一種植物乳桿菌及其在中式豬肉發酵香腸製備中的應用的製作方法

2023-04-26 11:55:44

本發明涉及食品加工
技術領域：
，具體涉及一種植物乳桿菌及其在中式豬肉發酵香腸製備中的應用。
背景技術：
：我國肉製品加工業正處於傳統到精加工的過渡期。傳統發酵香腸是依賴於環境中微生物的自然發酵，發酵時間長，產品單一，而且產品的抗氧化程度較低，尤其是脂肪的氧化會生成很多對人體有害的物質，食用後不利於身體健康。生命活動的氧化代謝過程中不斷產生各種自由基，這些自由基能攻擊多不飽和脂肪酸，觸發脂質過氧化，造成機體損傷。目前為了降低氧化程度，在製作過程中通常添加化學合成的抗氧化劑，但存在安全性問題，因此尋求天然的抗氧化劑是解決此類問題的有效途徑之一。乳酸菌能降低ros的生成，清除體內自由基，有研究表明乳酸菌細胞和無細胞提取物在體外有類似的抗氧化劑活性。從肉製品中篩選具有優良抗氧化性能的菌株應用於發酵香腸，為功能性發酵香腸的開發奠定基礎。技術實現要素：本發明針對以上問題，提供了一種植物乳桿菌及其在中式豬肉發酵香腸製備中的應用，將從食品中篩選出來的新菌種植物乳桿菌應用到香腸生產中，縮短香腸的發酵周期，降低脂肪和蛋白質的氧化程度。本發明的技術方案是：一種植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)，保藏號為：cgmccno.14194。一種植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)在中式香腸製備中的應用，所述植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)的保藏號為：cgmccno.14194。一種中式豬肉發酵香腸的製備方法，包括如下步驟：1)、植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)種子液製備：植物乳桿菌菌株用mrs肉湯在37℃下培養18h，4℃下6000g離心機中離心10min後用去離子水洗滌兩次並重新懸浮於去離子水中製得菌懸液，菌懸液細胞沉澱的細菌計數調節至105-109cfu/ml，所述植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)的保藏號為：cgmccno.14194；2)、香腸製備：2.1)、將新鮮豬肉，肥瘦分離，分割成塊，3-10℃水中清洗，去掉血塊及豬皮，肥肉重量佔肉總重的30％，絞碎備用；2.2)、按照總肉重量100份稱取如下配料：白糖6-7份、鹽3-4份、味精0.1-0.2份、五香粉0.1-0.2份、生薑0.1-0.2份、大曲10-20ml/kg，再加入肉和前述配料總重量9-12％的水；2.3)、接種步驟1)中製得的菌懸液至醃製肉糜中混勻，接種量為109cfu/g，然後灌制香腸；2.4)、30±0.5℃，rh90％-95％條件下發酵1天；2.5)、16±0.5℃，rh85％-90％條件下放置6天，然後在12±0.5℃，rh75％-80％條件下放置14天使香腸發酵成熟；2.6)、將發酵成熟的香腸修剪整齊，真空包裝，即得成品發酵香腸。所述步驟2.2)中豬肉與配料混合後，常溫下醃製1-2h。所述步驟2.4)中發酵期內除黴。本發明的有益效果是：本發明發酵菌株抗氧化活性強，生產的豬肉發酵香腸品質及抗氧化性均優於傳統發酵香腸，且發酵周期短，脂肪氧化程度低，蛋白氧化程度顯著降低。另外，添加了發酵劑的發酵香腸ph低於傳統發酵香腸，有效抑制有害菌生長繁殖，可在一定程度上抑制香腸腐敗和黴變，延長了中式發酵香腸的保質期，為企業減少了因產品快速變質帶來的經濟損失，具體體現在以下方面：(1)產品的發酵周期為21天，傳統發酵香腸發酵周期為28-45天，縮短發酵周期。(2)產品的呈色迅速，產品的質地比較緊密，切面比較平整細膩，呈棗紅色，脂白色、有光澤，鹹淡適中，硬度，咀嚼性和彈性明顯增強。(3)脂肪氧化程度，以tba值為代表，接菌組脂肪氧化程度較低，接種量為109cfu/g組丙二醛含量顯著低於對照組1.46×10-5mgmda/kg；有效抑制脂質的氧化，提高產品的口味和營養安全性。(4)產品的蛋白抗氧化性，以羰基值為代表，接種量為109cfu/g組羰基含量低於對照組0.12nmol羰基/mg蛋白。(5)產品的蛋白抗氧化性，以巰基值為代表，接種量為109cfu/g組巰基含量高於對照組2.57nmol巰基/mg蛋白。