 桿菌屬(Methanobacterium)、火球菌屬(Pyrococcus)、硫化葉菌屬(Sulfolobus)、和熱原 體屬(Tgermoplasma)。古細菌菌株的示例性例子包括但不限于敏捷氣火菌(Aeropyrum pernix)、發光古丸菌(Archaeoglobus fulgidus)、詹氏甲燒球菌(Methanococcus jannaschii)、口譽& [=I ff ￥ !^υ If lif (Methanobacterium thermoautotropgicum) > | 火球菌(Pyrococcusabyssi)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜酸熱原體 (Thermoplasmaacidophilum)、火山熱原體(Thermoplasma volcanium)。
原核細胞的例子包括但不限於屬於以下屬的細胞土壤桿菌屬(Agrobacterium)、脂環酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、魚腥藍細菌屬(Anabaena)、組囊藍細菌屬 (Anacystis)、節桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、 短桿菌屬(Brevibacterium)、著色菌屬(Chromatium)、梭菌屬(Clostridium)、棒狀杆 菌屬(Corynebacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、士矣希氏菌 屬(Escherichia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、中個曼生豐艮瘤菌 屬(Mesothizobium)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、席 藍細菌屬(Phormidium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅細菌屬(Rhodobacter)、紅假單胞 菌屬(Rhodopseudomonas)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、紅球菌屬(Rhodococcus)JH 氏菌屬(Salmonella)、柵列藍細菌屬(Scenedesmun)、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏菌 屬(Shigella)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、聚球藍細菌屬 (Synnecoccus)、禾口發酵單胞菌屬(Zymomonas)。原核細菌菌株的示例性例子包括但不限於枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、 角軍澱粉芽胞桿菌(Nacillus amyloliquefaciens)、產氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)、嗜氨短桿菌(Brevibacterium immariophilum)、拜氏梭菌(Clostridium beigerinckii)、阪山奇氏腸 If 胃(Enterobacter sakazakii)、大腸 If 胃(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、百脈根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium Ioti)、 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、邁氏假單胞菌(Pseudomonas mevalonii)、 惡臭假單胞菌(Peudomonas putida)、莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus)、球形 ^lMM (Rhodobacter sphaeroides) Λ if H H M M (Rhodospirillum rubrum) λ it ^ 門氏菌(Salmonella enterica)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門氏 菌(Salmonella typhimurium)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志賀 氏菌(Shigella flexneri)、宋內氏志賀氏菌(Shigella sonnei)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)等0一般而言，如果使用細菌宿主細胞，優選非致病性菌株。非致病性菌株的示例性例 子包括但不限於枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、嗜 酸乳桿菌(Lactibacillus acidophilus)、 卷士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、銅 參錄(Pseudomonas aeruginosa) Kl^Ifi^ (Pseudomonas mevalonii)、H 假單胞菌(Pseudomonas putida)、球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)、莢膜紅細菌 (Rodobacter capsulatus)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)等。真核細胞的例子包括但不限於真菌細胞。真菌細胞的例子包括但不限於屬於以 下屬的那些麴黴屬(Aspergillus)、念珠菌屬(Candida)、金孢屬(Chrysosporium)、隱球 菌屬(Cryptococcus)、鐮孢屬(Fusarium)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、內生真菌屬 (Neotyphodium)、脈孢菌屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、畢赤酵母屬(Pichia)、 酵母屬(Saccharomyces)、木黴屬(Trichoderma)、禾口法夫酵母屬(Xanthophyllomyces)(以 前稱作Phaffia)。真核菌株的示例性例子包括但不限於構巢麴黴(Aspergillus nidulans)、黑曲 黴(Aspergillus niger)、米麴黴(Aspergillus oryzae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、 拉氏金抱菌(Chrysosporium lucknowense)、禾穀鍵抱菌(Fusariumgraminearum)、鐮孢黴(Fusarium venenatum)、乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)、粗糙脈 孢菌(Neurospora crassa)、安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)、芬蘭畢赤酵母 (Pichia finlandica)、兒玉氏畢赤酵母(Pichia kodamae)、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、仙人掌畢赤酵母(Pichia opuntiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、珀氏畢赤酵母(Pichiapi jperi)、櫟樹畢 赤酵母(Pichia quercuum)、千屈菜畢赤酵母(Pichia salictaria)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、嗜海藻糖畢赤酵母(Pichia trehalophila)、樹幹畢赤酵母(Pichia stipitis)、生二素鏈黴菌(Streptomyces ambofaciens)、金黴素鏈黴菌(Streptomyces aureofaciens) >ikfeIjl^Iif (Streptomyces aureus) > JJlf^fiJ (Saccaromyces bayanus)、^: 酒酵母(Saccaromyces boulardi)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、殺真菌素鏈黴 菌(Streptomyces fungicidicus)、灰色產色鏈黴菌(Streptomyces griseochromogenes)、 灰色鏈黴菌(Str印tomycesgriseus)、變鉛青鏈黴菌(Sti^ptomyces lividans)、橄欖 灰鏈黴菌(Streptomycesolivogriseus)、枝鏈黴菌(Streptomyces rameus)、田無鏈黴 菌(Streptomycestanashiensis)、酒紅鏈黴菌(Streptomyces vinaceus)、裡氏木黴 (Trichodermareesei)、禾口紅法夫酵母(Xanthophy 1 lomyces dendrorhous)(以前稱作 Phaf f i arho do ζ yma)。 一般而言，如果使用真核細胞，優選非致病性菌株。非致病性菌株的示例性例子 包括但不限於禾穀德抱菌(Fusarium graminearum)、,廉抱黴(Fusarium venenatum)、 巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、果酒酵母(Saccaromyces boulardi)、和釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0另外，一些菌株已經被食品和藥物管理局確定為GRAS或一般認為安全的。這些菌 株包括枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、嗜酸乳桿菌(Lactibacillusacidophilus)、 瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、禾口酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。類異戊二烯化合物本發明提供的宿主細胞被用於製備類異戊二烯。具體的類異戊二烯化合物由IPP 或DMAPP製備，而且可能需要額外的酶處理。合適的類異戊二烯的非限制性實施例包括半 萜(源自1個異戊二烯單元)，例如異戊二烯；單萜(源自2個異戊二烯單元)，例如月桂 烯；倍半萜(源自3個異戊二烯單元)，例如紫穗槐_4，11- 二烯；二萜(源自四個異戊二烯 單元)，例如紫杉烯；三萜(源自6個異戊二烯單元)，例如鯊烯；四萜(源自8個類異戊二 烯)，例如胡蘿蔔素；和多萜(源自多於8個異戊二烯單元)，例如聚異戊二烯。在一些 實施方案中，類異戊二烯不是類胡蘿蔔素。在其它實施方案中，類異戊二烯是C5-C2tl類異戊 二烯。具體的C5-C2tl類異戊二烯化合物的示例性例子以及它們各自的處理酶在下面進一步 描述。C5化合物本發明提供的C5化合物一般源自IPP或DMAPP。這些化合物也被稱作半萜，因為 它們源自單個異戊二烯單元(IPP或DMAPP)。異戊二烯在許多植物中發現異戊二烯，其結構為 異戊二烯是用異戊二烯合成酶由IPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包 括但不限於(AB198190 ；銀白楊(Populus alba))和(AJ294819 ；銀白楊(Populus alba) X 歐洲山楊(Populus tremula))。C10化合物本發明提供的Cltl化合物一般源自香葉基焦磷酸(GPP)，GPP由IPP與DMAPP縮合製備。已知催化該步驟的酶是，例如，香葉基焦磷酸合成酶。這些Cltl化合物也被稱作單萜， 因為它們源自兩個異戊二烯單元。圖3圖解顯示了 IPP和DMAPP如何生成GPP，GPP可以被進一步加工成單萜。香葉基焦磷酸合成酶核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(AF513111 ；北 美 7令杉(Abies grandis))、(AF513112 ；北美冷杉(Abies grandis))、(AF513113 ；北 美冷杉(Abies grandis))、(AY534686 ；金魚草(Antirrhinummajus))、(AY534687 ；金 魚草(Antirrhinum ma jus)), (Υ17376 ；擬南芥(Arabidopsisthaliana))、(ΑΕ016877, 位點 ΑΡ11092 ；賭狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) ；ATCC14579)、(AJ243739 ；甜橙 (Citrus sinensis))、(AY534745 ；伯惠繡衣(Clarkiabreweri)), (AY953508 ；美松齒 小蠹(Ips pini))、 (DQ28693O;番茄(Lycopersiconesculentum))、 (AF182828 ；辣薄 荷(MenthaXpiperita))、(AF182827 ；辣薄荷(MenthaXpiperita))、(MPI249453 ；辣薄 荷(MenthaXpiperita))、(PZE431697，位點 CAD24425 ；產玉米黃質副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens))、 (AY866498 ；胡黃連(Picrorhiza kurrooa))> (AY351862 ；葡 萄(Vitis yinifera))、和(AF203881，位點 AAF12843 ；運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis))。