一個與神經系統發育相關的人類新基因rhbdl2的製作方法

2023-12-08 23:22:56 2

專利名稱：一個與神經系統發育相關的人類新基因rhbdl2的製作方法
技術領域：
本發明涉及人類基因，具體是類rhomboid基因家族的人類新基因RHBDL2的cDNA全長克隆，它在人體胚胎發育過程中的詳細表達。
背景技術：
表皮生長因子受體控制著無脊椎動物和脊椎動物中細胞生長和發育的許多方面。舉例來說，在無脊椎動物如果蠅的胚胎中，表皮生長因子受體的信號參與了腹部上皮的形成，中線膠質細胞的分化，感覺器官前體細胞的特化，以及體壁肌肉的形成和氣管的形態建成。在幼蟲和蛹形成階段，其信號參與了卵子發生，光感受器的特化和翅脈的發育。表皮生長因子受體所具有的多重重要功能表明其信號在時間和空間上調控的精確性。而這種精確性又是通過其配體的多樣性來達到的。在脊椎動物中，已確定了3個配體TGF-α，EGF和Neuregulins，而在無脊椎動物(以果蠅為例)中，則有4個，Vein，Gurken和Spitz是起活化作用的，而Argos則是抑制的，其中發育上最重要的是Spitz，與其他的配體相比，它的轉錄在時間上和空間上都相當廣泛。和TGF-α這個哺乳動物中的同系物相似，Spitz合成為不活化的跨膜形式。而Spitz的信號可以傳播到數個細胞之遠表明它可以從細胞膜上釋放出來成為可溶的活化配體。這個過程依賴於Spitz跨膜部分的蛋白水解作用，並需要Rhomboid和Star的參與。
Rhomboid和Star基因編碼整合的膜蛋白，並對表皮生長因子受體信號起重要的正調節作用。Rhomboid和Star可以促使表皮生長因子受體非細胞自主性的活化，且這種活化可以通過表達Spitz胞外的可溶部分來達到。這表明Rhomboid和Star控制著膜結合的Spitz成為可溶性的活化配體這一過程。而Bang和Kintner的實驗表明Spitz的活化有一種不需要蛋白水解的途徑。一系列的證據表明Rhomboid和Star的功能是協作和互相依賴的，僅有其中一個只能很微弱的刺激表皮生長因子受體的活化。但在果蠅的眼發育中，表皮生長因子受體的活化並不受Rhomboid功能的影響，這表明可能有額外的蛋白與Rhomboid的功能相互重疊。相比之下，Rhomboid和Star對翅脈的形成是必須的，但Spitz對翅來說並不重要，這似乎暗示Rhomboid可能作用於一個未知的，獨立於Spitz的表皮生長因子配體來促進翅的發育。
Rhomboid編碼一個7-跨膜區蛋白，定位於細胞膜上並作用於表皮生長因子受體的上遊。最近在果蠅中有6個類rhomboid基因(rhomboid-2 to-7)己被鑑定，其中3個的全長cDNA以被分離，它們在7-跨膜區均高度保守。Rhomboid-3和Rhomboid最為相近，它們共同作用來控制果蠅眼發育中的細胞補充。Rhomboid的人類同系物已被鑑定出來，它的功能可能也是保守的。

發明內容
本發明的目的在於提供一個與神經系統發育相關的人類新基因RHBDL2，分析它在幾個不同時期人體胚胎的不同組織的表達水平及其在染色體上的定位，以探索其對神經系統的作用。
在研究果蠅發育的分子調節機理，並以此為模型研究人類的胚胎發育過程中，我們得到了本發明，即從人類早期胚胎腦cDNA文庫中分離得到一新的類rhomboid蛋白-RHBDL2。
本發明以類rhomboid基因家族蛋白的跨膜保守區用blastn去搜索dbEST，得到一條人類基因的同源物EST BG252873，用BG252873去搜索dbEST得到重疊EST並拼接成完整的開放閱讀框ORF，長共912bp，根據這條開放閱讀框設計一對特異性引物RH1s/RH1as，再以大腦文庫為模板，來擴增此開放閱讀框，並經T-載體克隆、測序。而後在此基礎上，分別用兩對引物RRH 1/UPM，NRRH 1/NUP和RRH2/UPM，NRRH2/NUP進行5′-RACE和3′-RACE快速擴增末端。其中RRH1/NRRH1，RRH2/NRRH2是基因特異引物，UPM和NUP由SMART RACE試劑盒提供，RACE反應分別得到了203bp和833bp的目的片段，經T-載體克隆、測序，它們為該基因的5′端和3′端，將它們拼接為全長cDNA，共1728bp，至此，我們得到了新基因的全長cDNA，經國際人類基因命名委員會批准命名為RHBDL2。
RHBDL2基因全長為1728bp，編碼303個胺基酸，大約41kD，起始密碼子ATG開始於核苷酸127，終止密碼子TGA在核苷酸1038的位置，在3′未翻譯區的核苷酸1687-1693的位置有一個加尾信號AAATAAA，SAMRT程序分析表明RHBDL2在靠近C-末端含一個相似的rhomboid區域，它包含一個7-跨膜區並含有3個非常保守的組氨酸，而在C-末端和N-末端則保守性相當小。
用DNASTAR程序的CLUSTAL分析其與類rhomboid基因家族的其它蛋白的同源發現，RHBDL2與果蠅的rhomboid最同源，同源度達42％，特別是在7-跨膜區(見圖1)。類rhomboid基因在許多種類的生物體中均有發現，是一個具有7-跨膜區的保守家族。這種驚人的保守性表明這些基因在不同的物種中具有類似的生化功能。
