應用某些溶菌酶和糖苷內切酶的方法和組合物的製作方法

2023-05-07 16:42:11 3

專利名稱：應用某些溶菌酶和糖苷內切酶的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及應用反芻類胃溶菌酶和某些糖苷內切酶的抗微生物組合物和方法。更具體地說，本發明涉及某些抗微生物組合物和用這些抗微生物組合物處理以破壞或去除微生物的方法，這些組合物含有反芻類胃溶菌酶和β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶或糖肽內切酶。
溶菌酶是一種粘肽糖水解酶，它水解N-乙醯胞壁酸和N-乙醯葡糖胺之間的1，4-β連鍵，因而對某些微生物的細胞壁有破壞作用。市售的溶菌酶已應用於許多場合，例如潔牙劑、口香糖及接觸鏡片清洗劑等。
反芻類胃溶菌酶是有前腸的哺乳動物的胃黏膜所特有的一種溶菌酶。它顯然還沒有廣泛的商業用途。β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶已普通用作碳水化合物和糖蛋白結構研究的分析工具。我們發現，反芻類胃溶菌酶加上β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶和/或糖肽內切酶的抗微生物效果，比單獨用其中任何一種酶的抗微生物效果都要強。
作為抗微生物劑的混合液中採用溶菌酶已在牙用清洗液中受到注意(1982年10月19日授予Rabussay的美國專利4，355，022)。Rabussay公開了一種去除牙斑和牙結石的方法，包括塗用一種含有溶菌酶(0.1ml/mg)的溶液，同時還可視需要而塗用脂酶、磷脂酶、糖酶和/或蛋白酶。Rabussay還公開了一種含有該混合物的牙科治療劑。糖酶是一大類酶，糖苷內切酶就屬於這類酶。
1986年5月1日授予Neeser的澳大利亞專利8548514公開了一種含有糖肽(Ⅰ)和/或寡糖的抗菌組合物。其製備方法是，用一種蛋白水解酶消化植物來源的糖蛋白(A)，然後視需要用β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶H處理糖肽產物而將其轉化成寡糖。接著可用一種α-甘露糖苷外切酶消化產物，優先切割甘露糖殘基間的α1-2連鍵。分離出的糖肽(Ⅰ)據稱對具有Ⅰ型菌毛的病原菌(如大腸桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、鼠傷寒沙門氏菌或弗氏志賀氏菌)具有抗菌效果。
1987年2月26日公開的日本專利62044180公開了一種β-N-乙乙醯氨基葡糖苷內切酶(Ⅰ)，該酶能與糖蛋白中與天冬醯胺鍵接的糖的N，N′-二乙醯殼二糖結構反應，從而水解N-乙醯葡糖胺的β-4位鍵而從糖蛋白中分離出寡糖。該酶具有底物特異性，使得酶(Ⅰ)與高甘露糖型或鍵接天冬醯胺的混合型糖鏈反應，從而得到複雜的產物。該酶得自刀豆(Canavalia gladiata DC)，可用於研究糖蛋白中糖鏈部分的生物活性。但是通過糖苷內切酶的作用來增強反芻類胃溶菌酶的作用尚未述及。
與本專利申請同一天提交的三個共同未決的美國專利申請，描述了包括Ⅱ型糖苷內切酶的方法和配方，這一組酶中包括本發明的糖苷內切酶。第一個共同未決的專利申請題為「應用Ⅱ型糖苷內切酶的方法和配方」，其發明人為R.S.Carpenter、A.M.Wolff、P.J.Lad和I.J.Goldstein，該申請描述了用於除去含糖苷物質的Ⅱ型糖苷內切酶。第二個共同未決的專利申請題為「應用Ⅱ型糖苷內切酶的方法」，其發明人為R.S.Carpenter、A.M.Wolff和P.J.Lad，該申請描述了用於除去微生物的Ⅱ型糖苷內切酶。第三個共同未決的專利申請題為「應用Ⅱ型糖苷內切酶和抗微生物劑的抗微生物方法和配方」，其發明人為R.S.Carpenter、A.M.Wolff和P.J.Lad，該申請描述了Ⅱ型糖苷內切酶與抗微生物劑的混合物。本專利申請描述了將反芻類胃溶菌酶與β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶和/或糖肽內切酶混合而獲得的典型優點。
本發明提供某些抗微生物組合物，這些組合物中包含β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶和/或糖肽內切酶及反芻類胃溶菌酶。優選內切酶H.D或F和肽∶N-糖苷酶(PNG)F或A。特別優選的溶菌酶是通過基因工程在一種酵母(Piohia pastoris)中表達的牛溶菌酶。這些組合物最好含有去汙表面活性劑。本發明還包括通過用β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶和/或糖肽內切酶及反芻類胃溶菌酶處理破壞和/或去除微生物的方法。
本發明涉及反芻類胃溶菌酶與某些糖苷內切酶的混合物，這種混合物具有驚人的抗微生物效果。本發明還包括應用該混合物的抗微生物組合物和方法。
