產生芳香分子的酵母表達系統的製作方法

2023-05-07 15:52:51

專利名稱：：產生芳香分子的酵母表達系統的製作方法產生芳香分子的酵母表達系統本發明涉及天然芳香分子的產生。更特別地，本發明涉及酵母的新表達系統，所述表達系統使用表達盒且允許通過生物轉化產生酚類衍生物，所述酚類衍生物可能用於產生用作食品調味劑或用於香料(香味或香水)的天然芳香分子。通過這兩種途徑的一種或另一種獲得香草醛。香草醛(3-曱氧基-4-羥基苯曱醛)是對衍生自香草(P^mW"莢的香草提取物的嗅覺和味覺性質負責的主要成分。它是工業上最常用的芳香分子之一。然而，從香草莢或香草提取物產生的天然香草醛只佔市場的20%;其應用受限，這首先歸因於全球可用莢的潛力，其次是這些莢的高成本，所述成本波動很大(大約從30€/kg到450€/kg,即天然香草醛的潛力至少為1500€/kg)。因此，合成香草醛常用作天然香草醛的廉價替代品(約15€/kg)。然而，儘管合成香草醛適用於香料和化妝品，但是它可以在農業食品業造成管理問題。此外，合成調味劑一般不如天然調味劑為消費者喜愛。因此，尋求通過生物學方法，特別是生物轉化方法獲得天然芳香分子，特別是香草醛，所述方法利用微生物(細菌、酵母、黴菌)或植物細胞，或其酶系統。為本發明的目的，術語"生物轉化"是指底物的生物學轉化，所述底物優選衍生自天然來源，以便獲得天然調味料、香水或者調味料或香水的前體。香草醛可按照下列反應方案產生只要可獲得，提及的每個分子均有可能獲得香草醛，所述分子中最重要的是阿魏酸和丁香酚。例如，申請EP453368、PCT申請WO96/08576和PCT申請WO00/61721描述在存在絲狀真菌下通過生物轉化從阿魏酸產生天然香草醛的方法。這些方法中使用的阿魏酸來源於提取含阿魏酸酯的農副產品玉米、水稻、甜菜或小麥。然而，這些副產品的阿魏酸濃度低及其提取-純化所需的步驟多，意味著從這些酯提取，產量仍然相當低；從而造成該起始材料的高成本，並且因此造成由其衍生的香草醛的高生產成本。為了使利用微生物的生物方法有可能節省成本，因此優選使用更為廣泛可獲且廉價的底物。丁香酚便是如此，其可以作為松柏醇或阿魏酸的來源。由J.Overhage等發表的文章說明一個事實，即在大腸桿菌(foc/zen'c/n'aco/z')中表達衍生自簡青黴CPem.c/〃&m157'附///(^157'柳"柳)的香草醇氧化酶基因，會使催化丁香酚轉化為松柏醇成為可能。為轉化松柏醇為阿魏酸，J.Overhage等後來在大腸桿菌中表達其他兩個簡青黴來源的酶松柏醇脫氫酶和^M白醛脫氫酶(在大腸桿菌重組菌4朱中高效生物轉化丁香酚為阿魏酸，並進一步轉化為香草醛，2003,AppliedandEnvironmentalmicrobiology(應用和環境微生物學)，6569-6576)。儘管這種方法的確使用了可用的且相對低廉的底物丁香酚，但是，由於轉化丁香酚為阿魏酸需要三份克隆，在大腸桿菌中產生阿魏酸的系統仍然難以實施。因此，本發明的主題是以比現有技術低的產生成本，用在工業上實施簡單的方法，產生天然香草醛前體或天然香草醛本身的方法。本發明提出的方案是使用或產生廉價可用的天然底物，例如丁香酚和阿魏酸。後者是合成香草醛最常用的底物，通常昂貴而且質量難以控制。因此，本發明的另一主題是產生天然阿魏酸和/或天然松柏醇的簡單而有效的方法，其成本在工業上可以接受。儘管阿魏酸可以用作天然香草醛的前體，然而，松柏醇是罕見香水如佳雷花(fleursdetiar6)香水中的脫氫+〉柏醇的來源，並且可通過氧化作為阿魏酸的來源。