檢測尿液中單羥酚類代謝物的試劑盒及其製備方法與流程
2023-12-09 04:45:01 1
本發明涉及腫瘤標誌物檢測技術領域，尤其是涉及一種檢測尿液中單羥酚類代謝物的試劑盒及其製備方法。
背景技術：
腫瘤標誌物是指在腫瘤的發生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身所產生的或者是由機體對腫瘤細胞反應而產生的，反映腫瘤存在和生長的一類物質，包括蛋白質、激素、酶(同工酶)及癌基因產物等。化驗患者血液或體液中的腫瘤標誌物，可在腫瘤普查中早期發現腫瘤,並觀察腫瘤治療的療效以及判斷患者預後。
單羥酚類代謝物(即酪氨酸、色氨酸等)作為腫瘤標誌物，已經被眾多學者所認知，例如CN102004103、快速尿液單羥酚代謝物檢測在惡性腫瘤中的診斷價值(檢驗醫學與臨床，2016第6期，李興翠等)、尿液單羥酚類代謝物檢測在惡性腫瘤早期預測中的應用價值(檢驗醫學與臨床，2015年第16期，黃學梅等)。
目前這些檢測方法均為無機化學試劑檢測法，無機化學檢測法的優點是檢測試劑製備簡單。但是，尿液中的單羥酚類代謝物的含量是及其微量的，並且尿液中還存在多種其他多種成分會影響檢測結果，因此，開發一種更為精密、特異性更高的檢測方法迫在眉睫。
技術實現要素：
針對現有技術存在的上述問題，本申請人提供了一種檢測尿液中單羥酚類代謝物的試劑盒及其製備方法。本發明對尿液中微量的單羥酚類代謝物具有特異性檢測功能，檢測方法簡單、快速，準確率高。
本發明的技術方案如下：
檢測尿液中單羥酚類代謝物的試劑盒，包括盛裝有檢測試劑的安瓿瓶，所述檢測試劑為吸附有顯色混合物的殼聚糖複合纖維素氣凝膠。其製備方法為：
(1)將天然纖維素進行溶解，得到纖維素溶液，再將纖維素溶液流延或塗覆成膜狀，通過凝固再生和水洗，製備成厚度為20～25微米的纖維素膜；
(2)在步驟(1)製備得到的纖維素膜上流延或塗覆一層殼聚糖溶液，凝固後得到一層厚度為20～25微米的殼聚糖膜；
(3)用無水乙醇對步驟(2)得到的纖維素-殼聚糖複合膜進行置換，去除其中的水分，然後將纖維素-殼聚糖複合膜反轉放置，使纖維素膜位於上方；
(4)在步驟(3)得到的纖維素-殼聚糖複合膜的纖維素膜上流延或塗覆一層殼聚糖溶液，凝固後得到一層厚度為20～25微米的殼聚糖膜，得到殼聚糖-纖維素-殼聚糖複合膜；
(5)用無水乙醇對步驟(4)得到的殼聚糖-纖維素-殼聚糖複合膜進行置換，去除其中的水分，然後經冷凍乾燥或臨界乾燥，得到殼聚糖-纖維素-殼聚糖複合氣凝膠；
(6)將酪氨酸酶和色氨酸酶按照2:1的質量比混合均勻得到酶混合物，並且將高碘酸鈉和2,4-二硝基苯阱、氫氧化鈉按照2:1:0.5的質量比混合均勻得到標記混合物；
(7)將酶混合物和標記混合物按照2～3:1的質量比混合，然後置於去離子水配製成固體質量分數為15～20％的混懸液，然後將步驟(5)得到的複合氣凝膠放入該混懸液中，在水浴振蕩器中振蕩固定3～5小時，即得。
所述酪氨酸酶和色氨酸酶為市售哺乳動物酪氨酸酶和色氨酸酶。優選的，所述酪氨酸酶和色氨酸酶為市售人酪氨酸酶和色氨酸酶或大鼠酪氨酸酶和色氨酸酶。