A.糖苷內切酶糖苷內切酶屬糖水解酶類，切割底物中的內糖苷鍵。這裡所用的糖苷內切酶來自目前已知的三組主要的糖苷內切酶中的兩組。此處優選第一組，即β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶，它特異於天冬醯胺(Asn)連接的寡糖鏈核心部分中的二-N-乙醯殼二糖部分(見Thotakura，NR等人，「糖蛋白的酶促去糖基化」，Methods in Enzymology，138∶350-359)。已知的β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶包括來自肺炎雙球菌的內切酶D、來自灰色鏈黴菌的內切酶H、來自腦膜膿毒性黃桿菌的內切酶F。內切酶H還已經在大腸桿菌(Robbins，PW等人，J.Biol.Chem.259∶7517，1984)和芽孢桿菌中克隆。
這裡所用的第二組酶是稱為N-糖苷酶或糖肽酶或肽N-糖苷酶的糖肽內切酶。這些酶水解N-乙醯氨基葡糖基天冬醯胺連鍵。PNG酶為糖肽內切酶。另一類糖肽內切酶，即肽O-糖苷酶(來自肺炎雙球菌的N-乙醯-α-D-氨基半乳糖苷內切酶)，切割N-乙醯氨基半乳糖基絲氨酸/蘇氨酸連鍵，它的底物特異性很窄，在這裡並不重要。
這裡所用的最有用的PNG酶是來自苦杏仁酶的PNG酶A和來自腦膜膿毒性黃桿菌的PNG酶F。這兩種酶最近才被分離出來並作了定性鑑定(見Methods in Enzymology，同上，138∶351)。
第三組主要的糖苷內切酶是來自肺炎雙球菌的β-N-半乳糖苷內切酶，它水解多聚(N-乙醯半乳糖胺)型寡糖輔基中的糖苷鍵(Methods in Enzymology，同上)。這些酶在這裡並不重要，糖苷外切酶也不重要，後者切割外糖苷鍵而非內糖苷鍵。
β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶和/或糖肽內切酶是本發明組合物的第一個組分。這裡優先選用內切酶H、內切酶D、內切酶F、PNG酶A和F。選用內切酶H、F和PNG酶F更優，內切酶H最優。
以下剛剛提到的各種糖苷內切酶的純品可以從市場上買到，但它們在過去多半是用於學術研究中。β-乙醯氨基葡糖苷內切酶曾用來確定糖蛋白中碳水化合物鏈的結構特點(Hughes，RC，The Glyooproteins，第24頁，1983)。迄今為止實際上一般都不能大量供應，因而尚未用於消費品中。
內切酶H、內切酶F、內切酶D和PNG酶F可以從Beohringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis，IN)得到。內切酶H的最適pH為5.0，它水解糖蛋白和糖肽，其糖基特異性很高，即要求四糖Manα1→3Manα1→6Manβ1→4GloNAo(非還原端的α-甘露糖殘基可在C-2位由其它糖取代)，這種糖基特異性比內切酶D要高。它水解組成為N-乙醯葡糖胺、N-乙醯氨基葡糖醇和GlcNAc並以Asn為配基的糖鏈，但不能作用於Fuoα1→6GloNAc和Fuoα1→6GloNAc→Asn的糖鏈」(Biochemica Information，1987，Boehringer Mannheim，「內切酶H」一節)。還可以買到由變鉛青鏈黴菌克隆的褶皺鏈黴菌內切酶H，其最適pH為5.0至7.5，其底物特異性與上述內切酶H相同。
內切酶D的最適pH為6.5，「它水解糖蛋白和糖肽，其糖基特異性很高，即要求三糖Manα1→3Manβ1→4GloNAo(非還原端的α-甘露糖殘基不可被其它糖取代);其糖苷配基特異性很寬，即水解與N-乙醯葡糖胺、Fuoα1→6GlcNAc、GlcNAc→Asn以及Fuoα1→6GlcNAc→Asn連接的糖鏈」(Biochemica Information，1987，Boehringer Mannheim，「內切酶D」一節)。
內切酶F的最適pH為5.0，「它切割殼二糖內的N-聚糖而在天冬醯胺上留下一個N-乙醯葡糖胺分子。它特異地切割『高甘露糖』型的N-聚糖。它還以低得多的速度切割某些『雜交的』和複合的雙分枝N-聚糖，但不切割複合的三分枝和四分枝N-聚糖」(Biochemica Information，1987，Boehringer Mannheim，「內切酶F」一節)。
也有與PNG酶F混合的內切酶F。對這一混合物來說，「酶活性是由pH控制的」。在pH4.0時，只有內切酶F活性「發揮作用，從卵清蛋白中釋放出八肽-GlcNAc和寡糖-GlcNAc。pH9.3時，主要由PNG酶F切割糖基胺鍵，釋放出八肽和寡糖-GlcNAc-GlcNAc。這個寡糖接著被內切酶F水解成寡糖-GlcNAc加GlcNAc」(Biochemica Information，1987，Boehringer Mannheim，「內切酶F」一節)。
PNG酶F的最適pH為5.0-7.0，它水解「多種類型的N-聚糖的天冬醯胺與碳水化合物部分之間的連鍵，前提是肽鍵中同時存在有氨基和羧基」(見Biochemica Information，1987，Boehringer Mannheim，「PNG酶F」一節)。
據Thotakura等人報導(Methods in Enzymology，138∶354-355)，內切酶H、內切酶F和PNG酶A的最適pH為4-5，而PNG酶F的最適pH約為8.5。他們述及檸檬酸能完全抑制PNG酶F的活性;非離子型去汙劑能穩定這些糖苷內切酶;PNG酶A和F具有相似的底物特異性，但PNG酶F的活性明顯較強。