GPP隨後被轉化成多種Cltl化合物。Cltl化合物的示例性例子包括但不限於^M在許多樹特別是松樹的樹脂中發現蒈烯，其結構為 蒈烯是用蒈烯合成酶由GPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包括但不限 於(AF461460,區域 43. · 1926 ；歐洲雲杉(Picea abies))和(AF527416,區域78. · 1871 ； 狹葉鼠尾草(Salvia stenophylla))。朧牛兒醇櫳牛兒醇(也被稱作香葉醇)，其結構為 其是玫瑰油和玫瑰草油的主要成分。它也存在於天竺葵、檸檬和香茅中。櫳牛兒 醇是用櫳牛兒醇合成酶由GPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包括但不限於 (AJ457070 ；細毛樟(Cinnamomum tenuipilum))、(AY362553 ；羅勒(Ocimum basilicum))、 (DQ234300 ；紫蘇(Perilla frutescens)品系 1864)、(DQ234299 ；檸檬紫蘇(Perilla citriodora)品系 1861)、(DQ234298 ；檸檬紫蘇(Perilla citriodora)品系 4935)、和 (DQ088667 ；檸檬紫蘇(Perilla citriodora))。芳樟醇 在許多花和香料植物例如芫荽籽中發現芳樟醇，其結構為 芳樟醇是用芳樟醇合成酶由GPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包 括但不限於(AF497485 ；擬南芥(Arabidopsis thaliana))、(AC002294,位點 AAB71482 ； 擬南芥(Arabidopsis thaliana))、 (AY059757 ；擬南芥(Arabidopsisthaliana))、 (NM_104793 ；擬南芥(Arabidopsis thaliana))、(AF154124 ；黃花蒿(Artemisia annua))、 (AF067603 ；伯惠繡衣(Clarkia breweri))、(AF067602 ；矮送春花(Clarkia concinna))、 (AF067601 ；伯惠繡衣(Clarkia breweri))、(U58314;伯惠繡衣(Clarkia breweri))、 (AY840091 ；番茄(Lycopersicon esculentum))、(DQ263741 ；薰衣草(Lavandula angustifolia))、(AY083653 ；檸檬薄荷(Menthacitrate))、(AY693647 ；羅勒(Ocimum basilicum))、 (XM_463918 ；稻(Oryzasativa))、 (AP004078,位點 BAD07605 ；稻(Oryza sativa))、(XM_463918,位點 XP_463918 ；稻(Oryza sativa))、(AY917193 ；檸檬紫蘇 (Perilla citriodora))、(AF271259;紫蘇(Perilla frutescens))、(AY473623 ；歐洲雲 杉(Picea abies))、(DQ195274 ；北美雲杉(Picea sitchensis))、和(AF444798 ；回回蘇 (Perillafrutescens var. crispa)品禾中號 79)。檸檬烯在柑橘屬水果的外皮和薄荷中發現檸檬烯，其結構為 檸檬烯是用檸檬烯合成酶由GPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包 括但不限於(+)-檸檬烯合成酶(AF514287，區域47. .1867;檸檬(Citrus Iimon))和 (AY055214，區域48. · 1889 ；藿香(Agastache rugosa))，和(_)_檸檬烯合成酶(DQ195275, 區域1. . 1905 ；北美雲杉(Picea sithensis))、(AF006193，區域73. . 1986 ；北美冷杉 (Abies grandis))、和(MHC4SLSP,區域29. · 1828 ；綠薄荷(Mentha spicata))。
月桂烯在許多植物包括月桂樹、馬鞭草和月桂葉的香精油中發現月桂烯，其結構為 月桂烯由月桂葉而得名。月桂烯是用月桂烯合成酶由GPP製備的。合適的核苷 酸序列的示例性例子包括但不限於(U87908 ；北美冷杉(Abies grandis))、(AY195609 ； 金魚草(Antirrhinum ma jus)) > (AY195608 ；金魚草(Antirrhinummajus)) > (NM_127982 ； 擬南芥(Arabidopsis thaliana)TPS10)、(NM_113485 ；擬南芥(Arabidopsis thaliana) ATTPS-CIN)、(匪 113483;擬南芥(Arabidopsisthaliana)ATTPS-CIN)、(AF271259;紫蘇 (Perilla frutescens))、(AY473626 ；歐洲雲杉(Picea abies))、(AF369919 ；歐洲雲杉 (Picea abies))、和(AJ304839 ；冬青櫟(Quercus ilex))。羅勒烯在多種植物和水果包括羅勒(Ocimum basilicum)中發現α -和β -羅勒烯，它們
的結構分別是 且它們是用羅勒烯合成酶由GPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包括 但不限於(AY195607 ；金魚草(Antirrhinum ma jus)), (ΑΥ195609 ；金魚草(Antirrhinum ma jus)), (AY195608 ；金魚草(Antirrhinum ma jus)), (AK221024 ；擬南芥(Arabidopsis thaliana))、(NM_113485 ；擬南芥(Arabidopsisthaliana) ATTPS-CIN)、(NM_113483 ；擬南 芥(Arabidopsisthaliana)ATTPS-CIN)、(NM_117775 ；擬南芥(Arabidopsis thaliana) ATTPS03)、(NM_001036574 ；擬南芥(Arabidopsis thaliana)ATTPS03)、(NM_127982 ；擬 南芥(Arabidopsis thaliana) TPS10)、(AB110642;柑橘(Citrus unshiu) CitMTSL4)、禾口 (AY575970 ；光葉百脈根(Lotus corniculatus var. japonicus))。α -蒎烯在松樹和桉樹中發現α -菔烯，其結構為 α -菔烯是用α -菔烯合成酶由GPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包 括但不限於⑴α -菔烯合成酶(AF543530,區域1. · 1887 ；火炬松(Pinus taeda))、(-) α -菔烯合成酶(AF543527，區域32. · 1921 ；火炬松(Pinus taeda))、禾口 (+) / (-) α -菔烯 合成酶(AGU87909，區域6111892 ；北美冷杉(Abies grandis))。β -蒎烯
在松樹、迷迭香、歐芹、蒔蘿、羅勒、和玫瑰中發現β-菔烯，其結構為 β -菔烯是用β -菔烯合成酶由GPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包 括但不限於(-)β _菔烯合成酶(AF276072,區域1. · 1749 ；黃花蒿(Artemisiaannua))禾口 (AF514288，區域26. . 1834 ；檸檬(Citrus Iimon))。 在黑胡椒、胡蘿蔔種子、鼠尾草和茶樹中發現檜萜，其結構為 檜萜是用檜萜合成酶由GPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包括但不限 於 AF051901，區域26. · 1798，來自藥用鼠尾草(Salvia officinalis)。Y-萜品烯Y-萜品烯，其結構為 其是來自柑橘屬水果的香精油的組成成分。生物化學上，Y-萜品烯是用Y-萜 品烯合成酶由GPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包括(AF514286，區域 30. · 1832，來自檸檬(Citrus Iimon))和(ABl 10640,區域 1. · 1803，來自柑橘(Citrus unshiu))ο萜品油烯在黑醋慄、柏樹、番石榴、荔枝、番木瓜、松樹和茶葉中發現萜品油烯，其結構為 萜品油烯是用萜品油烯合成酶由GPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包 括但不限於 AY906866，區域10. . 1887，來自花旗松(Pseudotsugamenziesii)。
C15化合物本發明提供的C15化合物一般源自法尼西基焦磷酸(FPP)，FPP是由兩分子IPP與一分子DMAPP縮合製備的。已知催化該步驟的酶是，例如，法尼西基焦磷酸合成酶。這些C15 化合物也被稱作倍半萜，因為它們源自三個異戊二烯單元。圖3圖解顯示了 IPP和DMAPP如何結合以生成FPP，FPP可以被進一步加工成倍半
ISo法尼西基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(ATU80605 ； 擬南芥(Arabidopsis thaliana))、(ATHFPS2R ；擬南芥(Arabidopsisthaliana))、 (AAU36376 ；黃花蒿(Artemisia annua))、(AF461050 ；牛(Bos taurus))、(D00694 ；大 腸桿菌(Escherichia coli)K_12)、(AE009951，位點AAL95523 ；具核梭桿菌具核亞種 (Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum)ATCC 25586)、(GFFPPSGEN ；藤倉赤黴 (Gibberella fujikuroi))、(CP000009，位點 AAW60034 ；氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)621H)、(AFO19892 ；向日葵(Helianthusannuus))、(HUMFAPS ；智人(Homo sapiens))、(KLPFPSQCR ；乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)), (LAU15777;白羽 扇豆(Lupinus albus))、(LAU20771 ；白羽扇豆(Lupinus albus))、(AF309508 ；小家鼠 (Mus musculus))、(NCFPPSGEN ；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa))、(PAFPS1 ；銀膠菊 (Parthenium argentatum))、(PAFPS2 ；銀膠菊(Parthenium argentatum))、(RATFAPS ；褐 MU (Rattusnorvegicus)) > (YSCFPP ；酉良胃—(Saccharomyces cerevisiae)) > (D89104 ； 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、(CP000003，位點 AAT87386 ；釀膿鏈球菌 (Streptococcus pyogenes))、(CP000017，位點 AAZ51849 ；釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes))、(NC_008022，位點 YP_598856 ；釀膿鏈球菌(Sti^ptococcus pyogenes)MGAS 10270)、(NC_008023，位點 YP_600845 ；釀膿鏈球菌(Sti^ptococcus pyogenes)MGAS2096)、 (NC_008024,位點 YP_602832 ；釀膿鏈球菌(Sti^ptococcus pyogenes) MGAS 10750)、和 (MZEFPS ；玉米(Zeamays))。或者，FPP也可以通過將IPP添加到GPP上製備。編碼能夠用於該反應的 酶的核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(AE000657，位點AAC06913 ；風產液菌 (Aquifex aeolicus)VF5), (NM_202836 ；擬南芥(Arabidopsis thaliana))、 (D84432, 位點 BAA12575 ；枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis))、(U12678，位點 AAC28894 ；大豆 慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA 110)、(BACFDPS ；嗜熱脂肪地芽孢桿菌 (Geobacillus stearothermophilus))、(NC_002940,位點 NP_873754 ；杜克雷嗜血桿菌 (Haemophilus ducreyi) 35000HP)、(L42023，位點 AAC23087 ；流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) Rd KW20)、(J05262;智人(Homo sapiens))、(YP_395294 ；清酒乳桿菌清酒 亞種(Lactobacillus sakei subsp. sakei) 23K)、(NC_005823，位點 YP_000273 ；問號鉤端 螺方iH本哥本哈根血清型 Fiocruz 菌株(Leptospira interrogans serovarCopenhageni str. Fiocruz)Ll-130), (AB003187 ；藤黃微球菌(Micrococcusluteus))、(NC_002946, 位點 YP_208768 ；淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)FA 1090)、(U00090,位 點 AAB91752 ；根瘤菌屬(Rhizobium sp.)NGR234)、(J05091;釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、(CP000031，位點 AAV93568 ；波氏矽桿菌(Silicibacter pomeroyi)DSS-3)、 (AE008481，位點 AAK99890 ；肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae) R6)、和(NC_004556、位點 NP 779706 ；蒂梅丘拉苛養木桿菌 l(Xylella fastidiosa Temeculal))。