一種同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重rt－pcr方法及專用試劑盒的製作方法

2023-12-09 03:36:41 1

專利名稱：一種同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重rt－pcr方法及專用試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病的方法，尤其涉及一種同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT-PCR方法及專用試劑盒。
背景技術：
牛輪狀病毒(bovine rotavirus，BRV)和牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrheavirus，BVDV)是兩種引起牛病毒性腹瀉的重要病原體。BRV可引起新生犢牛嚴重腹瀉，英國的調查顯示，其發病率為60-80％，給養牛業造成很大經濟損失。BVDV也是一種廣泛存在於世界各國牧場牛群中的病原體，國內王新平等對內蒙古、吉林、寧夏等不同地區進行流行病學調查發現其感染率為16.5-89％。目前隨著我國奶牛養殖業規模化、集約化程度的提高，牛腹瀉病特別是新生犢牛腹瀉病成為困擾我國奶牛養殖業的主要疾病之一，嚴重阻礙了我國奶牛養殖業的發展。腹瀉病的病原有多種，主要包括細菌性病原和病毒性病原。近年來隨著奶牛養殖規模的擴大，由多種病原的混合感染的病例在臨床上屢見不鮮。輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的混合感染就是其中的一種，發病率雖然較低，但死亡率很高，達70％以上。另外由這兩種病原引起的腹瀉症狀相似，臨床上很難區分。
目前，已有多種檢測BRV和BVDV的方法，如病毒分離法、中和試驗、瓊擴試驗、電鏡觀察、ELISA、核酸探針、RT-PCR等，但特異性的針對牛腹瀉病的快速診斷方法研究較少，傳統的病毒分離、電鏡觀察、中和試驗等方法耗時長，需7-10天才能出診斷結果，而ELISA、瓊擴試驗、核酸探針等方法敏感性和特異性較差。另外，查閱國內文獻資料尚沒有關於同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的診斷方法的研究。因此，建立一種同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的快速診斷方法對於腹瀉病的流行病學調查、實驗室快速鑑別診斷及疾病防治具有重要的意義。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是利用雙重RT-PCR技術建立一種同時快速檢測牛輪轉病毒和牛病毒性腹瀉病毒的方法，並進一步細化製備出相應的診斷試劑盒，為牛腹瀉病的快速診斷和流行病學調查提供技術支持。
本發明所述的同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT-PCR方法，步驟包括樣品的採集，病毒RNA的提取，特異性引物的設計，RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳，結果判定；其特徵在於所述特異性引物包括牛輪狀病毒特異性擴增引物和牛病毒性腹瀉病毒特異性擴增引物，其序列是牛輪狀病毒所用的特異性擴增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹瀉病毒所用的特異性擴增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P4 5`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`；所述RT-PCR擴增採用兩步法，反轉錄時使用的引物為長9bp的隨機引物(5`-NNNNNNNNN-3`)，PCR反應時在1個PCR反應管中同時加入了牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的特異性上、下遊引物P1、P2、P3、P4，其中RT-PCR反轉錄反應體系為10μl，包含有RNA模板2μl，MgCl22μl，10倍反轉錄緩衝液1μl，DEPC處理水2.75μl，dNTP 1μl，RNase抑制劑0.25μl，AMV反轉錄酶0.5μl，隨機引物0.5μl；反應條件為30℃10min，42℃30min，95℃5min，5℃5min；PCR反應體系為50μl，反轉錄反應後在反轉錄反應管中加入PCR緩衝液10μl，引物P1、P2、P3、P4各0.1μl，Taq酶0.25μl，滅菌三蒸水29.35μl；PCR反應條件為94℃預變性2min，94℃30s，55℃30s，72 1min，共30個循環，然後72℃10min；所述結果判定是以陽性對照PCR產物電泳後產生的342bp和196bp條帶為標準對樣品的結果進行判定，樣品結果產生342bp條帶的，判定為輪狀病毒感染；樣品結果產生196bp條帶的，判定牛病毒性腹瀉病毒感染；樣品結果同時產生342bp和196bp兩個條帶的，判定為牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒混合感染；樣品結果沒有任何條帶的，則判為陰性。
