診斷抗體測定的製作方法

2023-04-23 10:55:36

專利名稱：診斷抗體測定的製作方法
診斷抗體測定本發明涉及新診斷測定，其用於診斷澱粉樣變，這是與澱粉樣蛋白相關的一組病 症和異常，如阿爾茨海默病及相關方面。本發明特別提供了抗體測定。澱粉樣變不是單一的疾病實體，而是一組不同的進行性疾病，特徵在於稱作澱粉 樣蛋白的蠟狀澱粉樣蛋白的細胞外組織沉積，其積聚在一種或多種器官或者機體系統中。 隨著澱粉樣蛋白沉積物的積聚，它們開始幹擾所述器官或者機體系統的正常功能。存在至 少15種不同類型的澱粉樣變。主要形式是無已知先例的原發澱粉樣變，一些其它病症之後 的繼發性澱粉樣變，以及遺傳性澱粉樣變。繼發性澱粉樣變在慢性感染或炎性疾病期間發生，如結核病、稱作家族性地中海 熱的細菌感染、骨感染(骨髓炎)、類風溼性關節炎、小腸炎症(肉芽腫性迴腸炎)、霍奇金 病和麻風病。澱粉樣蛋白沉積物包括澱粉樣蛋白P(五邊形)組分(AP)，其與正常血清澱粉樣 蛋白P(SAP)相關的糖蛋白；以及硫酸化糖胺聚糖(GAG)，其是結締組織的複合碳水化合物。 澱粉樣蛋白原纖維佔澱粉樣材料的大約90%，其包含若干種不同類型蛋白的一種。這些蛋 白能摺疊成所謂的「β-摺疊」原纖維，這是呈現出導致澱粉樣蛋白獨特的染色性質的剛果 紅結合位點的獨特蛋白構型。許多衰老性疾病基於或與澱粉樣蛋白相關，且部分地特徵在於促使發病以及該疾 病進展的澱粉樣蛋白或澱粉樣材料的細胞外積聚的形成。這些疾病包括但不限於神經性病 症如輕度認知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，如散發性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿 爾茨海默痴呆(FAD)如家族性英國型痴呆(FBD)和家族性丹麥型痴呆(FDD)，唐氏症候群中 的神經變性，盧伊體痴呆，具有澱粉樣變的遺傳性腦出血(Dutch型)；關島帕金森-痴呆綜 合徵(Guam Parkinson-Dementia complex)。基於或者與澱粉樣蛋白相關的其它疾病是進 行性核上麻痺、多發性硬化症；克-雅病(Creutzfeld Jacob disease)，帕金森病，HIV-相 關痴呆，ALS (肌萎縮側索硬化症)，成人發病型糖尿病；老年性心臟澱粉樣變；內分泌性腫 瘤及其它疾病，包括黃斑變性。儘管這些疾病的發病機制可能不同，但是它們的特徵性沉積物通常含有許多共有 的分子組分。這在很大程度上可以歸因於促炎途徑的局部活化，從而導致激活的補體組分、 急性期反應物、免疫調節物及其它炎性介導物的同時沉積(McGeer et al.，Tohoku J Exp Med. 174(3) :269-277 (1994))。最近，越來越多的證據表明阿爾茨海默病涉及N末端修飾的Αβ肽變體。針對性 活組織檢查表明Aβ 1-40和Αβ 1-42不僅存在於阿爾茨海默病患者的腦中，也存在於未受 影響個體的老年斑中。然而，N-末端截短的和焦穀氨酸修飾的A β Ν3ρΕ-40/Αβ Ν3ρΕ_42 幾乎只存在於阿爾茨海默病患者的斑中，使得這種Αβ變體是適當的診斷標記物和潛在的 藥物開發靶標。目前一些商業生產廠家提供了 ELISA試劑盒，其允許檢測低皮克(pg)範圍的 Αβ 1-40/1-42 和 Αβ Ν3ρΕ-40/Αβ Ν3ρΕ_42。阿爾茨海默病(AD)患者腦的形態學特徵是存在神經元纖維纏結以及新皮層腦結構中 Αβ 肽的沉積(Selkoe，D. J.& Schenk，D. Alzheimer 『 s disease :molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43,545-584(2003)) ο在被β-和Y -分泌酶相繼切割後，A β肽從澱粉樣前體 蛋白(APP)中釋放。Y-分泌酶切割導致Αβ 1-40和Αβ 1-42肽的產生，它們的C-末 端不同且呈現出不同的聚集、原纖維形成及神經毒性效力(Shin，R. W. et al. Amyloid beta-protein (Abeta)1-40 but not Abeta l_42contributes to the experimental formation of Alzheimer disease amyloid fibrils in rat brain. J. Neurosci. 17, 8187-8193(1997) ；Iwatsubo,T.et al.Visualization of Abeta 42 (43)and Abeta 40 in senile plaques with end-specific Abeta monoclonals :evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron 13，45-53 (1994) ；Iwatsubo，T.，Mann, D. M.，Odaka，A.，Suzuki, N. & Ihara，Y. Amyloid beta protein (Abeta) deposition Abeta 42 (43)precedes Abeta 40 in Down syndrome. Ann. Neurol.37，294-299 (1995); Hardy，J. A. & Higgins, G.A. Alzheimerr s disease :the amyloid cascade hypothesis. Science 256,184-185(1992) ；Ro ^ner, S. ，Ueberham，U. ， Schliebs， R. ，Perez-Polo, J. R. & Bigl, V.The regulation of amyloid precursor protein metabolism by cholinergic mechanisms and neurotrophin receptor signaling. Prog. Neurobiol. 56, 541-569 (1998)) ο除了 C末端可變性之外，N末端修飾的Αβ肽是大量的(Saido, T. C. et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species，A beta N3(pE)，in senile plaques. Neuron 14,457-466(1995) ；Russo，C. et al.Presenilin-I mutations in Alzheimer ' s disease. Nature 405，531-532(2000)； Saido，T. C.，Yamao, H.，Iwatsubo, Τ. & Kawashima, S. Amino-and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215，173-176(1996))。看起來Αβ肽的大部分經歷了 N末端截短兩個胺基酸，從 而暴露穀氨酸殘基，其隨後被環化為焦穀氨酸(ΡΕ)，這產生Αβ3(ρΕ)-42肽(Mido， Τ. C.et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species，A beta N3 (pE)，in senile plaques. Neuron 14，457-466 (1995)； Saido, T. C.，Yamao, H.，Iwatsubo, Τ. & Kawashima，S. Amino-and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215,173-176(1996))。或者，pE可以在BACEl的β，-切割之後形成，從而產生 Aβ Nil(pE)-42(Naslund，J. et al. Relative abundance of Alzheimer A beta amyloid peptide variants in Alzheimer disease and normal aging. Proc. Natl.Acad.Sci. U.S.A.91,8378-8382(1994) ；Liu, K. et al.Characterization of Abetal1-40/42 peptide deposition in Alzheimer' s disease and young Down' s syndrome brains implication of N-terminally truncated Abeta species in the pathogenesis of Alzheimer' s disease. Acta Neuropathol. 112,163-174 (2006)) 0 特別地，已經證實 Αβ Ν3(ρ^-42在散發性和家族性阿爾茨海默病(FAD)中是Αβ沉積物的主要組分(Mido， Τ. C. et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species，A beta N3 (pE)，in senile plaques. Neuron 14,457-466 (1995) ；Miravalle，L et al. Amino-terminally truncated Abeta peptide species are the main component ofcotton wool plaques. Biochemistry 44,10810-10821 (2005)) Αβ N3pE-42 肽與 Αβ 1-40/1-42 肽共存(Saido，Τ. C. et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Abeta N3pE, in senile plaques. Neuron 14,457-466 (1995) ；Saido, T. C. , Yamao, H. , Iwatsubo, T. & Kawashima,S. Amino-and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215，173-176 (1996))，並且基於許多觀察 結果可以在AD的發病機制中起重要作用。例如，已經概述了 Αβ Ν3ρΕ-42肽的特殊神 經毒性(Russo, C. et al. Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides—AbetaN3 ( pE)__strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 1480-1489(2002)，以及N-截短的Aβ肽的pE-修飾賦予對大部分氨肽酶及Aβ -降解內 妝酶的抗性(Russo, C. et al. Pyroglutamate-modif ied amyloid beta-peptides—AbetaN 3 (pE)__strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 1480-1489 (2002) ；Saido, T. C. Alzheimer ' s disease as proteolytic disorders anabolism and catabolism of beta-amyloid. Neurobiol. Aging 19,S69-S75 (1998))。谷 氨酸環化為PE導致N末端電荷喪失，從而引起與未修飾的Αβ肽相比Αβ Ν3ρΕ的加速聚集 (He,W.& Barrow,C. J. The Abeta 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vitro than full-length A beta. Biochemistry 38,10871-10877(1999) ；Schilling, S. et al. On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides(in vitro). Biochemistry 45,12393-12399 (2006)) 因此，A β N3pE_42 形成的減少應使所述肽去穩 定，這通過使它們更易降解及隨之防止較高分子量Αβ聚集的形成以及增強神經元存活率 而進行的。然而，長期以來還未知怎樣發生Αβ肽的PE-修飾。近年來，揭示了穀氨醯胺醯 基環化酶OiC)在略酸性條件下能催化A β Ν3ρΕ-42形成，以及特異性QC抑制劑防止A β Ν3ρΕ-42 在體夕卜產生(Schilling, S. ，Hoffmann, Τ. ，Manhart, S. ，Hoffmann, Μ. & Demuth， H. -U. Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions. FEBS Lett. 563,191-196(2004) ；Cynis, H. et al. Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta 1764，1618-1625(2006))。盧伊體痴呆(LBD)是神經變性病症，其可以在65歲以上的人中發生，並且通常導 致認知(思考)障礙和異常行為改變的症狀。症狀可包括認知障礙，神經病徵，睡眠障礙以 及自主衰竭。認知障礙在大多數情況中是LBD的代表性特徵。患者經常發生逐漸惡化的精 神錯亂的現象。認知能力的波動通常與注意力和警覺度的改變程度相關。認知障礙和思想 波動可以在幾分鐘、幾小時或幾天內變化。盧伊體形成自磷酸化和未磷酸化的神經絲蛋白； 它們含有突觸蛋白α-突觸核蛋白以及泛素，其參與損傷或異常蛋白的清除。除了盧伊體 之外，也可以存在盧伊神經突，其是神經細胞的細胞過程中的包涵體。澱粉樣斑可以在DLB 患者腦中形成，然而它們的數目比在阿爾茨海默病患者中所觀察到的數目少。AD的另一微 病理學特點神經原纖維纏結不是LBD的主要特徵，但是是除了澱粉樣斑之外經常存在。肌萎縮側索硬化症(ALQ特徵在於上和下運動神經元的變性。在一些ALS患者中，可以存在痴呆或失語(ALS-D)。痴呆是最常見的額顳痴呆(FTD)，許多這些病例在齒狀回和 額葉及顳葉淺層神經元中具有泛素陽性、tau-陰性的包涵體。包涵體肌炎(IBM)是致殘性疾病，通常在50歲以上的人中發現，其中肌纖維發生 炎症並開始萎縮，但是腦不受影響，患者保留其全部智力。發現參與澱粉樣β蛋白產生的 兩種酶在這種老年人最常見的晚期肌病患者的肌細胞中增加，其中澱粉樣蛋白也增 加。基於或者與澱粉樣蛋白的積聚和沉積相關的另一疾病是黃斑變性。黃斑變性是常 見的眼病，其導致是視網膜(眼後面的極薄組織，其中光敏細胞輸送視覺信號至腦)中心區 域的黃斑退化。敏銳、清晰、「筆直」視力由黃斑處理形成。黃斑損傷導致產生盲點及模糊 或失真的視力。年齡相關性黃斑變性(AMD)在美國是視力障礙的主要因素，並且對於65歲 以上的白種人是導致法定盲的主要因素。大約180萬年齡為40歲及更大的美國人患有晚 期AMD，並且患有中期AMD的另外730萬人處於視力喪失的危險中。政府估計到2020年將 有290萬人患有晚期AMD。通常令人驚奇及沮喪地發現對AMD患者的這種失明狀況的原因 的了解及治療很少。存在兩種形式黃斑變性乾性黃斑變性和溼性黃斑變性。其中黃斑的細胞緩慢開 始破壞的乾性形式佔診斷的黃斑變性病例的85%。雙眼通常均受乾性AMD的影響，但是一 隻眼睛可以喪失視力，而另一隻眼睛保持未受影響。玻璃疣是視網膜下的黃色沉積物，其通 常是乾性AMD的早期跡象。發生晚期乾性AMD或溼性AMD的風險隨著玻璃疣的數目或大小 的增加而增加。乾性AMD進展且導致視力喪失而不變成該疾病的溼性形式是可能的；然而， 早期乾性AMD迅速變成溼性形式也是可能的。溼性形式AMD儘管只佔病例的15%，但導致90 %的患者失明，並且被認為是晚期 AMD (沒有早期和中期階段的溼性AMD)。乾性形式的疾病總是先於溼性AMD。隨著乾性形式 的惡化，一些人開始具有黃斑後的異常血管生長。這些血管非常脆弱，並會滲出液體和血液 (因此「溼性」黃斑變性)，從而導致黃斑的快速損傷。乾性形式AMD最初通常導致輕微的視力模糊。特別是視力中心可變得模糊，且這 個區域隨著疾病的進展而漸漸擴大。如果僅一隻眼睛受影響，則無可注意到的症狀。在溼 性AMD中，直線可出現波浪，且可迅速發生中心視力喪失。黃斑變性的診斷通常包括散瞳眼底檢查，視力靈敏度測試及使用稱作眼底檢查的 程序檢查眼的背部以幫助診斷AMD，並且如果懷疑是溼性AMD，也可以進行螢光素血管造影 術。如果幹性AMD達到晚期階段，目前還沒有防止視力喪失的治療方法。然而，特別的高 劑量抗氧化劑和鋅配方可延緩或防止中期AMD發展為晚期階段。Macugen (哌加他尼鈉 (pegaptanib sodium)注射劑)、雷射凝固術和光動力學療法可以控制黃斑的異常血管生長 及出血，這有助於患有溼性AMD的一些人；然而，通過這些技術不能恢復已經喪失的視力。 如果視力已經喪失，現有的低視力輔助器可有助於改善生存質量。年齡相關性黃斑變性(AMD)的最早徵兆之一是視網膜色素上皮(RPE)的基底層與 布魯赫膜(BM)之間稱作玻璃疣的胞外沉積物的積聚。最近Anderson等的研究證實玻璃疣 含有澱粉樣蛋白 β (Experimental Eye Research 78(2004)243-256) 本發明的目的是建立高靈敏性且同時強力的(robust)檢測技術，其使得可以定 量確定諸如液體或血清樣品、優選血清樣品的生物樣品中的Αβ變體、特別是pGlu-Αβ肽。考慮到Αβ肽在血液中的低豐度，這是一個巨大挑戰。然而，具有這種檢測技術是在藥物篩 選程序中研究小分子抑制劑的效力的前提條件。本發明提供了新的方法和包含高特異性和高有效性抗體的組合物，所述抗體包括 嵌合抗體及其片段，包括部分或完全人源化抗體及其片段，其具有特異性識別及結合一系 列澱粉樣蛋白抗原、特別是pGlu-Αβ肽的特異性表位的能力，所述抗原可以單體、二聚 體、三聚體等形式或聚合物形式，集合物(aggregate)、纖維、絲的形式或者斑的濃縮形式呈 遞給抗體。本發明教導的抗體特別用於診斷澱粉樣變，該澱粉樣變是一組與澱粉樣斑形成 相關的疾病和病症，包括繼發性澱粉樣變和年齡相關性澱粉樣變，包括但不限於神經性病 症如阿爾茨海默病(AD)，盧伊體痴呆，唐氏症候群，具有澱粉樣變的遺傳性腦出血(Dutch 型)；關島帕金森-痴呆症候群；以及基於或者與澱粉樣蛋白相關的其它疾病，如進行性核 上麻痺，多發性硬化症；克-雅病，具有澱粉樣變的遺傳性腦出血(Dutch型)，帕金森病， HIV-相關痴呆，ALS (肌萎縮側索硬化症)，成人發病型糖尿病；老年性心臟澱粉樣變；內分 泌性腫瘤及其它疾病，包括黃斑變性等等。為了滿足上述所有需求，特別優選基於ELISA的技術。使用ΑβΝ3ρΕ ELISA開始 研究，因為對於這種Αβ變體，已經可以商購ELISA系統(Human Amyloid β (N3pE)Assay Kit-IBL, Code No. 27716)，其用作參考和內部質量對照。Αβ Ν3ρΕ_40肽的捕獲使用TGC ^ hA^ (x-40)ELISA(HS) ii ^f (The Genetics Company, Inc. , Wagistrasse 23,8952 Schlieren, Zurich area Switzerland)，其應當便於和加速開發過程。發明_既述本發明特別涉及抗體或其變體，特徵在於其以高親和力與Αβ_肽結合。所述高親 和力在本發明中是指親和力Kd值為1(ΓΜ或更好，優選Kd值為或更好，甚至更優選Kd 值為 1(Γ9Μ-10^Μ。特別地，所述抗體優選為單克隆抗體，並選自以下組A β 5-5-6A β 6-1-6A β 17-4-3A β 24-2-3本發明的抗體可特別用於診斷方法以檢測澱粉樣變，特別是阿爾茨海默病。附圖
描述圖 1Α)通過增加pGlu-6166抗體(克隆12-1)的濃度檢測lOng/ml澱粉樣蛋g βΝ3ρΕ-40。B)確定檢測lOng/ml澱粉樣蛋白β Ν3ρΕ_40所需的pGlu-6166抗體(克隆12-1)
的最高濃度。圖 2各個IgG產生克隆的雜交瘤細胞培養上清的斑點印跡分析。圖 3pGlu-6166雜交瘤細胞克隆和IBL-A β Ν3ρΕ抗體的P印Spot分析。圖4