本發明方法的必不可少的裝置是酵母，所述酵母包括至少一個編碼香草醇氧化酶的基因，其屬於諸如衍生自簡青黴的香草醇氧化酶基因(SEQIDNo.l)(GenBank參考號Y15627)或與SEQIDNo.1的序列至少70%，優選80%，非常優選90%—致的任何核苷酸序列的類型。因此，本發明的目的是提出在包括至少一個編碼香草醇氧化酶基因的酵母中生物轉化^^宜的底物。通過本發明的酵母生物轉化丁香酚，一方面可以以低成本產生無雜質的天然阿魏酸和/或天然松柏醇，另一方面，可以產生天然香草醛。根據本發明的一個實施方案，所述酵母包括至少一個包含編碼香草醇氧化酶的基因的表達系統。有利的是，該表達系統包括(1)整合該系統到所述細胞基因組中的裝置，其包括兩個核苷酸序列，(2)選擇已經整合了該系統的所述細胞的裝置，其包括選擇插入片段，該插入片段包括作為啟動子、諸如抗生素抗性基因的可選^^標誌物以及終止子邊界的兩個LoxP序列，(3)編碼香草醇氧化酶的基因的表達盒，包括允許該基因表達的啟動子、允許該基因整合的至少一個克隆位點以及終止子。術語"表達盒"是指核苷酸序列，其包括啟動子、克隆目的基因的插入位點或多克隆位點(MCS)和終止子。術語"啟動子"是指啟動和控制轉錄所需的DNA序列，術語"克隆插入位點"或"多克隆位點"是指含有一個或多個限制位點的DNA序列，以及術語"終止子"是指轉錄終止所需的DNA序列。術語"載體"是指任何可能插入外源核酸片段於其中的DNA序列，所述載體使把外源DNA引入宿主細胞成為可能。載體的實例是質粒、粘粒、酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)和Pl噬菌體衍生的人工染色體(PAC)，以及病毒衍生載體。術語"可選擇標誌物"是指基因，其表達賦予含有它的細胞可被選擇的特性。它是，例如抗生素抗性基因。根據本發明的優選實施方案，所述克隆位點包括限制性內切酶Notl、BamHI、Mfel和Xhol的限制性位點，其使香草醇氧化酶核苷酸序列插入所述表達盒。有利的是，該克隆位點的序列是序列SEQIDNo.2或與序列SEQIDNo.2至少70%,優選80°/。，非常優選90%同源的任何序列。根據本發明的優選實施方案，可選擇標誌物以兩個LoxP位點為邊界，這將使該可選擇標誌物被CRE/Lox系統切除。CRE酶是特異性識別LoxP位點的重組酶。這兩個位點之間的核苷酸序列被稱作靶DNA，將在CRE酶存在時被除去。這是因為，在CRE酶與LoxP位點結合時，它切開這兩個位點，並在耙DNA^皮除去後又將這兩半粘接在一起。有利的是，序列LoxP的序列是序列SEQIDNo.3或與序列SEQIDNo.3至少70%，優選80%，非常優選90%同源的任何序列。根據本發明的優選實施方案，可使所述表達系統整合入該酵母基因組中的序列有多種並選自包括TY序列、端粒序列X和Y'、DUP序列、序列□或在酵母基因組中重複的任何序列的組。有利的是，該序列是釀酒酵母(&cc/zaramyc&scereWWae)的TY1A和TY1B序列，其序列優選分別為序列SEQIDNo.4和SEQIDNo.5或與其至少70%，優選80%,非常優選90%同源的任何序列。根據本發明另一個優選實施方案，用於所述表達系統的啟動子是強啟動子，即在其控制下，引起所述基因強轉錄的啟動子。強啟動子的實例是l)控制基因表達的啟動子，其蛋白在酵母中豐富，例如控制糖酵解蛋白或氮代謝蛋白表達的啟動子；2)表達特異的啟動子，例如其活性受糖或氮的存在調節的啟動子；3)轉錄組實驗可見高活性的啟動子；或4)設計為使其調節的基因強轉錄的人工啟動子。