FPP隨後被轉化成多種C15化合物。C15化合物的示例性例子包括但不限於紫穗槐二烯紫穗槐二烯，其結構為 其是由黃花蒿(Artemisia annua)生成的青蒿素的前體。紫穗槐二烯是用紫穗槐 二烯合成酶由FPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子是美國專利號7，192，751的 SEQ ID No. 37。α -法暱烯在多種生物資源(包括但不限於螞蟻的杜氏腺，以及蘋果和梨的果皮)中發現 α-法呢烯，其結構為 α-法呢烯是用α-法呢烯合成酶由FPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性 例子包括但不限於來自西洋梨品種安久梨(Pyrus communis cultivar d' Anjou)的 DQ309034 (梨；基因名AFS1)和來自蘋果(Malus domestica)的AY182241 (蘋果；基因 AFS1)。Pechouus 等，Planta 219(1) :84_94(2004)。β -法暱烯在多種生物資源(包括但不限於蚜蟲和香精油，例如來自薄荷的香精油)中發現
β-法呢烯，其結構為 在某些植物例如野生土豆中，β _法呢烯被合成作為天然的驅蟲劑。β _法呢烯是 用β -法呢烯合成酶由FPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包括但不限於GenBank 登錄號 AF024615，來自辣薄荷(MenthaXpiperita)(薄荷；基因 Tspal 1)和 ΑΥ835398，來 自黃花蒿(Artemisia annua)。Picaud 等，Phytochemistry66 (9) :961_967 (2005)。法暱醇在多種生物資源(包括昆蟲和香精油，例如來自香茅、橙花、仙客來、檸檬草、晚香 玉和玫瑰的香精油)中發現法呢醇，其結構為 法呢醇是用羥化酶例如法呢醇合成酶由FPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包括但不限於GenBank登錄號AF529266，來自玉米(Zea mays)和YDR481C，來自釀 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(基因 Pho8)。 Song，L.，AppliedBiochemistry and Biotechnology 128:149-158(2006)。橙花叔醇橙花叔醇，也被稱作橙花油醇，其結構為 在多種生物資源(包括如香精油，例如來自橙花、姜、茉莉、薰衣草、茶樹和檸檬草 的香精油)中發現橙花叔醇。橙花叔醇是用羥化酶例如橙花叔醇合成酶由FPP製備的。合 適的核苷酸序列的示例性例子包括但不限於AF529266，來自玉米(Zea mays)(玉米；基因 tpsl)ο綠葉醇綠葉醇，也被稱作廣藿香醇，其結構為 其是廣藿香(Pogostemon patchouli)香精油的組成成分。綠葉醇是用綠葉醇合成 酶由FPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包括但不限於AY508730，區域1. . 1659， 來自廣藿香(Pogostemon cablin)。瓦倫西亞橘烯瓦倫西亞橘烯，其結構為 其是橘子的氣味和風味的主要化學成分之一，在橘子皮中被發現。瓦倫西亞 橘烯是用香柏酮合成酶由FPP製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包括但不限於 AF441124，區域1· . 1647，來自甜橙(Citrus sinensis))和AY917195，區域1· . 1653，來自 紫蘇(Perilla frutescens)。C20化合物本文提供的C2tl化合物一般源自香葉基櫳牛兒醇焦磷酸(GGPP)，GGPP是由三分子 IPP和一分子DMAPP縮合製備的。已知催化該步驟的酶是，例如，香葉基香葉基焦磷酸合成 酶。這些C2tl化合物也被稱作二萜，因為它們源自四個異戊二烯單元。圖3圖解顯示了 IPP和DMAPP如何結合生成GGPP，GGPP可以被進一步加工成二 萜，或者可以被進一步加工以生成類胡蘿蔔素。香葉基香葉基焦磷酸合成酶核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(ATHGERPYRS ；擬南芥(Arabidopsis thaliana))、(BT005328 ；擬南芥(Arabidopsis thaliana))、 (NM_119845 ；擬南芥(Arabidopsis thaliana))、 (NZ_AAJMO1000380,位 點ZP_00743052 ；蘇雲金芽孢桿菌以色列血清型(Bacillus thuringiensis serovar israelensis), ATCC 35646sql563)、(CRGGPPS ；長春花(Catharanthus roseus))、(NZ_ AABF02000074,位點 ZP_00144509 ；具核梭桿菌文氏亞種(Fusobacterium nucIeatum subsp. Vincentii), ATCC 49256)、(GFGGPPSGN ；藤倉赤黴(Gibberella fujikuroi))、 (AY371321;銀杏(Ginkgobiloba))、(AB055496 ；巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis))、 (ABO17971 ；智人(Homosapiens))、(MCI276129 ；葡萄牙卷枝毛黴(Mucor circinelloides f. Iusitanicus))、(AB016044 ；小家鼠(Mus musculus))、(AABX01000298，位點 NCU01427 ； 粗糙脈孢菌(Neurospora crassa))、(NCU20940 ；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa))、(NZ_ AAKL01000008，位點 ZP_00943566 ；青枯菌(Ralstoniasolanacearum) UW551)、(ABl 18238 ； 褐家鼠(Rattus norvegicus))、(SCU31632 ；酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、 (ABO 16095 ；細長聚球藍細菌(Synechococcus elongatus))、(SAGGPS ；白芥(Sinapis alba))、(SS0GDS ；嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius))、(NC_007759,位 點 YP_461832 ；酸養互營菌(Syntrophus aciditrophicus) SB)、和(NC_006840，位點 YP_204095 ；費氏弧菌(Vibrio fischeri)ES114)。
或者，GGPP也可以通過將IPP添加到FPP上製備。編碼能夠催化該反應的酶的 核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(NM_112315 ；擬南芥(Arabidopsis thaliana)), (ERWCRTE ；成團泛菌(Pantoea agglomerans))、(D90087,位點 BAA14124 ；菠蘿泛菌 (Pantoea ananatis))、(X52291，位點 CAA36538 ；莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus))、 (AF195122，位點 AAF24294 ；球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides))、和(NC_004350，位 點 NP_721015 ；變異鏈球菌(Sti^ptococcus mutans) UA159)。GGPP隨後被轉化成多種C2tl類異戊二烯。C2tl化合物的示例性例子包括但不限於香葉基櫳牛兒醇香葉基櫳牛兒醇，其結構為 其是來自紅椿(Cedrela toona)的木油和亞麻籽油的組成成分。香葉基櫳牛兒醇 可以通過例如在表達構建體中在GGPP合成酶基因的後面添加磷酸酶基因來製備。松香二烯松香二烯包含以下異構體 其在樹木例如北美冷杉(Abies grandis)中被發現。松香二烯是用松香二烯合成酶製備的。合適的核苷酸序列的示例性例子包括但不限於(U50768;北美冷杉(Abies grandis))和(AY473621 ；歐洲雲杉(Picea abies))。C2Q+化合物C2tl+化合物也包含在本文提供的範圍內。這些化合物的示例性例子包括二倍半萜 (由五個異戊二烯單元製備的C25化合物)、三萜(由六個異戊二烯單元製備的C3tl化合物)、 和四萜(由八個異戊二烯單元製備的C4tl化合物)。這些化合物通過使用本文描述的類似 方法，並且取代或添加了適當的合成酶的核苷酸序列來製備。類異戊二烯化合物的高產率本發明提供了通過在使用乙醇作為碳源的條件下培養或維持宿主細胞來高效制 備類異戊二烯的組合物和方法。使用本發明描述的方法，宿主細胞生成多於約5克類異戊 二烯每升發酵反應混合物(5g/L)。在其它實施方案中，生成多於約10g/L、多於約15g/L、多 於約20g/L、多於25g/L，或生成多於約30g/L的類異戊二烯。或者，類異戊二烯的製備可以用比生成率而不是產量來表示。例如，使用本發明描 述的方法，宿主細胞生成多於約50毫克類異戊二烯每克幹宿主細胞。在其它實施方案中， 生成多於約100毫克每克細胞乾重、多於約150毫克每克細胞乾重、多於約200毫克每克細 胞乾重、多於約250毫克每克細胞乾重、多於約500毫克每克細胞乾重、多於約750毫克每 克細胞乾重、或多於約1000毫克每克細胞乾重的類異戊二烯。無論製備水平是用產量還是比生成率表示，製備發生在小於約120小時、小於約 96小時、小於約72小時、優選地小於約48小時、或甚至小於約24小時。本發明提供的方法可以在分批、補料分批或連續工藝中進行。分批工藝通常是封 閉工藝，其中所有的原材料都在工藝開始時添加。補料分批工藝通常是封閉工藝，其中碳源 和/或其它底物在工藝期間增量添加。補料分批工藝實現了對培養基和微生物的生長的更 大控制。連續工藝可以被認為是開放系統，其中培養基是連續添加的，而且產物被同時去 除。介於補料分批和連續工藝之間的工藝也可以被使用。例如，在一個實施方案中， 工藝作為補料分批工藝開始，而且在工藝進行期間有機層被與培養基接觸。將類異戊二烯 (通常在有機溶液中比在水溶液中具有更高的溶解度)從培養基中萃取到有機層中。因為 將產物從培養基中去除，本方法同時具有補料分批和連續工藝的特點。通過有機覆蓋層(例如十二烷、肉豆蔻酸異丙酯、油酸甲酯等)去除產物，經常可 以引起類異戊二烯產量的增加。去除產物可以引起產量增加，而且其在產物積累導致途徑 抑制時尤其合適。在一些實施方案中，有機層可以由類異戊二烯產物自身形成。這發生在 生成的類異戊二烯超過了其飽和點並形成了可與水性培養基分離的層的時候。在一些實施方案中，乙醇是宿主細胞的唯一碳源。在其它實施方案中，碳源同時包 括乙醇和非乙醇碳源。在又一些實施方案中，非乙醇碳源是碳水化合物。碳水化合物的示例性例子包括單糖、二糖、及其組合。合適的單糖的一些非限制性 例子包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖，及其組合。合適的二糖的一些非限制性例子 包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖，及其組合。合適的多糖的一些非限制性例子包 括澱粉、糖原、纖維素、幾丁質，及其組合。碳水化合物的其它來源包括甘蔗汁和糖蜜。