內切酶H和內切酶F都切割高甘露糖型結構。內切酶F還能以較低的速度切割雙分枝複合結構，但不切割帶有分枝β-1，4-N-乙醯葡糖胺的寡糖鏈(Methods in Enzymology，138∶355)。
內切酶H和F的底物為
切割位點用箭頭示出。GlcNAc為N-乙醯葡糖醛酸。
據報導，內切酶H切割連接脂類的寡糖(Chalifour，R.J.等，Arohives of Biochemistry and Biophysics，229∶386-394，1983)和寡糖及糖蛋白中的二-N-乙醯殼二糖連鍵(Tarenton，A.L.等，J.Biol.Chem.249∶811-817，1974)。
PNG酶F的底物為
切割位點用箭頭示出。PNG酶F和A能切割高甘露糖結構或複雜的多分支寡糖鏈，包括三分枝和四分枝結構，除非這些結構位於氨基或羧基末端(Methods in Enzymology，138∶355)。PNG酶F要求至少一個二-N-乙醯殼二糖核(Laemmli，U.K.，Nature227∶680，1970)。
發生去糖基化作用所需的糖苷內切酶濃度及保溫時間取決於底物的類型。
最近證明，本發明的糖苷內切酶能除去含糖苷物質並破壞和/或除去各種表面上的微生物，特別是真菌，並給其它抗微生物劑帶來意外的好處。
糖苷內切酶是當前的一個研究課題，因此可以預計，將會發現並克隆出與上述酶具有相同或相似活性的新糖苷內切酶。與這裡所述的反芻類胃溶菌酶一起起作用的糖苷內切酶打算包括在本發明內。
B.反芻類胃溶菌酶本發明組合物中的第二個組分是來自反芻類的胃溶菌酶，包括牛溶菌酶。反芻類動物是一種有瘤胃(前腸)的反芻食團的哺乳動物。前腸起無氧發酵室的作用，其中有一些消化纖維素的微生物(Vaughan，T.A.，Mammalogy，第二版，WB Saunders Co.，Philadelphia，1978)。這些微生物中有許多進入胃而在胃中被消化。有一種以高水平存在於反芻類胃黏膜中的特殊類型的酶是溶菌酶C，它能幫助消化這些微生物(Dobson，DE等，「反芻類的胃溶菌酶」，J.Biol.Chem.，259∶11607-11625，1984，該文獻列入本文)。溶菌酶C對胃蛋白酶的失活作用具有不尋常的耐受性，而且據說與其它非反芻類溶菌酶相比它能在更低的PH下起作用(J.Biol.Chem.，259∶11607，11617)。有證據表明，這些反芻類胃溶菌酶C與通常的哺乳動物溶菌酶C明顯不同，這可能是在特化的反芻類胃環境中演化的結果(J.Biol.Chem.，259∶11608)。
在這裡優先使用反芻類胃溶菌酶C。選用從母牛胃黏膜中分離出的三種密切相關的溶菌酶C(1、2和3)更優(J.Biol.Chem.，259∶11619-11625，包括補充材料，該文獻併入本文)。這些溶菌酶C與已知胺基酸組成的溶菌酶C有相似之處，即有8個半胱氨酸殘基，色氨酸比例高，但這些溶菌酶C的精氨酸含量低，這與其它已知溶菌酶C不同(J.Biol.Chem.，259∶11625及補充材料)。這三種密切相關的母牛胃溶菌酶C中，有一種稱為C2的酶已測定了其129個胺基酸的胺基酸順序。它的39-60位胺基酸殘基與其它已知的溶菌酶C不同，其中包括缺失一個胺基酸(J.Biol.Chem.，259∶11617)。在這三種母牛胃溶菌酶中，以母牛胃溶菌酶C2最優。母牛或一般牛溶菌酶C2的分子量為14，398(J.Biol.Chem.，259∶11626及補充材料)。
牛胃溶菌酶C2比雞卵清溶菌酶對蛋白酶的耐受性更高，並具有更接近酸性的狹窄PH範圍(J.Biol.Chem.，25911607)。牛(母牛胃)溶菌酶目前雖然尚未廣泛商業化使用，但已被建議作為酸性pH下的抗菌劑或作為動物飼料添加劑(Digan，ME等，「通過由酵母Piohia pastoris分泌而連續生產一種新的溶菌酶」，Biotechnology，7∶160-164，1989，該文獻列入本文)。
最近，牛溶菌酶C2已借基因工程在酵母Pichia pastoris中表達。加利福尼亞州LaJolla的一家公司(Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates，Inc.)通過遺傳工程製備這種酶，作法是克隆牛溶菌酶C2的cDNA，並通過用其固有的信號順序在Pichia pastoris中進行分泌而表達其蛋白產物(Biotechhology，7∶160)。據說重組產物的生物活性得到了保留，並預計會生產出成本低的大批量產物(Biotechnology，7∶160，163)。
重組牛溶菌酶，特別是來自酵母Pichia pastoris的重組牛溶菌酶，在這裡最優先被選用。由Pichia pastoris基因工程生產的牛溶菌酶C2應用特別廣泛，因為它對表面活性劑穩定。本發明還考慮到可能被發現和/或克隆的其它反芻類胃溶菌酶，只要它們在與β-N-乙醯氨基糖苷內切酶或糖肽內切酶混合時能帶來好處。