20 μ g pGlu-6166抗體和雜交瘤細胞培養上清的12% SDS-PAGE。圖 5雜交瘤細胞培養上清的Biacore分析。圖示了監測的結合過程的疊加。圖 6抗-Αβ N3pE抗體克隆6_1_6與Αβ pE3_40相互作用的傳感圖。S 7抗-Αβ N3pE抗體克隆與Αβ pE3_40相互作用的傳感圖。S 8克隆6-1-6 的 N3pE-ELISA，Αβ pE3-40 的標準曲線。S 9Ν3ρΕ抗體克隆6-1-6的傳感圖。圖 10利用以下方法的ΑβρΕ3-42定量1 20稀釋於EIA緩衝液，用860 μ 1 3. 5Μ Tris 進行PH滴定的中和。圖 11阿爾茨海默病(AD)患者的染色腦切片。(A)用識別總A β的抗-A β抗體6Ε10染色的散發性AD (SAD)患者的腦，(B)用識別A β ρΕ3-χ的Ν3ρΕ抗體克隆染色的散發性AD (SAD)患者的腦，(C)用識別A β ρΕ3-χ的Ν3ρΕ抗體克隆染色的家族性AD (FAD)患者的腦。發明詳述定義術語「抗體」以其最廣泛的含義使用，並且特別包括完整的單克隆抗體、多克隆抗 體、從至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及抗體片段(只要 它們呈現出期望的生物學活性)。抗體可以是IgM, IgG(例如IgGU IgG2、IgG3或IgG4)、 IgD、IgA或IgE。然而，優選所述抗體不是IgM抗體。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，通常是完整抗體的抗原結合區或可變區。抗 體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2和Fv片段雙抗體、單鏈抗體分子以及從抗體片 段形成的多特異性抗體。如本文所用，術語「單克隆抗體」是指得自一群基本均質的抗體的抗體，即該群包 含的各個抗體除了可能少量天然存在的突變之外是相同的。單克隆抗體對於單一抗原性位 點是高度特異性的。此外，與通常包含不同決定簇(表位)的不同抗體的「多克隆抗體」制 備物相反，每個單克隆抗體只針對抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外，單克隆抗 體通常的有利之處是它們通過雜交瘤培養合成，未被其它免疫球蛋白汙染。「單克隆」是指 抗體的特性，其得自基本均質的抗體群，不應理解為需要通過任何特殊方法來產生抗體。例 如，本發明中使用的單克隆抗體可以通過首先由K6hleret al. ,Nature, 256 :495(1975)所 述的雜交瘤方法產生，或者可以通過通常已知的重組DNA方法產生。「單克隆抗體」也可以 分離自噬菌體抗體文庫，使用如 Clackson et al.，Nature，352 :6^-6 (1991)和Marks et al.，J. Mol. Biol.，222 :581-597 (1991)所述的技術。本文的單克隆抗體特別包括嵌合抗體(免疫球蛋白)，其中一部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特定物種的抗體或者屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或者同 源，而鏈的剩餘部分與衍生自另一物種的抗體或者屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相 應序列相同或者同源；以及這樣的抗體的片段，只要它們呈現出期望的生物學活性。「人源化」形式的非人(例如鼠)抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段 (如Fv、Fab、Fab'、F(ab' ) 2或者抗體的其它抗原結合子序列)，其含有衍生自非人免疫 球蛋白的最小序列。人源化抗體的大部分是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的 互補決定區(CDR)的殘基由具有期望的特異性、親和力和能力(capacity)的非人物種(供 體抗體)如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基代替。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構架區 (FR)殘基由相應的非人殘基代替。此外，人源化抗體可包含這樣的殘基，其在受體抗體及引 入的CDR或構架序列中均未發現。進行這些修飾以進一步精製和優化抗體的性能。通常，人源化抗體包含基本上所 有的至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有CDR區對應於非人免疫球蛋 白的那些區域，並且所有或基本上所有FR區是人免疫球蛋白序列的那些區域。人源化抗體 最優選還包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fe)，通常為人免疫球蛋白的恆定區。進一步 的細節參見 Jones et al.，Nature, 321 :522-525 (1986)，Reichmann et al, Nature. 332 323-329(1988) R Presta, Curr. Op. Struct. Biel.，2 :593-596 (1992)。人源化抗體包括 I^imatized 抗體，其中所述抗體的抗原結合區源自通過用所關注的抗原免疫恆河猴而產 生的抗體。「單鏈Fv」或「sFv」抗體片段包含抗體的Vh和\結構域，其中這些結構域存在 於單多肽鏈中。通常地，Fv多肽還包含Vh與\結構域之間的多肽連接物(linker)，這使 得sFv形成抗原結合所期望的結構。關於sFv的綜述見Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. ,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。術語「雙抗體」是指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，該片段包含在相同多 肽鏈中與輕鏈可變結構域(Vd)連接的重鏈可變結構域(Vh) (Vh-Vd)。通過使用過短而不 允許在相同鏈上兩個結構域之間配對的連接物，迫使結構域與另一鏈的互補結構域配對， 並產生兩個抗原結合位點。雙抗體在Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sol. USA,90 6444-6448(1993)中得以更充分描述。「分離的」抗體是已經鑑定並從其天然環境的組分中分離和/或回收的抗體。其 天然環境的汙染組分是幹擾抗體的診斷或治療用途的材料，並且可以包括酶、激素及其它 蛋白質或非蛋白質溶質。在優選的實施方案中，將抗體純化為(1)通過勞裡(Lowry)方 法確定為大於95重量％的抗體，最優選大於99重量％ ； (2)通過使用旋杯測序儀足以以 獲得N末端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的程度；或者(3)通過還原或非還原條件 SDS-PAGE使用考馬斯藍或優選銀染純化的均一性。分離的抗體包括重組細胞內原位抗體， 因為不存在抗體天然環境的至少一種成分。然而，通常分離的抗體通過至少一個純化步驟 來製備。如本文所用，表述「細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」可互換使用，並且所有這些 名稱均包括後代。因此，詞語「轉化體」和「轉化的細胞」包括初始的對象細胞及從其衍生 的培養物而不論轉移的數目。還應當理解，由於有意或無意的突變所致所有後代的DNA含量可以不完全相同。本發明包括經篩選與原始轉化的細胞具有相同功能或生物學活性的突 變體後代。在使用不同名稱的情況下，從上下文可明了。 如本文所用，術語「多肽」、「肽」和「蛋白，，可互換使用，是指由通過肽鍵連接的氨 基酸組成的生物分子。如本文所用，術語「一個(a) 」、「一個(an) 」及「這個(the) 」是指「一個或多個」，
並且包括複數形式，除非在上下文中是不適合的。表述「由澱粉樣蛋白或澱粉狀蛋白導致或者與其相關的疾病和病症」包括但不限 於由單體、原纖維或多聚體狀態或者這者的任意組合形式的澱粉樣蛋白的存在或活性導致 的疾病和病症。這樣的疾病和病症包括但不限於澱粉樣變、內分泌腫瘤以及黃斑變性。術語「澱粉樣變」是指一組與澱粉樣斑形成相關的疾病和病症，包括但不限於繼發 性澱粉樣變和年齡相關性澱粉樣變，例如這樣的疾病，包括但不限於神經性病症如阿爾茨 海默病(AD)，包括特徵在於認知記憶能力喪失的疾病或疾病狀況(condition)，如輕度認 知障礙(MCI)，散發性阿爾茨海默病，盧伊體痴呆，唐氏症候群，具有澱粉樣變的遺傳性腦出 血(Dutch型)；關島帕金森-痴呆症候群，家族形式的阿爾茨海默病如家族性英國型痴呆 (FBD)和家族性丹麥型痴呆(FDD)；以及基於或者與澱粉樣蛋白相關的其它疾病，如進行性 核上麻痺，多發性硬化症；克-雅病，帕金森病，HIV-相關痴呆，ALS (肌萎縮側索硬化症)， 包涵體肌炎(IBM)，成人發病型糖尿病和老年性心臟澱粉樣變；以及各種眼病，包括黃斑變 性、玻璃疣相關的視神經病變及由於β-澱粉樣蛋白沉積所致的白內障。「澱粉樣蛋白β、Αβ或澱粉樣蛋白」是本領域公認的術語，並且指澱粉樣β 蛋白和肽、澱粉樣β前體蛋白(APP)及其修飾、片段和任何功能等同物。特別地，如本文所 用，澱粉樣蛋白β是指通過APP的蛋白酶剪切所產生的任何片段，但特別是涉及或者與澱 粉樣蛋白病理學相關的那些片段，包括但不限於AiVpAiV4c^AiV42t5這些Αβ肽的氨基 酸序列如下所示A β 1-42 (SEQ ID NO. 1)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-AlaA β 1-40 (SEQ ID NO. 2)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-ValA β 1-38 (SEQ ID NO. 3)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly「pGlu-Αβ 」或「Αβ N3pE」是指N末端截短形式的Aβ，其在Aβ的胺基酸序列 的第3位的穀氨酸殘基開始，其中所述穀氨酸殘基被環化形成焦穀氨酸殘基。特別地，如 本文所用，pGlu-Αβ是指涉及或者與澱粉樣蛋白病理學相關的那些片段，包括但不限於 pGlu-A β 3—38、pGlu-A β 3—40、p-Glu-A β 3—42。