就用於所述表達系統的終止子允許良好mRNA穩定性的能力，對其選擇。有利的是，選擇的終止子對應以上選擇的強啟動子。有利的是，使目的基因在所述表達系統表達的啟動子為釀酒酵母TDH3基因的啟動子，其序列優選為序列SEQIDNo.6或與序列SEQIDNo.6至少70%，優選80%,非常優選卯％同源的任何序列。有利的是，相關的終止子是釀酒酵母CYC1基因的終止子，其序列優選為序列SEQIDNo.7或與序列SEQIDNo.7至少70%,優選80%，非常優選90%同源的任何序列。有利的是，允許表達所述可選擇標誌物的啟動子及終止子為棉蚜G4W^agowj^z')TEF1基因的啟動子及終止子，其序列優選分別為序列SEQIDNo.8和SEQIDNo.9或與其至少70%,優選80%,非常優選90%同源的任何序列。根據本發明另一個優選實施方案，用於所述表達系統的可選擇標誌物為抗生素抗性基因，其選自包括抗遺傳黴素(g6n6ticine)基因、抗諾爾絲菌素(nourseothricine)基因、抗腐草黴素基因或抗z6ocine基因，或抗野生型酵母敏感的支配抗生素的任何其它基因的組。有利的是，用於所述表達系統的可選擇標誌物為抗遺傳黴素的基因，其序列優選為序列SEQIDNo.10或與序列SEQIDNo.10至少70%,優選80%，非常優選90%同源的任何序列。根據本發明另一個優選實施方案，含有香草醇氧化酶基因的表達系統序列為SEQIDNo.11核苷酸序列，或與序列SEQIDNo.11至少70%,優選80%,非常優選90%同源的任何序列。本發明的主題也是包括以上定義的表達系統的載體。根據本發明另一個優選實施方案，包括所述表達系統的載體為質粒，並且有利的是，為pUC57。本發明還包括含至少一個以上定義的載體的轉化細菌。這些轉化的細菌可能屬於允許複製所選載體的任何種。有利的是，這些為大腸桿菌屬的細菌。本發明的主題還是用於切除抗生素抗性基因的載體，該切除載體包括(1)選擇含有它的細胞的裝置，包括棉蚜TEF1基因及諾爾絲菌素抗性基因的啟動子及終止子，以及(2)切除所述表達系統中存在的可選擇標誌物的裝置，包括釀酒酵母GAL1基因、CRE基因的啟動子和釀酒酵母CYC1基因的終止子。有利的是，所述切除載體包括序列SEQIDNo.12或與序列SEQIDNo.12至少70%，優選80%,非常優選90%同源的任何序列。根據本發明的優選實施方案，上述切除載體選自在細胞分裂期間分離不佳的載體，從而通過這一特性導致在不存在常見選擇壓力下丟失載體，所述載體例如多拷貝複製型載體。有利的是，所述切除載體是質粒pFL44s。所述切除載體的第一個優點是，它可使存在於酵母基因組的抗生素抗性基因在用所述表達系統轉化該酵母后除掉。因此，除了編碼香草醇氧化酶的基因外，允許產生根據本發明的芳香分子的酵母不包含源自屬於同一屬或同一科的菌林的任何DNA。此外，通過所述切除載體消除抗性基因也使酵母轉化數次成為可能，從而增加存在於基因組的所述表達系統的拷貝數，並且從而增加香草醇氧化酶蛋白的產量。本發明的主題為包括含有香草醇氧化酶的表達系統的酵母，該表達系統的序列為序列SEQIDNo.11或與序列SEQIDNo.11至少70%,優選80%,非常優選90%同源的任何序列。本發明的主題還是上述酵母和/或上述切除載體轉化的酵母。根據本發明的優選實施方案，所述酵母屬於能夠實現^f艮據已知現有技術方法的香草醛前體(特別是丁香酚、阿魏酸、松柏醇)向香草醛生物轉化的酵母的任何種。