一種用於糖絲菌的pcr引物及檢測糖絲菌的方法及試劑盒的製作方法

2023-05-14 02:30:01

一種用於糖絲菌的pcr引物及檢測糖絲菌的方法及試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及微生物領域，公開了一對用於擴增糖絲菌DNA的PCR引物，其上遊引物序列如SEQ?ID?No.1所示，下遊引物序列如SEQ?ID?No.2所示。本發明還提供用所述引物檢測糖絲菌的方法及試劑盒。本發明所述引物適合於純化糖絲菌擴增DNA，也適合於從混合菌群擴增糖絲菌DNA，擴增出糖絲菌安全、準確、快速、穩定，特異性強，靈敏度高。
【專利說明】—種用於糖絲菌的PCR引物及檢測糖絲菌的方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物領域，具體涉及一種用於糖絲菌的PCR引物及檢測糖絲菌的方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002]糖絲菌屬細菌屬於放線菌目假諾卡氏菌科，是一類好氧的革蘭氏陽性菌，大多數糖絲菌能在沙漠中廣泛生長。糖絲菌具有一個相對快速和簡單的生長周期，可作為實驗系統進行科學研究。
[0003]糖絲菌具有重要的應用價值，分離到的多株糖絲菌能生產多種強效抗菌素。另外糖絲菌能夠以蒽、菲、芘為惟一碳源和能源，降解及利用一些環境汙染物及有機物如烷烴。因此糖絲菌越來越為人們所關注。
[0004]現有技術中，有兩種常用的對糖絲菌進行鑑定的方法:
[0005]1、生理生化指標鑑定。此方法是目前許多生化實驗室常用的方法，此方法需要得到菌株的純培養物，且實驗周期長，實驗結果受人為觀察影響因素較大，準確性不高。
[0006]2、提取菌株DNA進行測序。目前是用16SrRNA基因引物進行PCR擴增，將擴增出的DNA片段進行測序。此方法結果比較準確。但仍需要得到菌株的純培養物，無法從混合樣品中快速鑑定是否含有假單胞菌。
[0007]因此本領域迫切需要開發出一種能夠快速、準確判定糖絲菌的方法。