N末端截短的形式的A β、A β 3-38> A β 3_4(1、A β 3_42的序列如下所示A β 3-42 (SEQ ID NO. 4)Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-AlaA β 3-40 (SEQ ID NO. 5)Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-LeuMet-Val-Gly-Gly-V al-ValA β 3-38 (SEQ ID NO. 6)Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-P he-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-IIe-IIe-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly特別地，本發明涉及如下項1.抗體，特徵在於其與Αβ肽或其變體結合，優選以高親和力結合。2.項1的抗體，其中所述高親和力是指解離常數(Kd)為IO-7M或更好。3.項1或2的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。4.前述任一項的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有選自SEQ ID NO :49、 53,57和61的核苷酸序列或者選自SEQ ID NO =50,54,58和62的胺基酸序列。5.前述任一項的抗體，其中所述抗體的重鏈的可變部分具有選自SEQ ID NO :51、 55,59和63的核苷酸序列或者選自SEQ ID NO :52、56、60和64的胺基酸序列。6.前述任一項的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQ ID NO :49的核 苷酸序列或者SEQ ID NO :50的胺基酸序列，並且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有SEQ ID NO 51的核苷酸序列或者SEQ ID NO 52的胺基酸序列。7.前述任一項的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQ ID NO :53的核 苷酸序列或者SEQ ID NO力4的胺基酸序列，並且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有SEQ ID NO 55的核苷酸序列或者SEQ ID NO 56的胺基酸序列。8.前述任一項的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQ ID NO :57的核 苷酸序列或者SEQ ID NO :58的胺基酸序列，並且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有SEQ ID NO 59的核苷酸序列或者SEQ ID NO 60的胺基酸序列。9.前述任一項的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQ ID NO :61的核 苷酸序列或者SEQ ID NO :62的胺基酸序列，並且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有SEQ ID NO 63的核苷酸序列或者SEQ ID NO 64的胺基酸序列。10.前述任一項的抗體，其中所述抗體選自以下組或其功能性變體A β 5-5-6 (保藏號 DSM ACC 2923)A β 6-1-6 (保藏號 DSM ACC 2924)A β 17-4-3(保藏號 DSM ACC 2925)A β 24-2-3 (保藏號 DSM ACC 2926)。11.前述任一項的抗體，其中所述抗體是A β 6-1-6 (保藏號DSM ACC四對)。12.前述任一項的抗體，其中所述抗體是A β 24-2-3 (保藏號DSM ACC四沈)。
13.前述任一項的抗體，其中所述抗體是保留高親和力的人源化或嵌合抗體或者 抗體片段。14.前述任一項的抗體，其用於檢測A β肽或其變體。15.項14的抗體，其中所述變體選自下組pGlu-A β 3-38pGlu-A β 3-40pGlu_A33_42，及pGlu_A33_x 變體，其中χ為10至42的整數，優選18至42、更優選30至42的整數。16.前述任一項的抗體，其是人的。17.前述任一項的抗體，其是保留高親和力的雙抗體或單鏈抗體。18.前述任一項的抗體，其與由項15所定義的抗體結合的表位結合。19.前述任一項的抗體，其具有項15所定義的抗體的互補決定區。20.前述任一項的抗體，其是標記的。21.前述任一項的抗體，其固定在固相上。22.抗體，其可得自雜交瘤細胞系 DSM ACC 2923、DSM ACC 2924、DSM ACC 2925、 DSM ACC 2926的任意一種。23.組合物，其包含前述任一項的抗體。24.項23的組合物，其用於治療、預防或延緩澱粉樣變。25.項23或M的組合物，其中所述澱粉樣變是選自輕度認知障礙、阿爾茨海默病 和唐氏症候群中神經變性的神經變性疾病。26.項23或M的組合物，其中所述澱粉樣變是散發性阿爾茨海默病或者家族性阿 爾茨海默痴呆。27.項沈的組合物，其中所述家族性阿爾茨海默痴呆是家族性英國型痴呆或者家 族性丹麥型痴呆。28.雜交瘤細胞系 DSM ACC 2923。29.雜交瘤細胞系 DSM ACC 2924。30.雜交瘤細胞系 DSM ACC 2925。31.雜交瘤細胞系 DSM ACC 2926。32.項1-22中任一項所定義的抗體或項23_27中任一項所定義的組合物在診斷或 治療方法中的用途。33.項32的用途，其用於診斷澱粉樣變相關(amyloid-associated)疾病或疾病狀 況。34.項33的用途，其中所述澱粉樣變是選自輕度認知障礙、阿爾茨海默病和唐氏 症候群中的神經變性的神經變性疾病。35.項33的用途，其中所述澱粉樣變是散發性阿爾茨海默病或者家族性阿爾茨海
默痴呆。36.項35的用途，其中所述家族性阿爾茨海默痴呆是家族性英國型痴呆或者家族 性丹麥型痴呆。
37.診斷澱粉樣變相關疾病或疾病狀況，特別是阿爾茨海默病的體外診斷方法，包 括如下步驟使項1至22中任一項的抗體與疑似患有所述疾病或疾病狀況的個體的樣品接觸， 以及檢測所述抗體與來自所述樣品的pGlu-澱粉樣蛋白、優選pGlu-Αβ肽的結合。38.診斷試劑盒，其包含項1至22中任一項所定義的抗體和使用說明書，以及任選 存在的其它生物學活性物質。39.項32的診斷試劑盒，其中所述其它生物學物質是穀氨醯胺醯基環化酶抑制 劑。40.寡核苷酸，其選自 SEQ ID No :23_48。本發明的抗體可用於診斷澱粉樣變。本發明的抗體可用作親和力純化劑。在這種方法中，使用本領域已知的方法將抗 體固定在固相樹脂或濾紙上。使固定的抗體與含有要純化的Αβ-肽(或其片 段)的樣品接觸，然後用合適的溶劑洗滌該支持物，這會基本上除去樣品中除了與固定的 抗體結合的Αβ-肽之外的所有材料。最後，用另一合適溶劑洗滌該支持物，所述另一合適 溶劑如ρΗ 5.0的甘氨酸緩衝液，其會從抗體中釋放A β肽。抗-A β -肽抗體也可用於A β -肽的診斷測定，例如檢測其在特定細胞、組織或血 清中的出現。因此，所述抗體可用於澱粉樣變的診斷，特別是選自如下的神經變性疾病輕 度認知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，如散發性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海 默痴呆(FAD)如家族性英國型痴呆(FBD)和家族性丹麥型痴呆(FDD)，以及唐氏症候群中的 神經變性；優選阿爾茨海默病。對於診斷應用，所述抗體通常用可檢測部分標記。可使用許多標記，其通常可分為 如下幾組(a)放射性同位素，如35S、14C、125I、3H和1311。所述抗體可以利用如Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2,Giitigen et al. ,Ed. ,ffiley-Interscience. New York, New York. Pubs.，(1991)所述的技術，用放射性同位素進行標記，放射性可以利 用閃爍計數測量。(b)可以利用螢光標記，如稀土金屬螯合物(銪螯合物)或螢光素及其衍生物、若 丹明及其衍生物、丹磺醯、麗絲胺(Lissamine)、藻紅素和德克薩斯紅(Texas Red)。可以利 用例如Current Protocols in Immunology，見上文所公開的技術將螢光標記與抗體偶聯。 螢光可以使用螢光計定量。(c)可以利用各種酶-底物標記。酶通常催化生色底物的化學改變，這可以使用 各種技術測量。例如，酶可催化底物顏色改變，這可以通過分光光度計測量。或者，酶可改 變底物的螢光或化學發光。定量螢光改變的技術在上文描述。化學發光底物通過化學反應 變成電子激發的，然後可以發出可測量的光(如使用化學發光計測量)或者將能量送給熒 光接受體。酶標記的實例包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶；美國專利 4，737，456 號)、螢光素、2，3- 二氫 2，3- 二氮雜萘二酮(2，3-dihydrophthalazinedione)、 蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)、鹼性磷酸酶、0-半乳糖苷 酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(如尿酸氧化酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶 等。將酶與抗體偶聯的技術在 0' Sullivan et al.，Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,in Methods in Enzym(ed Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York,73 :147-166(1981)中ffii$。酶-底物組合的實例包括例如(i)辣根過氧化物酶(HRPO)與作為底物的過氧化氫酶，其中過氧化氫酶氧化染料 前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3，3' ,5,5'-四甲基鹽酸聯苯胺(TMB))；(ii)鹼性磷酸酶(AP)與作為生色底物的磷酸對硝基苯酯；和(iii) β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)與生色底物(例如ρ_硝基苯基-β _D_半乳 糖苷酶)或螢光底物4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷酶G-methylumbelliferyl-ii-D-ga lactosidase)。本領域技術人員可利用許多其它酶-底物組合。有時，將標記與抗體間接偶聯。技術人員應當知道實現這個目的的各種技術。例 如，可以將抗體與生物素偶聯，以及可以將任何上述三大類標記與抗生物素蛋白偶聯，或者 反之亦然。生物素選擇性地與抗生物素蛋白結合，因此可以將該標記以這種間接方式與抗 體偶聯。或者，為了實現標記與抗體的間接偶聯，將抗體與小的半抗原(例如地高辛)偶聯， 並將上述不同類型標記之一與抗半抗原抗體(例如抗地高辛抗體)偶聯。因此，可以實現 標記與抗體的間接偶聯。Aβ -抗體不需要標記，並且其存在可以使用與Aβ -抗體結合的標記的抗體來檢 測。本發明的抗體可用於任何已知測定方法，如競爭性結合測定、直接和間接夾心 ^^ ^ ^ ^。 Zola， Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques, pp.147-158(CRC Press. Inc.，1987)。競爭性結合測定依賴於標記的標準物與測試樣品分析物競爭結合有限量的抗體 的能力。測試樣品中Αβ-肽的量與變為與抗體結合的標準物的量成反比。