免疫層析試驗用具的製作方法

2023-12-09 09:59:01

專利名稱：：免疫層析試驗用具的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種免疫層析試驗用具、用免疫層析試驗用具檢測待測物的方法及免疫層析試驗用具的製作方法。
背景技術：
：免疫層析試驗用具作為用能與試樣中待測物特異性結合的物質檢測待測物的實驗器具已為人所知。將疑為含待測物的試樣添加到此實驗器具的一部分(加樣區)，則試樣由於毛細管現象在加樣區內移動，達到固定有可與待測物結合的標記物的標記物固定墊。如果有待測物，則待測物與標記物結合，形成待測物一標記物複合物。試樣再因毛細管現象散開，此複合物在免疫層析膜移動，到達固定有可與待測物結合的結合物的判斷區，於是，該複合物結合到該結合物。如此，在判斷區形成標記物一待測物一結合物夾心式複合物。當標記物含有色載體粒子(染色的乳膠粒子和膠體金屬粒子等)時，標記物會被判斷區捕捉，則判斷區顯色。通過觀察此判斷區的顯色，即可進行試樣中待測物的檢測。在使用這種免疫層析試驗用具的實驗中，試樣中所含影響免疫層析反應的物質可能造成假陽性反應。比如，有時採自人的生物試樣中會含有人抗鼠抗體(HAMA)，此時，HAMA在免疫層析試驗用具中會與作為結合物使用的來源於鼠的抗體起反應。因此，即使不含待測物的試樣中也可能出現疑似存在待測物的假陽性結果。美國專利申請第2007/0059682號記述有一種免疫層析試驗用具，其中層析膜有固定了捕捉HAMA的物質的HAMA捕捉器。此免疫層析試驗用具通過用HAMA捕捉器捕捉存在於試樣中的HAMA提高結果的準確性。然而，專利文獻1記述的免疫層析試驗用具有時不能徹底捕捉HAMA。其結果，受未捕捉的HAMA的影響，可能給出錯誤的判斷結果。
發明內容本發明的範圍只由後附權利要求書所規定，在任何程度上都不受這一節
發明內容的陳述所限。本發明的目的是提供一種免疫層析試驗用具，它可以降低可能存在於試樣中的人抗鼠抗體(HAMA)對免疫層析反應產生的影響，從而得出比以往的免疫層析試驗用具更準確的判斷結果。本發明的另一目的是提供一種用上述免疫層析試驗用具檢測待測物的檢測方法以及一種上述免疫層析試驗用具的製作方法。即本發明提供一種檢測試樣中待測物的免疫層析試驗用具，包括層析膜，有固定了可以與待測物結合的結合物的判斷區；試樣展開墊，有加樣區配置於比層析膜靠近試樣展開方向上遊的位置，用於添加試樣；及6標記物附著墊，配置於比加樣區靠近試樣展開方向下遊、比層析膜靠近試樣展開方向上遊的位置，用於附著可與待測物結合的標記物。在此，可與人抗鼠抗體反應的物質附著在配置於比層析膜靠近試樣展開方向上遊的墊中。所述免疫層析試驗用具，其中可與人抗鼠抗體反應的物質附著在標記物附著墊。其中可與人抗鼠抗體反應的物質附著在試樣展開墊。其中標記物附著墊配置在與試樣展開墊和層析膜有接觸的位置。其中標記物附著墊配置在與層析膜有一定間隔的位置。其中試樣展開墊配置在與層析膜有接觸的位置。其中試樣展開墊配置在與層析膜有一定間隔的位置。所述免疫層析試驗用具，還包括配置在比層析膜靠試樣展開方向下遊位置的吸收墊。其中吸收墊配置在與層析膜有接觸的位置。其中可與人抗鼠抗體反應的物質為可與人抗鼠抗體反應的抗體或可與人抗鼠抗體反應的抗體片段。其中可與人抗鼠抗體反應的抗體是選自保藏於日本國家技術評估研究所專利微生物寄存中心(NPMD)的保藏日為2007年9月25日的保藏號為NITEBP—420和保藏號NITEBP—421之中的至少一種雜交瘤產生的單克隆抗體。