(6)與傳統發酵香腸相比，產品ph值較低，減緩了香腸因金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等有害微生物作用引起的腐敗和黴變，延長產品貨架期，保證產品的安全性。本發明篩選的植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)於2017年5月26日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，分類命名：植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，保藏號：cgmccno.14194。保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院研究所；郵編：100101。附圖說明圖1是dpph清除率對比圖；圖2是羰基值對比圖；圖3是總巰基對比圖。具體實施方式下面結合實施例對本發明作具體說明。一、菌種的篩選與抗氧化活性研究實施例1菌種的篩選(1)分離、純化：隨機選取金華火腿，在籤點肌肉和股二頭肌上隨機確定4個點，用無菌的剪子和手術刀在其表面切除約0.5cm厚、邊長為4cm左右的部分，棄用；在深處切出厚度約為2cm左右，大小相似的肉塊取出；先將肉塊在酒精燈上進行表面消毒，然後放入已滅菌的塑料瓶中，進行無菌操作，用無菌剪子從肉樣上剪取約2.0g深層肌肉，放入滅菌乳缽內粉碎，然後加滅菌海沙研磨，磨碎後加入滅菌水混勻後稀釋成1:10稀釋液，再按10倍遞增稀釋。塗布於mrs培養基，分別於37℃生化培養箱培養18-24h，挑取單菌落反覆劃線分離純化，直至獲得單一菌株。(2)篩選：以革蘭氏陽性、不產粘液、耐nacl(8％)、非產氣性、非產h2s，非產h2o2，不具胺基酸脫羧酶作為初篩指標；以產酸速度、產酸能力和產香性作為乳酸菌復篩指標，篩選出適合接種於發酵香腸的菌株。(3)鑑定：根據菌落的表型特徵和生理生化特性，結合16s測序確定菌株為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)。(4)保藏：將菌液和甘油按1：1混合置於-70℃保藏。上述菌株於2017年5月26日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)(保藏號cgmccno.14194)。實施例2植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)抗氧化活性研究實施例1中得到的菌株細胞通過離心(6000g，10min，4℃)，用去離子水洗滌兩次並重新懸浮於去離子水。細胞沉澱的細菌計數調節至107、108、109cfu/ml得樣品溶液。(1)dpph清除率測定：2ml樣品溶液，0.2mmol/ldpph-無水乙醇溶液1ml，混勻暗處理30min，6000轉離心10min，取上清液(以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液調零，517nm處)測吸光值a1，以等體積無水乙醇代替dpph以同樣方法測吸光值a0，以等體積蒸餾水代替樣品溶液以同樣方法測吸光值a2。dpph清除率＝[1-(a1-a0)/a2]×100％。vc作為對照，結果如圖1所示，對照組vc的dpph自由基清除率最高，達到57.36％。其次是植物乳桿菌濃度109cfu/ml的細胞內無細胞提取物的dpph自由基清除率較高，清除率達到為42.62％，顯著高於菌株濃度108cfu/ml和107cfu/ml的dpph自由基清除率(p<0.05)，本發明的植物乳桿菌有良好的清除dpph自由基的能力。(2)過氧化氫耐受試驗：植物乳桿菌菌株的過夜培養物接種1％(v/v)到mrs肉湯，mrs肉湯含有0.4、0.7、1.0mmh2o2(30％)，vc作為對照，37℃培養8h。用分光光度計于波長為600nm處測od值。結果如表1所示，結果表明：植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)菌株能夠耐受一定濃度的過氧化氫(h2o2)，菌株對過氧化氫的耐受呈濃度依賴型關係。