用於微生物快速生長和檢測的組合物和方法

2023-05-07 17:29:56 2

專利名稱：用於微生物快速生長和檢測的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及用於在待測樣本中，檢測採自微生物尤其致病微生物的特定物質的方法。本發明還涉及用於該微生物快速生長使得與當前的方法相比，明顯早地檢測成為可能的組合物和方法。
背景技術：
由於食物產品從本質上是生物的，其能夠支持多種微生物的生長。根據統計，在美國每年發生七千六百萬例食源性疾病，在醫療護理和生產力降低方面花費六十五億到349 億美元的(Buzby和Roberts，1997 ；Mead等人，1999)。據統計在歐洲沙門氏菌屬的經濟和衛生服務的花費在六億兩千萬到三十億歐元之間(David Byrne, European Commissioner for health and consumer protection，2000)。沙門氏菌屬，屬，彎曲桿菌屬，大腸桿菌0157:H7以及志賀氏菌屬是形成大多數食源性疾病案例的原因。例如，沙門氏菌屬和李斯特菌屬單獨地對分別為31%和的食物相關的死亡負責(Mead等人1999)，而在日本，在1981年到1995年之間，沙門氏菌病佔總的食源性疾病爆發的14%以上(Lee等人，2001)。實際上，根據估計細菌是多達60%的需要住院的食源性疾病的病例的病因。因此，對微生物汙染產品的低效率的及慢速的檢測造成的延遲是造成浪費的最大因素之一。按照當前的檢測方法，生產商必須為微生物繁殖結果等待三到七天。該延遲所產生的成本是顯著的——降低了供應鏈的效率，佔用庫存並且增加損壞。不適當的或者不完善的檢測的成本可能是昂貴的，如果不會帶來更多問題的話。 例如，1999年Sara Lee在其食物被認為與李斯特氏菌屬爆發有關之後，與其BiI Mar Foods 單位的三千五百萬磅熱狗和熟肉的召回有關的花費估計有七千六百萬美元。根據《The Scotsman)), 2006年Cadbury Schweppes在為沙門氏菌屬汙染巧克力的召回成本，廣告，損失的收入以及隨後對其生產操作的改進花費了估計有兩千萬英鎊。更近的在2009年，美國花生公司，作為2008年經營收入估計有兩千五百萬美元的公司，在被確認是美國花生中一次較大的沙門氏菌爆發的源頭之後，遞交了破產請求。因此，在食物、飼料和環境樣品中檢測致病性微生物如沙門氏菌屬，志賀氏菌屬和李斯特氏菌屬的存在具有重大的經濟意義。然而，用於該微生物檢測的傳統培養方法不僅是勞動力密集的，而且耗時。通常這樣的方法基於已經使用超過五十年的標準步驟。除此之外，致病性的微生物能夠在環境中長期處於受嚴重的脅迫狀態，所述的「活的非可培養狀態(VNC) 」或者「不能立即培養(NIC)」狀態。該受嚴重的脅迫的微生物僅僅顯示出弱的，通常在檢測限上的代謝活性，並且其失去在非選擇性平面皿培養基上形成聚落，或者在非選擇性肉湯培養基中生長的能力(Reissbrodt等人，200 。然而，當這種不可培養的聚落存在於食物和動物飼料中時，如果食用，其仍然可能導致疾病。由於這樣受脅迫的微生物可能無法充分地活化以至於能夠被檢測，這帶來了特別的問題。因此，任意診斷中在進一步培養、鋪板和檢測之前通常包括旨在活化該細胞的額外的細胞培養步驟。因此，在非選擇性的培養介質中預先富集對於傳統的方法而言是關鍵