為本發明的目的，術語"酵母"是指任何二倍體或多倍體酵母或衍生自這些菌林的一種的孢子形成的任何單倍體克隆，或者可選擇地衍生自兩個單倍體克隆雜交的任何二倍體克隆。有利的是，所述酵母屬於半子嚢菌酵母的任何種，優選屬於酵母屬GS"cc/2ara/7^cey)或其雜種。非常優選地，所述酵母源自釀酒酵母(Cev/w'ae)菌才朱或其雜種。本發明的主題是產生天然松柏醇和/或天然阿魏酸的方法，包括以下步驟a)將編碼香草醇氧化酶的基因的核苷酸序列克隆入所述表達系統，b)以如此獲得的表達系統轉化所述酵母，c)在允許表達香草醇氧化酶的條件下培養所述酵母，d)使所述酵母與丁香酚接觸。根據本發明的優選實施方案，先將編碼香草醇氧化酶的基因的核苷酸序列和包括所述表達系統的載體以一種或多種限制性酶消化。然後，將編碼香草醇氧化酶的基因的序列通過簡單的連接或其它任何插入裝置插入所述載體攜帶的表達系統中。為了擴增所述表達系統，用根據任一方法的連接產物(攜帶含有香草醇氧化酶基因的表達系統的載體)轉化細菌。利用存在於載體中的抗生素抗性基因選擇已經整合了所述表達系統的細菌，該載體攜帶含有編碼香草醇氧化酶的基因的表達系統。其次，將攜帶所述表達系統的載體以一種或多種限制性酶，優選PvuII消化，所述酶切割所述表達系統的兩邊。接著純化所述表達系統，然後根據任一已知方法將其用於轉化所述酵母。利用存在於所述表達系統中的抗性基因選擇已經整合了所述表達系統的酵母。最後，以本領域技術人員已知的允許表達香草醇氧化酶的條件培養轉化的酵母。當把丁香酚添加至培養基時，香草醇氧化酶使催化生物轉化所述丁香酚為松柏醇和/或阿魏酸成為可能。本發明的主題還是產生天然松柏醇和/或天然阿魏酸的方法，其中存在於酵母基因組中的可選擇標誌物已切除，該方法包括在步驟b)之後且在步驟c)和步驟d)之前的以下步驟bl)、步驟b2)及步驟b3):b1)以所述切除載體轉化所述酵母，b2)在允許所述CRE酶表達的條件下培養所述酵母，b3)分離已丟失所述可選擇標誌物的酵母。根據本發明的優選實施方案，將編碼香草醇氧化酶的基因的核苷酸序列插入所述表達系統，首先如上所述以該表達系統轉化所述酵母。利用第一可選擇標誌物的存在，選擇整合了所述表達系統的酵母，所述第一可選^t爭標誌物優選抗生素抗性基因。然後，用任何已知的方法以所述切除載體轉化陽性選擇的酵母。利用存在於所述切除載體中的諾爾絲菌素抗性基因選擇已經整合了所述切除載體的酵母。然後，將已經由此整合了所述表達系統和所述切除載體的酵母，在允許表達CRE酶的條件下培養。活性的CRE酶將使切除所述表達系統中以loxP序列為邊界的所述第一可選擇標誌物成為可能。隨後，選4奪已經丟失該可選擇標誌物的酵母。例如，利用已經丟失該第一抗生素抗性基因的酵母對該抗生素抗性的缺失而對其選擇。採用該選擇步驟得到的酵母不再具備存在於所述表達系統中的可選擇標誌物，但仍擁有存在於所述切除載體中的諾爾絲菌素抗性基因。如上所述，所述切除載體選自在細胞分裂期間分離不佳的載體。利用這一特性，所述切除載體在缺乏通常的選擇壓力下很容易丟失。術語"選4奪壓力"是指有助於選擇所述細胞的任何方法。例如，在培養中，在抗生素存在下，保持具有該抗生素抗性的基因的酵母，對應於選擇壓力的方法。因此，將在前一步中獲得的酵母在沒有選擇壓力下培養，從而丟失所述切除載體，然後就諾爾絲菌素抗性基因的丟失而對其選擇。如此獲得的酵母已將允許香草醇氧化酶表達的表達系統整合入其基因組中，而其基因組不再包含任何抗生素抗性基因。然後，將轉化的酵母在本領域技術人員已知的允許表達香草醇氧化酶的條件下培養。當將丁香酚添加至所述培養基時，香草醇氧化酶使催化生物轉化所述丁香酚為松柏醇和/或阿魏酸成為可能。