其檢測方法為：檢驗時溫度20℃左右為宜，取新鮮清潔尿樣(最好是早晨第一次尿液)3ml加入裝有試劑的安瓿瓶中，搖勻後靜放3～5分鐘，然後與比色卡進行比色，如果是無色到黃色，則是陰性；如果是粉色、紫色或者紅色、棕色，則為陽性；如果是其他顏色，則為無效。
氣凝膠是一種具有納米結構的多孔材料，其孔隙率高達90％以上，密度最低可至0.001g/cm3，是目前世界上最輕的固體材料之一。它明顯不同於孔洞結構在微米和毫米級的多孔材料，具有極大的比表面積。由於其特有的納米多孔、三維網絡結構，使其具有許多獨特的性能。殼聚糖複合纖維素氣凝膠的微觀結構是具有超大比表面積的三維立體網絡狀蜂窩結構，每個微小蜂窩中都吸附有若干個酪氨酸酶。本發明製備得到的雙層氣凝膠的結構更為疏鬆，比表面積更大，可以達到500m2/g，並且纖維素和殼聚糖都是親生物性材料，不會對酪氨酸酶產生影響。
酪氨酸酶和色氨酸酶通過固定酶的方法固定在雙層氣凝膠的孔隙中，這種方法可以使酪氨酸酶和色氨酸酶牢固粘結在氣凝膠孔隙中，不需要小心翼翼的搬運，更為適合普通人購買、運送和使用。並且固定化酶的方法可以使酪氨酸酶和色氨酸酶更為均勻的分布，並且是單層分布。這使得在氣凝膠的空隙中，在平均單位面積上有最多的單層酪氨酸酶存在，當其遇到酪氨酸時，可以有最高的靈敏度和反應速度。
酪氨酸酶和色氨酸酶來自於市售的人酪氨酸酶；其他哺乳動物如大鼠酪氨酸酶也可以用。酪氨酸酶與尿液中的酪氨酸接觸以後，迅速的將酪氨酸分解為鄰苯二酚。顯色試劑為高碘酸鈉粉末，鄰苯二酚與高碘酸鈉反應生成鄰苯二琨，呈粉紅色，可以由肉眼觀察到。色氨酸酶與尿液中的色氨酸接觸以後可以分解為丙酮酸、吲哚等物質，其中所含的丙酮酸可與2,4-二硝基苯阱反應，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯蹤，其在鹼性溶液中呈櫻紅色。
本發明有益的技術效果在於：
本發明提供的試劑盒檢測方法簡單，便於各種人群自測；檢測時間短，顯色效果明顯，檢測者無需專業知識即可進行判斷；檢測效果靈敏，準確率高，適於大範圍推廣應用。
具體實施方式
下面結合實施例，對本發明進行具體描述。
實施例1
一種檢測尿液中單羥酚類代謝物的試劑盒，包括盛裝有檢測試劑的安瓿瓶，所述檢測試劑為吸附有顯色混合物的殼聚糖複合纖維素氣凝膠。其製備方法為：
(1)用氫氧化鈉將天然纖維素進行溶解，得到4wt％的纖維素溶液，再將纖維素溶液流延或塗覆成膜狀，通過凝固再生和水洗，製備成厚度為20微米的纖維素膜；
(2)在步驟(1)製備得到的纖維素膜上流延或塗覆一層殼聚糖溶液，溶解殼聚糖的溶劑為乙酸，製備得到的殼聚糖濃度為5wt％；凝固後得到一層厚度為20微米的殼聚糖膜；
(3)用無水乙醇對步驟(2)得到的纖維素-殼聚糖複合膜進行置換，去除其中的水分，然後將纖維素-殼聚糖複合膜反轉放置，使纖維素膜位於上方；
(4)在步驟(3)得到的纖維素-殼聚糖複合膜的纖維素膜上流延或塗覆一層殼聚糖溶液，凝固後得到一層厚度為20微米的殼聚糖膜，得到殼聚糖-纖維素-殼聚糖複合膜；