據說革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌對溶菌酶的作用更敏感。金黃色葡萄球菌雖然是一種革蘭氏陽性菌，但它對溶菌酶較不敏感，這可能是因為它的細胞壁糖肽中有不同的糖類(Davis等，《微生物學和免疫學原理》，Harper Row，New York，118-119頁，1968)。在本發明中，β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶和/或糖肽內切酶(優選內切酶H)與反芻類胃溶菌酶(優選來自Pichia pastoris的重組牛溶菌酶的混合物確能嚴重破壞金黃色葡萄球菌(見實施例)。此外，上述混合物意外地顯著減少大腸桿菌(一種普通的革蘭氏陰性菌)菌落，而這些酶單獨存在時沒有這種作用。甚至對革蘭氏陽性菌表皮葡萄球菌，單獨的溶菌酶或內切酶H有不利影響，這兩種酶的混合物比任何一種酶單獨用的不利影響都更強。除細菌外，本發明的組合物還對真菌和酵母有效，但相信這與糖苷內切酶尤其是內切酶H的作用有關，而不僅僅是由於糖苷內切酶與溶菌酶的混合物的作用。
C.組合物本發明包括含有反芻類胃溶菌酶、β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶和/或糖肽內切酶的抗微生物組合物。優先選用反芻類胃溶菌酶C和下列酶中的一種或多種內切酶H、內切酶F、內切酶D、PNG酶A、PNG酶F。以牛溶菌酶C2和內切酶H或PNG酶F更優。來自Pichia pastoris的重組牛溶菌酶和內切酶H最優。
反芻類胃溶菌酶與β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶或糖肽內切酶的重量比約以1∶4至4∶1為好，約以2∶1至1∶2更好。對內切酶H和來自Pichia pastoris的牛溶菌酶來說，最優的比例是1∶1。
這裡優選的組合物含有約1-1000ppm(優選約50-400ppm)的反芻類胃溶菌酶和約1-1200ppm(優選約50-400ppm)的β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶或糖肽內切酶。這裡最優選的組合物含有約80-150ppm內切酶H和約80-150ppm重組牛溶菌酶。
這裡的抗微生物組合物的形式優選漱口劑、託牙清洗劑、潔牙劑、洗衣去汙劑、防腐劑、液體皂、接觸鏡片清洗劑或皮膚清洗劑。這些將在下面更詳細地敘述。這些組合物的形式更優選的是託牙清洗劑、潔牙劑、漱口劑、防腐劑、液體皂或洗衣去汙劑，最優選的是洗衣去汙劑，特別是重垢型液體洗衣去汙劑。
這裡的抗微生物組合物最好含有約0.1-60%(重量)的去汙表面活性劑。去汙表面活性劑可為陰離子型、非離子型、陽離子型、兩性型和/或兩性離子型表面活性劑，優選非離子型和/或陰離子型表面活性劑。最優選的是非離子型表面活性劑。
本發明的組合物可以配製成洗衣去汙劑，如美國專利4，507，219、4，318，818、4，605，509和4，412，934所公開的洗衣去汙劑;硬表面清洗劑，如美國專利4，414，128、3，679，608、3，985，668和4，005，027所公開的硬表面清洗劑;條皂，如美國專利3，993，772和3，070，574所公開的條皂;洗髮劑，例如美國專利4，345，080、4，704，272和4，741，855所公開的洗髮劑;抗痤瘡產品，如美國專利4，318，907和4，608，370所公開的產品;口服組合物，如美國專利4，684，518所公開的口服組合物。這些專利在此列為參考。
如果抗微生物組合物是一種優選的漱口劑、託牙清洗劑或潔牙劑，它最好含有內切酶H或PNG酶F和牛溶菌酶C2各1-150ppm。這同樣適用於抗微生物組合物為接觸鏡片清洗劑的情形。
如果抗微生物組合物是一種液態或顆粒狀洗衣去汙劑，它最好含有內切酶H和重組牛溶菌酶C2各約2-250ppm，以及1-90%(重量)的去汙表面活性劑，該表面活性劑選自陰離子型、非離子型、陽離子型、兩性型和兩性離子型表面活性劑。優選的洗衣去汙劑組合物中優選含有約5-50%(重量)的上述去汙表面活性劑，最優選的是含有10-40%(重量)。
可用於這裡的去汙劑組合物的表面活性劑，包括熟知的陰離子型、非離子型、陽離子型、兩性型和兩性離子型合成表面活性劑。其中典型的有烷基苯磺酸鹽、烷基硫酸鹽和烷基醚硫酸鹽、石蠟磺酸鹽、烯烴磺酸鹽、烷氧基化的(尤其是乙氧基化的)醇類和烷基酚類、氧化胺、脂肪酸和脂肪酸酯的α-磺酸鹽、烷基內銨鹽等，這些都是去汙劑領域內熟知的。這些去汙表面活性劑一般含有C9-C18範圍的烷基。陰離子型去汙表面活性劑可以以其鈉鹽、鉀鹽或三乙醇銨鹽的形式使用;非離子型則一般含有約5-17個氧化乙烯基團。含有約0-4個氧化乙烯單位的C11-C16烷基苯磺酸鹽、C12-C13石蠟磺酸鹽和C10-C16烷基硫酸鹽，在本類型的組合物中是特別優選的。
適用於這裡的組合物的表面活性劑的詳細目錄可在1976年2月3日授予Baskerville的美國專利3，936，537中查找，該專利在此列為參考。這些表面活性劑的商業來源可在McCutcheon的《乳化劑和去汙劑》一書中查找(North American Edition，1984，McCutcheon Division，MC Publishing Company)，這本書也在此列為參考。
可用於去汙劑組合物的助洗劑包括任何常規的無機和有機水溶性鹽類助洗劑，以及各種水溶性的所謂「接種」助洗劑。本發明的洗衣去汙劑組合物的助洗劑含量，按重量計優選為約1-75%，更優選的是約5-40%，最優選的是約10-20%。