用全長cDNA檢索GenBank的Blastn nr，發現BAC AL139260.17上包含了該基因，RHBDL2在基因組上囊括了共約33kb長，有7個外顯子和6個內含子，根據BAC AL139260.17的定位，可知RHBDL2定位於1p32.3-34.1。我們已把RHBDL2的基因序列遞交到GenBank，受理號為AY126343。
進行19周，21周，24周，25周的人體胚胎各種組織總RNA膜的Northern雜交分析，結果表明該基因在人體胚胎發育過程中廣泛表達，(見圖2)，其在大腦和腎中表達最強，在肺和小腦中表達相對較弱，心臟，骨骼肌，脾，和腸中的表達則更弱，而在肝臟中的表達隨胚胎的發育逐漸減弱並在第25周消失。這暗示了RHBDL2在胚胎發育過程中的起作用，並與神經系統的發育相關。
本發明的優點1.提供了一個人類新基因RHBDL2基因的全長cDNA序列，並描述了其編碼的蛋白產物與不同物種中類rhomboid基因的同源性，證明了該基因是類rhomboid基因家族成員之一。
2.該基因編碼的蛋白產物具有7-跨膜區，它在不同物種中的保守性表明這些基因具有類似的生化功能。
3.該基因在人體胚胎發育過程中廣泛表達，並在大腦和腎中表達最強，說明該基因胚胎發育過程中的起重要作用，並與神經系統的發育相關。
本發明通過以下附圖和實施例作進一步闡述，但並不限制本發明的範圍。


圖1.RHBDL2的胺基酸與不同物種中類rhomboid基因胺基酸的同源比較圖中黑色陰影表示胺基酸同源部分。
圖2.RHBDL2在人類組織的Northern雜交A-19周胚胎組織B-21周胚胎組織C-24周胚胎組織D-25周胚胎組織圖中1肝 2腸 3腎上腺 4心臟 5肺 6大腦 7小腦 8腎 9骨骼肌10胃 11脾 12皮膚 13胰腺 14舌
具體實施例方式RHBDL2基因的克隆測序與表達1 GenBank搜索篩選新基因以類rhomboid基因家族蛋白的跨膜保守區用blastn去搜索dbEST，得到一條人類基因的同源物EST BG252873，用BG252873去搜索dbEST得到重疊EST並拼接成完整的開放閱讀框ORF。
根據這條開放閱讀框設計引物RH1ssense 5′-AGGGAATTCGACAATGGCTGCTGCTGTTCARH1as antisense 5′-GACGAATTCTAGGGGCAGGTCTGTTTGC再以大腦文庫為模板，反應條件為94℃4分鐘；然後94℃30秒，55℃30秒，72℃90秒，30個循環；最後72℃10分鐘，來擴增此開放閱讀框。擴增的帶，並經T-載體克隆、挑選轉化子去測序。測序結果證實了此開放閱讀框，長共912bp。
2 RHBDL2全長cDNA的克隆和測序以開放閱讀框的cDNA序列設計RACE引物RRH1 antisense5′-GGAGGCGGGAAGCAGTTANRRH1 antisense5′-CCTCCAGCTCTTCTTTCATCTCRRH2 sense5′-GCTCTGATGGGAGGCTATNRRH2 sense5′-GAATGTCCATTGGCTACACG利用CLONTECH公司的SMART RACE試劑盒做5′端和3′端的RACE。
本實驗中取腦組織mRNA 5ug為模板。具體操作按該公司protocol進行。
將RACE產物克隆入T載體並測序獲得RHBDL2的5′端和3′端序列，將它們拼接為全長cDNA。
3 Northern雜交(1).組織總RNA的提取按「一種快速的總RNA提取方法」，進行。(《生命科學研究》，5(1)88-90(2001)王雁雲，羅開梅等)(2).總RNA的電泳及轉膜，均按《現代分子生物學實驗技術》介紹的方法進行(盧聖棟主編，第二版)。
(3).Northern雜交將轉有20ug人體胚胎多種組織的總RNA的尼龍膜，放入培養皿中，加入10ml 42℃預熱的預雜交液，42℃預雜交30分鐘，加入變性的同位素標記的RHBDL2的cDNA片段，42℃雜交過夜。用2XSSC，0.05％SDS，42℃洗兩次，15分鐘/次；0.1XSSC，0.1％SDS，42℃洗兩次，15分鐘/次。
(4).-80℃曝光幾天，洗X光片。
(5).用0.1×SSC和0.5％SDS在95℃洗10分鐘膜用β-actin cDNA重新標記，做Northern雜交進行陽性對照。
RHBDL2 cDNA的核苷酸序列和編碼的胺基酸序列ggaaaggcct tggaaagcag tcgttgcgcc agacagccca gggaagagcg gcagcctgag 60gacctagggc cacctgctgt tccctgggat tcatgtcctt ctggggagga gggaggaccc 120aggaca atg gct gct 135Met Ala Ala1gtt cat gat ctg gag atg gag agc atg aat ctg aat atg ggg aga180Val His Asp Leu Glu Met Glu Ser Met Asn Leu Asn Met Gly Arg5 10 15gag atg aaa gaa gag