一般而言，多糖在首先通過化學手段或酶方法被轉化成單糖和寡糖之後被宿主細 胞用作碳源。例如，纖維素可以被纖維素酶轉化成葡萄糖。在一些實施方案中，如發酵開始 時所測定的，多糖分解後，單糖和/或寡糖構成了碳源的至少約50%重量。在其它實施方案 中，如發酵開始時所測定的，單糖和/或寡糖構成了碳源的至少約80%或甚至90%重量，因 此，發酵培養基基本不含纖維素。在一些實施方案中，宿主細胞被外源提供乙醇作為碳源。在其它實施方案中，被宿主細胞作為碳源消耗的乙醇是由宿主細胞生成的。也就是說，向宿主細胞提供了非乙醇碳 源(通常為碳水化合物)，其被宿主細胞轉化成乙醇，而乙醇隨後被宿主細胞消耗。宿主細胞對乙醇的使用可以用許多方式量化。在一個方法中，使用乙醇濃度。除 了作為碳源之外，培養基中存在的乙醇也具有阻止微生物汙染的益處。因此，在一個實施方案中，培養基中的乙醇濃度在至少4小時內是至少約1克每升 培養基。乙醇濃度可以通過任何本領域已知的方法測定。可以通過培養基取樣直接測量， 或通過廢氣取樣間接測量乙醇濃度。如果使用間接方法例如通過質譜分光光度計進行廢氣 分析，首先必須建立廢氣測量(以每百萬分之一為單位)和培養基中乙醇的直接測量之間 的相互關係。在其它實施方案中，培養基中的乙醇濃度在約1到約5克、約1到約10克、或 約1到約20克每升培養基之間。在又一些實施方案中，培養基中的乙醇濃度大於約10克 每升培養基或大於約20克每升培養基。在又一些實施方案中，以上乙醇濃度被保持至少6 小時、8小時、10小時、12小時、24小時、或48小時。然而，在宿主細胞使用乙醇作為碳源時，仍然可能檢測不到乙醇水平，或者乙醇濃 度接近零。例如，這可以發生在宿主細胞消耗乙醇與補充乙醇一樣快時。因此，本發明提供 了對宿主細胞的乙醇使用率的其它測量法。在另一實施方案中，宿主細胞的比乙醇消耗率是至少0.01克乙醇每克細胞乾重 每小時。在其它實施方案中，比乙醇消耗率在約0. 01到約0. 20克乙醇、或約0. 02到約0. 10 克乙醇每克細胞乾重每小時之間。在又一些實施方案中，比乙醇消耗率大於約0. 10克乙醇 每克細胞乾重每小時。比乙醇消耗率被保持至少4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、 24小時、或48小時。或者，比乙醇消耗率以克乙醇每克細胞乾重每天表示。在一些實施方案中，宿主細 胞的比乙醇消耗率是至少0. 2克乙醇每克細胞乾重每天。在一些實施方案中，比乙醇消耗 率在約0. 2到約5克或約0. 5到約3克乙醇每克細胞乾重每天之間。在其它實施方案中， 比乙醇消耗率大於約3克乙醇每克細胞乾重每天。 在一些實施方案中，細胞被培養或維持在不限制氧氣的條件下。也就是說，細胞處 在有氧條件下。但是，因為質量轉移的限制和氧氣在水溶液中的相對低溶解度，在大規模加工中 保持完全有氧條件可能是特別具有挑戰性的。例如，如果用空氣噴射到罐中，氧氣在20°C 下在水中的溶解度是9毫克每升。如果使用純氧來代替空氣，那麼溶解度增加到43毫克每 升。在任一種情況下(噴射空氣或純氧)，除非持續提供氧氣，該氧氣量將在數秒內被活躍 且密集的微生物群耗盡。相比之下，細胞在相同時間(數秒，例如，低於一分鐘)內使用的 其它養分的量與總體濃度相比可以忽略。我們已經發現本發明提供的宿主細胞能夠忍受一段時期的氧氣限制，並仍然生成高水平的類異戊二烯化合物。該靈活性使得可以通過在發酵罐設計方面的節約、降低的氧 氣需要、更低的用於通風的能量消耗等，實現更加經濟的工藝。此外，在一些情況下，氧氣限 制似乎是有益的。不受限於理論，氧氣限制條件下的細胞生長似乎允許更多的碳形成產物， 而不是形成生物量或通過二氧化碳丟失。因而，在一些其它實施方案中，宿主細胞被培養或維持在氧氣限制條件下。氧氣限 制的時間包括至少4小時、至少6小時、至少8小時、至少10小時、至少12小時、至少24小 時、或至少48小時。當宿主細胞的比生長速率低於氧氣不受限(例如，過量提供)時的最大比生長速率時，發生氧氣限制。比生長速率是每單位生物量每單位時間的細胞生長速率，且其以時間 的倒數(1/t)為單位。細胞在培養基中的最大比生長速率跟底物濃度(在本例中是氧氣) 對生長速率的影響有關。一般地，細胞在低水平的底物下將緩慢生長，而且隨著培養基中的 底物水平增加，細胞生長的速率也會增加。但是，細胞生長的速率不會持續無限升高，而且 在高水平的底物下，底物量的給定增加將使細胞生長的速率產生越來越小的增加。因此，生 長速率最終達到一個極限，它經常被稱為最大比生長速率。對培養中生長速率之間的關係的理論處理是本領域技術人員熟知的，且被稱為 Monod 方程式。參見，例如，Pirt，Principles of Microbe and CellCultivation, Wiley, NY，1975，4-10頁。在該理論處理中，最大比速率是漸近的極限，該極限在底物達到無限水 平之時才能達到。但是，實踐中，當研究條件(例如，底物水平例如氧氣)支持最快的初始 生長速率時，可以認為獲得了最大比生長速率。例如，在補料分批反應器中，當生長需要的 所有底物(例如養分和氧氣)被過量提供，而且發酵發生在宿主細胞的最適溫度時，該初始 條件被認為是實現最大生長速率的條件。參見，例如，Lee等(1996)TrendSBiotechnol. 14 98-105和Korz等(1995) J Biotechnology 39 :59_65。最大比生長速率在某些時候也被稱 為不受限的生長。在一個方法中，氧氣限制被量化為培養基中的氧氣濃度，而且用溶解的氧濃度 (DOC)表示。培養基中的DOC可以低於約20%、低於約15%、低於約10%、和低於約5%。 在其它實施方案中，DOC是約0%或低於可檢測水平。然而，因為氧氣被細胞相對快速地消耗，DOC為零可以指細胞在厭氧條件(沒有氧 氣)下培養，也可以指細胞的耗氧和供氧一樣快。在另一個方法中，細胞的氧氣使用以氧氣 攝入率(OUR;每升培養基的細胞氧氣消耗速率)表示，以區分這兩種可能性。合適的氧氣 攝入率包括低於約50毫摩爾、低於約40毫摩爾、低於約30毫摩爾、低於約20毫摩爾每升 培養基，或低於約10毫摩爾每升培養基。或者，當相對於細胞密度的標準化值為優選時，可以使用比氧氣攝入率(S0UR，即 OUR除以細胞密度)。每升發酵物中的微生物數量，或微生物密度，可以通過測量給定體積 的發酵培養基中分離的微生物重量來測量。常用的測量是每升發酵培養基的細胞乾重。另 一個可以用來在發酵進程中監測發酵的方法是測量培養基的光密度。常用的方法是在波長 600nm處測量光密度，稱作0D_值，或OD值。OD值可以與特定培養基內的特定類型生物體 的密度相關聯，但OD值和每體積微生物量之間的特定關係通常將不能適用於所有類型的 培養基中所有類型的生物體。通過在一定細胞密度範圍內測量OD值和細胞乾重，可以創建 校準曲線。在某些情況下，這些關聯性可被用於相同或類似的微生物在相同或類似的培養基中的不同發酵中。合適的比氧氣攝入率包括低於約30毫摩爾、低於約25毫摩爾、低於約 20毫摩爾、低於約15毫摩爾、低於約10毫摩爾、或低於約5毫摩爾每克細胞乾重每小時。我們也已經發現，本發明提供的宿主細胞能夠容忍一段時期的磷酸鹽限制，並仍 然製備高水平的類異戊二烯化合物。不受限於理論，磷酸鹽限制條件下的細胞生長似乎允 許更多的碳形成產物，而不是生物量。培養基中的合適磷酸鹽濃度是低於約5克、低於約4 克、低於約3克、低於約2克、或低於約1克每升培養基。在一些實施方案中，磷酸鹽濃度為 零或低於可檢測水平。這樣的磷酸鹽限制的時間包括至少4小時、至少6小時、至少8小時、 至少10小時、至少12小時、至少24小時、或至少48小時。宿主細胞可以在非限制性條件(允許最大比生長)下生長，以在施加限制條件(氧氣限制、磷酸鹽限制、或兩者同時)之前形成足夠的生物量。這些限制條件包括使比 生長低於最大比生長速率的約 90%,80%,75%,60%,50%,40%,30%,25%,20%,10%, 5%、或的條件。儘管本文提供了具體的實施方案，以上描述是為了說明，而非限制實施方案的範 圍。實施方案範圍內的其他方面、益處、和修飾對本領域技術人員將是顯而易見的。
實施例除非另外指出，本領域技術範圍內的生物合成工業的常規技術等可以被用來實現 本發明提供的實施方案。對於本文中沒有充分說明的此類技術，可以在科學文獻中找到足 夠的相關參考。在以下實施例中，已經盡力保證所使用的數字(例如數量、溫度等)的精確度，但 是變化和偏差是可以接受的，且如果本文報導的數字存在筆誤，本領域普通技術人員可以 基於本文披露的其它內容，推導出正確的量。除非另外指出，溫度以攝氏度表示，且壓力是 或接近海平面的大氣壓。所有的試劑，除非另外指出，是可商業獲得的。以下實施例僅僅為 了說明目的，而不以任何方式限制本發明提供的實施方案的範圍。實施例1本實施例描述了製備載體用於將編碼酶(包括MEV途徑的酶)的核酸靶向整合到 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的特定染色體位點中的方法。基因組DNA分離自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株Y002和 Y003 (CEN. PK2 背景 MATA 或 MATa ura3-52trpl-2891eu2-3，112his3 Δ 1MAL2-8C SUC2) (van Dijken 等(2000) Enzyme Microb. Technol. 26 :706_714)、Y007 (S288C 背景 MATA trpl Δ63) (ATCC 號 200873)、和 EG 123(MATA ura3trp Ileu2his4canl)(Michaelis&Herskowitz. (1988)Mol. Cell. Biol. 8 1309-1318) 在包含酵母提取物、2%細菌蛋白腖和2%右旋 糖的液體培養基(YPD培養基)中過夜生長菌株。通過在3，IOOrpm離心、在IOmL超純水中 洗滌細胞沉澱、並重新離心來從IOmL液體培養基中分離細胞。使用Y-DER酵母DNA提取試 劑盒(Pierce Biotechnologies, Rockford，IL)按照生產商建議的步驟提取基因組DNA。 將提取的基因組DNA在100 μ L IOmM Tris_Cl，ρΗ8. 5中重懸，並在ND-1000分光光度計 (NanoDrop Technologies, Wilmington,DE)上取得 0D26(1/2M 讀數，以測定基因組 DNA 濃度和 純度。在 Applied Biosystems 2720 溫控循環器(Applied Biosystems Inc.，FosterCity, CA)上，按照生產商建議的步驟，使用Phusion高保真DNA聚合酶體系 (Finnzymes OY，Espoo，Finland)，通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行DNA擴增。在將待插入 到 TOPO TA pCR2. 1 克隆載體(Invitrogen，Carlsbad, CA)中的 DNA 片段 PCR 擴增完畢後， 通過如下步驟生成核苷酸突出端向反應混合物加入IyL Qiagen Taq聚合酶(Qiagen， Valencia, CA)，並進行額外10分鐘72°C PCR延伸步驟，接著冷卻到4°C。在PCR擴增完成 後，向反應混合物添加8 μ L 50%甘油溶液。使用包含0. 5g/mL 溴化乙啶的 1 % TBE (0. 89M Tris, 0. 89M 硼酸，0.02MEDTA 鈉 鹽)瓊脂糖凝膠，在120V，400mA，進行30分鐘瓊脂糖凝膠電泳。使用紫外光觀察DNA條 帶。用無菌的剃鬚刀片從凝膠中切除DNA條帶，使用Zymoclean凝膠DNA回收試劑盒(Zymo Research, Orange, CA)依照生產商建議的步驟凝膠純化切下的DNA。將純化的DNA洗脫到 10 μ L超純水中，並在ND-1000分光光度計上取得0D26Q/28Q讀數，以測定DNA濃度和純度。使用100-500 μ g純化的PCR產物和高濃度T4DNA連接酶(New EnglandBiolabs, Ipswich, ΜΑ)按照生產商建議的步驟進行連接。為增殖質粒，按照生產商建議的步驟將連 接後的構建物轉化到大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a化學感受態細胞(Invitrogen， Carlsbad, CA)中。在包含1. 5%細菌用瓊脂、1 %胰蛋白腖、0. 5%酵母提取物、1 % NaCl、 和合適抗生素的固體培養基上篩選陽性轉化株。分離的轉化株在37°C在包含適當抗生素 的液體Luria-Bertoni (LB)培養基中生長16小時，並使用QIApr印Spin Miniprep試劑 盒(Qiagen，Valencia, CA)按照生產商建議的步驟分離和純化質粒。通過如下步驟驗證 構建體進行診斷性限制性內切酶消化，用瓊脂糖凝膠解析DNA片段，並使用紫外光觀察 條帶。也通過DNA測序來驗證選擇的構建體，DNA測序由ElimBiopharmaceuticals Inc. (Hayward, CA)完成。 通過將載體pAM471的ERG20-PeAL-tHMGR插入片段插入到載體pAM466中，生成 質粒 PAM489。通過將 DNA 片段 ERG20-PeAftHMGR 插入到 Τ0Ρ0 Zero Blunt II 克隆載 體(Invitrogen，Carlsbad, CA)中，生成載體 pAM47l，所述 DNA 片段 ERG20-PGAL-tHMGR 包含釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的ERG20基因的開放讀碼框(ORF) (ERG20核苷酸位點1至1208 ；ATG起始密碼子的A是核苷酸1) (ERG20)、包含釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)的分歧 GALl 和 GALlO 啟動子(GAL1 核苷酸位點 _1 至-668)的 基因組位點(PaJ,和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HMGl基因的截短的ORF (HMG1 核苷酸位點 1586 至 3323) (tHMGR)。通過將 DNA 片段 TRPr856 5+548 插入到 Τ0Ρ0 TA pCR2. 1 克隆載體(Invitrogen，Carlsbad, CA)中，生成載體 pAM466，所述 DNA 片段 TRPl—856 5+548 包 含釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的野生型TRPl位點片段(從核苷酸位點_856延 伸至位點548，且在鹼基-226和-225之間包含非天然的內部XmaI限制性酶切位點)。如表 1所示，通過PCR擴增生成DNA片段ERG20-PeAL-tHMGR和TRP1-8565+548。對PAM489的構建， 使用 XmaI 限制性內切酶(New England Biolabs, Ipswich, ΜΑ)完全消化 400ng 的 pAM471 禾口 IOOng的pAM466，將對應於ERG20-PeAf tHMGR插入片段的DNA片段和線性化的pAM466載 體凝膠純化，並將4摩爾當量的純化的插入片段與1摩爾當量的純化的線性化載體連接，生 成PAM489。圖4A顯示了 ERG20-PeAftHMGR插入片段的圖譜，而SEQ ID NO :1顯示了側翼為
TRPl序列的插入片段的核苷酸序列。