所述免疫層析試驗用具，其中標記物附著墊還附著質控用標記物，層析膜還有固定可與質控用標記物結合的物質的質控區。7所述免疫層析試驗用具，還包括第二試樣展開墊，其配置在比加樣區靠近試樣展開方向下遊且比層析膜靠近試樣展開方向上遊的位置。其中可與人抗鼠抗體反應的物質附著在第二試樣展開墊。其中可與人抗鼠抗體反應的物質附著在墊中，以便與試樣一起展開。本發明還提供一種用免疫層析試驗用具檢測試樣中待測物的方法，該免疫層析試驗用具所含層析膜有一判斷區，其中固定有可與待測物結合的結合物。該方法包括以下步驟向免疫層析試驗用具添加試樣；使可與人抗鼠抗體反應的物質和可與待測物結合的標記物與試樣在配置於比層析膜靠近試樣展開方向上遊的墊中接觸；以及讓可與固定在判斷區的待測物結合的結合物與試樣接觸；檢測出通過待測物結合到判斷區的標記物質。本發明再提供一種免疫層析試驗用具的製作方法，其中該免疫層析試驗用具所含層析膜有一用於檢測試樣中所含待測物的判斷區，該判斷區中固定有可與待測物結合的結合物。該製造方法包括讓可與人抗鼠抗體反應的物質附著在配置於比層析膜靠近試樣展幵方向上遊的墊中。使用本發明的免疫層析試驗用具，即使試樣中含有人抗鼠抗體(HAMA)，也可以徹底降低HAMA對免疫層析反應的影響。因此，可以準確地檢測出試樣中的待測物。比如當檢査病毒和細菌等病原體感染時，可以降低產生假陽性結果的可能性。因此可以得出更正確的檢查結果。8圖l為本發明的免疫層析試驗用具形態的例示圖。圖2為比較例的層析膜平面圖。具體實施例方式本發明的免疫層析試驗用具用於檢測試樣中由抗原或抗體組成的待測物。上述試樣含從人體採集的生物樣本和對該生物樣本進行前期處理所得的產物。作為採自人體的生物樣本有血液、血清、糞便、尿液、唾液、鼻腔抽取液、拭液、汗液、淚液等。作為上述前期處理比如有將生物樣本溶解到適當的前期處理試劑中，用過濾器過濾溶解所得溶液等。待測物只要是能夠獲得待測物相應抗體的物質即可，無特別限定。比如可以是細菌、原生生物和真菌等細胞、病毒、蛋白質、多糖類等。具體而言，作為待測物有流感病毒(如A型、B型等)、副流感病毒、RS病毒、輪狀病毒、杯狀病毒(calicivirus)、冠狀病毒、腺病毒、腸道病毒、皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、重症急性呼吸器症候群病原病毒(冠狀病毒)等病毒；支原體肺炎、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、三日瘧原蟲等細胞；其他消化器官疾病、中樞神經疾病、出血熱等各種疾病的病原體、這些病原體的代謝物；癌胚抗原和CyFRA等腫瘤標記物、激素等。這些待測物在生物樣本中也可以含一種以上。本發明的免疫層析試驗用具尤其適用於檢測從流感病毒、冠狀病毒、輪狀病毒和腺病毒中選擇的一種以上的病毒。9本發明的免疫層析試驗用具將可與人抗鼠抗體(HAMA)反應的物質(HAMA反應物)附著在比層析膜靠近試樣展開方向上遊的墊中。HAMA反應物只要是配置於比層析膜靠近試樣展開方向上遊的墊，既可以僅附著在一個墊中，也可以附著在二個以上墊中。HAMA反應物最好不固定在墊中。即HAMA反應物最好能夠與試樣一起展開。HAMA是一種人類所具有的能夠特異性認識鼠的免疫球蛋白(鼠抗體)的抗體。在多數情況下，被暴露於鼠抗體的人和接受使用鼠單克隆抗體的藥物治療的人具有HAMA。在本說明書中，對HAMA無特別限定，只要是能與鼠抗體反應的人所具有的抗體即可。比如，也可以是兔抗體和狗抗體等能與其他哺乳動物抗體交叉反應的來源於人的抗體。