適用的水溶性無機鹼性鹽類助洗劑的非限制性實例包括鹼金屬碳酸鹽、硼酸鹽、磷酸鹽、多磷酸鹽、三聚磷酸鹽、碳酸氫鹽、矽酸鹽、硫酸鹽。這類鹽的具體實例包括鈉和鉀的四硼酸鹽、碳酸氫鹽、碳酸鹽、三聚磷酸鹽、焦磷酸鹽、六偏磷酸鹽。
適用的有機鹼性鹽類助洗劑的實例有(1)水溶性氨基多乙酸鹽，例如鈉和鉀的乙二胺四乙酸鹽、次氮基三乙酸鹽、N-(2-羥乙基)次氮基二乙酸鹽;(2)肌醇六磷酸的水溶性鹽，如肌醇六磷酸的鈉鹽和鉀鹽;(3)水溶性多膦酸鹽，包括乙烷-1-羥基-1，1-二膦酸的鈉鹽、鉀鹽和鋰鹽以及亞甲基二磷酸的鈉鹽、鉀鹽和鋰鹽，等等。
接種助洗劑包括象用碳酸鈣或硫酸鋇接種的碳酸鈉或矽酸鈉這樣一些物質。粒度小於約5微米的水合鈉沸石A特別理想。
適用助洗劑的詳細目錄可在美國專利3，936，537中查找，該專利在此列為參考。優選的助洗劑為脂肪酸、多碳酸鹽、多磷酸鹽以及它們的混合物。
酌情使用的去汙劑組合物組分包括酶類(如蛋白酶和澱粉酶)、過氧化物漂白劑和漂白劑激活劑、滷素漂白劑(如二氯異氰脲酸的鈉鹽和鉀鹽)、汙垢釋出劑(如甲基纖維素)、汙垢懸浮劑(如羧甲基纖維素鈉)、織物增亮劑、酶穩定劑、色斑、增泡劑或抑泡劑、防腐蝕劑、染料、填料、殺菌劑、pH調節劑、非助洗劑鹼性源等。
抗微生物組合物還可以是一種防腐劑，例如洗髮劑或化妝品(如面霜)或食品或飲料中的防腐劑。它最好以牛溶菌酶C2和內切酶H(優選)或PNG酶F各約50-400ppm的量用於化妝品或洗髮劑。
本發明的組合物可以是洗髮劑的形式。這些洗髮劑一般含有約5-60%(重量)的合成表面活性劑，其餘為水。適用的表面活性劑包括月桂基硫酸銨、勞瑞基(laureth)硫酸銨、月桂基硫酸三乙胺鹽、月桂基硫酸三乙醇胺鹽、勞瑞基硫酸三乙醇胺鹽、月桂基硫酸單乙醇胺鹽、勞瑞基硫酸單乙醇胺鹽、月桂基硫酸二乙醇胺鹽、勞瑞基硫酸二乙醇胺鹽、甘油單月桂酸酯硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、勞瑞基硫酸鈉、月桂基硫酸鉀、勞瑞基硫酸鉀、月桂基肌氨酸、可可基(cocoyl)肌氨酸、可可基硫酸銨、月桂醯硫酸銨、可可基硫酸鈉、月桂醯硫酸鈉、可可基硫酸鉀、月桂醯硫酸鉀、月桂醯硫酸三乙胺鹽、月桂醯硫酸三乙醇胺鹽、可可基硫酸單乙醇胺鹽、月桂醯硫酸單乙醇胺鹽、十三烷基苯磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉。
這些洗髮劑可以含有各種酌情添加的組分。這些常規的組分是本領域專業人員熟知的，例如防腐劑，如苄醇、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和咪唑烷基脲;陽離子型表面活性劑，如十六烷基三甲基氯化銨、月桂基三甲基氯化銨、三(十六烷基)甲基氯化銨、十八烷基二甲基苄基氯化銨、二(部分氫化脂)二甲基氯化銨;增稠劑和粘度調節劑，如長鏈脂肪酸的二乙醇醯胺(如PRG 3 月桂醯胺)、環氧乙烷與環氧丙烷的嵌段共聚物、氯化鈉、硫酸鈉、聚乙烯醇、乙醇及水溶性聚合物(如咕噸膠、羥乙基纖維素、古爾膠和澱粉);pH調節劑，如檸檬酸、琥珀酸、磷酸、氫氧化鈉、碳酸鈉;香料;染料;和/或螯合劑，如乙二胺四乙酸二鈉。這些試劑各自的用量按組合物重量計一般約為0.01-10%，優選約0.5-5.0%。
如果抗微生物組合物是一種液體洗手皂，則它含有內切酶H或PNG酶F和牛溶菌酶C2各約50-400ppm，以及約10-40%(重量)的去汙表面活性劑(如前面對去汙劑組合物所述)。
抗微生物組合物可以是一種皮膚清洗劑，其中最好含有內切酶H和來自Pichia pastoris的重組牛溶菌酶各約80-150ppm。
不應使用與這些酶不相容的其它成分。這些組合物的PH優選為5-8，更優選為5.5-7，最優選的是6.5-7.5。這些酶應當以不致失活的方式加到組合物中。
D.方法破壞或除去微生物的方法與抗微生物組合物一起包括在本發明中。這些方法包括用反芻類胃溶菌酶和β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶和/或糖肽內切酶處理，最好是施用含有這些酶的組合物。優選反芻類胃溶菌酶C和選自內切酶H、內切酶F、內切酶D、PNG酶A和PNG酶F的糖苷內切酶。處理組合物最好含有牛溶菌酶C2及內切酶H和/或PNG酶F。最優選的是來自Pichia pastoris的重組牛溶菌酶和內切酶H。優選的處理方法包括施用一種組合物，該組合物中含有內切酶H和/或PNG酶F以及來自Pichia pastoris的重組牛溶菌酶。
這些酶應以足以產生抗微生物效果的濃度使用。該處理中糖苷內切酶或溶菌酶的量通常少於該酶單獨使用時產生同樣抗微生物效果所需的量。雖然不想受理論的束縛，但據信這兩種類型的酶之間有某種協同作用，即，這裡的糖苷內切酶和溶菌酶，特別是內切酶H和重組牛溶菌酶C2的效果，比這二者效果的加和要強。
本方法優選用於破壞或除去細菌，最優選革蘭氏陽性菌。該方法最好採用一組合物，其中含有約1-1200ppm(優選約50-400ppm)β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶或糖肽內切酶(最優選的是內切酶H)、以及約1-1000ppm(優選約50-400ppm)反芻類胃溶菌酶C(最優選的是來自Pichia pastoris的重組牛溶菌酶)。預計本方法也對真菌和酵母有效，但這可能是由於內切酶H的作用而不是與溶菌酶的混合物的作用。