通過將載體pAM472的ERG 13-PeAf tHMGR插入片段插入到載體pAM467中，生成 質粒 PAM491。通過將 DNA 片段 ERGl 3-PeAf tHMGR 插入到 Τ0Ρ0 Zero Blunt II 克隆載 體中生成載體pAM472，所述DNA片段ERGl3-PeAf tHMGR包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ERG13基因的0RF(ERG13核苷酸位點1至1626) (ERG 13)、包含釀酒酵 母(Saccharomycescerevisiae)的分歧 GALl 和 GAL10 啟動子(GAL1 核苷酸位點 _1 至-668) (PaJ的基因組位點、和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HMGl基因的截 短的ORF (HMG1核苷酸位點1586至3323) (tHMGR)。通過將DNA片段URA3 —723 5 插入 到Τ0Ρ0 TA pCR2. 1克隆載體中生成載體pAM467，所述DNA片段URA3_723 5toi包含釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)的野生型URA3位點片段(從核苷酸位點-723延伸至 位點-224，且在鹼基-224和-223之間包含非天然的內部XmaI限制性酶切位點)。如 表2所示，通過PCR擴增生成DNA片段ERG13-PeAL-tHMGR和URA3〃2357CI1。對於pAM491的 構建，使用XmaI限制性內切酶完全消化400ng的pAM472和IOOng的pAM467，將對應於 ERG13-PGAL-tHMGR插入片段的DNA片段和線性化的pAM467載體凝膠純化，且將4摩爾當 量的純化的插入片段與1摩爾當量的純化的線性化載體連接，生成PAM491。圖4B顯示了 ERG13-PeAf tHMGR插入片段的圖譜，而SEQ ID NO :2顯示了側翼為URA3序列的插入片段的
核苷酸序列。 通過將載體pam473的idi l-peaf thmgr插入片段插入到載體pam468中生成質粒 pam493。通過將dna片段idil-peAL-thmgr插入到τ0ρ0 zeroblunt ii克隆載體中生成載體 pam473，所述dna片段 idil-pgal-thmgr包含釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae) idil 基 因的 orfddil 核苷酸位點 1 至 1017) (idil)、包含釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae) 的分歧gall和gallo啟動子(gal1核苷酸位點_1至-668)的基因組位點(paj、和釀酒酵 母(saccharomyces cerevisiae)hmgl 基因的截短的 0rf(hmg1 核苷酸位點 1586 至 3323) (thmgr)。通過將dna片段ader8255653插入到τ0ρ0 ta pcr2. 1克隆載體中生成載體pam468， 所述dna片段ader825 5 653包含釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的野生型adel位 點片段(從核苷酸位點-225延伸至位點653，且在鹼基-226和-225之間包含非天然的內 部xmai限制性酶切位點)。如表3所示，通過pcr擴增生成dna片段idil-peaf thmgr和 adel—825 5 653。對於pam493的構建，使用xmai限制性內切酶完全消化400ng的pam473和 ioong的pam468，將對應於idil-peaf thmgr插入片段的dna片段和線性化的pam468載體 凝膠純化，且將4摩爾當量的純化的插入片段與1摩爾當量的純化的線性化載體連接，生成 載體pam493。圖4c顯示了 idil-peAL-thmgr插入片段的圖譜，而seq id no 3顯示了側翼 為adel序列的插入片段的核苷酸序列。 通過將pAM474的ERG10-PeAfERG12插入片段插入到載體pAM469中，生成質粒 PAM495。通過將DNA片段ERG10-reAL_ERG12插入到Τ0Ρ0 ZeroBlunt II克隆載體中生成載 體 PAM474。所述 DNA 片段 ERG10-rcAL-ERG12 包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ERG10基因的0RF(ERG10核苷酸位點1至1347) (ERG10)、包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的分歧GALl和GAL10啟動子(GAL 1核苷酸位點_1至-668) (Pgal)的基因組 位點、和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ERG12基因的0RF(ERG12核苷酸位點1至 1482) (ERG 12)。通過將 DNA 片段 HIS3-32至-10CI0-HISMX_HIS3504 至-1103 插入到 Τ0Ρ0ΤΑ pCR2. 1 克隆載體中生成載體PAM469，所述DNA片段HIS3—325-1(I°°-HISMX-HIS35°41(13包含釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)的HIS位點的兩個片段(從核苷酸位點-32延伸至位 點-1000和從核苷酸位點504延伸至位點1103)、HISMX標記、和在HIS3504至_1103序列與 HISMX標記之間的非天然的XmaI限制性酶切位點。如表4所示，通過PCR擴增生成DNA片 段 ERGIO-Pgal-ERG 12 和 HIS3-32 至-1000-HISMX_HIS3504至-1103。對於 pAM495 的構建，使用 XmaI 限制性內切酶完全消化400ng的pAM474和IOOng的pAM469，將對應於ERGlO-Pt^-ERG 12插 入片段的DNA片段和線性化的PAM469載體凝膠純化，且將4摩爾當量的純化的插入片段與 1摩爾當量的純化的線性化載體連接，生成載體pAM495。圖4D顯示了 ERG10-PeAfERG12插 入片段的圖譜，而SEQ ID NO :4顯示了側翼為HIS3序列的插入片段的核苷酸序列。
通過將pAM475的ERG8-PMl-ERG19插入片段插入到載體pAM470中生成質粒 PAM497。通過將DNA片段ERG8-PMl-ERG19插入到Τ0Ρ0 Zero BluntII克隆載體中生成載體 PAM475，所述DNA片段ERG8-Pgal-ERG19包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ERG8基 因的 0RF(ERG8 核苷酸位點 1 至 1512) (ERG8)、包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的分歧GALl和GAL10啟動子(GAL1核苷酸位點_1至-668)的基因組位點(PaJ，和釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)ERG19 基因的 0RF(ERG19 核苷酸位點 1 至 1341) (ERG 19)。通過將DNA片段LEU2-1°°545°HISMX-LEU21°965m°插入到TOPOTA pCR2. 1克隆載體中生成載 體 pAM470，所述 DNA 片段 LE^Ja^^-HISMX-LEU〗1。965 包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LEU2位點的兩個片段(從核苷酸位點_100延伸至位點450和從核苷酸位點 1096延伸至位點1770)、HISMX標記、和在LEU21(l965m°序列與HISMX標記之間的非天然的 XmaI限制性酶切位點。如表5所示，通過PCR擴增生成DNA片段ERG8-PMl-ERG19和LEU2-1(I° 至45°-HISMX-LEU21Q965m°。對於pAM497的構建，使用XmaI限制性內切酶完全消化400ng 的pAM475和IOOng的pAM470，將對應於ERG8-PMl-ERG19插入片段的DNA片段和線性化的 PAM470載體純化，且將4摩爾當量的純化的插入片段與1摩爾當量的純化的線性化載體連 接，生成載體PAM497。圖4E是ERG8-PMl-ERG19插入片段的圖譜，而SEQ ID NO :5顯示了側 翼為LEU2序列的插入片段的核苷酸序列。
實施例2本實施例描述了可用於製備本發明提供的實施方案中的質粒和DNA片段的方法。通過將DNA 片段 GAL7451Q21-HPH-GAL11637 5 2587 插入到 TOPO ZEROBlunt II 克隆載 體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生成質粒 pAM584。DNA 片段 GAL74至1°21-HPH-GAL11637 至 2587 包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GAL7基因的ORF片段(GAL7核苷酸位點4至 1021) (GAL7451。21)、潮黴素抗性盒(HPH)、和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GALl 基 因的3非翻譯區(UTR)片段(GAL1核苷酸位點1637至2587)。如表6所示，通過PCR擴增 生增生成DNA片段。圖4F顯示了圖譜，而SEQ ID NO :9是DNA片段GAL7451CI21-HPH-GAL11637
5 2587的核苷酸序列。
**質粒PAM547是合成生成的，且包含HPH盒，其由大腸桿菌CEscfer/c/^ co//)的潮 黴素B磷酸轉移酶編碼序列組成，側翼是軋酸克魯維酵母(Kiuyveromyces lactis)TefJ基 因的啟動子和終止子。_通過PCR擴增生成DNA片段GALSiT5ci5-1-NatR_GAL8013°951358。該DNA片段包含諾爾 斯氏鏈黴菌(Sti^ptomyces noursei)的諾爾絲菌素抗性選擇性標記基因(NatR)，側翼是 兩個各自具有50個核苷酸的片段，分別直接位於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GAL80基因編碼區域的上遊和下遊(分別是GAL80核苷酸位點-50至-1和1309至1358 ； GAL8(T50 至和 GAL801309至 1358)。圖 4G 顯示 了圖譜，而 SEQ ID NO :8 是 DNA 片段 GAL8(T50 至^l-NatR-GALSO1309 5 1358 的核苷酸序列。通過PCR擴增生成DNA片段GALl1548-NatR_GALl15°°5155°。該DNA片段包含諾爾 斯氏鏈黴菌(Sti^ptomyces noursei)的諾爾絲菌素抗性選擇性標記基因(NatR)，側翼是 兩個各自具有40至50個核苷酸的片段，分別位於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GALl基因編碼區域的5和3端(分別是GALl核苷酸位點1至48和1500至1550 ；GALl1至48 和 GALl1500 至 1550)。圖 4H 顯示了圖譜，而 SEQ ID NO :68 是 DNA 片段 GALl1548_NatR_GALl15°° 5 1550的核苷酸序列。通過將編碼β -法呢烯合成酶的核苷酸序列插入到PRS425-GAL1載體(Mumberg 等(1994) Nucl. Acids. Res. 22 (25) :5767_5768)中，生成表達質粒 pAM353。合成生成 核苷酸序列插入片段，使用黃花蒿(Artemisia annua)的β-法呢烯合成酶基因的編 碼序列(GenBank登錄號ΑΥ835398)作為模板，該編碼序列經密碼子優化以在釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)中表達(SEQ IDNO :10)。合成生成的核苷酸序列側翼是 5BamHI和3XhoI限制酶切位點，並因此可以被克隆到克隆載體例如標準的pUC或pACYC源 載體的相容的限制性酶切位點中。通過使用BamHI和XhoI限制性內切酶完全消化DNA合 成構建物而將合成生成的核苷酸序列分離。通過凝膠電泳解析反應混合物，凝膠提取包含 β -法呢烯合成酶編碼序列的約1. 7kb DNA片段，並將分離的DNA片段連接到pRS425_GALl 載體的BamHI XhoI限制性酶切位點中，生成表達質粒pAM353。通過將編碼黃花蒿(Artemisia annua)的β -法呢烯合成酶的、經密碼子優化以 在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達的核苷酸序列插入到載體pAM178 (SEQ ID NO 69)中以生成表達質粒 pAM404。使用引物 52_84pAM326BamHI (SEQ ID NO :71)禾口 52-84pAM326NheI (SEQ ID NO 72)從pAM353PCR擴增編碼β -法呢烯合成酶的核苷酸序列。 使用BamHI和Nhel限制性內切酶將得到的PCR產物完全消化，通過凝膠電泳解析反應混合 物，凝膠提取包含β-法呢烯合成酶編碼序列的約1.7kb DNA片段，並將分離的DNA片段連接到載體PAM178的BamHI Nhel限制酶切位點中以生成表達質粒pAM404 (質粒圖譜參見圖 5)。實施例3本實施例描述了可用於本發明提供的實施方案的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的生成。通過用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MET3啟動子替換ERG9啟動子，並用光滑假絲酵母(Candida glabrata) LEU2基因(CgLEU2)替換ADE10RF，來製備釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)菌株 CEN. PK2-1C Y002 和 Y003 (MATA 或 ΜΑΤ α ；ura3-52 ； trp 1-289 ；leu2-3,112 ；his3A1 ；MAL2-8C ；SUC2)(van Dijken 等(2000)Enzyme Microb. Technol.26(9-10) 706-714)從而引入可被誘導的MEV途徑基因。