4的要素Stephens等人，2000)。例如，沙門氏菌屬的檢測需要長達5天的數個培養階段；分析通常包括富集步驟，從而活化「生病的」細菌，並且檢測通常受到該富集肉湯和培養基的性能的限制。因此，為了恢復來自潛在地含有異源的細菌種群的臨床標本，食物和其他產品的微生物，可以使用三大類培養介質(1)為初步分離目的的非選擇性的介質；( 富集肉湯以及C3)選擇性的和/或分化性的瓊脂糖。該介質的配方通常複雜，並且包括不僅抑制特定的細菌種類生長，也即它們是選擇性的，同時也檢測幾種生物化學特性，所述的生物化學特性在對樣品中存在的微生物進行早期鑑別是重要的，也即，它們是分化性的。為了進行合理的選擇，微生物學家必須知道各個配方的成分以及所包括的各個化合物的目的及相對濃度。不幸的是，可得到的介質通常過於複雜，以及多種組分的效果和量通常很少為人所知。 通常，所使用的介質與使用了幾個世紀的介質是一樣的，並可能是一開始為了完全不同的生物體開發的。例如，由於這些缺陷，當前對沙門氏菌屬的檢測率在15天內低於50%，以及在沘天內低於90% (King，2009)。因此，需要明確界定，不含有多餘的組分的培養介質，所述的培養介質可能具有少的或者沒有副作用，並且對於即使受脅迫的微生物的生長和快速培養而言是優化的，。該培養介質應該不需要二次的/額外的培養步驟。也有對新的和更好的檢測方法的需要，所述的方法使得能夠分離和/或鑑定非常低數量的，以及位於異源微生物群落的環境下的致病性微生物。進一步地，任意的該方法應該等同地適用於從大範圍內的來源中檢測微生物，所述的來源如化妝品、食物產品、臨床樣品和環境樣品，所述的食物產品包括冷凍的、凍幹的和液體的產品，所述的臨床樣品如尿、大便或者血液樣品和環境樣品。發明概述在本發明的第一個方面，提供了用於至少一種微生物的生長的培養介質，其必要地包括⑴基礎肉湯；(ii)至少一種生長抑制劑，其選自煌綠、萘啶酸和氯化鋰所組成的組；和(iii)可選地，至少一種生長促進劑，其選自連四硫酸鈉、連四硫酸鉀、檸檬酸鐵銨和檸檬酸鈉所組成的組。為了避免產生懷疑，此處使用的術語「必要地包括」包括僅包括所規定的材料或者步驟，以及不相當地影響到本發明的基本的和創新的特徵的範圍內的額外組分或者元素。可以將介質分類為簡單的、複雜的或者經界定的。基礎肉湯或者基礎培養基從根本上是維持細菌的具有最少的附加成分的簡單培養基。一般地說該基礎肉湯只需提供能量的來源，以及具有保持正確的滲透壓。蛋白腖、胰化蛋白腖、肉汁(蛋白腖、肉的提取物，可選地酵母提取物和氯化鈉)，L-肉湯(胰化蛋白腖、酵母提取物和氯化鈉)，革蘭氏陰性肉湯、胰蛋白酶大豆肉湯、含有酵母的胰蛋白酶大豆肉湯和改良的胰蛋白酶大豆肉湯是本領域適用的基礎組分。蛋白腖是幾種水溶的蛋白質衍生物，其通過將蛋白質(或者多種蛋白質)在消化過程中，由酸或者酶部分水解得到。胰蛋白酶大豆肉湯一般地包括例如胰化蛋白腖(酪蛋白的胰腺消化物)，大豆腖(大豆粉木瓜蛋白酶消化物)和氯化鈉。改良的胰蛋白酶大豆肉湯可以進一步地包括葡萄糖、膽汁鹽和磷酸二鉀鹽。具體地，基礎肉湯選自胰化蛋白腖、肉汁、L-肉湯、革蘭氏陰性肉湯、蛋白腖、胰蛋白酶大豆肉湯、具有酵母的胰蛋白酶大豆肉湯和改良的胰蛋白酶大豆肉湯所組成的組。更具體地，基礎肉湯選自蛋白腖、胰蛋白酶大豆肉湯、具有酵母的胰蛋白酶大豆肉湯和改良的胰蛋白酶大豆肉湯所組成的組。在具體的實施方案中，所述的生長抑制劑是煌綠，一種三芳基甲烷染料(CAS號為 633-03-4)。煌綠是已知抑制革蘭氏陽性細菌和大多數革蘭氏陰性細菌的染料。在本領域中其以變化的量使用，例如，在Difco m煌綠肉湯中25mg/L，以及在煌綠連四硫酸鹽膽汁肉湯中70mg/L，在MLCB瓊脂糖中4. 5_6mg/L，以及在Muller Kauffmann連四硫酸鹽肉湯中 10mg/L。儘管已經使用了幾個世紀，發明人驚奇地發現煌綠的該濃度對於例如沙門氏菌屬和志賀氏菌屬的生長而言不是最優的。實際上，據認為該高濃度對於沙門氏菌屬和志賀氏菌屬的充分和快速的生長是有害的，並可能妨礙「生病的」或者「受脅迫的」細菌的恢復。沙門氏菌屬的特定的株如傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌以及其他已知是對煌綠敏感的株， 並且目前沒有適當的培養介質在株之間顯示出有差別的抑制(Chau和Leimg，2008)。