最後，本發明的主題還是產生天然松柏醇和/或天然阿魏酸的方法，其中按照所需的所述表達系統的拷貝數，將步驟b)、步驟bl)、步驟b2)及步驟b3)重複許多次，目的在於增加酵母基因組中的表達系統的拷貝數。根據本發明的優選實施方案，首先以該表達系統轉化所述酵母，然後如上所述對其選擇。接著以所述切除載體轉化這些酵母，從而如上所述消除可選擇標誌物。如此獲得的酵母不再擁有其基因組中的可選擇標誌物，並整合了所述表達系統的至少一個拷貝。其次，為了增加所述表達系統的拷貝數，再次以所述表達系統轉化這些酵母。進行同上的選擇方法，用切除載體轉化的方法和最後選擇的方法。如此獲得的酵母不再擁有可選擇標誌物，並且已經整合了至少2個拷貝的所述表達系統至其基因組中。該方法可重複所需的多次。本發明的主題是產生香草醛的方法，其包括上述步驟a)、步驟b)、步驟c)及步驟d)，及隨後的將步驟d)中產生的阿魏酸和/或松柏醇轉化為香草醛的步驟。根據本發明的優選實施方案，酵母利用自己的遺傳物質，能夠將步驟d)中產生的阿魏酸轉化為香草醛。根據本發明的另一個優選實施方案，根據專利EP0606441和EP0804606所述的方法，通過酶法或生化方法進行轉化阿魏酸和/或+>柏醇為香草醛的步驟。從隨後的進一步描述中將更加清楚地了解本發明，參考獲得包括香草醇氧化酶的表達系統的實施例，包括該表達系統的載體，切除載體及其在通過丁香酚的生物轉化產生松柏醇和阿魏酸上的用途。在後續以說明的方式給出的實施例中，參考附後的圖，其中圖l展示了所述表達系統的方案，圖2展示了所述酵母表達香草醇氧化酶，圖3展示了獲得切除載體pFL44s-NATl-CRE的方法。實施例l:通過用表達系統轉化酵母在酵母中表達香草醇氧化酶1/表達系統的合成表達系統包括SEQIDNo.13中所述的2715bp的核苷酸序列。該核苷酸序列由合成序列(SEQIDNo.14)和選擇插入片段(SEQIDNo.15)構建。所述合成序列大小為1225bp,由GenScript公司合成。該序列包括-TYIA序列-LoxP序列-TDH3基因啟動子的序列-多克隆位點序列-CYCl基因終止子的序列-TYIB序列。所述選擇插入片段分離自克隆入大腸桿菌的載體pUG6(Giildener，U.,Heck，S.,Fiedler,T.，BeinHauer,J.,andHegemann,J.H.1996.Anewefficientgenedisruptioncassetteforrepeateduseinbuddingyeast(—種在芽殖酵母中重複4吏用的新的有效基因中斷盒).NucleicAcidsRes.24:2519-2524)。所述選擇插入片段包含1500bp並且包括-loxP序列-TEF1基因的啟動子序列-]^111"基因的序列-TEFl基因的終止子序列。以Sail及Sacl限制性酶消化pUG6載體，從而分離該插入片段。通過EcoRI及Pstl限制性位點將包括所述合成序列的表達系統克隆入pUC57載體(GenScript公司)。以Sail及Sacl限制性酶消化包含所述表達系統的pUG6載體和pUC57載體。隨後，通過簡單的連接將所述選擇插入片段插入位於Sail及Sacl限制性位點任一側的TY1A和LoxP序列之間的合成序列中。由此獲得的載體稱作pM2-KAN(圖1)，其包括所述表達系統(合成序列+選擇插入片段)。若用戶期望，存在於所述選擇插入片段中的Xbal及Sacl限制性位點使改變所述可選擇標誌物及其表達序列成為可能。