這一點通過以下方法完 成使用引物 50-56-pwl00-G(SEQ ID NO 10)和 50-56-pwl01_G (SEQ ID N0:11)(其包含 與天然ERG9啟動子同源的45個鹼基對)PCR擴增載體pAM328的KanMX-PMET3區域(SEQ ID NO 6)，該區域包含Pmet3啟動子，該啟動子的前面是卡那黴素抗性標記，該標記的側翼是乳 酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis) Tefl基因的啟動子和終止子；使用40% w/w聚乙 二醇 3350 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、IOOmM 醋酸鋰(Sigma-Aldrich，St. Louis, M0)、 禾口 10 μ g 鮭魚精 DNA(Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)將 10 μ g 生成的 PCR 產物轉化到 指數生長的Y002和Y003細胞中，並將細胞在30°C培養30分鐘，接著在42°C熱休克30分 鍾(Schiestl 和 Gietz (1989) Curr. Genet. 16 :339_346)。通過細胞在包含 0. 5 μ g/mL 遺 傳黴素(Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)的富集培養基上生長的能力來識別陽性重組 物，並通過PCR鑑定來確認篩選的克隆。得到的克隆被命名為Y93 (ΜΑΤ Α)和Υ94(ΜΑΤα)。 然後使用引物 61-67-CPK066-G(SEQID NO :60)和 61-67-CPK067-G (SEQ ID N0:61)(其包 含與ADE10RF同源的50個鹼基對的側翼)從光滑假絲酵母(Candida glabrata)基因組 DNA (ATCC,Manassas, VA)擴增3. 5kb CgLEU2基因組位點，並將10 μ g得到的PCR產物轉化 到指數生長的Y93和Y94細胞中，通過在缺乏亮氨酸補充下生長來選擇陽性重組物，並通過 PCR鑑定來確認篩選的克隆。得到的克隆被命名為Y176 (ΜΑΤ Α)和Υ177(ΜΑΤα)。通過使用PmeI 限制性內切酶(New England Biolabs, Beverly, ΜΑ)將 ρΑΜ491 禾口 ΡΑΜ495質粒DNA消化完全，並將純化的DNA插入片段引入到指數生長的Υ176細胞中，來生 成菌株Υ188。通過在缺乏尿嘧啶和組氨酸的培養基上生長來篩選陽性重組物，並通過診斷 性PCR來確認整合到了正確的基因組位點中。通過使用PmeI限制性內切酶將ρΑΜ489和ρΑΜ497質粒DNA消化完全，並將純化的 DNA插入片段引入到指數生長的Υ177細胞中，以生成菌株Υ189。通過在缺乏色氨酸和組氨 酸的培養基上生長來篩選陽性重組，並通過診斷性PCR來確認整合到了正確的基因組位點 中。將約1 X IO7個來自菌株Υ188和Υ189的細胞在室溫下在YPD培養基平板上混合 6小時以使之結合。將混合的細胞培養物接種到缺乏組氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培養基中， 以篩選二倍體細胞的生長。如下生成菌株Υ238 用已使用PmeI限制性內切酶完全消化的 ΡΑΜ493質粒DNA轉化二倍體細胞，並將純化的DNA插入片段引入到指數生長的二倍體細胞 中。通過在缺乏腺嘌呤的培養基上生長來篩選陽性重組，並通過診斷性PCR來確認整合到 了正確的基因組位點中。
如下生成單倍體菌株Υ211(ΜΑΤα)使菌株Υ238在2 %醋酸鉀和0. 02 %棉籽 糖液體培養基中形成孢子，使用Singer Instruments MSM300系列微操作器(Singer Instrument LTD, Somerset, UK)分離約200個遺傳四分體，通過它們在腺嘌呤、組氨酸、尿 嘧啶和色氨酸的缺乏下的生長能力，識別包含了引入的遺傳物質的合適補體的獨立遺傳分 離物，並通過診斷性PCR確認所有引入的DNA的整合。 通過使菌株能夠將FPP轉化成紫穗槐-4，11-二烯，由菌株Y211生成菌株Y227。為 此，用表達質粒pAM426(SEQ IDNO 7)轉化指數生長的Y211細胞，該質粒包含GALl啟動子， 其與經密碼子優化以在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表達的紫穗槐_4，11-二 烯合成酶基因的編碼序列可操作地連接(Merke等(2000) Ach. Biochem. Biophys. 381 173-180)。在缺乏亮氨酸的完全合成的確定成分培養基上篩選宿主細胞轉化株。通過刪除GAL80基因的編碼序列，並因此使得菌株中的GAL啟動子具有組成性活 性，由菌株Y227生成菌株Y293。為此，用DNA片段GAL80_5°5-LNatR-GALSO13ci95 1358轉化指 數生長的Y227細胞。在包含100 μ g/mL諾爾絲菌素的YPD瓊脂上篩選宿主細胞轉化株，挑 取單克隆，並通過診斷性PCR來確認整合到了正確的基因組位點中。通過使得菌株不能降解半乳糖，由菌株Y227生成菌株Y337。為此，使用PmeI限制 性內切酶將PAM584質粒DNA消化完全，並將純化的DNA插入片段GAL7451(I21-HPH-GAL11637 5 2587引入到指數生長的Y227細胞中。通過在包含潮黴素B (Sigma，St. Louis, MO)的YPD瓊 脂上生長來篩選陽性重組物。通過診斷性PCR和測試菌株缺乏使用半乳糖作碳源的能力， 來確認整合到了正確的基因組位點中。通過使得菌株不能降解半乳糖，由菌株Y211生成菌株Y351。為此，使用PmeI限制 性內切酶將PAM584質粒DNA消化完全，並將純化的DNA插入片段GAL7451(I21-HPH-GAL11637 5 2587引入到指數生長的Y211中。在包含潮黴素B的YPD瓊脂上篩選宿主細胞轉化株。通過 診斷性PCR和測試菌株缺乏使用半乳糖作碳源的能力，來確認整合到了正確的基因組位點 中。通過使得菌株能夠生成β -法呢烯合成酶，由菌株Υ351生成菌株Υ352。為此，用 表達質粒ΡΑΜ404轉化指數生長的Υ351細胞。在缺乏亮氨酸的完全合成的確定成分培養基 上篩選宿主細胞轉化株。通過刪除GALl基因的編碼序列並因此使得菌株不能降解半乳糖，由菌株Υ227生 成菌株Υ283。為此，用DNA片段GALll548-NatR-GALl15°°5l55°轉化指數生長的Y227細胞。 在包含100 μ g/mL諾爾絲菌素的YPD瓊脂上篩選宿主細胞轉化株，挑取單克隆，並通過診斷 性PCR和通過使菌株在包含甘油和2-脫氧半乳糖(有功能的GALlp會把後者轉化成毒素) 的瓊脂上生長，來確認整合到了正確的基因組位點中。通過用載體pAM178(SEQ ID NO 69)轉化指數生長的Y211細胞，由菌株Y211生成 菌株Y221。通過在缺乏亮氨酸的完全合成培養基上生長來篩選陽性轉化株。通過刪除GAL80基因的編碼序列並因此使得菌株中的GAL啟動子具有組成性活 性，由菌株Y221生成菌株Y290。通過篩選丟失了 pAM178載體的克隆，由菌株Y290生成菌株Y318。通過使得菌株能夠在半乳糖存在下生成β _法呢烯合成酶，由菌株Υ318生成菌株 409。為此，用表達質粒ΡΑΜ404轉化指數生長的Υ318細胞。在缺乏亮氨酸的完全合成的確定成分培養基上篩選宿主細胞轉化株。通過使得菌株中的GAL啟動子具有組成性活性並能夠在葡萄糖的存在下表達更 高水平的GAL4p(即，能夠在葡萄糖存在下更加有效地驅動半乳糖誘導的啟動子的表達， 同時確保有足夠的Gal4p轉錄因子驅動細胞中所有半乳糖誘導的啟動子的表達)，由菌株 Y409生成菌株Y419。為此，菌株Y409中ERG9位點的KanMX標記被替換成一段DNA片段，該 片段包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GAL4基因的ORF (其處於「可操作的、組成 性的」天然啟動子的控制下)(Griggs&Johnston (1991)PNAS 88(19) :8597_8601)，和 GAL4 終止子(PGal4QC-GAL4-TGAL4)、以及諾爾斯氏鏈黴菌(Str印tomyces noursei)的諾爾絲菌素抗 性選擇標記基因(NatR)(其側翼是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)Tefl基因的 啟動子和終止子)。通過將甲羥戊酸激酶的編碼區域的另一拷貝引入到位於GAL80位點的Pem的控制下，由菌株Y419生成菌株Y677。通過在30°C在接種培養基中培養細胞，直到其0D_值達到2-5來製備菌株Y293、 Y283、Y352和Y677的細胞庫。此時，將瓶放置於冰上。將三份培養物和2份冰冷的無菌 50%甘油混合，將ImL該混合物的等份在_80°C冷凍在小冷凍瓶中。對於菌株Y337使用相 同步驟，但該菌株的0D_值在其冷凍時為13. 6。實施例4本實施例描述了宿主細胞在補料分批、僅用葡萄糖給料的限碳發酵中對紫穗 槐-4，11-二烯的生成。通過接種ImL冷凍小瓶到包含50mL接種培養基(表7)的250mL瓶中，製備Y337 接種培養物。在30°C生長約24小時後，將0. 5mL培養物在各自包含50mL接種培養基的另 外多個250mL瓶中繼代培養。接種培養物在30°C生長過夜，直至0D_值為約3到12。合 並這些瓶，並被用來以10% ν/ν接種包含分批培養基(表8)的生物反應器。 儲備液
C)通過在水中加熱溶解琥珀酸，讓溶液冷卻，用NaOH調節pH值為5.05，並 高壓滅菌溶液(12〗°C，45分鐘)來製備琥珀酸儲備液_

a)首先將生物素溶解在10mL 5 M NaOH中，然後添加到DI水(750mL/L)中。
使用5 MNaOH或HCl調節pH值至6.5，並在加入每種維生素後再次調節pH。 所有的維生素都溶解後，溶液用DI水樸滿至終體積，並過濾滅菌。瓶子用鋁 箔覆蓋，在4°C儲存。
b)在ZnSO4溶解前，首先將EDTA添加到DI水(750mL/L)中。使用5M NaOH 調節pH值至6.0，並在加入每種金屬後再次調節pH。所有的金屬都溶解後， 使用5 MHCl調節pH值至4.0，溶液用DI水補滿至終體積，並過濾滅茵。瓶 子用鋁箔覆蓋，在4°C儲存。__自動控制發酵的pH值，而且通過加入ION NH4OH使pH保持在5。將溫度保持在 30°C。以ILPM的速率供應氣流。通過高落攪拌和隨後的氧氣富集將溶解的氧保持在40%。 用Biospumex抗泡沫劑200K控制泡沫。 讓生物反應器培養物生長，直到分批培養基中的葡萄糖耗盡，在此時，開始指數葡 萄糖給料，其中以如下方程式限定的速率將葡萄糖給料培養基(表10)泵到生物反應器 中F = νμ^β^^'^V = V0+Vfeed
F是底物質量流速(g/hr)，V是在指定時間生物反應器中的液體體積(L)，Sb是分 批培養基中的底物濃度(20g/L)，μ set是比給料速率(0. OSThf1)，t是分批時間(hr)，tQ是 給料開始時的分批時間(hr)，V。是生物反應器中的初始體積，而Vfted是在指定時間添加到 生物反應器中的給料總體積(L)。持續指數給料階段，直到F/V比率達到預設的最大給料速 率(表11)。達到該最大值後，剩餘過程中的F/V比率(表11)恆定地保持在預設的固定給 料速率。 b)通過在 300 mL 的 38°C 自來水中混合葡萄糖、KH2P04、MgSO4WH2CK K2SO4 和Na2SO4,加熱混合物到約100°C以完全溶解糖和鹽，添加水將體積補到750 mL,冷卻溶液，使用0.2微米過濾器過濾滅菌，在無菌罩內先添加237 mL 95%(v/v)乙醇，再添加補充成分(微量金屬和維生素的過濾滅菌的濃縮儲備 液)，添加無菌水將溶液補滿至終體積1 L而製備混合給料培養基。_接種後約24小時，在OD6tltl值為50時，通過向生物反應器和給料瓶添加10g/L半 乳糖(每升培養物體積添加22. 2mL的450g/L半乳糖儲備液)，誘導紫穗槐_4，11-二烯的 生成。另外，向生物反應器添加0. 25g/L的甲硫氨酸，並向給料瓶添加lg/L的甲硫氨酸，以 抑制ERG9基因的轉錄(每升培養物體積添加IOmL的25g/L甲硫氨酸儲備液，和每升給料 體積添加40mL的25g/L甲硫氨酸儲備液)，並向生物反應器添加10% ν/ν的高壓滅菌的油 酸甲酯，以收穫紫穗槐-4，11 - 二烯。(通過在水中加熱溶解糖，讓溶液冷卻，並過濾滅菌，來 製備450g/L半乳糖儲備液。通過在水中溶解甲硫氨酸，並過濾滅菌溶液，製備25g/L甲硫 氨酸儲備液。)在不同時間點取樣，並以1 20的比率將樣本稀釋在甲醇中。將每個稀釋的樣本 振蕩30分鐘，沉澱培養物殘渣。通過將5到10 μ L上清液轉移到包含990到995 μ L使用反式-石竹烯作為內標標定的乙酸乙酯的乾淨玻璃小瓶中，測定紫穗槐-4，11- 二烯的滴 度。在配備了火焰離子探測器的Agilent 7890N氣相色譜儀(Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA)上分析乙酸乙酯樣本。如下分離各樣本的1 μ L等份中的化合物使用DB Wax 柱(AgilentTechnologies, Inc.，Palo Alto，CA)，氦載氣，和以下溫度程序:220°C保持 3分鐘，以100°C/分鐘增溫到溫度260°C。使用該方案，紫穗槐_4，11-二烯具有約3. 4分 鐘的滯留時間。將產生的峰面積與純化的紫穗槐_4，11-二烯在用反式-石竹烯標定的乙 酸乙酯中的定量校準曲線比較，計算紫穗槐-4，11-二烯的滴度。如表11和圖6所示，在僅用葡萄糖給料的過程中，在發酵開始後第114小時，菌株 Y337 生成了 2. 4g/L 紫穗槐-4，11- 二烯(AD)。 實施例5本實施例描述了宿主細胞在補料分批、葡萄糖_乙醇混合給料的限碳發酵中對紫 穗槐-4，11-二烯的生成。如實施例4中所述，製備Y337接種培養物，並用來接種生物反應器。進行發酵並 分析樣本，基本如實施例4中所述，具有以下改變。在發酵的早期階段，分批培養基中的一些葡萄糖被轉化成乙醇。讓生物反應器的 培養物生長，直到分批培養基中的葡萄糖和乙醇耗盡，在此時，開始指數給料，其中以如下 方程式規定的速率將混合給料培養基(表10)泵到生物反應器中 V = VVfeedF是底物質量流速(g/hr)，V是在指定時間生物反應器中的液體體積(L)，Sb是分 批培養基中的底物濃度(20g/L)，μ set是比給料速率(0. OSThr—1)，t是分批時間(hr)，tQ是 給料開始時的分批時間(hr)，Vtl是生物反應器中的初始體積，而Vfted是在指定時間添加到 生物反應器中的給料總體積(L)。持續指數給料階段，直到F/V比率達到預設的最大給料速 率，單位為g底物/hr/L生物反應器體積(表11)。達到該最大值後，剩餘過程中F/V比率 (表11)恆定地保持在預設的固定給料速率。接種約40小時後，在0D_值為77時，誘導紫穗槐_4，11- 二烯的生成。如表11和圖6顯示，在葡萄糖和乙醇混合給料發酵中，在發酵開始後第118小時， 菌株Y337生成了高達16. 5g/L的紫穗槐_4，11- 二烯。實施例6