發明人發現了一系列濃度的煌綠針對例如革蘭氏陽性細菌提供抑制效果，同時使得沙門氏菌屬(包括傷寒沙門氏菌和副傷寒沙門氏菌)和志賀氏菌屬能快速地恢復並生長。因此，在具體的實施方案中，所述的培養介質包括煌綠，其用量約為0. 05至約0. 25mg/ L之間，或者在約0. 1至約0. 25mg/L之間，更具體地0. 15mg/L。從本領域中介質中已知的水平來看，這些「低水平」是令人吃驚的。人們相信由於本領域已知的長期的培養方法，在可能長達48小時的培養持續時間內使用高濃度的煌綠抑制競爭微生物以前是必要的。然而在本發明的介質中，生長效率是微生物能在單一的培養基中20小時之內培養到適合的檢測水平，具體地約4-15個小時，更具體地約4-8個小時，以及再更具體地4-6個小時。在其他的實施方案中，如果用於表面棉籤試驗，這可能進一步地縮減到約30分鐘至約4小時，具體地約1、1. 5、2、2. 5或者3小時。結果是可以使用令人吃驚地低的水平的煌綠，並且其仍然在抑制特定的競爭性微生物上起效長達20小時， 而且其充分地低，從而對感興趣的微生物，如沙門氏菌屬和/或志賀氏菌屬的生長沒有影響。儘管量一般以mg/L或者g/L提及，應當理解組合物可以幹的性質預先混合提供， 如為片、粉末、顆粒或者其他合適的幹的形式，分別地或者順序地加到水中。如果需要，所屬的組合物也能以多個包裝系統中分開的組分提供。在這個情況下，所述的量指在合適的水中稀釋之後組分的最終濃度。例如，含有0. 5mg煌綠的小包幹粉稀釋於2升水中，達到濃度為 0. 25mg/L。在其他的實施方案中，所述的介質含有萘啶酸和/或氯化鋰作為抑制劑(或者多種抑制劑。)萘啶酸(CAS編號為389-08-2)有效抑制革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌。在較低的濃度下，其以細菌抑制的方式起效果；也即其抑制細菌的生長和繁殖。在更高的濃度下， 其為殺菌的，意味著其殺死細菌而不僅僅抑制其生長。在具體的實施方案中，所述的介質包括量為約1至:3mg/L，更具體地約ang/L的萘啶酸。氯化鋰(CAS編號為7447-41-8)抑制革蘭氏陰性細菌的生長，而不影響革蘭氏陽性細菌的生長。在具體的實施方案中，介質包含約1至3g/L，更具體低約2g/L的量的氯化鋰。
萘啶酸和/或氯化鋰作為生長抑制劑的使用在用於李斯特菌屬生長的培養介質中是有利的。在具體的實施方案中，培養介質可以選地包括生長促進劑。對於沙門氏菌屬而言，發現了當基礎肉湯包括蛋白腖時，包括連四硫酸鈉或者其鹽是有利的。出人意料的是，發明人發現培養介質中連四硫酸鈉水平高於20g/L時沙門氏菌屬的生長顯著地受抑制。由於在本領域中對沙門氏菌屬進行陽性選擇和培養時，高於 20g/L的水平是慣常地使用的。因此，優選地連四硫酸鈉以約1至約20g/L的量存在，更具體地約4至約15g/L，6至約15g/L，再更具體地約7至約15g/L，約8至12g/L或者約8g/L。在供選擇的實施方案中，在不背離本發明精神的前提下可以使用適量的硫代硫酸鈉和碘代替連四硫酸鈉。這是由於碘能和硫代硫酸鈉原位反應產生連四硫酸鈉(以及碘化鈉)。在其他的實施方案中，可以使用連四硫酸鉀、無水連二硫酸鋇、其鹽或者能夠釋放連四硫酸根陰離子(S4O62-)的化合物，這些化合物的混合物。在其他的實施方案中，所述的培養介質包括生長促進劑，其中所述的生長促進劑為檸檬酸鐵銨。在特定的實施方案中，使用約200至1000mg/L的量的檸檬酸鐵銨(CAS編號為 1185-57-5)，更具體地約200至約500mg/L，再更具體地約200至約300mg/L，以及進一步再更具體地約250mg/L。在再另一個實施方案中，培養介質進一步地包括生長促進劑檸檬酸鈉。