本發明所述的同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT-PCR專用試劑盒，包括樣品病毒RNA提取試劑，反轉錄試劑盒，PCR試劑盒，陽性對照品和陰性對照品；其特徵在於所述反轉錄試劑盒由15mM MgCl2，10倍反轉錄緩衝液，DEPC處理水；dNTP；RNase抑制劑；AMV反轉錄酶；50μM隨機引物組成，保存溫度-20℃；其反應體系為MgCl22μl，10倍反轉錄緩衝液1μl，DEPC處理水2.75μl，dNTP 1μl，RNase抑制劑0.25μl，AMV反轉錄酶0.5μl，隨機引物0.5μl，RNA模板2μl；所述PCR試劑盒由PCR緩衝液，20mM牛輪狀病毒特異性擴增引物和牛病毒性腹瀉病毒特異性擴增引物P1、P2、P3、P4，Taq酶，滅菌三蒸水組成，保存溫度-20℃；其反應體系為PCR緩衝液10μl，牛輪狀病毒所用的特異性擴增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹瀉病毒所用的特異性擴增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P45`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`各0.1μl，Taq酶0.25μl，滅菌三蒸水29.35μl。
RT-PCR方法可以針對不同的靶序列進行快速、準確的診斷，在國內外得到了廣泛應用。本發明依據RT-PCR方法針對牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒設計了兩對特異性引物，建立了能夠同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT-PCR方法，可在一次RT-PCR反應中同時檢測出引起牛腹瀉的兩種病毒(牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒)，檢測敏感性為1pg病毒RNA，具有很好的特異性和敏感性，本發明方法與病毒分離、中和試驗、ELISA、核酸探針等方法相比，明顯地降低了檢測成本和檢測時間，非常適於牛病毒性腹瀉病的試驗室快速診斷和流行病學研究。
本發明方法與分別檢測兩種病毒的RT-PCR方法相比，同樣很大程度上降低了檢測時間和檢測成本，本發明方法僅需4個多小時即可出結果，每份樣品的檢測費用也只有約30元。


圖11％瓊脂糖凝膠電泳示各個毒株RT-PCR檢測結果其中1.BVDV分離株；2.BVDV標準株；3.BRV和BVDV分離株；4.BRV和BVDV標準株(oregon C24v)；5.BRV CHLY分離株；6.BRV標準株(NCDV)。
圖2瓊脂糖凝膠電泳示分別提取牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的細胞培養物、雞輪狀病毒、豬瘟病毒以及正常細胞培養物RNA進行RT-PCR試驗結果(特異性擴增結果)其中1.正常細胞培養物；2.豬瘟病毒；3.雞輪狀病毒；4.BRV和BVDV。
結果BRV和BVDV組能得到目的條帶，其它均沒有擴增出任何條帶。
圖3瓊脂糖凝膠電泳示對不同濃度的RNA進行RT-PCR擴增檢測敏感性試驗結果其中1. 1pg RNA；2. 10pgRNA；3. 100pg RNA；4. 1μg RNA。
結果發現本方法能檢測出1pg的病毒RNA。
具體實施例方式
實施例11.樣品採集與處理採腹瀉牛糞便樣品約10g，將糞便樣品加滅菌生理鹽水製備成1∶5糞便懸液，4000rpm/min，離心10min，取上清備用；或屍體剖檢時採取腸繫膜淋巴結、腸管黏膜或脾臟低溫保存送試驗室，取以上組織樣品約5g，剪碎，加滅菌生理鹽水研磨，然後，4000rpm/min，離心10min，取上清備用。
2.樣品RNA模板的提取(1)取步驟1上清液500μl加入1.5ml離心管，然後加入500μl TRIZOL LS，充分混勻，室溫放置10min。
(2)加入200μl氯仿，用力振蕩，使溶液呈乳白色，無分相，室溫放置10min。
(3)4℃13000rpm/min離心15min，取上層液相移入另一離心管(勿吸動白色中間相)。
(4)加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min。
(5)4℃13000rpm/min離心15min，小心吸去上清。
(6)1ml 75％乙醇洗一遍，4℃ 8000rpm/min離心10min，小心吸去上清，乾燥5min。
(7)加入10μl DEPC處理水，然後立即做反轉錄。若要保存，置-20℃，可保存1個月左右。
3.使用本發明所述RT-PCR方專用試劑盒進行以下試驗(1)反轉錄反應反應體系為10μl，在200μl的PCR反應管中依次加入10倍反轉錄緩衝液1μl，DEPC處理水2.75μl，MgCl22μl，dNTP 1μl，隨機引物(5`-NNNNNNNNN-3`)0.5μl，RNA模板2μl，RNase抑制劑0.25μl，AMV反轉錄酶0.5μl。
反應條件為30℃10min，42℃30min，95℃5min，5℃5min。
同時設1個陽性對照和1個陰性對照，反應體系和反應條件同上，不同的是分別以該試劑盒的陽性對照品(輪狀病毒和病毒性腹瀉病毒的RNA模板，其濃度為100ng/ul)和陰性對照品(DEPC水)代替樣品RNA。
(2)PCR反應反應體系為50μl。反轉錄反應後在反轉錄管中加入PCR緩衝液10μl，牛輪狀病毒所用的特異性擴增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹瀉病毒所用的特異性擴增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P4 5`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`各0.1μl，Taq酶0.25μl，滅菌三蒸水29.35μl。
PCR反應條件為94℃預變性2min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30個循環，然後72℃10min。