上述HAMA反應物只要能與HAMA反應無特別限定。比如可以是與HAMA反應的鼠抗體及其片段(如Fc片段、F(ab，)2片段、Fab片段、Fab，片段等)。更具體地說，作為HAMA反應物有由保藏號NITEBP—420(微生物識別碼HB2—2350)的雜交瘤或保藏號NITEBP—421(微生物識別碼HB3—354)的雜交瘤(均於2007年9月25日由國家技術評估研究所專利微生物寄存中心保藏)產生的來源於鼠的單克隆抗體或"單克隆用非特異去除劑"(BioLink公司生產)。HAMA反應物可以一種單獨使用，也可以二種以上混合使用。特別是混合了上述由保藏號NITEBP—420的雜交瘤和保藏號NITEBP—421的雜交瘤產生的來源於鼠的單克隆抗體的HAMA反應物最好。本發明的免疫層析試驗用具，上述HAMA反應物附著在配置於比層析膜靠近試樣展開方向上遊位置的墊中。作為配置於比上述層析膜靠近試樣展開方向上遊的墊，可舉出試樣展開墊和標記物附著墊。也可以是與試樣展開墊和標記物附著墊不同的第二試樣展開墊。如本發明這樣讓HAMA反應物附著在配置於比層析膜靠近試樣展開方向上遊位置的墊中，可以比將HAMA反應物固定在層析膜上更多地附著HAMA反應物。還可以比將HAMA反應物固定在層析膜上延長試樣中所含HAMA與HAMA反應物的反應時間。因此，可以減少HAMA對免疫層析反應的影響。在本說明書中，所謂"試樣展開方向上遊"和"試樣展開方向下遊"指在免疫層析試驗用具的縱長方向的相對方向，添加試樣的一頭為上遊，試樣展開下去(流下去)的一頭為下遊。在本說明書中，所謂比如"在比層析膜靠近試樣展開方向上遊位置放在襯底上的試樣展開墊"指包括層析膜的試樣展開方向上遊開頭部分在內，試樣展開方向上遊的某一處至少有試樣展開墊的一部分。本發明的免疫層析試驗用具的試樣展開墊有添加試樣的加樣區，在比層析膜靠近試樣展開方向上遊位置放在襯底上。試樣展開墊可以使用人造纖維、玻璃纖維、纖維素纖維等材質的東西。加樣區為添加試樣的部分，最好位於試樣展開墊的試樣展開方向上遊位置。本發明的免疫層析試驗用具的標記物附著墊附著可與待測物結合的標記物。標記物附著墊在比加樣區靠近試樣展開方向下遊ii且比層析膜靠近試樣展開方向上遊位置放在襯底上。標記物附著墊可以使用玻璃纖維、纖維素纖維、塑料(如聚酯、聚丙烯、聚乙烯等)纖維等材質的東西。標記物附著墊最好與試樣展開墊接觸配置。可與待測物結合的標記物最好為被標記的可與待測物結合的抗體或抗原。作為標記此抗原或抗體的標記成份如有瓊脂、瓊脂糖、交聯瓊脂糖、交聯海藻酸、交聯瓜爾膠、硝酸纖維素和羧基纖維素等纖維素酯類、凝膠、交聯凝膠、乳膠、橡膠、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯樹脂、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸環氧丙酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物等天然或合成樹脂及其衍生物、用色素粒、螢光分子或磁粒子等標記的玻璃(比如活性化玻璃)、矽膠、高嶺土、雲母、矽鋁、氧化鋁、硫酸鋇等無機材料組成的粒子所得粒子；紅細胞；及金等金屬膠體。其中尤以含色素分子、螢光分子或磁性粒子的乳膠粒子和金膠體為佳。可與待測物結合的標記物也可根據待測物種類為二種以上。標記物附著墊最好還附著有用於確認試樣是否適當展開的質控用標記物。質控用標記物最好對試樣中的成份實際上不起反應。該質控用標記物可以與下述能與質控用標記物結合的物質組合使用。