在特定的實施方案中，使用約10至20g/L，約12至18g/L以及更具體地約15g/L 的量的檸檬酸三鈉鹽(CAS編號為68-04-2)。在特定的實施方案中，所述的培養介質用於沙門氏菌屬的生長。在其他的實施方案中，所述的培養介質用於志賀氏菌屬的生長。在再進一步的實施方案中，所述的培養介質用於李斯特菌屬的生長。根據本發明的第二個方面，本發明提供了從微生物細胞中，將核心寡糖單體釋放出來的方法，其包括(i)在含有所述的微生物的至少一個培養樣品中加入洗滌劑，從而提供洗滌劑-培養物溶液；並且(ii)將所述的洗滌劑-培養物溶液加熱到足以釋放所述的核心寡糖的溫度。細菌脂多糖(LPQ對於全部的革蘭氏陰性細菌和一些革蘭氏陽性細菌而言是外膜的關鍵組分。人們認為它們在該細菌感染的患者中，是造成炎症反應的原因。革蘭氏陰性細菌的實例包括大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌和彎曲桿菌。李斯特菌是革蘭氏陽性的細菌。多數經表徵的LPS具有相同的主要結構；確定了 LPS的結構中包括三個不同的區 脂類A區，核心寡糖以及0-多糖鏈(

圖12a)。該結構在脂類A及LPS的內核中是尤其保守的。由於這一結構上的保守，脂類A區的結合物，如抗體可能不具有對特定種的特異性，而導致在任何分子檢測步驟中的假陽性。進一步地，針對如核心區的多種結合物的應用是差強人意的，由於該結合物可能對同一表位進行競爭，由於表位之間的類似性可能妨礙彼此各自的結合反應。因此，現有技術的檢測方法依賴於對如沙門氏菌屬的細胞表面或者鞭毛有特異性的結合物，由於這些容易達到。
一般通過含水酚萃取，隨後純化來分離LPS。經分離的LPS隨後可以通過如 SDS-PAGE、質譜和NMR進行表徵(Raetz，1996)。本發明人發現可以通過使用快速的方法， 使核心寡糖區釋放或者使其可及，或者可以進行檢測，所述的檢測例如通過抗體結合技術， 所述的方法使用洗滌劑以及加熱。這一套簡單方法的不適用於如細胞表面抗原或者鞭毛的檢測，由於已知洗滌劑與脂類相互作用，並且會破壞或者擾亂結合物可能與之反應的脂類A 表位。同時可以單獨地使用洗滌劑，加熱的使用是進一步有利的，由於其將LPS分解為可檢測的單體，並且具有著殺死病原菌的附加好處。優選地，所述的洗滌劑是十二烷基磺酸鈉 (SDS)或者吐溫20、40、60或者80。出人意料地，在下文所述的直接測定中，本發明人發現SDS的使用能夠增強結合物如抗體和表位之間的結合高達10倍。類似地，儘管其他的洗滌劑在直接測定(如下所示)中，妨礙和阻止抗體結合，出人意料地本發明人發現了吐溫20、40、60和80很少或者沒有這樣的效果，例如，在競爭測定中。這與現有技術中現成的示教形成了鮮明的對比，所述示教如Qualtiere等人，1977。所述的洗滌劑可以以液體加入培養樣品中，例如溶解於如水等溶劑中，或者在SDS 的情況下以固體的形式加入。用於本方法的特定的洗滌劑濃度為從約0. 至約2%，具體地約0. 5%至約1 % (w/v或者ν/ν)。優選地，所述的洗滌劑在水中溶解或者稀釋，並以液體加入，得到前文所述的濃度。優選地，洗滌劑溶液中不存在進一步的組分如緩衝液等等。因此，在優選的實施方案中， 所述洗滌劑溶液僅包括洗滌劑，溶於水中的十二烷基磺酸鈉或者吐溫20、40、60或者80。在本方法的下一步中，將洗滌劑-培養物溶液加熱到足以使核心寡糖釋放的溫度。優選地，將所述溶液(或多種溶液)加熱到足以殺死樣品中可能存在的細菌的溫度，所述細菌具體地為沙門氏菌、志賀氏菌或者李斯特菌。具體的溫度包括從約60°C到約100°C， 具體地約65、70、75、80、85、90、95到約100°C。對於本領域技術人員而言，顯而易見的是步驟(i)和(ii)可以依次進行，同時進行，或者所述培養樣品和/或洗滌劑可以在合併之前分別地加熱。