(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測各取5μl PCR產物與DL 2000Marker，分別與1μl加樣緩衝液混勻後加樣於1％的瓊脂糖凝膠，80V電泳30-40min，利用凝膠成像系統照相，分析電泳結果。
(4)結果判定首先看陽性管與陰性管PCR產物的電泳結果，陽性管PCR產物電泳後應產生兩條帶，分別為342bp和196bp，而陰性管沒有條帶。然後再看樣品管的結果，如果產生342bp的條帶，判定為輪狀病毒感染；如果產生196bp的條帶，判定牛病毒性腹瀉病毒感染，如果產生342bp和196bp兩個條帶，判定輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒混合感染；如果沒有任何條帶則判為陰性。
權利要求
1.一種同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT-PCR方法，步驟包括樣品的採集，病毒RNA的提取，特異性引物的設計，RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳，結果判定；其特徵在於所述特異性引物包括牛輪狀病毒特異性擴增引物和牛病毒性腹瀉病毒特異性擴增引物，其序列是牛輪狀病毒所用的特異性擴增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹瀉病毒所用的特異性擴增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P4 5`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`；所述RT-PCR擴增採用兩步法，反轉錄時使用的引物為長9bp的隨機引物(5`-NNNNNNNNN-3`)，PCR反應時在1個PCR反應管中同時加入了牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒的特異性上、下遊引物P1、P2、P3、P4，其中RT-PCR反轉錄反應體系為10μl，包含有RNA模板2μl，MgCl22μl，10倍反轉錄緩衝液1μl，DEPC處理水2.75μl，dNTP 1μl，RNase抑制劑0.25μl，AMV反轉錄酶0.5μl，隨機引物0.5μl；反應條件為30℃ 10min，42℃ 30min，95℃ 5min，5℃ 5min；PCR反應體系為50μl，反轉錄反應後在反轉錄反應管中加入PCR緩衝液10μl，引物P1、P2、P3、P4各0.1μl，Taq酶0.25μl，滅菌三蒸水29.35μl；PCR反應條件為94℃預變性2min，94℃ 30s，55℃ 30s，72 1min，共30個循環，然後72℃ 10min；所述結果判定是以陽性對照PCR產物電泳後產生的342bp和196bp條帶為標準對樣品的結果進行判定，樣品結果產生342bp條帶的，判定為輪狀病毒感染；樣品結果產生196bp條帶的，判定牛病毒性腹瀉病毒感染；樣品結果同時產生342bp和196bp兩個條帶的，判定為牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒混合感染；樣品結果沒有任何條帶的，則判為陰性。
2.權利要求1所述的同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT-PCR專用試劑盒，包括樣品病毒RNA提取試劑，反轉錄試劑盒，PCR試劑盒，陽性對照品和陰性對照品；其特徵在於所述反轉錄試劑盒由15mM MgCl2，10倍反轉錄緩衝液，DEPC處理水；dNTP；RNase抑制劑；AMV反轉錄酶；50μM隨機引物組成，保存溫度-20℃；其反應體系為MgCl22μl，10倍反轉錄緩衝液1μl，DEPC處理水2.75μl，dNTP 1μl，RNase抑制劑0.25μl，AMV反轉錄酶0.5μl，隨機引物0.5μl，RNA模板2μl；所述PCR試劑盒由PCR緩衝液，20mM牛輪狀病毒特異性擴增引物和牛病毒性腹瀉病毒特異性擴增引物P1、P2、P3、P4，Taq酶，滅菌三蒸水組成，保存溫度-20℃；其反應體系為PCR緩衝液10μl，牛輪狀病毒所用的特異性擴增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹瀉病毒所用的特異性擴增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P4 5`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`各0.1μl，Taq酶0.25μl，滅菌三蒸水29.35μl。
全文摘要
本發明公開了一種同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的雙重RT－PCR方法，包括樣品的採集，病毒RNA的提取，特異性引物的設計，RT－PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳，結果判定等步驟；本發明同時還公開了同時檢測牛輪狀病毒與牛病毒性腹瀉病毒的專用試劑盒，包括樣品病毒RNA提取試劑，反轉錄試劑盒，PCR試劑盒，陽性對照品和陰性對照品。利用本發明方法和試劑盒可在一次RT－PCR反應中同時檢測出引起牛腹瀉的兩種病毒，檢測敏感性為1pg病毒RNA，具有很好的特異性和敏感性，本發明方法與病毒分離、中和試驗、ELISA、核酸探針等方法相比，明顯地降低了檢測成本和檢測時間，非常適於牛病毒性腹瀉病的試驗室快速診斷和流行病學研究。
文檔編號C12Q1/68GK101063176SQ20071001445
公開日2007年10月31日 申請日期2007年5月23日 優先權日2007年5月23日
發明者楊少華, 王長法, 高運東, 楊宏軍 申請人:山東奧克斯生物技術有限公司