表1植物乳桿菌對過氧化氫的耐受能力二、香腸的製備實施例31)、植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)種子液製備：植物乳桿菌菌株用mrs肉湯在37℃下培養18h，4℃下6000g離心機中離心10min後用去離子水洗滌兩次並重新懸浮於去離子水中製得菌懸液，菌懸液細胞沉澱的細菌計數調節至105cfu/ml，所述植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)的保藏號為：cgmccno.14194；2)、香腸製備：2.1)、將新鮮豬肉，肥瘦分離，分割成塊，3℃水中清洗，去掉血塊及豬皮，肥肉重量佔肉總重的30％，絞碎備用；2.2)、按照總肉重量100份稱取如下配料：白糖6份、鹽3份、味精0.1份、五香粉0.1份、生薑0.1份、大曲10ml/kg，，再加入肉和前述配料總重量9％的水，豬肉與配料混合後，常溫下醃製1h；2.3)、接種步驟1)中製得的菌懸液至醃製肉糜中混勻，接種量為105cfu/g，然後灌制香腸；2.4)、29.5℃，rh90％條件下發酵1天，發酵期內除黴；2.5)、15.5℃，rh85％條件下放置6天，然後在11.5℃，rh75％條件下放置14天使香腸發酵成熟；2.6)、將發酵成熟的香腸修剪整齊，真空包裝，即得成品發酵香腸。實施例41)、植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)種子液製備：植物乳桿菌菌株用mrs肉湯在37℃下培養18h，4℃下6000g離心機中離心10min後用去離子水洗滌兩次並重新懸浮於去離子水中製得菌懸液，菌懸液細胞沉澱的細菌計數調節至107cfu/ml，所述植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)的保藏號為：cgmccno.14194；2)、香腸製備：2.1)、將新鮮豬肉，肥瘦分離，分割成塊，10℃水中清洗，去掉血塊及豬皮，肥肉重量佔肉總重的30％，絞碎備用；2.2)、按照總肉重量100份稱取如下配料：白糖7份、鹽4份、味精0.2份、五香粉0.2份、生薑0.2份、大曲20ml/kg，，再加入肉和前述配料總重量12％的水，豬肉與配料混合後，常溫下醃製2h；2.3)、接種步驟1)中製得的菌懸液至醃製肉糜中混勻，接種量為107cfu/g，然後灌制香腸；2.4)、30.5℃，rh95％條件下發酵1天，發酵期內除黴；2.5)、16.5℃，rh90％條件下放置6天，然後在12.5℃，rh80％條件下放置14天使香腸發酵成熟；2.6)、將發酵成熟的香腸修剪整齊，真空包裝，即得成品發酵香腸。實施例51)、植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)種子液製備：植物乳桿菌菌株用mrs肉湯在37℃下培養18h，4℃下6000g離心機中離心10min後用去離子水洗滌兩次並重新懸浮於去離子水中製得菌懸液，菌懸液細胞沉澱的細菌計數調節至109cfu/ml，所述植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)的保藏號為：cgmccno.14194；2)、香腸製備：2.1)、將新鮮豬肉，肥瘦分離，分割成塊，6℃水中清洗，去掉血塊及豬皮，肥肉重量佔肉總重的30％，絞碎備用；2.2)、按照總肉重量100份稱取如下配料：白糖6.5份、鹽3.5份、味精0.15份、五香粉0.15份、生薑0.15份、大曲15ml/kg，再加入肉和前述配料總重量10％的水，豬肉與配料混合後，常溫下醃製1.5h；2.3)、接種步驟1)中製得的菌懸液至醃製肉糜中混勻，接種量為109cfu/g，然後灌制香腸；2.4)、30℃，rh92％條件下發酵1天，發酵期內除黴；2.5)、16℃，rh88％條件下放置6天，然後在12℃，rh78％條件下放置14天使香腸發酵成熟；2.6)、將發酵成熟的香腸修剪整齊，真空包裝，即得成品發酵香腸。實施例6對照組(ck)2.1)、將新鮮豬肉，肥瘦分離，分割成塊，6℃水中清洗，去掉血塊及豬皮，肥肉重量佔肉總重的30％，絞碎備用；2.2)、按照總肉重量100份稱取如下配料：白糖6.5份、鹽3.5份、味精0.15份、五香粉0.15份、生薑0.15份、大曲15ml/kg，再加入肉和前述配料總重量10％的水，豬肉與配料混合後，常溫下醃製1.5h；2.3)、30℃，rh92％條件下發酵1天，發酵期內除黴；2.4)、16℃，rh88％條件下放置6天，然後在12℃，rh78％條件下放置14天使香腸發酵成熟；2.5)、將發酵成熟的香腸修剪整齊，真空包裝，即得成品發酵香腸。三、性能檢測實施例7ph值稱取10g樣品，加入90ml蒸餾水，均漿，用酸度計測定ph值。