即，質控用標記物和能結合到質控用標記物的物質是二個能特異性結合的物質的組合。其中，以任何一者為質控用標記物使用均可。作為這種能特異性結合的二個物質的組合可以列舉出半抗原和能與之結合的蛋白質，如鏈黴親和素或親和素與生物12素、2，4一二硝基酚或異羥洋地黃毒苷與蛋白質(如清蛋白、酪蛋白、纖維蛋白原等)等。作為質控用標記物的標記可以使用與上述標記物同樣的標記。質控用標記物可以與標記物同一標記成份標記，也可以不同豐示i己j^1"分豐示i己。本發明的免疫層析試驗用具的襯底只要可以作為普通免疫層析試驗用具的襯底使用即可，無特別限定。比如可以使用塑料、紙張、玻璃等。襯底為了配置層析膜、試樣展開墊和標記物附著墊等，最好表面具有粘性。本發明的免疫層析試驗用具的層析膜具有固定了可與待測物結合的結合物的判斷區。作為層析膜的材質可以使用靠靜電作用和疏水相互作用等物理作用能與蛋白質結合且通過毛細管現象能使試樣展開的材質。比如，硝化纖維、尼龍(如也可以羧基和烷基作為置換基的導入了氨基的修飾尼龍)、聚偏氟乙烯(PVDF)、醋酸纖維素等。固定在層析膜判斷區的結合物只要是能與待測物結合的物質即可。尤以能與待測物特異性結合的抗體或抗原為宜。結合物最好能在與上述標記物與待測物結合的位點不同的位點與待測物結合°層析膜根據待測物的種類可以僅有一個判斷區，也可以有二個以上。當有二個以上時，各判斷區固定不同種類的能與待測物結合的結合物。層析膜最好有固定有可與質控用標記物結合的物質的質控區，用於確認試樣是否適當展開。判斷區和質控區可以是線形、圓形和方形等。本發明的免疫層析試驗用具除上述層析膜、試樣展開墊和標記物附著墊外，還可以有吸收墊。吸收墊可以用纖維素、玻璃纖維等材質的東西。吸收墊最好配置在比層析膜靠近試樣展開方向下遊的位置，並與層析膜接觸。在這種位置上配置吸收墊可以加快試樣的展開速度。本發明的免疫層析試驗用具可以使用已為人知的免疫層析試驗用具的製作方法，只要使HAMA反應物附著在配置於比層析膜靠近試樣展開方向上遊的墊中即可。比如，在以往的製作方法中，附著標記物的標記物附著墊用含標記物的緩衝液製作。具體而言，通過將標記物附著墊浸泡在該緩衝液、或在標記附著墊中添加緩衝液使標記物附著墊含有該緩衝液。然後乾燥含有該緩衝液的標記物附著墊，即可製作出附著有標記物的標記物附著墊。此時，再在上述緩衝液中添加HAMA反應物，即可使標記物附著墊除標記物之外又附著HAMA反應物。在上述緩衝液中添加質控用標記物，即可使標記物附著墊還附著質控用標記物。用含有HAMA反應物的緩衝液還可以製作附著有HAMA反應物的試樣展開墊。即，通過將試樣展開墊浸泡在該緩衝液、或在試樣展開墊中添加該緩衝液後乾燥，製作附著有HAMA反應物的試樣展開墊。附著有HAMA反應物的第二試樣展開墊也同樣可以用含有HAMA反應物的緩衝液製作。可以將如上製作的標記物附著墊、試樣展開墊或第二試樣展開墊與用眾所周知的方法製作的其他組成部分、如襯底、層析14膜、標記物附著墊或試樣展開墊、任意的第二試樣展開墊和任意吸收墊組裝在一起，進行裁剪，製作本發明的免疫層析試驗用具。本發明的免疫層析試驗用具的形式如圖1(a)(d)所例示。(a)、(b)和(c)所示免疫層析試驗用具有試樣展開墊1、標記物附著墊2、層析膜3、吸收墊4和襯底5。(d)所示免疫層析試驗用具有試樣展開墊1、標記物附著墊2、層析膜3、吸收墊4、襯底5和第二試樣展開墊6。加樣區10位於試樣展開墊1的試樣展開方向上遊。本發明的免疫層析試驗用具的理想狀態為，標記物附著墊2與試樣展開墊1和層析膜3接觸配置。