為了便於確定 變為結合的標準物的量，抗體在競爭之前或之後通常是不溶的，由此與抗體結合的標準物 和分析物可以方便地與保持未結合的標準物和分析物分離。夾心測定涉及使用兩種抗體，每種抗體能夠與要檢測的蛋白的不同免疫原性部分 或表位結合。在夾心測定中，測試樣品分析物由固定在固體支持物上的第一抗體結合，然後 第二抗體與分析物結合，因此形成不溶的三部分複合物。第二抗體自身可以用可檢測部分 標記(直接夾心測定)，或者可以使用可檢測部分標記的抗免疫球蛋白抗體測量(間接夾心 測定)。例如，一種優選類型的夾心測定是ELISA測定，其中可檢測部分是酶。對於免疫組織化學，組織樣品可以是新鮮或冷凍的，或者可以包埋在石蠟中及用 防腐劑如福馬林固定。診斷試劑盒便利地，本發明的抗體可以在試劑盒中提供，所述試劑盒即預定量的試劑與進行 診斷測定的說明書的包裝的組合。在抗體用酶標記的情況下，試劑盒包含酶所需的底物和 輔因子(例如提供可檢測生色團或螢光團的底物前體)。此外，可以包含其它添加劑，如穩 定劑、緩衝液(例如封閉緩衝液或裂解緩衝液)等。各種試劑的相對量可以是廣泛的，以提供充分優化測定靈敏性的試劑溶液的濃度。特別地，試劑可以乾粉，通常是凍乾粉末的形式 提供，其包含溶解時提供具有合適濃度的試劑溶液的賦形劑。本發明的診斷試劑盒可以含有如下文所述的其它生物學活性物質。特別優選用於 所述診斷試劑盒中的是穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑。本發明的診斷試劑盒可以特別用於檢測和診斷澱粉樣變相關疾病和疾病狀況，特 別是選自如下的神經變性疾病輕度認知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，如散發性阿爾茨 海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默痴呆(FAD)如家族性英國型痴呆(FBD)和家族性丹麥 型痴呆(FDD)，唐氏症候群中的神經變性；優選阿爾茨海默病。本發明特別涉及特徵在於以高親和力與Αβ_肽結合的抗體。本發明還涉及特徵 在於以高親和力與Αβ-肽或其變體結合的抗體。本發明中所述高親和力是指Kd值為10- 或更好的親和力，優選Kd值為或更好，甚至更優選Kd值為10_9M-10_12M。因此，本發明 的抗體以高於先前已知的抗體的親和力與A β -肽結合。特別地，所述抗體優選是單克隆抗體，並選自如下組A β 5-5-6 (DSM ACC 2923)A β 6-1-6 (DSM ACC 2924)A β 17-4-3 (DSM ACC 2925)A β 24-2-3 (DSM ACC 2926)本發明的抗體可特別用於診斷方法中，以檢測澱粉樣變，特別是選自如下的神經 變性疾病輕度認知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，如散發性阿爾茨海默病(SAD)或者家 族性阿爾茨海默痴呆(FAD)如家族性英國型痴呆(FBD)和家族性丹麥型痴呆(FDD)，唐氏綜 合徵中的神經變性；優選阿爾茨海默病。根據優選的實施方案，所述抗體可以是人源化抗體或者嵌合抗體或者人抗體。此外，選自上述組的抗體也可以是所述組的功能性變體。在本發明中，P-Glu-A β -肽的變體特別是pGlu-Αβ 3-38'pGlu-A^3-40'pGlu-A β 3-42Αβ -肽的其它變體是所有pGlu-Αβ 3_χ變體，已經證實其由於阿爾茨海默病或者 在阿爾茨海默病之前在腦中積聚。X定義為10至42的整數，例如在上述pGlu-Ai33_42中， 「42」是χ所表示的整數。在本發明中，本發明抗體的「功能性變體」是這樣的抗體或其功能性變體，其保留 結合能力，特別是與PGlu-A β 3-χ肽以高親和力結合的能力。本領域已知這種功能性變體的 條件，並包含上述可能性，其在抗體及其片段的定義下表示。在優選的實施方案中，所述抗體是如上文所定義的抗體片段。在另一優選實施方案中，本發明的抗體是與由上文所定義的抗體結合的表位結合 的抗體，特別是抗體5-5-6、抗體6-1-6、抗體17-4-3和抗體對_2_3。在另一優選實施方案中，本發明的抗體是具有上文所定義的抗體的互補決定區 (CDR)的抗體。優選地，所述抗體可以是標記的；特別地，可能的標記是上述那些標記以及 本領域技術人員已知的用於抗體的診斷用途的所有標記。
優選地，所述抗體固定在固相上。本發明還涉及可得自雜交瘤細胞系6-1-6 (DSM ACC 2924)的抗體。本發明還涉及包含上文所定義的抗體的組合物。特別地，所述組合物是用於診斷 的組合物，特別是用於神經變性疾病的診斷，所述神經變性疾病選自輕度認知障礙(MCI)， 阿爾茨海默病(AD)，如散發性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默痴呆(FAD)如家 族性英國型痴呆(FBD)和家族性丹麥型痴呆(FDD)，唐氏症候群中的神經變性；優選阿爾茨 海默病；特別是通過檢測生物樣品中的Αβ肽或其變體來進行診斷。在另一實施方案中，本發明及本文前述的抗體或其片段呈現出的對Αβ寡聚體、 纖維、原纖維或絲的結合親和力比對A β單體的結合親和力高至少2倍，特別是至少4倍、 特別是至少10倍、特別是至少15倍，更特別是至少20倍，但是特別是至少25倍。仍然在一實施方案中，提供了本文前述的抗體或其片段，或者嵌合抗體或片段，或 者人源化抗體或其片段，所述抗體充分與哺乳動物中，特別是人腦中包括A β斑在內的聚 集的Αβ結合，但是優選不表現出與澱粉樣前體蛋白(APP)的任何顯著的交叉反應性。在本發明另一方面，提供了本文前述的抗體或其片段，或者嵌合抗體或其片段，或 者人源化抗體或其片段，所述抗體充分與哺乳動物中，特別是人腦中可溶性聚合澱粉樣蛋 白，特別是澱粉樣蛋白β (Αβ)，包括Αβ單體結合，但是優選不表現出與澱粉樣前體蛋白 (APP)的任何顯著的交叉反應性。本發明還涉及上文所定義的人源化形式的抗體，包含所述人源化抗體的組合物以 及所述組合物在治療澱粉樣變，特別是治療哺乳動物特別是人的神經變性疾病中的用途。 所述神經變性疾病特別選自輕度認知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，如散發性阿爾茨海 默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默痴呆(FAD)如家族性英國型痴呆(FBD)和家族性丹麥型 痴呆(FDD)，唐氏症候群中的神經變性。優選所述神經變性疾病是阿爾茨海默病。本發明還涉及如下雜交瘤細胞系5-5-6、6-1_6、17-4-3和M_2_3。本發明還涉及上文所定義的抗體或包含所述抗體的組合物在體外診斷方法中的 用途。特別地，這種診斷方法用於診斷選自如下的神經變性疾病輕度認知障礙
爾茨海默病(AD)，如散發性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默痴呆(FAD)如家族 性英國型痴呆(FBD)和家族性丹麥型痴呆(FDD)，唐氏症候群中的神經變性；優選阿爾茨海 默病；特別是通過檢測生物樣品中的Αβ肽或其變體來進行診斷。
優選地，所述樣品是血清樣品。根據另一優選的實施方案，所述樣品是液體或腦脊液(CSF)樣品。在特別優選的實施方案中，本發明涉及診斷澱粉樣變相關疾病或疾病狀況，優選 阿爾茨海默病的體外或原位診斷方法，所述方法包括如下步驟使本發明的抗體與疑似患有所述疾病狀況或疾病的個體的樣品接觸，所述樣品優 選自血清、液體或CSF樣品，最優選血清樣品；或者與特定身體部分或身體區域接觸，以及檢測所述抗體與樣品的pGlu-澱粉樣蛋白、優選pGlu-Αβ肽的結合。更特別地，本發明涉及澱粉樣變相關疾病或疾病狀況，優選阿爾茨海默病的診斷 方法，所述方法包括檢測抗體或其活性片段與樣品中的或原位PGlu-澱粉樣蛋白，優選 PGlu-A β肽的免疫特異性結合，所述方法包括如下步驟(a)使疑似含有澱粉樣蛋白的樣品或者特定的身體部分或身體區域與本發明的抗體，特別是單克隆抗體，或者本發明及本文前述的嵌合抗體或其片段，或者人源化抗體或其 片段和/或它們的功能性部分接觸，所述抗體與pGlu-Αβ肽結合；(b)使所述抗體和/或其功能性部分與pGlu-Αβ肽結合以形成免疫複合物；(c)檢測所述免疫複合物的形成；以及(d)使所述免疫複合物的存在或不存在與所述樣品或者特定的身體部分或區域中 WpGlu-Aii肽的存在或不存在相關連。本發明還包括確定組織和/或體液中促澱粉樣變斑負荷(amyloidogenic plaque burden)程度的方法，所述方法包括(a)獲得研究的組織和/或體液的代表性樣品；(b)用本發明的抗體，特別是單克隆抗體，或者本發明及本文前述的嵌合抗體或其 片段，或者人源化抗體或其片段和/或它們的功能部性分檢測所述樣品；(c)確定與蛋白結合的抗體的量；以及(d)計算所述組織和/或體液中的斑負荷。特別地，本發明涉及確定組織和/或體液中促澱粉樣變斑負荷的程度的方法，其 中確定步驟c)中免疫複合物的形成，由此所述免疫複合物的存在或不存在與澱粉樣蛋白， 特別是pGlu-Αβ肽的存在或不存在相關。仍然在另一實施方案中，本發明涉及這樣的組合物，其包含治療有效量的本發明 的抗體，或者本發明及本文前述的嵌合抗體或其片段，或者人源化抗體或其片段，包括它們 的任何功能等同的抗體或者任何衍生或功能性部分；特別是藥物組合物，其任選還包含藥 學可接受的載體。在本發明另一實施方案中，所述組合物包含治療有效量的抗體。本發明還包括這樣的混合物，其包含治療有效量的本發明的抗體，特別是單克隆 抗體，或者本發明及本文前述的嵌合抗體或其片段，或者人源化抗體或其片段，包括它們的 任何功能等同的抗體或者任何衍生或功能性部分；以及任選的其它生物學活性物質和/或 藥學可接受的載體和/或稀釋劑和/或賦形劑。特別地，本發明涉及這樣的混合物，其中所述其它生物學活性物質是用於澱粉樣 變藥物中的化合物，所述澱粉樣變是與涉及神經變性疾病的澱粉樣蛋白或澱粉狀蛋白如 Αβ蛋白相關的一組疾病或病症，所述神經變性疾病選自輕度認知障礙(MCI)，阿爾茨海默 病(AD)，如散發性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默痴呆(FAD)如家族性英國型 痴呆(FBD)和家族性丹麥型痴呆(FDD)，唐氏症候群中的神經變性；優選阿爾茨海默病。在本發明另一實施方案中，其它生物學活性物質或化合物也可以是治療劑，所述 治療劑可用於治療由澱粉樣蛋白β導致的澱粉樣變，或者可用於其它神經性病症的藥物 中。所述其它生物學活性物質或化合物可以通過與本發明的抗體相同或相似機制，或 者通過不相關的作用機制，或者通過多種相關和/或不相關的作用機制來發揮其生物作用。通常，所述其它生物學活性化合物可以包括神經元傳遞(neutron-transmission) 增強劑，精神治療藥物，乙醯膽鹼酯酶抑制劑，鈣通道阻滯劑，生物胺，苯並二氮雜罩鎮靜 劑，乙醯膽鹼合成、貯存或釋放增強劑，乙醯膽鹼突觸後受體激動劑，單胺氧化酶-A或-B抑制劑，N-甲基-D-天冬氨酸穀氨酸受體拮抗劑，非留體類抗炎藥物，抗氧化劑以及5-羥色 胺能受體拮抗劑。