(5)用無水乙醇對步驟(4)得到的殼聚糖-纖維素-殼聚糖複合膜進行置換，去除其中的水分，然後經冷凍乾燥或臨界乾燥，得到殼聚糖-纖維素-殼聚糖複合氣凝膠；
(6)將酪氨酸酶和色氨酸酶按照2:1的質量比混合均勻得到酶混合物，並且將高碘酸鈉和2,4-二硝基苯阱、氫氧化鈉按照2:1:0.5的質量比混合均勻得到標記混合物；所述酪氨酸酶和色氨酸酶為市售人酪氨酸酶和色氨酸酶；
(7)將酶混合物和標記混合物按照2:1的質量比混合，然後置於去離子水配製成固體質量分數為15％的混懸液，然後將步驟(5)得到的複合氣凝膠放入該混懸液中，在水浴振蕩器中振蕩固定5小時，即得。
其檢測方法為：檢驗時溫度20℃左右為宜，取新鮮清潔尿樣(最好是早晨第一次尿液)3ml加入裝有試劑的安瓿瓶中，搖勻後靜放3～5分鐘，然後與比色卡進行比色，如果是無色到黃色，則是陰性；如果是粉色、紫色或者紅色、棕色，則為陽性；如果是其他顏色，則為無效。這一方法的檢測準確率在99.2％以上，並且無效狀態的檢出率在0.001％以下。
實施例2
一種檢測尿液中單羥酚類代謝物的試劑盒，包括盛裝有檢測試劑的安瓿瓶，所述檢測試劑為吸附有顯色混合物的殼聚糖複合纖維素氣凝膠。其製備方法為：
(1)用氫氧化鈉和尿素將天然纖維素進行溶解，得到6wt％的纖維素溶液，再將纖維素溶液流延或塗覆成膜狀，通過凝固再生和水洗，製備成厚度為25微米的纖維素膜；
(2)在步驟(1)製備得到的纖維素膜上流延或塗覆一層殼聚糖溶液，溶解殼聚糖的溶劑為乙酸，製備得到的殼聚糖濃度為3wt％；凝固後得到一層厚度為25微米的殼聚糖膜；
(3)用無水乙醇對步驟(2)得到的纖維素-殼聚糖複合膜進行置換，去除其中的水分，然後將纖維素-殼聚糖複合膜反轉放置，使纖維素膜位於上方；
(4)在步驟(3)得到的纖維素-殼聚糖複合膜的纖維素膜上流延或塗覆一層殼聚糖溶液，凝固後得到一層厚度為25微米的殼聚糖膜，得到殼聚糖-纖維素-殼聚糖複合膜；
(5)用無水乙醇對步驟(4)得到的殼聚糖-纖維素-殼聚糖複合膜進行置換，去除其中的水分，然後經冷凍乾燥或臨界乾燥，得到殼聚糖-纖維素-殼聚糖複合氣凝膠；
(6)將酪氨酸酶和色氨酸酶按照2:1的質量比混合均勻得到酶混合物，並且將高碘酸鈉和2,4-二硝基苯阱、氫氧化鈉按照2:1:0.5的質量比混合均勻得到標記混合物；所述酪氨酸酶和色氨酸酶為市售大鼠酪氨酸酶和色氨酸酶；
(7)將酶混合物和標記混合物按照3:1的質量比混合，然後置於去離子水配製成固體質量分數為20％的混懸液，然後將步驟(5)得到的複合氣凝膠放入該混懸液中，在水浴振蕩器中振蕩固定3小時，即得。
其檢測方法為：檢驗時溫度20℃左右為宜，取新鮮清潔尿樣(最好是早晨第一次尿液)3ml加入裝有試劑的安瓿瓶中，搖勻後靜放3～5分鐘，然後與比色卡進行比色，如果是無色到黃色，則是陰性；如果是粉色、紫色或者紅色、棕色，則為陽性；如果是其他顏色，則為無效。這一方法的檢測準確率在99％以上，並且無效狀態的檢出率在0.002％以下。