作為這種狀態的例示如(a)和(c)。本發明的免疫層析試驗用具的另一理想狀態為，標記物附著墊2與層析膜3隔一定間隔配置。作為這種狀態的例示如(b)和(d)。上述間隔可根據免疫層析試驗用具的大小和所檢測的待測物種類等適當選擇。本發明的免疫層析試驗用具的其他理想狀態為，試樣展開墊l與層析膜3接觸配置。作為這種狀態的例示如(b)和(c)。本發明的免疫層析試驗用具最好在比加樣區10靠近試樣展開方向下遊、且比層析膜3靠近試樣展開方向上遊的位置還有放在襯底上的第二試樣展開墊6。該第二試樣展開墊6可以配置於比標記物附著墊2靠近試樣展開方向上遊的位置，也可以配置於下遊位置。第二試樣展開墊6還可以有二個以上。15當本發明的免疫層析試驗用具有第二試樣展開墊6時，選自試樣展開墊1、第二試樣展開墊6和標記物附著墊2中的至少一個附著HAMA反應物即可。第二試樣展開墊6可以使用與上述試樣展開墊1同樣材質的東西。舉例實施例1在市場銷售的檢測流感病毒用免疫層析試驗用具(pochtem流感A/B，希森美康(Sysmex)株式會社)的標記附著墊中作為HAMA反應物附著以保藏號NITEBP—420和保藏號NITEBP—421保藏在國家技術評估研究所專利微生物寄存中心的雜交瘤產生的來源於鼠的單克隆抗體，製備本發明的免疫層析試驗用具。艮P，如下製備pochtem流感A型/B型的標記物附著墊。將1050pg引發抗A型流感單克隆抗體變態反應的藍色聚苯乙烯乳膠粒子(粒徑0.3pm)懸浮於3950|iL分散用緩衝液(含有BSA和蔗糖的磷酸緩衝液(pH7.0))中，製備抗A型流感單克隆抗體變態反應粒子。將1050pg引發抗B型流感單克隆抗體變態反應的藍色聚苯乙烯乳膠粒子(粒徑0.3pm)懸浮於3950)iL分散用緩衝液(含有BSA和蔗糖的磷酸緩衝液(pH7.0))中，製備抗B型流感單克隆抗體變態反應粒子。將U5(Hig引發鏈黴親和素變態反應的紅色聚苯乙烯乳膠粒子(粒徑0.19)am)懸浮於385(HiL分散用緩衝液(含有BSA和蔗糖的磷酸緩衝液(pH7.0))中，製備鏈黴親和素變態反應乳膠粒子。16將上述二種雜交瘤產生的來源於鼠的單克隆抗體溶解於lmLHAMA反應物緩衝液(磷酸緩衝液(pH7.0))中，使其分別達到1.75mg/mL，製備HAMA反應物溶液。混合如上調製的抗A型流感單克隆抗體變態反應粒子3600pL、抗B型流感單克隆抗體變態反應粒子3600)iL、鏈黴親和素變態反應乳膠粒子200pL和HAMA反應物溶液800jiL，獲得含有HAMA反應物的混合乳膠粒子8200|iL。將所得含有HAMA反應物的混合乳膠粒子832pL放入玻璃纖維制薄墊(300mmx5mmx0.28mm)上，在真空乾燥機上烘乾，製備標記物附著墊。將如此製備的標記物附著墊與pochtem流感A/B的襯底、層析膜和試樣展開墊組裝在一起裁剪，獲得本發明的免疫層析試驗用具。此免疫層析試驗用具附著有平均一個測試條10pg的HAMA反應物。pochtem流感A/B是具有圖1(a)所示結構的試驗用具，針對A型流感的鼠單克隆抗體和針對B型流感的鼠單克隆抗體及生物素BSA作為能與待測物結合的結合物和能與質控用標記物結合的物質分別固定在層析膜載體上的判斷區和質控區。比較例1使用pochtem流感A/B作為比較例1。比較例2作為比較例2，使用的是將與實施例1中所用相伺的HAMA17反應物固定在pochtem流感A/B的層析膜第一判斷區7A(參照圖2)的用具。下面用圖2說明比較例2的層析膜的製備方法。圖2為層析膜的平面圖。如圖2所示，由硝化纖維膜構成的層析膜7有第一判斷區7A、第二判斷區7B和質控區7C。