反芻類胃溶菌酶與β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶/糖肽內切酶的比例約為1∶4至4∶1，優選約1∶2至2∶1，最優選的是約1∶1。
本方法(和組合物)最優選的是用於破壞金黃色葡萄球菌和/或大腸桿菌，並且最好是用一種組合物，其中含有內切酶H和重組牛溶菌酶各約50-400ppm，最優選的是約100-150ppm。
該方法最好是用含有反芻類胃溶菌酶和β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶和/或糖肽內切酶的組合物洗滌或衝洗含微生物的表面。根據表面的類型和所採用的處理方法，可以接著用水衝洗或用手象用布一樣擦拭。帶微生物的表面可以是例如牙齒或託牙、口腔、織物、皮膚或接觸鏡片。組合物優選為漱口劑、託牙清洗劑、潔牙劑、洗衣去汙劑、防腐劑、接觸鏡片清洗劑、液體皂或皮膚清洗劑(見上)，更優選的是託牙清洗劑、漱口劑、防腐劑、液體皂或洗衣去汙劑，最優選的是洗衣去汙劑、特別是液體重垢洗衣去汙劑。該組合物的去汙表面活性劑含量優選為約1-90%(重量)，更優選的是約5-50%，最優選的是10-40%。該表面活性劑選自陰離子型、非離子型、陽離子型、兩性型和兩性離子型表面活性劑，優選陰離子型和/或非離子型表面活性劑。該方法應以不使酶失活的方式進行。
這裡的組合物還可以定期用於除去或防止微生物生長，例如每天使用這裡的漱口劑組合物。可能較為理想的是，使這裡的抗微生物組合物在施用後在所處理的部位停留一定的時間，例如用這裡的漱口劑組合物衝洗30秒。
下列實施例說明本發明的組合物和方法。這些實施例不應誤認為是對本發明範圍的限制。所有份數、百分比和比例均按重量計，除非另外指出。
實施例1牛溶菌酶和內切酶H對大腸桿菌的效果從已培養4小時的大腸桿菌液體培養物中取幾個樣品，用下列試劑處理2小時1)0.2M檸檬酸鈉緩衝液(pH7.0);
2)0.2M檸檬酸鈉緩衝液(pH7.0)加牛溶菌酶和內切酶H(pH7.0)各200ppm;
3)＃1加200ppm牛溶菌酶(pH7.0);
4)＃1加200ppm內切酶H(pH5.5)。
牛溶菌酶為來自Pichia pastoris的重組牛溶菌酶。據信這種牛溶菌酶單獨存在或與內切酶H混合時起作用的最適PH為7.0。內切酶H為來自大腸桿菌的重組內切酶H。據信內切酶H單獨存在而起作用時的最適PH為5.5。
取連續稀釋的處理樣品鋪平板，於37℃下保溫過夜，然後計數菌落。
這些處理的最終菌落計數如下
1)單獨緩衝液 1.5×106個菌落2)牛溶菌酶/內切酶H 5.2×104個菌落3)單獨牛溶菌酶 1.8×106個菌落4)單獨內切酶H 1.2×106個菌落將＃2中的牛溶菌酶和內切酶H各變為100ppm重複上述實驗。
1)0.2M檸檬酸鈉緩衝液(pH7.0);
2)0.2M檸檬酸鈉緩衝液(pH7.0)加牛溶菌酶和內切酶H(pH7.0)各100ppm;
3)＃1加200ppm牛溶菌酶(pH7.0);
4)＃1加200ppm內切酶H(pH5.5)。
這些處理的最終菌落計數如下1)單獨緩衝液 0.3×106個菌落2)牛溶菌酶/內切酶H 3.8×103個菌落3)單獨牛溶菌酶 6.6×105個菌落4)單獨內切酶H 8.7×105個菌落總之，牛溶菌酶和內切酶H對大腸桿菌的效果比單獨的牛溶菌酶或單獨的內切酶H都顯著增強。該混合物比單獨的任一種酶或緩衝液使細菌減少二至三個數量級。該混合物在不同的保溫時間(如30分至7小時)都顯示效果。
實施例2牛溶菌酶和內切酶H對表皮葡萄球菌的效果從已培養4小時的表皮葡萄球菌液體培養物中取幾個樣品，用下列試劑處理6小時
1)0.2M檸檬酸鈉緩衝液(pH7.0);
2)0.2M檸檬酸鈉緩衝液(pH7.0)加牛溶菌酶和內切酶H(pH7.0)各100ppm;
3)＃1加100ppm牛溶菌酶(pH7.0);
4)＃1加100ppm內切酶H(pH5.5)。
牛溶菌酶為來自Pichia pastoris的重組牛溶菌酶。據信這種牛溶菌酶單獨存在或與內切酶H混合時起作用的最適pH為7.0。內切酶H為來自大腸桿菌的重組內切酶H。據信內切酶H單獨存在而起作用時的最適pH為5.5。
取連續稀釋的處理樣品鋪平板，於37℃下保溫過夜，然後計數菌落。
這些處理的最終菌落計數如下1)單獨緩衝液 1.1×105個菌落2)牛溶菌酶/內切酶H 5.8×103個菌落3)單獨牛溶菌酶 1.0×104個菌落4)單獨內切酶H 3.9×104個菌落總之，牛溶菌酶和內切酶H(各100ppm)對表皮葡萄球菌的效果比單獨的牛溶菌酶(100ppm)或單獨的內切酶H(100ppm)都顯著增強。該混合物還在不同的保溫時間(如30分至7小時)都顯示效果。
實施例3內切酶H/牛溶菌酶對金黃色葡萄球菌形態的影響將已培養4小時的金黃色葡萄球菌(ATCC＃6341)液體培養物分開，用下列活性物質在37℃下處理2小時1)0.2M檸檬酸鈉緩衝液(pH7.0);
2)＃1加200ppm牛溶菌酶和200ppm內切酶H(pH7.0);
3)＃1加400ppm牛溶菌酶(pH7.0);