本實施例描述了宿主細胞在補料分批、僅用乙醇給料的脈衝給料發酵中對紫穗 槐-4，11-二烯的生成。如實施例3中所述，製備Y293接種培養物，並用來接種生物反應器。進行發酵並 分析樣本，基本如實施例4中所述，具有以下改變在發酵的早期階段期間，分批培養基中的一些葡萄糖被轉化成乙醇。讓生物反應 器的培養物生長，直到分批培養基中的葡萄糖和乙醇耗盡，在此時，開始乙醇脈衝給料。給 料速率由廢氣中的CO2百分比(CO2釋放速率；CER)和計算機算法控制，所述CER用廢氣分 析儀監測，所述計算機算法指定一個變量(Cmax)為最大CER，其跟蹤廢氣中的CO2百分比的 最大值。當在葡萄糖上生長時，CER快速演變(圖7B)。當葡萄糖從分批培養基中耗盡時， CER降到低於Cmax的50%，而計算機算法重設Cmax為下降後的CO2值。當由分批培養基中的 過剩葡萄糖生成的乙醇耗盡時，CER第二次下降。脈衝給料在CER降到低於當前Cmax的75% 時自動觸發。泵向生物反應器中注射75% (ν/ν)乙醇5分鐘，向培養物遞送約IOg乙醇。 Cmax被重設為泵關畢時廢氣中的CO2百分比的值，然後重新指定以跟蹤CO2釋放的增加，且 當CER再次降到低於新設置的Cmax的75%時，泵被重新激活。在發酵期間重複該給料算法 (圖7Α)，並確保沒有對培養物過量給料乙醇。因為鹽，微量金屬、維生素、糖、或胺基酸溶液 在乙醇給料中都是不溶的，濃縮的給料成分(表12)被混合，並通過生物反應器封頭中的隔 膜，依照自前次添加給料成分後已經遞送的乙醇體積，每天注射一次。 在葡萄糖從分批培養基中耗盡後十小時，通過封頭向生物反應器添加0. 25g/L甲 硫氨酸，且將10% ν/ν高壓滅菌的油酸甲酯泵到容器中。(因為菌株Υ293包含被破壞的 GAL80基因，半乳糖不是誘導紫穗槐_4，11- 二烯生成所必需的。)如圖7Β顯示，菌株Υ293生成36g/L紫穗槐_4，11-二烯。實施例7本實施例描述了宿主細胞在補料分批、僅用乙醇給料的限碳發酵中對紫穗槐_4， 11-二烯的生成。如實施例3中所述，製備Y293接種培養物，並用來接種包含分批培養基(表13) 的生物反應器。 進行發酵並分析樣本，基本如實施例4中所述，具有以下改變使生物反應器中的培養物生長，直到分批培養基中的葡萄糖耗盡，在此時，開始指 數給料，其中以如下方程式規定的速率將葡萄糖給料培養基(表10)泵到生物反應器中 F是底物質量流速(g/hr)，V是在指定時間發酵器中的液體體積(L)，Sb是分批培 養基中的底物濃度(20g/L), Pset是比給料速率(0. OSihr-1), t是分批時間(hr), t0是給 料開始時的分批時間(hr)，Vtl是發酵器中的初始體積，而Vfted是在指定時間添加到發酵器 中的給料總體積(L)。持續指數給料，直到達到最大給料速率7. lg/hr/L (OD600值約為50)。 在此時，將給料切換為乙醇給料(190proof)，而且對於剩餘的發酵，給料速率設置為恆定容 積值2. 5g/hr/L。通過該設定的給料速率，乙醇消耗率被控制，範圍為0. 4到1. 75g乙醇/ gDCW/天。如圖8顯示，在發酵開始後第187小時，菌株Y293生成37g/L紫穗槐_4，11_ 二烯。實施例8本實施例描述了宿主細胞在補料分批、僅用乙醇給料的限碳發酵中對法呢烯的生 成。如實施例3中所述，製備Y677接種培養物，並用來接種各自包含630mL分批培養 基(表14)的兩個生物反應器。向兩個生物反應器中的一個添加200mL油酸甲酯，以收穫 產物。進行發酵並分析樣本，基本如實施例4中所述，具有以下改變
表14-生物反應器培養基 在發酵的早期階段期間，分批培養基中的一些葡萄糖被轉化成乙醇。讓生物反應 器中的培養物生長，直到分批培養基中的葡萄糖和乙醇耗盡，在此時，開始指數給料，其中 以如下方程式規定的速率將純乙醇(190prOOf)泵到生物反應器中 V = V。+Vfeed。F是底物質量流速(g/hr)，V是在指定時間發酵器中的液體體積(L)，Sb是分批培 養基中的底物濃度(39. 03g/L)，μ set是比給料速率(0. OSShr-1)，t是分批時間(hr)，t0是 給料開始時的分批時間(hr)，Vtl是發酵器中的初始體積(0. 70，而Vfeed是在指定時間添加 到發酵器中的給料總體積(L)。持續指數給料階段，直到F/V比率達到最大給料速率5g底 物/hr/L生物反應器體積。達到該最大值後，在剩餘過程中F/V比率恆定地保持在2. 5g/ hr/L的固定給料速率。但是，如圖9A中顯示，在指數給料階段開始時，乙醇利用的相對緩慢 速率導致乙醇積累。該積累使得必須手動調節預設的給料速率(圖9B)和將給料速率加倍 時間增加12至14小時以保持限碳過程。在油酸甲酯存在下生長的細胞快速恢復並重新生 長至預設的最大值和固定給料速率(圖9C)。相比之下，不包含油酸甲酯的培養物更慢地 消耗積累的乙醇，並因此需要二次暫停固定給料，接著將固定給料速率從2. 5g/hr/L降低 到1. 25g/hr/L。總的來說，菌株Y677在油酸甲酯缺乏下的乙醇消耗率為0至2. Ig乙醇/g DCW/天，而在油酸甲酯存在下為0. 27-2. 9g乙醇/g DCW/天。生物反應器的廢氣被導入冷凝器，以使用廢氣質譜儀測量氧氣攝入率(OUR)和CO2 生成(CER)。圖9D顯示了在油酸甲酯存在下菌株Y677的CER和OUR。通過一天取樣兩次，監測細胞密度和乙醇消耗。在每個時間點，取ImL培養液樣 本，並以1 1000用水稀釋，使用波長設置在eoonm的分光光度計測量細胞密度。通過HPLC量化乙醇水平。在每個時間點，取ImL培養液樣本，並在30mM硫酸溶液 中進行2 X稀釋(將400 μ L 30mM硫酸加入400 μ L上清液以達到15mM硫酸的終濃度，這 與流動相溶液的濃度匹配)。加樣前通過離心和過濾去除細胞。通過GC-FID量化生成的法呢烯的水平。在每個時間點，取100 μ L油酸甲酯覆 蓋層，並用包含0.001%反式-β石竹烯的乙酸乙酯1 40稀釋。混合物用乙酸乙酯以 1 100再次稀釋，最終成為1 4000稀釋液，這與該方法的校準曲線相適應。當沒有使用 油酸甲酯收穫產物時，將25 μ L培養液與975 μ L甲醇混合，混合物振蕩五分鐘並離心，最終 在分析前用包含0.001%反式-β石竹烯的乙酸乙酯以1 100稀釋。如圖9Ε顯示，在油酸甲酯存在下，菌株Υ677達到法呢烯滴度峰值30g/L，而在油酸 甲酯缺乏下其達到法呢烯滴度峰值40g/L。實施例9本實施例描述了宿主細胞在限氧發酵中對紫穗槐_4，11- 二烯和法呢烯的生成。如實施例3中所述，製備Y283和Y352接種培養物，並用來接種包含SOOmL分批培 養基(表15)和IOOmL油酸甲酯的生物反應器。 發酵在配有兩個氣流定量控制器的2L Sartorius Biostat B中執行。通過加入 15N NH4OH和5N H2SO4,將pH值自動控制在pH 5. O0將溫度保持在30°C，並使用Biospumex 200K牌抗泡沫劑控制泡沫。在0D500值為0. 6-1之間接種生物反應器，並使其用30g/L的 葡萄糖生長。生物反應器的廢氣被導入冷凝器，以使用廢氣質譜儀測量氧氣攝入率(OUR)和CO2 生成(CER)。使用敏感度在IOppb至飽和之間的O2傳感器探頭(Hamilton，OXYFERM FDA 225，Hamilton Company, Reno, NV)測量溶解的氧(DO)濃度。在發酵的初始階段期間，生物反應器培養物將分批培養基中的葡萄糖轉化成生物 量和乙醇。當葡萄糖被消耗(取決於培養基中的氧氣可用度，在發酵開始後的8-14小時)， 半乳糖運輸和轉錄機制的葡萄糖抑制被減輕了，且GAL啟動子的基因表達被分批培養基中 的半乳糖誘導。分批培養物持續生長，直到發酵階段中生成的乙醇被耗盡，此時，DO峰標記 了培養階段的結束。對需氧工藝，將潔淨的乾燥空氣以ILPM的速率噴射到培養基中。攪拌速率初始設 置為400rpm，並使用DO反饋控制循環和攪拌級聯程序來保持DO濃度為40% (表16)。對微需氧工藝，氣體流量降低到0. 25LPM，以使到達廢氣分析儀的氣體的稀釋最 小化，並增加質譜儀的敏感度。氧氣遞送速率根據所使用的不同的空氣對氮氣的氣流比率 (表16)而變化。對完全厭氧工藝，接種前，將100%氮氣以0. 25LPM噴射到水性培養基中，而且在 培養期間保持恆定攪拌速率400rpm(表16)。 通過一天取樣兩次，監測細胞密度和乙醇消耗。在每個時間點，取ImL培養液樣 本，並用水以1 100稀釋，使用波長設置在eoonm的分光光度計測量細胞密度。如實施例8中所述，量化所生成的乙醇和法呢烯的水平，但油酸甲酯樣本用乙酸 乙酯稀釋到最終1 400稀釋液而不是1 4000稀釋液。圖IOA顯示了宿主菌株Y283的各種發酵中的DO濃度。如圖IOB和IOC顯示，在 菌株Y283中，培養基中的氧氣可用度增加引起細胞生長增加、葡萄糖向乙醇轉化的速率增 力口、和從培養基消耗乙醇的速率增加。儘管菌株Y283的生長、產物形成、和乙醇消耗在完全 通風培養(DO為40%)中是最大的，它們在24小時後進入平臺期。如表17顯示，所有微氧 工藝的每個細胞的乙醇消耗率在0.40-0. 72g乙醇/g DCW/天之間。如圖IOD顯示，在80% 空氣和20%氮氣時觀察到紫穗槐-4，11- 二烯相對於碳投入的最佳產量。
表17 -微氧發酵的具體乙醇利用率(EUR)— 如圖IOE和IOF顯示，在菌株Y352中，培養物中的氧氣可用度增加引起細胞生長增加、葡萄糖向乙醇轉化的速率增加、和從培養基消耗乙醇的速率增加。如表17顯示，兩個 測試的微氧工藝中的每個細胞的乙醇消耗率在0. 42-0. 88g乙醇/g DCW/天之間。如圖IOG 顯示，儘管在100%空氣下觀察到法呢烯相對碳投入的稍高產量，但在微氧培養物中，在更 長的時間段內持續生成。實施例10本實施例描述了宿主細胞在碳和磷酸鹽受限的搖瓶培養中對紫穗槐_4，11- 二烯 的生成。通過將固體澱粉葡糖苷酶(Sigma A7420-100MG)溶解在0. 5M琥珀酸緩衝液(pH 5. 0)中至100U/mL的終酶濃度，並過濾滅菌溶液，製備澱粉葡糖苷酶(葡糖澱粉酶)儲備酶 溶液。通過將ImL冷凍的Y337細胞接種到裝有50mL磷酸鹽受限的接種培養基(表18) 的250mL擋板瓶中，製備Y337的接種培養物。接種培養物在30°C和200rpm生長過夜。 使用Y337接種培養物接種數個250mL帶擋板的搖瓶，起始0D_值為0. 05。製備 瓶裝有40mL磷酸鹽受限的製備培養基(表18)。向每個瓶中加入100g/L的過濾滅菌的 KH2PO4儲備液，終濃度為0. 1、0. 25、0. 5、0. 8、2和8g/L。接種前，向每個瓶中加入80 μ L新 鮮解凍的100U/mL過濾滅菌的澱粉葡糖苷酶儲備液(終濃度為0. 2U/mL)。製備瓶在30°C 和200rpm培養長達3天。在培養期過程中，葡萄糖被葡糖澱粉酶以約20mg/小時的恆定速 率釋放。通過將2到IOyL油酸甲酯覆蓋層轉移到包含500μ L以β -或反式-石竹烯作 內標標定的乙酸乙酯的乾淨玻璃小瓶中，並如實施例4中所述分析乙酸乙酯樣本，測定紫 穗槐-4，11-二烯的滴度。如圖11顯示，除了最低磷酸鹽濃度(0. lg/L)以外，大體上紫穗槐_4，11-二烯滴 度在測試的所有磷酸鹽濃度是類似的，但在較低磷酸鹽濃度下細胞生長受限，轉換為在較 低磷酸鹽濃度時每個細胞生成的紫穗槐_4，11- 二烯增加。實施例11本實施例描述了宿主細胞在補料分批、葡萄糖給料並伴有磷酸鹽限制的限碳發酵中對紫穗槐-4，11-二烯的生成。如實施例3中所述，製備Y337接種培養物，並用來接種包含磷酸鹽受限的分批培 養基(表19)的生物反應器。進行發酵並分析樣本，基本如實施例4中所述，具有以下改變。使生物反應器的培養物生長，直到分批培養基中的葡萄糖耗盡，此時，開始指數給 料，其中以如下方程式規定的速率將磷酸鹽受限的葡萄糖給料培養基(表19)泵到生物反 應器中 V = VVfeed"F是底物質量流速(g/hr)，V是在指定時間生物反應器中的液體體積(L)，Sb是分 批培養基中的底物濃度(19. 5g/L)，μ set是比給料速率(0. OSihr-1)，t是分批時間(hr)，t0 是給料開始時的分批時間(hr)，Vtl是生物反應器中的初始體積，而Vfrad是在指定時間添加 到生物反應器中的給料總體積(L)。持續指數給料，直到F/V比率達到預設的最大給料速 率(表20)。達到該最大給料速率後，剩餘過程中的F/V比率恆定地保持在預設的固定給料 速率。但是，因為隨著更多給料被添加到生物反應器中，體積(V)持續增加，底物質量流速 (F)持續增加直到體積達到生物反應器的最大工作體積(約3倍於起始體積)。在剩餘過 程中，通過連續從反應器中去除細胞培養液，將生物反應器體積保持恆定，且底物質量流速 (F)保持恆定。圖12A顯示了發酵的葡萄糖給料速率圖。 在OD6tltl值為約50時，誘導紫穗槐-4，11- 二烯的生成。如表20和圖12B顯示，供應8g/L KH2PO4的分批培養基和沒有磷酸鹽的給料培養基 顯示最佳紫穗槐_4，11- 二烯產量為5. 52g/L。在這些條件下，分批培養基中的磷酸鹽在40 小時被耗盡，而且細胞生長因而受限(即，更少的碳成為生物量而更多的碳生成紫穗槐_4， 11-二烯)(圖 12C)。 