ctg gag gaa gag gag aaa atg aga gag gat225Glu Met Lys Glu Glu Leu Glu Glu Glu Glu Lys Met Arg Glu Asp20 25 30ggg gga ggt aaa gat cgg gcc aag agt aaa aag gtc cac agg att270Gly Gly Gly Lys Asp Arg Ala Lys Ser Lys Lys Val His Arg Ile35 40 45gtc tca aaa tgg atg ctg ccc gaa aag tcc cga gga aca tac ttg315Val Ser Lys Trp Met Leu Pro Glu Lys Ser Arg Gly Thr Tyr Leu50 55 60gag aga gct aac tgc ttc ccg cct ccc gtg ttc atc atc tcc atc360Glu Arg Ala Asn Cys Phe Pro Pro Pro Val Phe Ile Ile Ser Ile65 70 75agc ctg gcc gag ctg gca gtg ttt att tac tat gct gtg tgg aag405Ser Leu Ala Glu Leu Ala Val Phe Ile Tyr Tyr Ala Val Trp Lys80 85 90cct cag aaa cag tgg atc acg ttg gac aca ggc atc ttg gag agt450Pro Gln Lys Gln Trp Ile Thr Leu Asp Thr Gly Ile Leu Glu Ser95 100 105ccc ttt atc tac agt cct gag aag agg gag gaa gcc tgg agg ttt495Pro Phe Ile Tyr Ser Pro Glu Lys Arg Glu Glu Ala Trp Arg Phe110 115 120atc tca tac atg ctg gta cat gct gga gtt cag cac atc ttg ggg540Ile Ser Tyr Met Leu Val His Ala Gly Val Gln His Ile Leu Gly125 130 135aat ctt tgt atg cag ctt gtt ttg ggt att ccc ttg gaa atg gtc585Asn Leu Cys Met Gln Leu Val Leu Gly Ile Pro Leu Glu Met Val140 145 150cac aaa ggc ctc cgt gtg ggg ctg gtg tac ctg gca gga gtg att630His Lys Gly Leu Arg Val Gly Leu Val Tyr Leu Ala Gly Val Ile155 160 165gca ggg tcc ctt gcc agc tcc atc ttt gac cca ctc aga tat ctt675Ala Gly Ser Leu Ala Ser Ser Ile Phe Asp Pro Leu Arg Tyr Leu170 175 180gtg gga gct tca gga gga gtc tat gct ctg atg gga ggc tat ttt720(續後)
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RHBDL2的開放閱讀框核苷酸序列atggctgctg ttcatgatct ggagatggag agcatgaatc tgaatatggg gagagagatg 60aaagaagagc tggaggaaga ggagaaaatg agagaggatg ggggaggtaa agatcgggcc 120aagagtaaaa aggtccacag gattgtctca aaatggatgc tgcccgaaaa gtcccgagga 180acatacttgg agagagctaa ctgcttcccg cctcccgtgt tcatcatctc catcagcctg 240gccgagctgg cagtgtttat ttactatgct gtgtggaagc ctcagaaaca gtggatcacg 300ttggacacag gcatcttgga gagtcccttt atctacagtc ctgagaagag ggaggaagcc 360tggaggttta tctcatacat gctggtacat gctggagttc agcacatctt ggggaatctt 420tgtatgcagc ttgttttggg tattcccttg gaaatggtcc acaaaggcct ccgtgtgggg 480ctggtgtacc tggcaggagt gattgcaggg tcccttgcca gctccatctt tgacccactc 540agatatcttg