Sail及Spel限制性位點使除去或代替由以該兩個LoxP序列為邊界的2/將編碼香草醇氧化酶的基因插入表達系統VAO的核苷酸序列衍生自簡青黴(GenBank參考號Y15627)。合成實驗中使用的VAO序列(SEQIDNo.1)，其在5'位置有NotI位點，在3'位置有Xhol位點，以使其被克隆至pivex載體中，該克隆符合產生具有C末端六組氨酸標籤的蛋白的核苷酸序列的讀框。以Notl及EcoRI消化包含上述VAO序列的pivex載體，以釋放VAO-6His序列。接著，以簡單的連接將這個序列克隆至pUC57載體，該載體包含事先以Notl和Mfel消化的表達系統。3/用包括編碼香草醇氧化酶的基因的表達系統轉化酵母以PvuII限制性酶消化包含所述表達系統的pUC57載體。該酶切割包含目的基因VAO的表達系統的兩邊。將衍生自所述消化的DNA片段純化，根據熱激方法在PEG/醋酸鋰存在下轉化酵母。在包含300mg/1遺傳黴素的YPD豐富培養基(1%酵母提取物、1%蛋白腖、2。/。葡萄糖)上，利用所述表達系統攜帶的KANr抗性基因的存在，選擇轉化的酵母。轉化後(克隆92411KANVAO),獲得釀酒酵母(菌株9241l)的24個克隆。4/分析所轉化酵母的香草醇氧化酶的表達將轉化的酵母培養在完全含葡萄糖培養基(YPD)上。隨後，使用實施例1中的NiNTA樹脂親和純化VAO蛋白。將滯留在該樹脂上的蛋白以聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE凝膠)分析，以考馬斯藍檢測。圖2表明，就兩個克隆而言，產生了VAO蛋白(柱E92411KANVAO)。92411T克隆對應陰性對照，即未轉化的菌林92411,並且不產生任何VAO蛋白，而BL21I+F對應陽性對照，其得自pivex載體中的香草基VAO的克隆及其在大腸桿菌中的產生。實施例2:在表達香草醇氧化酶的酵母中通過生物轉化丁香酚產生松柏醇和阿魏酸首先，依據上述用包含香草醇氧化酶的表達系統轉化的酵母將丁香酚轉化為松柏醇的能力，對其選擇，然後依據其產生阿魏酸的能力，選擇它們中的一些。因此，在預選擇其形成松柏醇的能力後，發現93205克隆隨後能夠通過其衍生物將丁香酚轉化為阿魏酸。93207克隆及其子代被選為能夠在發酵罐中轉化丁香酚為松柏醇的菌抹的實例。1/用93207菌株及其衍生物93334在發酵罐中產生水>柏醇將93207菌林的兩個孢子雜交得到二倍體菌抹93334，其因而包括兩個拷貝的含有香草醇氧化酶的表達系統。隨後，將93334菌抹在100ml麥芽培養基中培養兩天，以達到約3xl0、6x108細月包/ml的濃度。隨後將所述細胞接種至含有3升麥芽培養基的發酵罐。在30°C和500rpm的振搖下，以預培養的一半體積進行接種。通氣為l升空氣/分鐘。培養20小時後，加入溶於50%葡萄糖的丁香酚(60g丁香酚+120ml以50%溶於水的葡萄糖)。轉化18小時後，停止所述發酵。取樣。用磷酸酸化，以乙醇稀釋2倍並在8000rpm下離心。用HPLC分析上清液。結果表明，在18小時中，丁香酚事實上被完全轉化，且合成了22g/1的松柏醇(摩爾產率接近100%)。2/用93205菌抹及其衍生物93342在發酵罐中產生阿魏酸在30。C及150rpm的振搖下，在100ml麥芽培養基中將衍生自93205菌抹孢子形成的單倍體菌林93242培養兩天。隨後，將所述細胞培養在含有3升麥芽培養基的發酵罐中。在30。C和500rpm的振搖下，以預培養的一半體積進行接種。以0.45升空氣/分鐘通氣24小時。在培養24小時後，以0.25-0.5克丁香酚/小時的流速不斷加入丁香酚溶液。