所述的洗滌劑-培養物溶液可以加熱約30秒到約20分鐘，具體地約2分鐘到約15分鐘，以及更具體地約2、3、4、5、6、7、8、9到約10分鐘。在本發明的第三個方面，提供了檢測感興趣的微生物在待測樣本中存在或不存在的檢測方法，所述的方法包括(i)將所述的檢測樣品在培養介質中培養，所述的培養介質允許感興趣的微生物的增殖；(ii)處理將所述的檢測樣品到足以從檢測樣品中存在的任意微生物中釋放一種或多種核心寡糖的程度；(iii)將所述的檢測樣品暴露於至少一種結合物，所述結合物對感興趣的微生物的核心寡糖有結合特異性；以及(iv)檢測至少一種結合物與感興趣的微生物的核心寡糖的任意結合。本檢測方法可以是直接的或者間接的。在直接結合或者非競爭性分析中(直接的或者間接的)，也稱作「三明治檢測」，核心寡糖優選地結合於表面和結合物，例如抗體與感興趣的微生物的任意核心寡糖反應。優選地所述結合物為經標記的結合物。隨後測定表面上的所述經標記的結合物。
直接檢測方法的結果一般來說與樣品核心寡糖的濃度直接成比例。如果樣品中不存在核心寡糖，很顯然經標記的結合物不會結合。在競爭性檢測中，檢測樣品中的核心寡糖在與結合物的結合中，與經標記的核心寡糖競爭。隨後測量經標記的結合於結合物的核心寡糖的量。在這個方法中，響應與樣品中核心寡糖的濃度成反比。這是由於響應越大，在「未知」的或者檢測樣品中能與經標記的核心寡糖競爭的核心寡糖越少。不管該檢測是直接的或者間接的，核心寡糖或者經標記的核心寡糖都優選地分別結合在檢測表面上。所述核心寡糖(或者多種寡糖)所結合的表面可以是現有技術中已知的材料，例如有機聚合物如塑料、玻璃、陶瓷等等。特定的有機聚合物包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯、纖維素和硝酸纖維素。優選的聚合物為聚苯乙烯，以及更具體地Y-射線輻照的聚苯乙烯。所述的表面其自身或者其一部分可以為片、微板塊或者微量滴定板，板子、膜、 孔、小丸、棒、棍、管、珠子等等。在特定的實施方案中，將LPS或者包括所述核心寡糖的單體固定於沒有任何修飾的表面上。例如該分子的疏水脂類A部分可以通過非共價的疏水相互作用結合於表面上， 所述表面如Y-射線輻照的聚苯乙烯表面。該結合使核心寡糖區易與結合物如抗體相互作用。在可選的實施方案中，通過使用中間的結合物，將LPS和/或核心寡糖結合到表面上，所述的中間的結合物如抗體、綴合物或者其他的連接物。在第W003/36419號國際專利申請公開中，公開了使用的替代物。該方法的第一步包括將檢測樣品在培養介質中進行培養，所述的培養介質使得感興趣的微生物能夠增殖。在特定的實施方案中，所述方法用於檢測食物或者食物產品中的微生物蛋白或者片段。在進一步的實施方案中，所述的樣品是環境樣品、農業樣品、醫學樣品或者製造業樣品。所述的檢測樣品可能為食品產品如肉、肉製品，其包括肉末、蛋、奶酪、牛奶、蔬菜、巧克力、花生醬等等，其包括經處理的、經乾燥的、經冷凍的或者經冷藏的食品產品。可選地所述檢測樣品可以為臨床上的樣品，如活組織檢查樣品、排洩物、唾液、保溼液、營養液、血液、血液產品、組織提取物、疫苗、麻醉劑、藥學上有活性的藥劑、成像藥劑、或者尿樣等等。所述的檢測樣品還可以包括棉籤，如皮膚_、盲囊_、排洩物的、排洩腔的、或者直腸的棉籤，或者表面的棉籤，如地板、門和牆，或者得自食品產品的棉籤，包括經屠宰的動物軀體的棉籤等等。 所述的檢測樣品還可以包括化妝品樣品如基礎化妝品、唇膏、洗液、乳霜、香波等等。優選地，將所述檢測樣品在根據本發明第一個方面的培養介質中進行培養。在具體的實施方案中，將所述的檢測樣品在培養介質中在約30°C到約44°C中進行培養，具體地約37°C到42°C，更具體地約37°C。所述的檢測樣品可以在培養介質中培養約4-15個小時，更具體地約4-8個小時，以及再更具體地4-6小時。在其他的實施方案中， 可以將所述的檢測樣品在培養介質中培養30分鐘到約4個小時，優選地約1、1. 5、2、2. 5或者3小時。所述方法的第二步包括將檢測樣品處理到足以從檢測樣品中存在的任何微生物中釋放一種或多種核心寡糖的程度。