結果如表2所示，從表2中可以看出，添加植物乳桿菌(lactobacillusplantarumnjau-01)明顯降低了發酵香腸的ph，低ph值可有效抑制有害菌生長繁殖，在一定程度上抑制香腸腐敗和黴變，延長中式發酵香腸的保質期。表2各實施例的ph值實施例3實施例4實施例5實施例6(ck)ph值5.07±0.0684.99±0.0644.53±0.0155.27±0.027實施例8tba值1g肉充分攪碎(5000rpm，5s,兩次)，加10ml蒸餾水，12000rpm勻漿2次，每次30s。取0.2ml勻漿液加入0.2ml8.1％的sds溶液和1.5mlph3.5的20％醋酸緩衝液，1.5ml0.8％的tba溶液，0.6ml蒸餾水，振蕩混勻，95℃水浴60min，流水冷卻10min。然後試管中加1ml蒸餾水和4ml吡啶與正丁醇混合物(1：15)，混勻渦旋後4000rpm離心10min，取上層液與532nm處測定吸光度。標準曲線，取1μg/mltep標準溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ml，加入試管中，再加入0.2ml8.1％sds溶液，1.5ml20％醋酸緩衝液(ph3.5)和0.8％tba溶液1.5ml，定容至4ml，使得體系內tep的量分別為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mg，95℃水浴60min，流水冷卻10min，加1ml蒸餾水和4ml吡啶與正丁醇混合物(1：15)，混勻渦旋後4000rpm離心10min，532nm處測定吸光度。結果如表3所示，接菌組中丙二醛(mda)含量顯著低於空白組，有效抑制產品脂質氧化，mda含量隨著發酵時間延長呈增加的趨勢，在發酵後期mda增加趨勢減緩。表3各實施例中的tba值實施例9羰基值稱取1.5g肉樣於50ml離心管中(只取瘦肉、肉攪拌)，加入15ml焦磷酸鹽緩衝液，取勻漿液於離心管中(每管3ml)，分對照組和實驗組，加入3ml20％tca振蕩混勻，離心12000g，5min，取沉澱，加入3ml10％tca，振蕩混勻，離心(12000g，5min)，取沉澱。對照組加3ml2mhcl，實驗組加3mldnph，暗處放30min，每10min振蕩一次，每次10s，加20％tca振蕩混勻，離心(12000g，5min)，取沉澱。加7.5ml乙醇/乙酸乙酯混合液，混勻，離心(12000g，5min)，取沉澱，重複3次。加3ml鹽酸胍，4℃保存過夜後離心(12000g，5min)，取上清液，測吸光值(370nm)。結果如圖2所示，從圖2中可以看出，本發明製得的產品蛋白氧化程度(以羰基值為代表)，明顯低於對照組，說明植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)有效降低了羰基的產生，抑制了蛋白質的氧化。實施例10巰基值取0.2ml2mg/ml蛋白液，加1.8ml脲緩衝液和80μldtnb，40℃水浴反應25min取出冷卻後反應液於412nm測定吸光度值，其摩爾吸光係數為13,600m-1/cm-1。總巰基單位用納摩爾巰基每毫克蛋白表示。結果如圖3所示，從圖3中可以看出，本發明製得的產品蛋白氧化程度(以巰基值為代表)，明顯高於對照組，說明植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)有效抑制了巰基的氧化，即抑制了蛋白質的氧化。實施例11感官品質用雙面刀將樣品切成1cm厚的圓柱體，「t」型金屬壓頭連在材料儀上，感應源1000n，初始力0.3n，壓頭直徑4lmm，壓縮比50％，測定速度：50mm/min，兩次循環，測定項目：硬度(n)；彈性(mm)；咀嚼性(mj)；黏聚性。質構分析如表4所示，色差分析如表5所示，表4各實施例中的質構分析表5各實施例中的色差分析實施例3實施例4實施例5實施例6(ck)l*46.73±1.1149.49±0.4549.51±0.8342.98±2.66a*13.57±0.9411.47±0.339.85±0.2712.36±0.04b*10.43±0.778.95±0.3610.26±0.189.01±1.19l*：代表明暗度(黑白)，a*：代表紅綠色，b*：代表黃藍色由表4、表5可知，添加植物乳桿菌njau-01(lactobacillusplantarumnjau-01)的豬肉發酵香腸肌肉質地比較緊密，切面比較平整細膩，呈紅色，鹹淡適中，具有濃鬱的發酵風味。由於本發明所使用的菌種均分離自金華幹醃火腿，並經過安全性分析，因此使用安全可靠。當前第1頁12