更特別地，本發明涉及這樣的混合物，其包含至少一種化合物與本發明的抗體以 及任選的藥學可接受的載體和/或稀釋劑和/或賦形劑，所述化合物選自有效抗氧化 應激的化合物；抗凋亡化合物；金屬螯合劑；DNA修復抑制劑如哌侖西平和代謝物；3-氨 基-1-丙磺酸(3-APS) ；1,3-丙二磺酸鹽(1，3PDS) ； α -分泌酶激活劑；β -和γ -分泌酶 抑制劑；Tau蛋白；神經遞質；β-摺疊破壞物(/3-sheet breaker)；澱粉樣蛋白β清除/ 耗竭細胞組分引誘劑；包括焦穀氨酸化澱粉樣蛋白β 3-42在內的N末端截短澱粉樣蛋白 β的抑制劑，如穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑；抗炎分子；或者膽鹼酯酶抑制劑(ChEI)，如他 克林、利凡斯的明、多奈哌齊和/或加蘭他敏；Ml激動劑；以及其它藥物，包括任何澱粉樣蛋 白或tau修飾藥物和營養補充劑及營養補充劑。本發明還涉及這樣的混合物，其中所述化合物是膽鹼酯酶抑制劑(ChEI)，特別是 這樣的混合物，其中所述化合物選自他克林、利凡斯的明、多奈哌齊、加蘭他敏、煙酸和美金 剛。在另一實施方案中，本發明的混合物可以包含煙酸或美金剛與本發明的抗體，以 及任選的藥學可接受的載體和/或稀釋劑和/或賦形劑。在另一實施方案中，本發明的混合物可以包含穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑與本發 明的抗體，以及任選的藥學可接受的載體和/或稀釋劑和/或賦形劑。優選的穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑描述於WO 2005/075436，特別是第31_40頁 所示的實施例1-141。實施例1-141的合成示於WO 2005/075436的第40-48頁。WO 2005/075436關於實施例1_141、它們的合成及它們作為穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑的用 途的公開通過引用併入本文。其它優選的穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑描述於WO 2008/055945，特別是第 46-155頁所示的實施例1-473。實施例1-473的合成示於WO 2008/055945的第156-192 頁。WO 2008/055945關於實施例1_473、它們的合成及它們作為穀氨醯胺醯基環化酶抑制 劑的用途的公開通過引用併入本文。其它優選的穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑描述於WO 2008/055947，特別是第 53-118頁所示的實施例l-345o實施例1-345的合成示於WO 2008/055947的第119-133 頁。WO 2008/055947關於實施例1_345、它們的合成及它們作為穀氨醯胺醯基環化酶抑制 劑的用途的公開通過引用併入本文。其它優選的穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑描述於WO 2008/055950，特別是第 57-120頁所示的實施例1-212。實施例1-212的合成示於WO 2008/055950的第121-128 頁。WO 2008/055950關於實施例1_212、它們的合成及它們作為穀氨醯胺醯基環化酶抑制 劑的用途的公開通過引用併入本文。其它優選的穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑描述於WO 2008/065141，特別是第56_59 頁所示的實施例1-25。實施例1-25的合成示於WO 2008/065141的第60-67頁。WO 2008/065141關於實施例1_25、它們的合成及它們作為穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑的用途 的公開通過引用併入本文。其它優選的穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑描述於WO 2008/110523，特別是第55_59頁所示的實施例1-27。實施例1-27的合成示於WO 2008/110523的第59-71頁。WO 2008/110523關於實施例1_27、它們的合成及它們作為穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑的用途 的公開通過引用併入本文。其它優選的穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑描述於WO 2008/U8981，特別是第62_65 頁所示的實施例1-18。實施例1-18的合成示於WO 2008/128981的第65-74頁。WO 2008/128981關於實施例1_18、它們的合成及它們作為穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑的用途 的公開通過引用併入本文。其它優選的穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑描述於WO 2008/U8982，特別是第61_67 頁所示的實施例1-44。實施例1-44的合成示於WO 2008/U8982的第68-83頁。WO 2008/128982關於實施例1_44、它們的合成及它們作為穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑的用途 的公開通過引用併入本文。其它優選的穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑描述於WO 2008/U8983，特別是第64_68 頁所示的實施例1-30。實施例1-30的合成示於WO 2008/U8983的第68-80頁。WO 2008/128983關於實施例1_30、它們的合成及它們作為穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑的用途 的公開通過引用併入本文。其它優選的穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑描述於WO 2008/128984,特別是第63_69 頁所示的實施例1-36。實施例1-36的合成示於WO 2008/U8984的第69-81頁。WO 2008/128984關於實施例1_36、它們的合成及它們作為穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑的用途 的公開通過引用併入本文。其它優選的穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑描述於WO 2008/U8985，特別是第66_76 頁所示的實施例1-71。實施例1-71的合成示於WO 2008/128985的第76-98頁。WO 2008/128985關於實施例1_71、它們的合成及它們作為穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑的用途 的公開通過引用併入本文。其它優選的穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑描述於WO 2008/U8986，特別是第 65-66頁所示的實施例1-7。實施例1-7的合成示於WO 2008/128986的第66-73頁。WO 2008/128986關於實施例1_7、它們的合成及它們作為穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑的用途 的公開通過引用併入本文。仍然在本發明另一實施方案中，提供了這樣的混合物，其包含「非典型抗精神病 藥」；和本發明的抗體、特別是單克隆抗體，但是特別是本發明及本文前述的嵌合抗體或其 片段，或者人源化抗體或其片段；以及任選的藥學可接受的載體和/或稀釋劑和/或賦形 劑，所述「非典型抗精神病藥」例如氯氮平、齊拉西酮、利培酮、阿立哌唑或奧氮平，其用於 治療陽性和陰性精神病症狀，包括幻覺、妄想、思維障礙(thought disorder)(表現為明顯 的不連貫、出軌(derailment)、言不及義)和怪誕或紊亂的行為，以及快感缺乏、情感障礙 (flattened affect)、情感淡漠和社交退縮(social withdrawal) 在本發明的具體實施方案中，本發明及本文前述的組合物和混合物包含分別為治 療有效量的抗體和生物學活性物質。可以合適地用於與本發明的抗體組合的混合物中的其它化合物描述於 W02008/065141 (特別參見第37/38頁)，包括PEP抑制劑(第43/44頁)；LiCl ；二肽基氨 基肽酶的抑制劑，優選地DP IV或DP IV樣酶的抑制劑(參見第48/49頁)；乙醯膽鹼酯酶(ACE)抑制劑(參見第47頁)；PIMT增強劑；β分泌酶的抑制劑(參見第41頁)；Y分泌酶 的抑制劑(參見第41/42頁)；中性內肽酶的抑制劑；磷酸二酯酶-4(PDE-4)的抑制劑(參 見第42/43頁)；TNF α抑制劑；毒蕈鹼性Ml受體拮抗劑(參見第46頁)；NMDA受體拮抗劑 (參見第47/48頁)；G -1受體抑制劑；組胺Η3拮抗劑(參見第43頁)；免疫調節劑、免疫 抑制劑或者選自antegren (那他珠單抗)、Neurelan (氨吡啶-SR)、campath (阿侖單抗)、 IR 208、NBI 5788/MSP 771 (替利莫肽)、紫杉醇、Anergix. MS (AG 沘4)、SH636、達芙文(CD 271，阿達帕林)、BAY 361677(白介素-4)、基質-金屬蛋白酶抑制劑(例如BB 76163)、幹 擾素-τ (滋養層素(trophoblastin))和SAIK-MS的藥劑；β -澱粉樣蛋白抗體(參見第 44頁)；半胱氨酸蛋白酶抑制劑(參見第44頁)；MCP-I拮抗劑(參見第44/45頁)；澱粉 樣蛋白沉積抑制劑(參見第42頁)以及β澱粉樣蛋白合成抑制劑(參見第42頁)，該文 獻通過引用併入本文。在另一實施方案中，本發明涉及這樣的混合物，其包含治療有效量的本發明的抗 體，特別是單克隆抗體，或者本發明及本文前述的嵌合抗體或其片段，或者人源化抗體或其 片段，和/或生物學活性物質。