定時取樣以監測所述底物向酚衍生物的轉化。以磷酸酸化各樣品並在8000rpm離心。以HPLC分析上清。底物流速2.5毫升/小時濃度為克/升tableseeoriginaldocumentpage16在這些條件下，從10g/1丁香酚產生10g/1阿魏酸(摩爾產率=85%)。實施例3:從所轉化酵母的基因組中切除可選擇標誌物1/構建用於切除可選一奪標誌物的pFL44s-NATl-CRE載體在本實施例中，切除載體的來源載體是pFL44s載體(GenBank參考號X70266)。該載體長度為4319bp，具有-111^3基因的序列-AmpR抗性基因的序列-多克隆位點-2micron複製原點的序列將包括可選擇標誌物的插入片段和包括CRE酶序列的插入片段插入該PFL44s載體中。包括可選擇標誌物的插入片段在此為諾爾絲菌素抗性基因NAT1，自編碼諾爾絲菌素的載體(GenBank參考號X73149)獲得。以BglII及EcoRI限制性酶消化該載體和pFL44s載體。將包括TEF基因啟動子、NAT1基因序列及TEF基因終止子的NAT1插入片段通過簡單連接插入pFL44s載體中。由此獲得的載體是pFL44s-NATl載體。自psh47載體(GenBank參考號AF298782)獲得包括CRE酶序列的插入片段。用PvuII限制性酶消化psh47載體和pFL44s-NATl載體。隨後，將包括GAL1基因啟動子、CRE基因序列及CYC1基因終止子的CRE插入片段通過簡單連接插入pFL44s-NATl載體。由此獲得的載體是pFL44s-NATl-CRE載體，其序列為序列SEQIDNo.ll(圖3)。2/用切除載體轉化酵母以除去存在於酵母基因組的可選擇標誌物以pFL44s-NATl-CRE切除載體轉化包括含有香草醇氧化酶的表達系統的酵母，例如93334菌4朱。在添加clonNAT(lOOmg/ml)的豐富培養基(YPD)上選擇轉化的酵母。隨後，將陽性選擇的酵母培養在YP半乳糖培養基中。由於CRE基因的啟動子在半乳糖存在下可誘導，因而該培養條件使誘導酵母中CRE酶的表達成為可能。該實驗的結果表明，80%的所述克隆已經丟失了KanR標誌物。以已經丟失所述可選擇標誌物的93334菌林進行1/中所述的轉化丁香酚為松柏醇的方法。經過18小時的轉化後，得到相同的結果，提示丟失了可選擇標誌物不影響所述菌抹的生物轉化能力。權利要求1.包括至少一個編碼香草醇氧化酶的基因的酵母，所述基因的序列為序列SEQIDNo.1或是與序列SEQIDNo.1至少70％、優選80％、非常優選90％同源的任何序列。2.如權利要求1所述的酵母，其特徵在於，編碼香草醇氧化酶的基因包含在表達系統中，所述系統包括(1)將所述系統整合進所述酵母的基因組的裝置，其包括兩個核苷酸序列，(2)選擇已經整合了所述系統的所述酵母的裝置，其包括選擇插入片段，該選擇插入片段包括作為啟動子、諸如抗生素抗性基因的可選擇標誌物以及終止子邊界的對應於序列SEQIDNO.3的兩個LoxP序列，(3)編碼香草醇氧化酶的基因的表達盒，其包括允許所述基因表達的啟動子、允許所述基因整合的至少一個克隆位點以及終止子。3.如權利要求2所述的酵母，其特徵在於，將所述表達系統整合進所述酵母的基因組的核苷酸序列為釀酒酵母的與序列SEQIDNo.4對應的TYIA序列和與序列SEQIDNo.5對應的TY1B序列，或與其至少70%、優選80%、非常優選90%同源的任何序列。4.