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可以將所述檢測樣品以任意適用的方法進行處理，所述方法導致從微生物的細胞膜中釋放細菌LPS和/或核心寡糖。優選地，將所述檢測樣品根據本發明的第二個方面進行處理。現有技術中有其他適用但是可能效率較低的提取方法，並且也可能使用，其包括超聲降解法、使用高壓、使用酶、「珠磨」等等。然而，當處理致病性細菌如沙門氏菌時，在高溫下(如煮沸或者前面所討論的)使用洗滌劑是尤其地有效的，由於高溫能確保所有的細菌被殺死。更具體地，當所述的檢測是直接結合檢測時，優選地使用SDS，然而當分析為競爭形式時，使用SDS來製備塗布抗原的板，同時將吐溫20、吐溫40、吐溫60或者吐溫80，優選吐溫20用在步驟中剩下的部分。在前文第一個方面中給出了適用的加熱/處理時間間隔。很明顯，感興趣的微生物可能不存在於檢測樣品中，在這種情況下該感興趣的微生物的 LPSs和核心寡糖也將不存在。在該方法的第三步中，將所述的檢測樣品暴露於至少一種結合物，所述結合物對感興趣的微生物的核心多糖具有結合特異性。在具體的實施方案中，在步驟(iii)之前，將經處理的檢測樣品中的核心寡糖、 LPS或者單體固定在表面上，暴露於至少一種結合物，所述結合物對感興趣的微生物的核心多糖具有結合特異性。在該實施方案中，可以通過將經處理的檢測樣品與表面接觸，並溫育和/或保持接觸約10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘到約60分鐘將在樣品中的所述核心寡糖、LPS或者單體進行固定。在其他的實施方案中，例如在競爭性檢測中，將所述的檢測樣品施加到，或者接觸到表面上，所述表面上已經固定了已知的或標準量的核心寡糖、LPS或者單體。來自已知的或者標準物的核心寡糖、LPS或者單體與檢測樣品的核心寡糖、LPS或者單體競爭結合於至少一種結合物上。可以將核心寡糖、LPS或者單體直接地固定在所述的表面上，其通過例如非共價的疏水相互作用或者如前所述地間接的方法。應該將檢測樣品暴露於至少一種結合物足夠的時間，從而使核心寡糖、LPS或者單體結合於至少一種結合物形成複合物，例如核心寡糖/結合物複合物。合適的時間包括從約1分鐘到約4小時，具體地從約30分鐘到約2小時，具體地約45分鐘、1小時和1. 5小時。在特定的實施方案中，在所述方法的可選的步驟中，將所述的複合物暴露於對至少一種結合物具有結合特異性得第二種結合物足夠的時間，從而使第二種結合物形成次級複合物，例如核心寡糖/結合物/第二結合物的複合物。優選地，所述的結合物為抗體，更優選地為親和純化的抗體，以及再更優選地為單
克隆抗體。用於本發明的檢測的抗體可以為多克隆的、單克隆的、雙特異性的、人源化的或者嵌合的抗體。該抗體可包括單個的鏈，但優選地包括至少輕鏈或者重鏈，但為了結合與抗體具有結合特異性的靶如核心寡糖或者微生物汙染物，最好有至少一個互補決定區(CDR)。製備抗體的方法是本領域中已知的。例如如果想要多克隆抗體，可以將所選擇的抗原，如細菌內毒素免疫接種於所選擇的哺乳動物中，所述的哺乳動物如鼠、兔、山羊或者馬。收集經免疫的動物的血清並進行處理從而得到抗體，所述的處理如通過免疫親和層析。可以通過現有技術中已知的方法製備單克隆抗體，並且這是一般來說優選的。利用雜種瘤技術製備單克隆抗體的一般方法是公知的(參見例如Kohler，G和Milstein，C， Nature 256:495-497(1975) ；Kozbor 等人，I mmunology Today 4:72(1983) ；Cole 等人， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 第 77-96 頁，Alan R. Liss, Inc. (1985))。