tgggagcttc aggaggagtc tatgctctga tgggaggcta ttttatgaat 600gttctggtga attttcaaga aatgattcct gcctttggaa ttttcagact gctgatcatc 660atcctgataa ttgtgttgga catgggattt gctctctata gaaggttctt tgttcctgaa 720gatgggtctc cggtgtcttt tgcagctcac attgcaggtg gatttgctgg aatgtccatt 780ggctacacgg tgtttagctg ctttgataaa gcactgctga aagatccaag gttttggata 840gcaattgctg catatttagc ttgtgtctta tttgctgtgt ttttcaacat tttcctatct 900ccagcaaact ga 91權利要求
1.一個與神經系統發育相關的人類新基因RHBDL2，其特徵在於該基因的cDNA核苷酸序列和編碼胺基酸序列如下ggaaaggcct tggaaagcag tcgttgcgcc agacagccca gggaagagcg gcagcctgag 60gacctagggc cacctgctgt tccctgggat tcatgtcctt ctggggagga gggaggaccc 120aggaca atg gct gct 135Met Ala Ala1gtt cat gat ctg gag atg gag agc atg aat ctg aat atg ggg aga180Val His Asp Leu Glu Met Glu Ser Met Asn Leu Asn Met Gly Arg5 10 15gag atg aaa gaa gag ctg gag gaa gag gag aaa atg aga gag gat225Glu Met Lys Glu Glu Leu Glu Glu Glu Glu Lys Met Arg Glu Asp20 25 30ggg gga ggt aaa gat cgg gcc aag agt aaa aag gtc cac agg att270Gly Gly Gly Lys Asp Arg Ala Lys Ser Lys Lys Val His Arg Ile35 40 45gtc tca aaa tgg atg ctg ccc gaa aag tcc cga gga aca tac ttg315Val Ser Lys Trp Met Leu Pro Glu Lys Ser Arg Gly Thr Tyr Leu50 55 60gag aga gct aac tgc ttc ccg cct ccc gtg ttc atc atc tcc atc360Glu Arg Ala Asn Cys Phe Pro Pro Pro Val Phe Ile Ile Ser Ile65 70 75agc ctg gcc gag ctg gca gtg ttt att tac tat gct gtg tgg aag405Ser Leu Ala Glu Leu Ala Val Phe Ile Tyr Tyr Ala Val Trp Lys80 85 90cct cag aaa cag tgg atc acg ttg gac aca ggc atc ttg gag agt450Pro Gln Lys Gln Trp Ile Thr Leu Asp Thr Gly Ile Leu Glu Ser95 100 105ccc ttt atc tac agt cct gag aag agg gag gaa gcc tgg agg ttt495Pro Phe Ile Tyr Ser Pro Glu Lys Arg Glu Glu Ala Trp Arg Phe110 115 120atc tca tac atg ctg gta cat gct gga gtt cag cac atc ttg ggg540Ile Ser Tyr Met Leu Val His Ala Gly Val Gln His Ile Leu Gly125 130 135aat ctt tgt atg cag ctt gtt ttg ggt att ccc ttg gaa atg gtc585Asn Leu Cys Met Gln Leu Val Leu Gly Ile Pro Leu Glu Met Val140 145 150cac aaa ggc ctc cgt gtg ggg ctg gtg tac ctg gca gga gtg att630His Lys Gly Leu Arg Val Gly Leu Val Tyr Leu Ala Gly Val Ile155 160 165gca ggg tcc ctt gcc agc tcc atc ttt gac cca ctc aga tat ctt675Ala Gly Ser Leu Ala Ser Ser Ile Phe Asp Pro Leu