比較例2的層析膜用抗體塗覆機將以下溶液塗覆在第一判斷區7A、第二判斷區7B和質控區7C。第一判斷區7A:上述HAMA反應物所含兩種來源於鼠的單克隆抗體在磷酸緩衝液(pH7.0)分別稀釋為1.75mg/ml濃度的溶液。第二判斷區7B:用磷酸緩衝液(pH7.0)稀釋到濃度1.5mg/ml的抗B型流感單克隆抗體溶液。質控區7C:用磷酸緩衝液(pH7.0)稀釋到濃度2.0mg/ml的生物素BSA溶液。在實施例1和比較例1的層析膜中，均在第一判斷區7A塗覆了用磷酸緩衝液(pH7.0)稀釋到濃度2.0mg/ml的抗A型流感單克隆抗體溶液。將分別塗覆了各溶液的層析膜在5(TC乾燥30分鐘。將乾燥後的層析膜7浸泡於封閉液(含有BSA的磷酸緩衝液(pH7.0))中，進行封閉。封閉後，用清洗液(含有SDS的磷酸緩沖液(pH7.0))衝洗，40。C乾燥120分鐘，製備比較例2的層析膜。將所得比較例2的層析膜與pochtem流感A/B的襯底、標記物附著墊和試樣展開墊組裝在一起裁剪，獲得比較例2的免疫層析試驗用具。所得比較例2的免疫層析試驗用具有平均每測試條4.1pg的HAMA反應物固定在層析膜載體上。得知，若要固定多於此量的HAMA反應物，則層析膜載體表面會有HAMA反應物析出。因此，層析膜載體上可固定的HAMA反應物量，從試驗用具的質量考慮，比固定在實施例1的免疫層析試驗用具上的HAMA反應物數量要少得多。實驗例1將抗鼠IgG(MBL303G抗鼠IgG(山羊)、標籤號No.130)用以下所示稀釋用緩衝液稀釋到表1所示濃度。以此為試樣，在實施例1、比較例1和2的免疫層析試驗用具的加樣區添加試樣200pL。15分鐘後，目測判斷區的顯色強度。先製作目測判斷樣本，比如BioDot公司的TSR3000薄膜分析儀(membranestripreader)測定的判斷區的檢測線強度在0.015以上0.03以下設為l+，0.03以上且小於0.08設為2+，0.08以上設為3+，此目測判斷即通過將試驗用具上出現的檢測線強度與該目測判斷樣本比較而進行。判斷顯色比1+目測判斷樣本弱的檢測線為+w。作為陰性質控品(NC)使用了不含抗鼠IgG的稀釋用緩衝液。19稀釋用緩衝液成份如下〈稀釋用緩衝液〉磷酸鈉'2H2078g氯化鈉45g疊氮化鈉2.5g牛血清白蛋白50g4N氫氧化鈉87.5mL超純水5L*用1N氫氧化鈉和1N鹽酸調整為pH7.0。結果如表l所示。在此，"A"欄表示固定有抗A型流感單克隆抗體的第一判斷區的判斷結果。而"B"欄表示固定有抗B型流感單克隆抗體的第二判斷區的判斷結果。"一"表示目測無法確認判斷區顏色。比較例2如上所述在第一判斷區固定了HAMA反應物。因此，比較例2僅在第二判斷區判斷結果的"B"欄有記載。表中雖然沒有表示，但在所有實驗中均確認了質控區的顏色。即，確認試樣已適當展開。[表1]抗鼠IgG的濃度比較例1實施例1比較例2ABABB168//g/mL3+3+1+1+3+16.8/ig/mL2+2+——2+1.68/ig/mL+w+w一—+wNC---一20從表1的結果得知，pochtem流感A/B(比較例1)的判斷區(第一和第二判斷區)儘管試樣中未含有流感病毒，但由於抗鼠IgG的存在，顯示出假陽性結果。即使使用在層析膜上固定了HAMA反應物的比較例2的免疫層析試驗用具也未能避免這一假陽性結果。與此相反，用本發明的實施例1的免疫層析試驗用具，當抗鼠IgG濃度為168pg/mL時，雖然可見極少的假陽性結果，但比起比較例1和2的試驗用具來，可以提供更準確的結果。