如本文所述的抗原應該包括如CDR的表位結合區域。所述的抗體可以為任意適用的種類，包括IgE、IgM、IgD、IgA以及特別地，IgG。也預期了這些抗體不同的亞類。如在此所使用的，術語「抗體結合片段」具體地指抗體的片段，來自抗體保留抗體的結合特異性的多肽。該片段包括但不限於抗體片段，如Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv，其全部都能夠結合於表位。術語「抗體」還延伸到能得到的任意各種天然的和人工的抗體，以及可用的抗體衍生蛋白質，和它們的衍生物，例如，包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化的抗體、人類抗體、單功能域抗體、完整的抗體、抗體的片段如F(ab' )2*F(ab)的片段、 Fv片段(非共價的雜合二聚體)、單鏈的抗體如單鏈的Fv分子(scFv)、微抗體、特異性寡配體、二聚體或者三聚體抗體片段或者結構等等。術語「抗體」不暗示任意的具體來源，並且包括通過非傳統的過程得到的抗體，所述非傳統的過程如噬菌體表面展示。本發明的抗體可以為任意的亞型(如IgA、IgG、IgM也即α、Y或者μ重鏈)並可以具有κ (kappa)或者 λ (lambda)輕鏈。本發明因此延伸到抗體以及抗體衍生的結合片段的應用，所述的結合片段對本發明所使用的核心寡糖具有結合特異性。術語「特異地結合」或者「結合特異性」指抗體或者其片段結合靶微生物病原體的能力，所述的結合與其結合非靶表位相比具有更強的親和性。例如，抗體與靶表位的結合的親和力比非靶表位親和力的大至少10、50、100、250、500或者1000倍。在特定的實施方案中，親和力通過親和ELISA檢測進行測定。在可選的實施方案中，親和性通過大分子相互作用檢測進行測定。可選地，親和力可以通過動力學方法進行測定。在特定的實施方案中，結合物如抗體可以固定在表面上，在可選的洗滌步驟之後， 將可能含有感興趣的核心寡糖或者微生物汙染物的檢測樣品暴露於表面結合抗體足夠的時間，從而使結合發生，以及使表面結合第一結合物-核心複合物形成。該檢測可以隨後包括將包括表面結合第一結合物-核心複合物的與第二結合物接觸，所述第二結合物如抗體，其可以是共價結合態的並能發射光，例如為吖啶酯。在該情況下，第二結合物對存在於第一結合物上或者在核心寡糖上或者微生物汙染物上的表位具有結合特異性，從而所產生的信號的量與第一或者第二結合物所結合的核心寡糖或者微生物汙染物的量相對應。典型地，將抗體純化從而避免聚集。在特定的實施方案中，所述的表面為常規設計的微滴定板，然而在使用改性的表面的時候具有優點，例如具有塗黑的壁以及白色或者透明的部分(如在底部)。這在測量的時候加強了所產生的任意信號，並減少了背景光。白色的部分使得光線反射，從而增強所產生的信號。因此，在具體的實施方案中，表面是具有多個孔的多孔板，其中各個孔的底部是透明的或者大體上透明的，而孔的壁是不透明的，或者塗黑的從而避免光透過，或者染色的，從而與允許光線通過的孔的底部進行對比。再更具體地，所述的抗體是物種特異性的單克隆抗體。術語「物種特異性的」意圖表示該抗體能夠區分例如沙門氏菌、志賀氏菌和李斯特菌，而只有很少或者沒有交叉反應。在具體的實施方案中，所述的結合物與LPS核心寡糖的該表位相互作用及結合
權利要求
1.用於至少一種微生物的生長的培養介質，其本質上含有(i)基礎肉湯，選自蛋白腖、胰蛋白酶大豆肉湯、含有酵母的胰蛋白酶大豆肉湯以及改良的胰蛋白酶大豆肉湯；( )至少一種生長抑制劑，選自煌綠、萘啶酸和氯化鋰；和(iii)可選地，至少一種生長促進劑，選自連四硫酸鈉、檸檬酸鐵銨和檸檬酸鈉。