如權利要求2或3所述的酵母，其特徵在於，允許所述香草醇氧化酶表達的啟動子是釀酒酵母TDH3基因的啟動子(SEQIDNo.6)或與其至少70%、優選80%、非常優選90%同源的任何序列，並且相關的終止子是對應於序列SEQIDNo.7的釀酒酵母CYC1基因的終止子或與其至少70%、優選80%、非常優選90%同源的任何序列。5.如權利要求2至4中任一項所述的酵母，其特徵在於，允許所述可選擇標誌物表達的啟動子和終止子是棉辨TEF1基因的對應於序列SEQIDNo.8的啟動子和對應於序列SEQIDNo.9的終止子，或與其至少70%、優選80%、非常優選90%同源的任何序列。6.如權利要求2至5中任一項所述的酵母，其特徵在於，所迷可選擇標誌物為抗生素抗性基因，其選自包括抗遺傳黴素基因、抗諾爾絲菌素基因、抗腐草黴素基因或抗z6ocine基因，或抗野生型酵母敏感的支配抗生素的任何其它基因的組，並且優選是對應於序列SEQIDNo.10的遺傳黴素抗性基因或與其至少70%、優選80%、非常優選90%同源的任何序列。7.如權利要求2至6中任一項所述的酵母，其中含有香草醇氧化酶的表達系統的序列為核苷酸序列SEQIDNo.H，或與其至少70%、優選80%、非常優選卯％同源的任何序列。8.如權利要求1至7中任一項所述的酵母，其特徵在於，其屬於能夠將香草醛前體生物轉化為香草醛的酵母的任何種。9.如權利要求1至7中任一項所述的酵母，其特徵在於，其屬於半子嚢菌酵母的任何種，優選屬於酵母屬或其雜種，非常優選屬於釀酒酵母菌抹或其雜種。10.包括如權利要求2至7中任一項所述的表達系統的載體。11.包括如權利要求2至7中任一項所述的表達系統的質粒，其優選是pUC57。12.包括如權利要求10和11中任一項所述的載體的細菌，其優選是大腸桿菌。13.切除載體，其特徵在於，其選自多拷貝載體，優選pFL44s，並且其包括序列SEQIDNo.l2或與序列SEQIDNo.l2至少70。/。、優選800/。、非常優選90%同源的任何序列。14.產生天然*>柏醇和/或天然阿魏酸的方法，包括以下步驟a)將編碼香草醇氧化酶的基因的核苷酸序列克隆至如權利要求2至7中任一項所述的表達系統，b)用如此獲得的表達系統轉化酵母，c)在允許所述香草醇氧化酶表達的條件下培養所述酵母，d)使所述酵母與丁香酚接觸。15.如權利要求14所述的方法，包括在步驟b)之後且在步驟c)和步驟d)之前的以下步驟bl)、M)及b3):bl)用如權利要求13所述的切除載體轉化所述酵母，b2)在允許CRE酶表達的條件下培養所述酵母，b3)分離已丟失所述可選擇標誌物的酵母。16.如權利要求15所述的方法，其中按照所需的所述表達系統的拷貝數，將步驟b)、步驟bl)、步驟b2)及步驟b3)重複許多次。17.產生香草醛的方法，包括如權利要求14至16中任一項所述的步驟a)、b)、c)及d)，以及隨後的將步驟d)中產生的阿魏酸和/或松柏醇轉化為香草醛的步驟。18.如權利要求17所述的產生香草趁的方法，其中將步驟d)中產生的阿魏酸和/或松柏醇轉化為香草醛的步驟在酵母中進行，或利用生物化學方法或利用酶法進行。全文摘要包括至少一個編碼香草醇氧化酶的基因的酵母，所述基因的序列為序列SEQIDNo.1或與序列SEQIDNo.1至少70％、優選80％、非常優選90％同源的任何序列，以及產生松柏醇、阿魏酸和香草醛的方法。文檔編號C12N15/81GK101432429SQ200780015806公開日2009年5月13日申請日期2007年2月28日優先權日2006年3月1日發明者弗雷德裡克·內斯,法尼·安貝爾,米歇爾·艾格爾,約瑟夫·盧卡,讓·瑪奈申請人:瑪奈·菲爾薩公司