實施例2將與實施例1所用相同HAMA反應物附著在取代實施例1的pochtem流感A/B的pochtemS流感(希森美康株式會社)的標記物附著墊中，製備本發明的免疫層析試驗用具。pochtemS流感與pochtem流感A/B同樣，在層析膜上的各判斷區和質控區固定有作為能與待測物結合的結合物對A型流感病毒的鼠單克隆抗體和對B型流感病毒的鼠單克隆抗體以及作為能與質控用標記物結合的物質生物素BSA，具有圖1(b)所示結構。比較例3比較例3使用了pochtemS流感。實驗例2用實施例1和2及比較例1和3的免疫層析試驗用具對採自患者的試樣進行實驗。試樣按照pochtem流感A/B或pochtemS流感的附屬說明書，通過用附屬的標本抽取試劑對從患者採集的生物樣本(鼻腔抽取21液、鼻腔拭液或咽喉拭液)進行處理而製備。將所得試樣約200pL添加到實施例1和2及比較例1和3的免疫層析試驗用具加樣區，與實驗例l同樣，進行判斷區的檢測線強度判斷。檢測線強度+w以上者判斷為流感病毒陽性。作為質控實驗，對同樣生物試樣用RT—PCR(反轉錄聚合酶連鎖反應)檢測流感病毒抗原。免疫層析試驗用具或RT—PCR判斷為陽性的試樣數如表2的"A"(A型流感病毒為陽性)、"B"(B型流感病毒為陽性)或"A/B"(A型和B型流感病毒均為陽性)欄所示。表2的"一"欄表示判斷為陰性的試樣數。[表2]22(A)比較例1的免疫層析實驗用具tableseeoriginaldocumentpage23從表2的結果得知，有的試樣(表2(A)(C)畫網格的欄)用RT—PCR法判斷為沒有流感病毒，但用傳統的免疫層析試驗用具時判斷為陽性，但用本發明的免疫層析試驗用具即使這種試樣也與RT—PCR的結果一致，能判斷為陰性。S卩，使用本發明的免疫層析試驗用具降低了假陽性的發生率。實施例3作為HAMA反應物，使用市場銷售的非特異吸收抗體(Biolink公司，單克隆用非特異去除劑，標籤號061002)取代實施例2用的HAMA反應物，製備本發明的免疫層析試驗用具。平均每測試條附著的HAMA反應物數量為7.2pg。實驗例3用實施例3和比較例3的免疫層析試驗用具，以HAMA血清(含人抗鼠抗體的血清)為試樣進行檢測線強度判斷。HAMA血清使用以下幾種HAMA血清1:BioReclamation(國際生物公司制)BRH22942HAMA血清2:BioReclamation(國際生物公司帝DBRH40929HAMA血清3:BioReclamation(國際生物公司制)BRH40930HAMA血清4:BioReclamation(國際生物公司制)BRH40932將上述HAMA血清150|uL與附屬於pochtemS流感的標本抽取試劑800]iL混合，製備試樣。將20(HiL試樣添加到各免疫層析試驗用具的加樣區，10分鐘後與實驗例1同樣進行檢測線強度判斷。作為陰性質控品(NC)使用了200pL標本抽取試劑。結果如表3所示。其中"一"表示目測未能確認判斷區顯色。另，表中雖無表示，但在整個實驗中，確認質控區顯色。即確認試樣適當展開。[表3]24tableseeoriginaldocumentpage25從表3的結果得知，使用市場銷售的非特異性吸收抗體作為HAMA反應物的本發明免疫層析試驗用具比以往的免疫層析試驗用具能夠降低假陽性的發生率。前述的詳細說明及附圖是通過文字解釋和圖示來進行的，其目的不在於限定權利要求的保護範圍。本說明書中的具體實施方式的各個變種對於普通技術人員來說顯而易見，並處於權利要求及其等同技術的保護範圍內。權利要求1.