Arg Tyr Leu170 175 180gtg gga gct tca gga gga gtc tat gct ctg atg gga ggc tat ttt720Val Gly Ala Ser Gly G1y Val Tyr Ala Leu Met Gly Gly Tyr Phe185 190 195atg aat gtt ctg gtg aat ttt caa gaa atg att cct gcc ttt gga765Met Asn Val Leu Val Asn Phe Gln Glu Met Ile Pro Ala Phe Gly200 205 210att ttc aga ctg ctg atc atc atc ctg ata att gtg ttg gac atg810Ile Phe Arg Leu Leu Ile Ile Ile Leu Ile Ile Val Leu Asp Met215 220 225gga ttt gct ctc tat aga agg ttc ttt gtt cct gaa gat ggg tct855Gly phe Ala Leu Tyr Arg Arg Phe Phe Val Pro Glu Asp Gly Ser230 235 240ccg gtg tct ttt gca gct cac att gca ggt gga ttt gct gga atg900Pro Val Ser Phe Ala Ala His Ile Ala Gly Gly Phe Ala Gly Met245 250 255tcc att ggc tac acg gtg ttt agc tgc ttt gat aaa gca ctg ctg945Ser Ile Gly Tyr Thr Val Phe Ser Cys Phe Asp Lys Ala Leu Leu260 265 270aaa gat cca agg ttt tgg ata gca att gct gca tat tta gct tgt990Lys Asp Pro Arg Phe Trp Ile Ala Ile Ala Ala Tyr Leu Ala Cys275 280 285gtc tta ttt gct gtg ttt ttc aac att ttc cta tct cca gca aac1035Val Leu Phe Ala Val Phe Phe Asn Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asn290 295 300 303tgacctgccc ctattgtaag tcaattaata aaaagagcca tctggaggaa ataaaaaaaa 1095aaggaagact ctatgaagaa acagagaagt ctcagaaaag gctaacaatt ttatatagag 1155gacaaaacag cattaaactc atcagttgca aagattgcct ataaaaggac cttaggattt 1215aaggaagggg cttcttaatg tagaaaggga actacaaaga tgagaaatta ccagaagcct 1275cgccttttcc taagcaccag cggaaggagc tgtgccccgg gatggagtga gggtggaggg 1335cgcgtcagcc acgggtgggc cttgtgtcgc ctcgtatcgg cccaggtagg ttgttggcct 1395cttacttggg ctgacctgac ccccgaaaga gaaacagaca actctgttct caggattggg 1455gatggacggc ttcggccaag cgttttagcc tcattcactc aggccccact cagcactctg 1515ccagccaaga ccattgattt ggaaaatccg gtccccaccc gctaatgagc tgttgacact 1575gttgttcctt gctgaattgg attgttgact tgtagttcag aggcgtacaa ctagttggcg 1635attagacttg ttatgtgatg ttaccagcct gaaatgcgat caccccgtag gaaataaagc 1695aggcatctct ggacctcaaa aaaaaaaaaa aaa 1728
全文摘要
一個與神經系統發育相關的人類新基因RHBDL2涉及人類基因。該基因的cDNA全長1728bp，定位於1p32.3－34.1，編碼303個胺基酸，大約41KD；該基因在人體胚胎發育中廣泛表達，並在大腦和腎中表達最強，因此說明該基因對胚胎發育起重要作用，並與神經系統發育相關。
文檔編號C07K14/47GK1490325SQ0213975
公開日2004年4月21日 申請日期2002年11月12日 優先權日2002年11月12日
發明者吳秀山, 袁婺洲, 叫瑋, 劉明耀, 朱傳炳, 王躍群, 李永青 申請人:湖南師範大學