4)＃1加400ppm內切酶H(pH7.0)。
處理後，把這些樣品放在塗有聚乙烯醇縮甲醛樹脂的銅網上，用透射電子顯微鏡檢查。顯微照片表明，緩衝液對照和任一種單獨的酶都沒有破壞金黃色葡萄球菌。但當這兩種酶混合後，經過處理的微生物嚴重凝聚和/或被破壞。
實施例4牛溶菌酶/內切酶H相對其它溶菌酶/內切酶H的效果將大腸桿菌(083K.H.81)的對數期培養物分開，用不同的溶菌酶/內切酶H混合物於37℃下處理2和4小時。
處理結束後，從每個樣品各取若干等份試樣連續稀釋到磷酸緩衝鹽水中，並鋪在胰酶解酪蛋白大豆瓊脂上。將培養皿在37℃下保溫過夜，並計算菌落數。
結果處理 時間 菌落計數a)0.2M檸檬酸鈉緩衝液(pH7.0) 2小時 1.8×106b)0.2M檸檬酸鈉緩衝液+200ppm 2小時 1.9×106牛溶菌酶(pH7.0)c)0.2M檸檬酸鈉緩衝液+200ppm 2小時 2.3×103
牛溶菌酶+200ppm內切酶H(pH7.0)d)0.2M檸檬酸鈉緩衝液+200ppm 2小時 2.6×106變溶菌素+200ppm內切酶H(pH7.0)e)0.2M檸檬酸鈉緩衝液+200ppm 2小時 1.0×106雞卵清溶菌酶+200ppm內切酶H(pH7.0)f)0.2M檸檬酸鈉緩衝液(pH7.0) 4小時 1.5×106g)0.2M檸檬酸鈉緩衝液+200ppm 4小時 1.8×106牛溶菌酶(pH7.0)h)0.2M檸檬酸鈉緩衝液+200ppm 4小時 5.2×106牛溶菌酶+200ppm內切酶H(pH7.0)i)0.2M檸檬酸鈉緩衝液+200ppm 4小時 2.5×106變溶菌素+200內切酶H(pH7.0)j)0.2M檸檬鈉緩衝液+200ppm 4小時 1.0×106雞卵清溶菌酶+200ppm內切酶H(pH7.0)這些結果表明，牛溶菌酶和內切酶H的混合物使細菌明顯減少。這種減少遠遠大於任何一種所試驗的其它溶菌酶/內切酶H混合物。
將對照濃度加倍，例如單獨用400ppm的各種溶菌酶，重複該實驗，這時牛溶菌酶和內切酶H的混合物仍使細菌減少。
實施例5含有內切酶H和牛溶菌酶的洗衣去汙劑本發明的液體重垢洗衣去汙劑組合物如下
組分 活性物重量%C13直鏈烷基苯磺酸 8.0聚乙氧基化(2.25)C14-15烷基磺酸 12.01，2-丙二醇 3.5二亞乙基三胺五乙酸鈉 0.3單乙醇胺 2.0聚乙氧基化(6.5)C12-13醇 5.0乙醇 8.5氫氧化鈉 3.85氫氧化鉀 1.8C12-14脂肪酸 10.0檸檬酸 4.0甲酸鈣 0.12C12烷基三甲基氯化銨 0.5四亞乙基五胺乙氧化物(15-18) 2.0水 37.12染料 0.08香料 0.25蛋白酶＊ 0.125內切酶H 125ppm牛溶菌酶＊＊ 125ppm＊mg活性酶/g(34mg活性酶/g貯液)＊＊4.0單位/微克±25%將以上列出的各成分加到帶有單一攪拌器的混合罐中。在加入酶、染料和香料之前調節混合物的pH，使10%(重量)水溶液在20℃下的pH為～8.5。
該組合物在生產出之後立即進行測試時，能除去和防止衣物汙垢中所帶的微生物，特別是細菌。這種去除和防止作用比不含內切酶H/牛溶菌酶的液體重垢去汙劑要好。
實施例6含防腐劑的洗髮劑組分 含量烷基硫酸銨(29%水溶液) 55.25%美國專利4，345，080實施例1的萬畝定鋅晶體 2.0椰子單乙醇醯胺 3.0乙二醇二硬脂酸酯 5.0檸檬酸鈉 0.5檸檬酸 0.2顏料溶液 0.1香料 0.5內切酶H 100ppm牛溶菌酶＊＊ 100ppm二羥甲基二甲基乙內醯脲 0.05%水 加至100%＊＊4.0單位/微克±25%這種去頭屑洗髮劑組合物保持無細菌或真菌汙染的程度和時間比不含內切酶H/牛溶菌酶的配方更高、更長。
實施例7液體皂本發明的一種液體皂組合物如下組分 活性物重量%月桂基硫酸銨 6.0烷基肌氨酸鈉 5.7可可醯胺基丙基內銨鹽 6.3椰子脂肪酸 1.0乙二胺四乙酸 0.2硫酸銨 0.4香料 0.25染料 5ppm水 80.15內切酶H 50ppm牛溶菌酶＊＊ 50ppm＊＊4.0單位/微克±25%將以上列出的各成分以上列順序加入帶有單一攪拌器的混合罐中。在加入酶、染料和香料前，調整混合物的pH使10%(重量)水溶液在20℃下的pH為約6.5。
這種組合物產生去除普通皮膚菌叢的抗微生物作用。
實施例8片狀託牙清洗劑在60-65℃下，分別將以下物質在熱空氣床中流化30分鐘製成顆粒碳酸氫鈉、過硼酸鈉單水合物、酒石酸、三聚磷酸鈉、氨基磺酸、聚乙二醇(20M)和乙二胺四乙酸。然後把這些顆粒與其它成分轉鼓混合，制出「第一層」混合物和「第二層」混合物，其中「第一層」混合物的組成如下重量%碳酸氫鈉 30.00酒石酸 23.00單過硫酸鉀 16.00氨基磺酸 11.00焦磷酸二鈉 8.20碳酸鈉 3.90聚乙二醇(20M) 2.60硫酸鈉 2.00薄荷粉 1.50二氧化矽 1.30十二烷基苯磺酸鈉 0.50「第二層」混合物的組成如下重量%過硼酸鈉單水合物 30.00單過硫酸鉀 28.00碳酸氫鈉 13.34三聚磷酸鈉 10.00碳酸氫鈉/顏料 4.00氨羧配合劑B 3.00碳酸鈉 3.00