一種用於檢測試樣中所含待測物的免疫層析試驗用具，包括層析膜，具有固定了可以與待測物結合的結合物的判斷區；試樣展開墊，具有加樣區配置在比層析膜靠近試樣展開方向上遊位置，用於添加試樣；及標記物附著墊，配置於比加樣區靠近試樣展開方向下遊且比層析膜靠近試樣展開方向上遊的位置，用於附著可與待測物結合的標記物；其中，可與人抗鼠抗體反應的物質附著在配置於比層析膜靠近試樣展開方向上遊的墊中。2.權利要求1所述免疫層析試驗用具，其特徵在於可與人抗鼠抗體反應的物質附著在標記物附著墊。3.權利要求1所述免疫層析試驗用具，其特徵在於可與人抗鼠抗體反應的物質附著在試樣展開墊。4.權利要求1~3中任一所述免疫層析試驗用具，其特徵在於標記物附著墊配置在與試樣展開墊和層析膜有接觸的位置。5.權利要求13中任一所述免疫層析試驗用具，其特徵在於標記物附著墊與層析膜有一定間隔。6.權利要求1~3中任一所述免疫層析試驗用具，其特徵在於試樣展開墊與層析膜接觸配置。7.權利要求1~3中任一所述免疫層析試驗用具，其特徵在於試樣展開墊與層析膜有一定間隔。8.權利要求1所述免疫層析試驗用具，還包括配置在比層析膜靠近試樣展開方向下遊位置的吸收墊。9.權利要求8所述免疫層析試驗用具，其特徵在於吸收墊與層析膜有接觸。10.權利要求1所述免疫層析試驗用具，其特徵在於可與人抗鼠抗體反應的物質為可與人抗鼠抗體反應的抗體或可與人抗鼠抗體反應的抗體片段。11.權利要求IO所述免疫層析試驗用具，其特徵在於可與人抗鼠抗體反應的抗體是選自保藏於日本國家技術評估研究所專利微生物寄存中心，保藏日期為2007年9月25日，國際保藏號為NITEBP—420和國際保藏號為NITEBP—421之中的至少一種雜交瘤產生的單克隆抗體。12.權利要求1~3中任一所述免疫層析試驗用具，其特徵在於標記物附著墊還附著質控用標記物；層析膜還有固定可與質控用標記物結合的物質的質控區。13.權利要求1所述免疫層析試驗用具，還包括第二試樣展開墊，其配置在比加樣區靠近試樣展開方向下遊且比層析膜靠近試樣展開方向上遊的位置。14.權利要求13所述免疫層析試驗用具，其特徵在於可與人抗鼠抗體反應的物質附著在第二試樣展開墊。15.權利要求1所述免疫層析試驗用具，其特徵在於可與人抗鼠抗體反應的物質附著在墊中，以便與試樣一起展開。16.—種用免疫層析試驗用具檢測試樣中所含待測物的方法，該免疫層析試驗用具所含層析膜有一判斷區，其中固定有可與待測物結合的結合物。該方法包括以下步驟向免疫層析試驗用具添加試樣；使可與人抗鼠抗體反應的物質和可與待測物結合的標記物與試樣在配置於比層析膜靠近試樣展開方向上遊的墊中接觸；以及讓可與固定在判斷區的待測物結合的結合物與試樣接觸；檢測出通過待測物結合到判斷區的標記物質。17.—種用於檢測試樣中待測物的免疫層析試驗用具的製造方法，所述免疫層析試驗用具所含層析膜有一個用於檢測試樣中所含待測物的判斷區，所述判斷區中固定有可與待測物結合的結合物，其特徵在於包括讓可與人抗鼠抗體反應的物質附著在配置於比層析膜靠近試樣展開方向上遊的墊中的步驟。全文摘要本發明提供一種免疫層析試驗用具、用該免疫層析試驗用具檢測待測物的方法以及該免疫層析試驗用具的製作方法。該免疫層析試驗用具包含層析膜，層析膜有判斷區，該區域固定有可與待測物結合的結合物，可與人抗鼠抗體反應的物質附著在配置於比層析膜靠近試樣展開方向上遊的墊中。文檔編號G01N33/577GK101435819SQ20081014885公開日2009年5月20日申請日期2008年9月27日優先權日2007年9月28日發明者一口毅,村上真澄,長谷川武宏申請人:希森美康株式會社