2.權利要求1中所述的培養介質，其中所述的生長抑制劑為用量為約0.05至0. 25mg/ L的煌綠。
3.權利要求1中所述的培養介質，其中所述的生長抑制劑為用量為約1至:3mg/L的萘啶酸和約1至約3g/L的氯化鋰。
4.權利要求1或者2中所述的培養介質，其包括生長促進劑，其中所述的生長促進劑是用量為約4至約12g/L的連四硫酸鈉。
5.權利要求1至4中所述的培養介質，其包括生長促進劑，其中所述的生長促進劑是量為約200至300mg/L的檸檬酸鐵銨。
6.權利要求7或者8中所述的培養介質，其還包括生長促進劑檸檬酸鈉，所述檸檬酸鈉的量為約10至20g/L，更具體地約為15g/L。
7.權利要求1、2或者4中任一項所述的培養介質，其中至少一種微生物是沙門氏菌屬。
8.權利要求1、2、5或者6中任一項所述的培養介質，其中至少一種微生物是志賀氏菌屬。
9.權利要求1、3或者5中任一項所述的培養介質，其中至少一種微生物是李斯特菌屬。
10.一種用於檢測待測樣本中感興趣的微生物存在或不存在的檢驗方法，所述的方法包括(i)將所述的待測樣本在培養介質中培養，所述的培養介質允許感興趣的微生物的增殖；( )將所述的待測樣本處理到足以從待測樣本中存在的任意微生物中釋放一種或多種核心寡糖的程度；(iii)將所述的待測樣本暴露於至少一種結合物，所述結合物對感興趣的微生物的核心寡糖有結合特異性；和(iv)檢測至少一種結合物與感興趣的微生物的核心寡糖的任意結合。
11.權利要求11所述的方法，其中步驟(ii)包括(a)在含有所述感興趣的微生物的一個待測樣本中加入洗滌劑，從而提供一個洗滌劑-培養物溶液；和(b)將所述的洗滌劑-培養物溶液加熱到足以釋放所述的核心寡糖的溫度。
12.權利要求11所述的方法，其中所述洗滌劑是十二烷基磺酸鈉、吐溫20、吐溫40、吐溫60或者吐溫80。
13.權利要求10至12中任一項所述的方法，其中步驟(i)使用根據權利要求1至9中任一項的培養介質進行。
14.權利要求10或者13中任一項所述的方法，其中步驟(iv)通過檢測冷光信號進行。
15.權利要求14所述的方法，其中所述的冷光信號由吖啶酯產生。
16.從微生物細胞中將核心寡糖單體釋放出來的方法，其包括(i)在含有所述的微生物的至少一個待測樣本中加入洗滌劑，從而提供洗滌劑-培養物溶液；和(ii)將所述的洗滌劑-培養物溶液加熱到足以釋放所述的核心寡糖的溫度。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述的洗滌劑是十二烷基磺酸鈉、吐溫20、吐溫 40、吐溫60或者吐溫80。
18.本質上含有十二烷基磺酸鈉、吐溫20、吐溫40、吐溫60或者吐溫80的溶液在權利要求16所述的方法中的應用。
19.對核心寡糖具有結合特異性的結合物在微生物的特異性檢測中的應用，所述微生物選自沙門氏菌、志賀氏菌和李斯特菌。
20.根據權利要求1至9中任一項的培養介質在至少一種細菌的生長中的應用，所述的細菌具體地為沙門氏菌、志賀氏菌或者李斯特菌。
21.權利要求10至17任一項所述的方法，其中所述的核心寡糖表位是
全文摘要
本發明涉及用於在待測樣本中檢測採自微生物尤其是致病微生物的特定物質如核心寡糖的檢測方法。本發明還涉及用於該微生物快速生長使得與當前的方法相比，明顯早地檢測成為可能的組合物和方法，。在具體的實施方案中，本發明旨在沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、李斯特氏菌屬的快速生長和/或檢測。
文檔編號C12Q1/04GK102216467SQ200980142725
公開日2011年10月12日 申請日期2009年9月10日 優先權日2008年9月10日
發明者W·斯廷森 申請人:速樂思科學解決方案有限公司