本發明還涉及本發明的抗體，特別是單克隆抗體，但是特別是本發明及本文前述 的嵌合抗體或其片段，或者人源化抗體或其片段，和/或它們的功能性部分，和/或包含所 述抗體的藥物組合物或混合物在製備用於治療或緩和澱粉樣變的藥物中的用途，所述澱粉 樣變是一組與澱粉樣斑形成相關的疾病和病症，包括繼發性澱粉樣變和年齡相關性澱粉樣 變，例如這樣的疾病，包括但不限於神經性病症如阿爾茨海默病(AD)，盧伊體痴呆，唐氏綜 合徵，具有澱粉樣變的遺傳性腦出血(Dutch型)；關島帕金森-痴呆症候群；以及基於或 者與澱粉樣蛋白相關的其它疾病，如進行性核上麻痺，多發性硬化症；克-雅病，帕金森病， HIV-相關痴呆，ALS (肌萎縮側索硬化症)，成人發病型糖尿病；老年性心臟澱粉樣變；內分 泌腫瘤及其它疾病，包括黃斑變性。本發明還包括這樣的方法，其用於製備用在預防、治療或緩和澱粉樣變的作用的 方法中的本發明的抗體，特別是單克隆抗體，但是特別是本發明及本文前述的嵌合抗體或 其片段，或者人源化抗體或其片段，和/或它們的功能性部分，和/或包含特別是治療有效 量的所述抗體和/或其功能性部分的藥物組合物或混合物，所述澱粉樣變是一組與澱粉 樣斑形成相關的疾病和病症，包括繼發性澱粉樣變和年齡相關性澱粉樣變，例如這樣的疾 病，包括但不限於神經性病症如輕度認知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，例如散發性阿爾 茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默痴呆(FAD)如家族性英國型痴呆(FBD)和家族性 丹麥型痴呆(FDD)，唐氏症候群中的神經變性；盧伊體痴呆，具有澱粉樣變的遺傳性腦出血 (Dutch型)；關島帕金森-痴呆症候群；以及基於或者與澱粉樣蛋白相關的其它疾病，如進 行性核上麻痺，多發性硬化症；克-雅病，帕金森病，HIV-相關痴呆，ALS (肌萎縮側索硬化 症)，成人發病型糖尿病；老年性心臟澱粉樣變；內分泌腫瘤及其它疾病，包括黃斑變性，所 述方法包括將本發明的抗體，特別是單克隆抗體，但是特別是本發明的嵌合抗體或其片段， 或者人源化抗體或其片段配製成藥學可接受形式。本發明還包括預防、治療或緩和澱粉樣變的作用的方法，所述澱粉樣變是一組與 澱粉樣斑形成相關的疾病和病症，包括繼發性澱粉樣變和年齡相關性澱粉樣變，例如這樣 的疾病，包括但不限於神經性病症如輕度認知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)例如散發性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默痴呆(FAD)如家族性英國型痴呆(FBD)和家 族性丹麥型痴呆(FDD)，唐氏症候群中的神經變性；盧伊體(Lewy body)痴呆，具有澱粉樣 變的遺傳性腦出血(Dutch型)；關島帕金森-痴呆症候群；以及基於或者與澱粉樣蛋白相 關的其它疾病，如進行性核上麻痺，多發性硬化症；克-雅病，帕金森病，HIV-相關痴呆， ALS (肌萎縮側索硬化症)，成人發病型糖尿病；老年性心臟澱粉樣變；內分泌腫瘤及其它疾 病，包括黃斑變性，所述方法通過將抗體和/或其功能性部分，但是特別是人源化抗體和/ 或其功能性部分，或者包含這種抗體和/或其功能性部分的組合物或混合物給予患有這種 病症的動物或人來進行，所述方法包括給予治療有效量的抗體。本發明的另一目的是提供通過將本發明及本文所述的抗體，特別是藥物組合物給 予動物，特別是哺乳動物或人來治療澱粉樣變的方法，所述澱粉樣變是一組與澱粉樣斑形 成相關的疾病和病症，包括繼發性澱粉樣變和年齡相關性澱粉樣變，包括但不限於神經變 性疾病如輕度認知障礙(MCI)、阿爾茨海默病(AD)例如散發性阿爾茨海默病(SAD)或者家 族性阿爾茨海默痴呆(FAD)如家族性英國型痴呆(FBD)和家族性丹麥型痴呆(FDD)、唐氏綜 合徵中的神經變性；特別是特徵在於喪失認知記憶能力的疾病或疾病狀況。在具體的實施方案中，本發明提供了保持或增加患有記憶障礙的動物，特別是哺 乳動物或人的認知記憶能力，但是特別是恢復認知記憶能力的方法，所述方法通過將本發 明及本文前述的抗體，特別是藥物組合物給予動物，特別是哺乳動物或人來進行。本發明的另一目的是提供治療組合物及生產這種組合物的方法，以及利用本發明 及本文前述的抗體治療澱粉樣變的方法，所述澱粉樣變是一組與澱粉樣斑形成相關的疾病 和病症，包括繼發性澱粉樣變和年齡相關性澱粉樣變，包括但不限於神經變性疾病如輕度 認知障礙(MCI)、阿爾茨海默病(AD)例如散發性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海 默痴呆(FAD)如家族性英國型痴呆(FBD)和家族性丹麥型痴呆(FDD)、唐氏症候群中的神經 變性；特別是特徵在於喪失認知記憶能力的疾病或疾病狀況。特別地，本發明涉及治療動物，特別是哺乳動物或人，其患有特徵在於喪失認知記 憶能力的澱粉樣變相關疾病狀況，所述治療使得保留認知記憶能力。
實施例1.材料和方法1. 1抗體的產生小鼠為生產雜交瘤，使用8周齡雌性BALB/C小鼠(Charles River)。骨髓瘤細胞係為產生雜交瘤，使用來自 Deutsche Stammsammlung von Mikoorganismen und Zellkulturen 的骨髓瘤細胞系 SP2/0_Agl4。抗原使用肽pGlu-6166 (序列 pGlu-FRHDSGC，SEQ ID NO :65)。策略作為免疫原，將所述肽經由3種不同連接物的馬來醯亞胺基團偶聯至牛甲狀腺球 蛋白(thyroglubulin) (BTG，SIGMA)。所用的三種不同長度的連接物來自N-[e_馬來醯亞氨基己醯氧基]琥珀醯亞胺酯(EMCS)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞氨基甲基)-環己 烷-1-羧基-(6-醯氨基己酸酯)(LCSMCC)和N-[b-馬來醯亞氨基丙氧基]琥珀醯亞胺酯 (BMPS)。為檢測產生的抗體，將相同的肽經由琥珀醯亞胺基-6_[(b-馬來醯亞氨基_丙醯 氨基)己酸酯](SMPH)的馬來醯亞氨基基團偶聯至牛血清白蛋白(BSA，SIGMA)。方法用於免疫的肽的偶聯偶聯經由肽的半胱氨酸殘基的SH-基團以兩步進行。1.載體蛋白的馬來醯化(Maleoylation)將2至5mg相應連接物(50mg/ml於N-甲基吡咯烷酮(NMP)中)加入2ml載體 蛋白溶液(10mg/ml於0. ImM NaHC03, pH 8. O中)中。將反應混合物在室溫(RT)下孵育 Ih0然後將反應混合物用S印hadex G_50柱(1. 5x14cm)脫鹽，該柱已用50mM磷酸鈉，250mM NaCl，pH 6. 8 平衡。2.馬來醯化的BTG與肽的偶聯將250 μ 1肽溶液(10mg/ml於重蒸餾水(Aqua bidest)中)與2ml含有50mM磷 酸鈉，250ml NaCl,pH 6. 8中的馬來醯化的載體蛋白(2. 5mg/ml)的溶液混合，在4°C下孵育 2h，再在RT下孵育4h。未反應的馬來醯亞胺基團通過加入2-巰基乙醇直至濃度為IOmM並 在4°C下過夜孵育而封閉。將所得偶聯物對IOmM磷酸鈉，150mM NaCl, pH 7. 5在4°C下滲 析(更換緩衝液3次，MW截斷值10. 000)。用於ELISA的肽的偶聯偶聯經由肽的半胱氨酸殘基的SH-基團以兩步進行。1.載體蛋白的馬來醯化將2mg SMPH(50mg/ml於N-甲基吡咯烷酮，NMP中)加入2ml載體蛋白溶液(BSA， 10mg/ml於0. ImM NaHC03, pH 8. O中)中。將反應混合物在室溫(RT)下孵育lh。然後將 反應混合物用S印hadex G-50柱(1. 5x14cm)脫鹽，該柱已用50mM磷酸鈉，250mM NaCl, pH 6. 8平衡。2.馬來醯化的BTG與肽的偶聯將100 μ 1 肽溶液(10mg/ml 於 50mM 磷酸鈉，250mM NaCl，pH 6. 8 中)與 Iml 含 有50mM磷酸鈉，250ml NaCl,pH 6. 8中的馬來醯化的載體蛋白(2. 5mg/ml)的溶液混合，在 4°C下孵育2h，再在RT下孵育4h。未反應的馬來醯亞胺基團通過加入2-巰基乙醇直至濃 度為IOmM並在4°C下過夜孵育而封閉。將所得偶聯物對IOmM磷酸鈉，150mM NaCl,pH 7. 5 在4°C下滲析(更換緩衝液3次，MW截斷值10. 000)。將5隻小鼠腹膜內免疫39天。對於免疫，使用油包水乳液，該乳液由等份的抗原 溶液(由等份的三種不同肽-BTG-偶聯物組成)和完全或不完全弗氏佐劑組成。MA將3隻免疫的小鼠通過C02培育(incubation)處死。取出脾並在無菌條件下勻漿。將脾細胞和骨髓瘤SP2/0細胞在達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium) (DMEM, SIGMA)中洗滌幾次，並以2，3脾細胞1 SP2/0細胞的比率，用聚乙二醇3350(lml 50% (w/v))融合。融合雜交瘤的進一步操作根據標準方法學進行。ELISA將針對IgG的ELISA用於篩選細胞培養上清。測試在96孔聚苯乙烯(polystyrol) 微量滴定板(Greiner，編號655061)中進行。將板用BSA-pGlu_6166肽包被。將100 μ 1未 稀釋的細胞培養上清加入每孔中，並在RT下孵育1小時。將來自SP2/0細胞的上清用作陰 性對照。將來自脾細胞的上清用作陽性對照。利用與鹼性磷酸酶偶聯的山羊抗小鼠IgG來檢測陽性孔。在DynexOpsys MR酶標 儀(Dynex Opsys MR Microplate Reader)中於 405nm 處測量光密度(OD)0詵擇產牛穩定抗體的雜交瘤細胞將來自陽性孔的細胞轉移到M孔板中，並培養幾天。將細胞再次轉移，並在ELISA 中測試BSA-pGlu-6199結合及交叉反應性。將陽性孔用於雜交瘤細胞系的低溫保存。經有限稀釋克降進行兩個連續克隆步驟以將產生抗體的細胞與不產生抗體的細胞分離，並且保證 所選擇的細胞是單克隆的。兩個克隆步驟均根據有限稀釋方法進行。低溫保存所選擇的雜交瘤使用DMSO和標準方法低溫保存。1.2. ELISA 測定A β Ν3ρΕ_40 的捕獲利用來自 TGC (The GENETICS Company ；Switzerland) ^ hAi3 (x-40) ELISA (HS)基本上根據廠商指導進行。產生了用於Αβ N3pE(pGlu-6166)的生物素化的檢測抗體。當提到時，將IBL HRP 偶聯的Αβ Ν3ρΕ抗體用作陽性對照(僅與IBL ELISA人澱粉樣蛋白β (Ν3ρΕ)測定試劑 盒組合時可用)。合成相應的A β Ν3ρΕ-40肽(50 μ g等份於六氟異丙醇(HFIP)中，儲存 在_80°C )。在即將使用之前，將HFIP蒸發，將肽用IOOmM Tris/HCl pH 10，4稀釋至1 μ g/ μ 。將這個儲存溶液進一步用TGC抗體稀釋劑稀釋。隨後的捕獲和檢測根據廠商指導進 行。1. 3. P印Spot 分析Aβ Ν3ρΕ抗體和細胞培養上清的特異性和生物學完整性用JPT P印tide Technologies GmbH, Volmerstrasse 5 (UTZ), 12489 Berlin, Germany ^ PepSpot i^i^M 定。相應的P印Spot 膜在JPT製備。該方法的原理由Kramer et al. 1997Cell 91， 799-809介紹和描述。對於分析，將膜用TBST-M(10mM Tris-Hcl, pH 7. 5,150mM NaCl，0. 005 % 吐溫 20+5%脫脂乳)在室溫下溫和振蕩封閉2小時。在搖動平臺上，於4°C下，將膜用在等體積 TBST-M中稀釋的各個細胞培養上清孵育過夜。利用與鹼性磷酸酶偶聯的抗小鼠二抗根據標 準程序進行信號檢測。1.4.斑點印跡分析進行簡單的斑點印跡方案以獲得A β Ν3ρΕ抗體和細胞培養上清對各自天然肽的 敏感性的信息。為此，將遞減濃度的A βΝ3ρΕ-40肽(IOOOng-Sng)點印在小塊硝酸纖維素 膜上，隨後進行與P印Spot 膜一樣的實驗程序。