實施例12本實施例描述了宿主細胞在補料分批、葡萄糖/乙醇混合給料並伴有磷酸鹽限制 的限碳發酵中對紫穗槐_4，11- 二烯的生成。如實施例3中所述，製備Y337接種培養物，並用來接種包含磷酸鹽受限的分批培 養基(表19)的生物反應器。進行發酵並分析樣本，基本如實施例4中所述，具有以下改變。在發酵的早期階段期間，分批培養基中的一些葡萄糖被轉化成乙醇。使生物反應 器中的培養物生長，直到分批培養基中的葡萄糖和乙醇耗盡，此時，開始指數給料，其中以 如下方程式規定的速率將磷酸鹽受限的混合給料培養基(表19)泵到生物反應器中 V = V0+VfeedF是底物質量流速(g/hr)，V是在指定時間生物反應器中的液體體積(L)，Sb是分 批培養基中的底物濃度(20g/L)，μ set是比給料速率(0. OSThr—1)，t是分批時間(hr)，tQ是 給料開始時的分批時間(hr)，Vtl是生物反應器中的初始體積，而Vfted是在指定時間添加到 生物反應器中的給料總體積(L)。持續指數給料階段，直到F/V比率達到預設的最大給料速 率，單位為g底物/hr/L生物反應器體積(表21)。達到該最大值後，剩餘過程中的F/V比 率恆定地保持在預設的固定給料速率(表21)。在OD6tltl值為約50時，誘導紫穗槐-4，11- 二烯的生成。如表21和圖13A顯示，供應8g/L KH2PO4的分批培養基和0到0. 5g/LKH2P04的給 料培養基顯示最佳的紫穗槐_4，11-二烯產量超過26到27g/L。在這些條件下，分批培養基 中的磷酸鹽在40小時被耗盡，而且細胞生長因而受限(即，更少的碳成為生物量而更多的 碳生成紫穗槐_4，11- 二烯)(圖13B)。與Og/L KH2PO4的給料培養基相比，0. 5g/L KH2PO4 的給料培養基在額外的24小時中實現細胞生長和紫穗槐_4，11- 二烯的持續生成。 實施例13本實施例描述了在其基因組中整合了編碼酶(包括MEV途徑的酶和萜烯合成酶) 的異源核苷酸序列的大腸桿菌(Escherichia coli)宿主菌株的生成方法。使用Datsenko&Wanner ((2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :6640_6645)概述的 步驟的變形進行基因組整合。該方法使用包含了 T7啟動子-感興趣的基因-FRT-Kan-FRT 盒的質粒。盒的兩邊側翼各為約100個核苷酸，其與盒的整合所靶向的基因組位點的側翼 區域同源。通過PCR擴增盒生成側翼區域，所述擴增使用的引物包含與盒的3或5端同源 的約30個核苷酸的延伸片段，和與基因組位點側翼區域同源的約50個核苷酸的另一延伸 片段(圖14)。得到的PCR產物在第二輪PCR反應中用作模板，在盒的任一端添加了另外 50個核苷酸的同源側翼序列(圖14)。盒與其側翼序列被電轉化到攜帶編碼Red重組酶蛋 白的質粒的電感受態大腸桿菌(Escherichia coli)細胞中。通過克隆PCR篩選卡那黴素 ("Kan")抗性克隆。陽性重組物用Pl-噬菌體處理，而整合通過Pl-轉導轉移到新的菌株 中。得到的菌株用編碼FLP重組酶的質粒轉化，該酶的活性導致Kan基因從盒中被切除，在 靶向的基因組位點留下T7啟動子-感興趣的基因。最終的宿主菌株去除了 FLP重組酶。應用所述方法，通過將編碼β -法呢烯合成酶(「FS」)的DNA片段整合到大腸桿菌 (Escherichia coli)菌株B1021 (MM294(DE3) (TlR))的Lac操縱子中，生成宿主菌株B1060。 為此，使用DE3溶原化試劑盒(Novagen, Darmstadt, Germany)使大腸桿菌(Escherichia coli)菌株MM294(ATCC33625)感染DE3，並通過在Tl噬菌體過剩存在下生長菌株使其對 Tl噬菌體有抗性，因此生成菌株B1021。使用QuikChange methodology (Geiser等(2001) Biotechniques 31 :88_92)的改進形式，將FRT-Kan-FRT盒插入到表達質粒pAM454中，該 質粒編碼黃花蒿(Artemisia annua)的β -法呢烯合成酶(GenBank登錄號ΑΥ835398)，其 在Τ7啟動子控制下，且經密碼子優化以在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達，因此生成了表達質粒PAM617。因為pAM617中的T7-FS-FRT-Kan-FRT盒側翼已經是來自mhpR和cynX 位點的序列(SEQ ID NO 70)，僅需要一輪PCR擴增來形成與Lac操縱子側翼mhpR或cynX 序列同源的100個核苷酸的序列。包含表達質粒PAM88 (編碼Red重組酶)的匪294 (DE3) 宿主細胞在30°C在包含50μ g/mL羧苄青黴素和ImM阿拉伯糖的LB培養基中生長到OD6tltl值 為0.6。收穫細胞，使其成為電感受態，並用PCR產物轉化。在包含50 μ g/mL卡那黴素的LB 瓊脂上在30°C生長2天後，獲取克隆，並通過克隆PCR篩選正確的整合體。整合通過Pl-轉 導轉移到宿主菌株B1021(MM294(DE3) (TlR))中，而且得到的菌株被製成感受態，並用表達 質粒pAM89 (編碼FLP重組酶)轉化。在包含50 μ g/mL羧苄青黴素的LB瓊脂上在30°C生 長2天後，獲取克隆。分離一個克隆，並在LB培養基中在42°C生長以丟失質粒pAM89，生成 菌株 B1060 (MM294 (DE3) (TlR) Iac T7-FS)。
通過將編碼甲羥戊酸激酶(「MK」)的DNA片段整合到大腸桿菌(Escherichia coli)菌株B1021的ackpta操縱子中，生成宿主菌株B1061。為此，將經密碼子優化以在 大腸桿菌(Escherichia coli)中表達的編碼釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甲 羥戊酸激酶的DNA片段(SEQ ID NO 71)插入到質粒pAM618的NdeI BamHI限制性酶切位 點中。質粒PAM618包含T7啟動子，接著是多克隆位點(MCS)和FRT-KanR-FRT盒(SEQ ID NO :72，圖15)。得到的T7-MK-FRT-Kan-FRT盒如上所述經歷兩輪PCR擴增，以創造與ack Pta操縱子同源的100個核苷酸的側翼序列。將PCR最終產物如上所述引入到大腸桿菌 (Escherichia coli)菌株 B1021 中，生成菌株 B1061 (MM294(DE3) (TlR)ackpta: :T7_MK)。 該整合也被轉移到宿主菌株B1060中，生成菌株B1124(MM294(DE3) (TlR)Iac: :T7_FS ackpta:T7-MK)。通過將編碼磷酸甲羥戊酸激酶(「PMK」)的DNA片段整合到大腸桿菌(Escherichia coli)菌株B1021的poxB位點中，生成宿主菌株B1062。為此，將經密碼子優化以在大腸杆 菌(Escherichia coli)中表達的編碼釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)磷酸甲羥戊 酸激酶的DNA片段(SEQ ID NO 73)插入到質粒pAM618的NdeI BamHI限制性酶切位點中。 得到的T7-PMK-FRT-Kan-FRT盒如上所述經歷兩輪PCR擴增，以生成與poxB位點同源的100 個核苷酸的側翼序列。將PCR最終產物如上所述引入到大腸桿菌(Escherichia coli)菌 株 BlO2I 中，生成菌株 BlO62 (匪294 (DE3) (TlR) poxB : 7_ΡΜΚ)。通過將編碼HMG-CoA還原酶(「HMGR」)的DNA片段整合到大腸桿菌(Escherichia coli)菌株B1021的IdhA位點中，生成宿主菌株B1273。為此，在用Klenow片段處理EcoRI 限制性酶切位點後，將編碼金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)HMGR的DNA片段 (mva ；GenBank 登錄號 BAOOOO17,區域2688925. · 2687648)插入到質粒 pAM618 的 EcoRI BamHI限制性酶切位點中。得到的T7-mVaA-FRT-Kan-FRT盒如上所述經歷兩輪PCR擴增，以 生成與IdhA位點同源的100個核苷酸的側翼序列。將PCR最終產物如上所述引入到大腸杆 菌(Escherichia coli)菌株B1021 中，生成菌株B1273 (MM294 (DE3) (TlR) IdhA: T7_mvaA)。儘管已經提供了許多具體實施例，以上描述是為了說明，而不是限制本發明提供 的實施方案。基於本說明書，實施方案的許多變型對本領域技術人員將是顯而易見的。實 施方案的範圍因此不應當由以上描述確定，而應當由所附的權利要求及其等同的整個範圍 確定。
權利要求
製備類異戊二烯化合物的方法，該方法包含(a)獲得多個能夠生成類異戊二烯化合物的宿主細胞，該宿主細胞包含染色體整合的異源核酸序列，該異源核酸序列編碼MEV或DXP途徑的酶；(b)在該宿主細胞使用乙醇作為碳源並生成類異戊二烯化合物的條件下，在培養基中培養該宿主細胞；和(c)從該培養基中回收類異戊二烯化合物。
2.如權利要求1所述的方法，其中被所述宿主細胞作為碳源消耗的乙醇是由所述宿主 細胞生成的。
3.如權利要求1所述的方法，其中被所述宿主細胞作為碳源消耗的乙醇是外源提供給 所述培養基的。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述培養基在至少4個小時中包含濃度等於或大於 約1克乙醇每升的乙醇。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述宿主細胞的乙醇消耗率等於或大於約0.2克到 約5克乙醇每克細胞乾重每天。
6.如權利要求1所述的方法，其中在所述宿主細胞在生成類異戊二烯化合物期間不限 制氧氣。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述培養條件包括比氧氣攝入率低於10毫摩爾氧氣 每克細胞乾重每小時的一段時間。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述培養條件包括所述對宿主細胞進行磷酸鹽限制 的一段時間。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述宿主細胞是原核細胞。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述宿主細胞是真核細胞。
12.如權利要求1所述的方法，其中所述宿主細胞是真菌。
13.如權利要求11所述的方法，其中所述宿主細胞是釀酒酵母。
14.如權利要求1所述的方法，其中所述類異戊二烯化合物以大於約10克每升培養基 的量生成。
15.如權利要求1所述的方法，其中所述類異戊二烯化合物以大於約50mg每克細胞乾重的量生成。
16.如權利要求1所述的方法，其中所述類異戊二烯化合物的量在小於約72小時中生成。
17.如權利要求1所述的方法，其中所述類異戊二烯化合物的量在小於約48小時中生成。
18.如權利要求1所述的方法，其中所述類異戊二烯化合物的量在小於約24小時中生產。
19.如權利要求1所述的方法，其中所述類異戊二烯選自半萜、單萜、二萜、三萜、四萜 和多萜。
20.如權利要求1所述的方法，其中所述類異戊二烯是C5-C2tl類異戊二烯。
21.如權利要求1所述的方法，其中所述類異戊二烯選自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α -法呢烯、β -法呢烯、法呢醇、櫳牛兒醇、香葉基櫳牛兒醇、異戊二烯、芳樟醇、檸檬烯、月 桂烯、橙花叔醇、羅勒烯、綠葉醇、β-菔烯、檜萜、Y-萜品烯、萜品油烯和瓦倫西亞橘烯。
22.製備C5-C2tl類異戊二烯化合物的方法，該方法包含(a)獲得多個能夠生成該類異戊二烯化合物的宿主細胞；(b)在乙醇含量等於或大於約1克每升培養基的培養基中，培養該宿主細胞至少四小 時；禾口(c)每升培養基回收至少5克該類異戊二烯化合物。
23.如權利要求20所述的方法，其中所述培養基包含約1到約5克乙醇每升培養基。
24.如權利要求20所述的方法，其中所述培養基包含約1到約20克乙醇每升培養基。
25.如權利要求20所述的方法，其中所述培養基的乙醇含量大於約20克乙醇每升培養基。
26.如權利要求22所述的方法，其中所述宿主細胞是酵母細胞。
27.如權利要求22所述的方法，其中所述培養基中的至少一部分乙醇是由所述宿主細 胞生成的。
28.製備C5-C2tl類異戊二烯化合物的方法，該方法包含(a)獲得多個能夠生成該類異戊二烯化合物的宿主細胞；(b)通過向培養基提供碳源，培養所述酵母細胞以形成生物量；(c)將所述細胞維持一定條件下，由此該酵母細胞的乙醇消耗率等於或大於約0.01克 乙醇每克細胞乾重每小時；和(d)每升培養基回收至少5克所述類異戊二烯化合物。
29.如權利要求28所述的方法，其中至少一部分被消耗的乙醇是由所述宿主細胞生成的。
30.如權利要求28所述的方法，其中所述乙醇消耗率在約0.01到約0. 20克乙醇每克 細胞乾重每小時之間。
31.如權利要求28所述的方法，其中乙醇消耗率大於約0.1克乙醇每克細胞乾重每小時。
32.如權利要求28所述的方法，其中所述碳源是碳水化合物。
33.如權利要求28所述的方法，其中所述碳源是碳水化合物和乙醇的混合物。
34.如權利要求28所述的方法，其中所述碳源是乙醇。
35.如權利要求28所述的方法，其中維持所述細胞的條件包括氧氣限制至少四小時。
36.如權利要求28所述的方法，其中維持所述細胞的條件包括磷酸鹽限制至少四小時。
37.如權利要求28所述的方法，其中所述宿主細胞是酵母細胞。
38.如權利要求28所述的方法，其中所述宿主細胞是釀酒酵母。
全文摘要
本發明提供了通過一種或多種生物合成途徑高效製備類異戊二烯的方法。本發明還提供了用於進行所述方法的核酸、酶、表達載體、和遺傳修飾的宿主細胞。本發明也提供了自遺傳修飾的宿主細胞獲得高產量類異戊二烯的發酵方法。
文檔編號C12N15/52GK101868532SQ200880117160
公開日2010年10月20日 申請日期2008年9月19日 優先權日2007年9月20日
發明者R·裡根廷, 雅各布·R·勒尼漢, 鶴田寬子 申請人:阿邁瑞斯生物技術公司