聚乙二醇(20M) 2.50二氧化矽 2.00薄荷粉 1.50Wasag酯 1.40硬化甘油三酯 0.50十二烷基苯磺酸鈉 0.40琥珀酸鹽去汙劑 0.30染料 0.06內切酶H 100ppm牛溶菌酶＊＊ 100ppm＊＊4.0單位/微克±25%在39衝HORN旋轉壓片機中壓製成片劑。壓制過程分兩步進行。先將「第二層」藍色混合物用填充法壓至很低的壓力(每片10千牛)。然後將「第一層」白色混合物灌入並壓至每片70千牛。這樣製得一個4克的片劑，其中含有2.7克藍色混合物和1.3克白色混合物。
片劑由消費者溶於水中，把託牙放入含有該託牙清洗劑的水中進行清洗，然後衝洗。
對上述優選實施方案所作的對本領域普通技術人員來說顯而易見的修改，將屬本發明的範圍之內。
權利要求
1.一種抗微生物組合物，其特徵在於，它包含反芻類胃溶菌酶和β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶或糖肽內切酶。
2.權利要求1的抗微生物組合物，其中所述反芻類胃溶菌酶是一種或多種反芻類胃溶菌酶C。
3.權利要求2的抗微生物組合物，其中所述β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶為內切酶F、內切酶D或內切酶H，所述糖肽內切酶為PNG酶F或PNG酶A。
4.權利要求3的抗微生物組合物，其中反芻類胃溶菌酶C與β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶或糖肽內切酶的比例約為1∶4至4∶1。
5.權利要求3的抗微生物組合物，它包含約1-1000ppm所述反芻類胃溶菌酶C和約1-1200ppm β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶或糖肽內切酶。
6.權利要求5的抗微生物組合物，它包含牛溶菌酶C2和內切酶H或PNG酶F。
7.權利要求6的抗微生物組合物，它包含約50-400ppm所述牛溶菌酶和50-400ppm所述內切酶H或PNG酶F。
8.權利要求7的抗微生物組合物，它包含重組牛溶菌酶C2和內切酶H。
9.權利要求8的抗微生物組合物，其中所述重組牛溶菌酶與內切酶H的比例約為2∶1至1∶2。
10.權利要求9的抗微生物組合物，它包含內切酶H和所述來自Pichia pastoris的重組牛溶菌酶各約80-150ppm。
11.權利要求5的抗微生物組合物，其中所述組合物選自漱口劑、託牙清洗劑、潔牙劑、洗衣去汙劑、防腐劑、接觸鏡片清洗劑、液體皂、皮膚清洗劑。
12.權利要求5的抗微生物組合物，它還包含約1-90%(重量)去汙表面活性劑，該表面活性劑選自陰離子型、非離子型、陽離子型、兩性型和兩性離子型表面活性劑。
13.權利要求6的抗微生物組合物，其中所述組合物為漱口劑、託牙清洗劑或潔牙劑，其中包含約1-150ppm內切酶H或PNG酶F和約1-150ppm牛溶菌酶C2。
14.權利要求8的抗微生物組合物，其中所述組合物為液體或顆粒狀洗衣去汙劑，其中包含內切酶H和重組牛溶菌酶C2各約2-250ppm，以及約5-50%(重量)去汙表面活性劑，該表面活性劑選自陰離子型、非離子型、陽離子型、兩性型和兩性離子型表面活性劑。
15.權利要求7的抗微生物組合物，其中所述組合物為洗髮劑或化妝品用的防腐劑。
16.權利要求7的抗微生物組合物，其中所述組合物為液體洗手皂，其中還包含約10-40%(重量)去汙表面活性劑，該表面活性劑選自陰離子型、非離子型、陽離子型、兩性型和兩性離子型表面活性劑。
17.權利要求10的抗微生物組合物，其中所述組合物為皮膚清洗劑。
18.一種破壞或去除微生物的方法，其特徵在於，用反芻類胃溶菌酶和β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶或糖肽內切酶處理。
19.權利要求18的方法，其中所述處理包括施用一種組合物，該組合物包含反芻類胃溶菌酶C和一種選自內切酶H、內切酶F、內切酶D、PNG酶A和PNG酶F的糖苷內切酶。
20.權利要求19的方法，其中所述反芻類胃溶菌酶C與糖苷內切酶在所述組合物中的比例約為1∶4至4∶1。
21.權利要求20的方法，其中所述組合物包含牛溶菌酶C2和內切酶H或PNG酶F。
22.權利要求21的方法，其中所述組合物包含內切酶H或PNG酶F以及來自Pichia pastoris的重組牛溶菌酶。
23.權利要求22的方法，它用於破壞或去除細菌，其中所述組合物包含約1-1200ppm內切酶H和約1-1000ppm所述重組牛溶菌酶。
24.權利要求23的方法，它用於破壞或去除金黃色葡萄球菌或大腸桿菌，其中所述組合物包含約50-400ppm所述重組牛溶菌酶和內切酶H。
25.權利要求23的方法，其中所述重組牛溶菌酶與內切酶H在所述組合物中的比例為約1∶2至2∶1。
26.權利要求25的方法，其中所述組合物包含內切酶H和所述重組牛溶菌酶各約100-150ppm。
全文摘要
提出了一種含有β-N-乙醯氨基葡糖苷內切酶和/或糖肽內切酶及反芻類胃溶菌酶的抗微生物組合物。還提出了一種通過用這些酶處理來破壞或去除微生物的方法。
文檔編號A61K8/00GK1051299SQ9010869
公開日1991年5月15日 申請日期1990年10月27日 優先權日1989年10月27日
發明者理察·謝潑德·卡彭特, 安·瑪格麗特·沃爾夫 申請人:普羅格特-甘布爾公司