1. 5. SDS PAGE將12% SDS聚丙烯醯胺凝膠根據標準方案成型。將15 μ 1細胞培養上清和10 μ g 生物素化的抗體在12% SDS聚丙烯醯胺凝膠上分離。電泳在100V恆壓下進行2小時。1. 6. BIAC0RE 分析將A β Ν3ρΕ-40肽(陽性對照)和A β Ν3Ε-40肽(陰性對照)偶聯在Biacore CM5晶片上。使用未修飾的晶片以確定空白值。監測在TGC稀釋劑中從20 μ g/ml稀釋至 1 μ g/ml的生物素化的抗體的締合與解離，以允許隨後確定各個KD值。以此方式，還確定了 各個細胞培養上清的結合特徵。1. 6. 1 A β Ν3ρΕ特異性抗體克隆6-1-6和的親和力將純化的抗體克隆6-1-6在HBS-EP緩衝液(Biacore)中向下稀釋至100、50、30、 20、15、10、7、4、2、lnM。親和力使用帶有固定了 Aβ ρΕ3_40 的 CM5-晶片的 Biacore 3000 來 確定。系統以30μ1/π η運行。測量的體效應和與晶片表面的非特異性結合通過減去固定 了 Αβ ρΕ3-40的流動池4的信號和空白流動池3的信號而校正。締合(IOmin)通過注射 300 μ 1每種濃度而獲得。觀察解離IOmin以上。剩餘的抗體分子通過注射5 μ 1 0. IM HCL 而除去。對於每種抗體濃度，記錄締合和解離。利用「二價分析物」模型，通過全局同時擬 合所有記錄的抗體濃度的締合和解離階段來確定締合和解離速率及解離常數。1. 7.測序抗體可變區雜交瘤細胞的培養使雜交瘤細胞在添加了 15% FBSU % MEM-NEA(非必需胺基酸，Gibco) ,50 μ g/ml 慶大黴素(Gibco)和50 μ M β-巰基乙醇的D-MEM (+L-穀氨醯胺，+丙酮酸鈉，4，5g/l葡萄 糖，Gibco)中，於37°C下和5%0)2中生長。傳代培養根據細胞密度在3-4天後進行。將細 胞以0. 5xl06細胞/ml接種，分瓶(splitting)在2_切106細胞/ml的細胞密度時進行。cDNA合成和逆轉錄根據NucleospinRNA分離試劑盒(Macherey-Nagel)的手冊從MlO6個細胞分離總 RNA。利用寡(dT)15 引物(Promega)和 Superscript III 逆轉錄酶 Qnvitrogen)，將 IOOng RNA用於cDNA合成。重鏈和輕鏈可變區的PCR擴增利用Phusion 高保真 DNA 聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)，使用與引物 MHV1-12 組合的引物MHCGl (在克隆5-5-6和6-1-6的情況下)和MHCG2b (克隆7-4-3和24-2-3) 從模板cDNA中擴增重鏈可變區。為了擴增輕鏈可變區，使用與引物MKV1-MKV11組合的引 物MKC。引物序列示於表1。PCR產物克隆於pJETl. 2中將PCR擴增的重鏈和輕鏈可變區根據Clone JET PCR克隆試劑盒(i^rmentas)的 方案克隆入PJET1. 2/平端(blunt)載體。使用pJETl. 2測序引物進行測序。表1 用於重鏈和輕鏈可變區PCR擴增的引物序列
權利要求
1.抗體，特徵在於其與A肽或其變體結合，優選以高親和力結合。
2.權利要求1的抗體，其中所述高親和力是指解離常數(Kd)值為ΙΟΙ或更好。
3.權利要求1或2的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
4.前述任一項權利要求的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有選自SEQID NO 49、53、57和61的核苷酸序列或者選自SEQ ID NO =50,54,58和62的胺基酸序列。
5.前述任一項權利要求的抗體，其中所述抗體的重鏈的可變部分具有選自SEQID NO 51、55、59和63的核苷酸序列或者選自SEQ ID NO 52、56、60和64的胺基酸序列。
6.前述任一項權利要求的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQID NO 49 的核苷酸序列或者SEQ ID NO :50的胺基酸序列，並且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有 SEQ ID NO 51的核苷酸序列或者SEQ ID NO 52的胺基酸序列。
7.前述任一項權利要求的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQID N0:53 的核苷酸序列或者SEQ ID NO力4的胺基酸序列，並且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有 SEQ ID NO 55的核苷酸序列或者SEQ ID NO 56的胺基酸序列。
8.前述任一項權利要求的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQID N0:57 的核苷酸序列或者SEQ ID NO :58的胺基酸序列，並且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有 SEQ ID NO 59的核苷酸序列或者SEQ ID NO 60的胺基酸序列。
9.前述任一項權利要求的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQID NO 61 的核苷酸序列或者SEQ ID NO :62的胺基酸序列，並且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有 SEQ ID NO 63的核苷酸序列或者SEQ ID NO 64的胺基酸序列。
10.前述任一項權利要求的抗體，其中所述抗體選自下組或其功能性變體 A β 5-5-6 (保藏號 DSM ACC 2923)A β 6-1-6 (保藏號 DSM ACC 2924) A β 17-4-3 (保藏號 DSM ACC 2925) A β 24-2-3 (保藏號 DSM ACC 2926)。
11.前述任一項權利要求的抗體，其中所述抗體是Aβ 6-1-6(保藏號DSM ACC 2924) 0
12.前述任一項權利要求的抗體，其中所述抗體是Αβ24-2-3(保藏號DSM ACC 2926)。
13.前述任一項權利要求的抗體，其中所述抗體是保留高親和力的人源化或嵌合抗體 或者抗體片段。
14.前述任一項權利要求的抗體，其用於檢測Aβ肽或其變體。
15.權利要求14的抗體，其中所述變體選自下組 PGIU-A β 3-38pGlu-A β 3-40 pGlu-Αβ 3_42，及 pGlu-A03_x 變體，其中χ為10至42的整數，優選18至42、更優選30至42的整數。
16.前述任一項權利要求的抗體，其是人的。
17.前述任一項權利要求的抗體，其是保留高親和力的雙抗體或單鏈抗體。
18.前述任一項權利要求的抗體，其與由權利要求15所定義的抗體結合的表位結合。
19.前述任一項權利要求的抗體，其具有權利要求15所定義的抗體的互補決定區。
20.前述任一項權利要求的抗體，其是標記的。
21.前述任一項權利要求的抗體，其固定在固相上。
22.抗體，其得自雜交瘤細胞系DSM ACC 2923、DSM ACC 2924、DSM ACC 2925、DSM ACC 2926的任意一種。
23.組合物，其包含前述任一項權利要求所定義的抗體。
24.權利要求23的組合物，其用於治療、預防或者延緩澱粉樣變。
25.權利要求23或M的組合物，其中所述澱粉樣變是選自輕度認知障礙、阿爾茨海默 病和唐氏症候群中的神經變性的神經變性疾病。
26.權利要求23或M的組合物，其中所述澱粉樣變是散發性阿爾茨海默病或者家族性 阿爾茨海默痴呆。
27.權利要求沈的組合物，其中所述家族性阿爾茨海默痴呆是家族性英國型痴呆或者 家族性丹麥型痴呆。
28.雜交瘤細胞系DSMACC四23。
29.雜交瘤細胞系DSMACC 2924。
30.雜交瘤細胞系DSMACC四25。
31.雜交瘤細胞系DSMACC四沈。
32.權利要求1-22中任一項所定義的抗體或者權利要求23-27中任一項所定義的組合 物在診斷或者治療方法中的用途。
33.權利要求32的用途，其用於診斷澱粉樣變相關疾病或疾病狀況。
34.權利要求33的用途，其中所述澱粉樣變是選自輕度認知障礙、阿爾茨海默病和唐 氏症候群中的神經變性的神經變性疾病。
35.權利要求33的用途，其中所述澱粉樣變是散發性阿爾茨海默病或者家族性阿爾茨 海默痴呆。
36.權利要求35的用途，其中所述家族性阿爾茨海默痴呆是家族性英國型痴呆或者家 族性丹麥型痴呆。
37.診斷澱粉樣變相關疾病或疾病狀況，特別是阿爾茨海默病的體外診斷方法，包括如 下步驟使權利要求1-22中任一項的抗體與疑似患有所述疾病或疾病狀況的個體的樣品接 觸，以及檢測所述抗體與來自所述樣品的PGlu-澱粉樣蛋白、優選pGlu-Αβ肽的結合。
38.診斷試劑盒，其包含權利要求1-22中任一項所定義的抗體和使用說明書，以及任 選存在的其它生物學活性物質。
39.權利要求32的診斷試劑盒，其中所述其它生物學物質是穀氨醯胺醯基環化酶抑制劑。
40.寡核苷酸，其選自SEQID No :23-48。
全文摘要
本發明涉及新診斷測定，其用於診斷澱粉樣變，特別是阿爾茨海默病及相關方面。特別地，本發明提供了單克隆抗體及抗體測定。
文檔編號A61K39/00GK102131519SQ200980132674
公開日2011年7月20日 申請日期2009年7月10日 優先權日2008年7月21日
發明者A·賴澤瑙爾-紹普, H-U·德穆特, J-U·拉費爾德, K·甘斯, M·克萊因施密特, S·席林, S·肯普弗 申請人:前體生物藥物股份公司