【發明內容】

[0008]本發明所需要解決的技術問題是針對現有技術鑑定糖絲菌試驗
[0009]周期長、適用範圍窄的不足，提供一種能夠快速、準確、方便，可對混合樣品如土壤、海底沉積物、水中是否含有糖絲菌進行快速判定的方法。
[0010]為了實現上述目的，本申請發明人設計了一對針對糖絲菌16SrDNA基因部分片段的 PCR 引物，設計簡併引物:Sac-F:5，-GCGGTTTGTTGCGTCGG-3』(如 SEQ ID N0.1 所示)，Sac-R:5，-TAGCACCCACCGTTTACG-3』(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0011]所述16S rDNA基因是指基因組中編碼16S核糖體RNA (rRNA)分子的對應的DNA序列，也就是編碼16S rRNA的基因，本發明所述引物的16S rDNA目的基因具體如下:
[0012]GAGGCAGACCTCGCTGCTTACCATGCAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTGTACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTAGGTCTAATACCGGATATGACTCCACTAGGCATCTTGTGGGGTGGAAAGTTCCGGCGGTACAGGATGGACCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCACCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAAGCGGTTTGTTGCGTCGGCTGTGAAAACTTCACGCTTAACGTGGAGCCTGCAGTCGATACGGGCAGACTTGAGTTCGGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGCGTAGCGGTGAAATGCGCAGATACCACGACGAACGCCGGTGGGGAAGGCGGGGCT (如 SEQID N0.3 所示)。
[0013]本發明的術語「引物」指作為合成引物延伸產物的起始位點的單鏈寡核苷酸序列，其與待覆制的核酸鏈互補，長度和序列必須適合於延伸產物的合成。引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結合在核酸鏈上與之互補的區域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，核酸聚合酶可由其3'端開始合成新的核酸鏈。體外人工設計的引物被廣泛用於聚合酶鏈反應、測序和探針合成等。
[0014]本發明的目的之一是提供一種檢測糖絲菌的試劑盒，包含用於擴增的PCR引物，其上遊引物序列如SEQ ID N0.1所示，下遊引物序列如SEQ ID N0.2所示。
[0015]本發明還提供一種檢測糖絲菌的方法，包含以下步驟:
[0016]步驟1:配製PCR反應體系，94°C預變性10分鐘進行30個PCR循環，循環完畢後72°C延伸10分鐘；所述PCR反應體系中上遊引物序列如SEQ ID N0.1所示，下遊引物序列如 SEQ ID N0.2 所示；
[0017]步驟2:檢測擴增結果並進行測序比對。
[0018]作為優選，步驟I所述PCR循環參數為:94°C變性lmin、56°C復性lmin、72°C延伸lmin。
[0019]作為優選，步驟I中所述PCR反應體系為:
[0020]PCR 緩衝液:5i iL
[0021]dNTP: 4 u L
[0022]Primer F 上遊引物:I ii L
[0023]Primer R 下遊引物:I U L
[0024]樣品DNA:luL
[0025]Taq:0.5 U L
[0026]ddH20:37.5 U L
[0027]其中，樣品DNA濃度為10-200ng/iiL，上遊引物及下遊引物濃度為10-20pmol/U L0
[0028]作為優選，步驟2所述檢測為瓊脂糖電泳檢測280bp的條帶出現。
[0029]本發明與現有的技術相比具有如下有益效果:
[0030]1.本發明所述糖絲菌檢測方法操作簡單，耗時少，結果更精確。
[0031]2.本發明所述引物目標位於16S rDNA基因，該基因在進化中較為保守，是分類學研究中常用的研究對象，具有較高特異性。
[0032]3.本發明所述方法檢測周期短，在3小時內得出結果、適用範圍廣，無需分離純菌株即可對各種環境樣品中是否含有糖絲菌屬細菌進行檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1本發明所述引物以混合菌株DNA為模板的擴增產物凝膠電泳圖；
[0034]圖2本發明所述引物以土壤DNA為模板的擴增產物凝膠電泳圖；其中泳道1_4分別為不同土壤的DNA樣品；
[0035]圖3本發明所述引物以混合菌株DNA為模板的擴增產物凝膠電泳圖；其中泳道I和泳道2為同一 DNA樣品；
[0036]圖4本發明所述引物以糖絲菌DNA配製的梯度濃度的DNA為模板的擴增產物凝膠電泳圖；其中泳道1-6中所含DNA含量分別為200ng，200X10 —ingdOOXlO —2ng、200X10一3ng、200X 10 4ng、200X 10 5ng。【具體實施方式】
[0037]本發明公開了一種用於糖絲菌的PCR引物及檢測糖絲菌的方法及試劑盒，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的產品、方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0038]為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。
[0039]實施例1:以純培養物基因組DNA為模板用本發明所述引物進行PCR擴增
[0040]步驟1:選取含有糖絲菌的混合菌培養物，提取其基因組DNA。提取方法參照TAKARA公司的細菌基因組DNA提取試劑盒，得到混合菌的基因組DNA。
[0041 ] 步驟2:以步驟I得到的DNA為模板，配製為100-200ng/ y L的DNA樣品，與10-20pmol/ii L的PCR引物配成如下50 y L反應體系，進行PCR擴增反應:
[0042]PCR buffer:5 U L
[0043]dNTP:4u L
[0044]Primer F 上遊引物:1 U L
[0045]Primer R 下遊引物:1 U L
[0046]DNA: I u L
[0047]Taq:0.5u L
[0048]ddH20:37.5 U L
[0049]步驟3:按照上述體系混合之後，將PCR管放入PCR儀器進行擴增。PCR程序如下:
[0050]I預變性94°C 10分鐘
[0051]2變性 94 °C I分鐘
[0052]3復性 56 °C I分鐘
[0053]4延伸 72 °C I分鐘
[0054]2至4循環30次
[0055]5 延伸 72°C 10 分鐘
[0056]PCR 酶採用的是 Taq 酶(TAKARA)
[0057]步驟4:電泳觀察。取出PCR終產物5 ii L與I ii L上樣緩衝液混合，80V, 1%瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，在凝膠電泳成像儀下紫外觀察。結果見圖1所示，其中，泳道M為marker，泳道I為含有糖絲菌的混合菌DNA樣品，可見泳道I特異擴增出280bp的條帶。將擴增出的條帶回收後進行測序。測序結果表明，所擴增的280bp條帶即為引物設計時糖絲菌屬的目標基因片段，其序列如SEQ ID N0.3所示；280bp條帶為目標基因片段。[0058]實施例2:以土壤細菌基因組DNA為模板進行PCR擴增
[0059]步驟1:取I至2克土壤樣品，提取其微生物總DNA。提取方法參照DNA Recoveryfrom Soils of Diverse Composition (JIZHONG ZHOU, 1996),得到土壤總 DNA 溶液。
[0060]步驟2:以步驟I得到的DNA為模板，配製為100-200ng/ y L的DNA樣品，與10-20pmol/ii L的PCR引物配成如下50 y L反應體系，進行PCR擴增反應:
[0061]PCR buffer:5 U L
[0062]dNTP:4u L
[0063]Primer F 上遊引物:1 ii L
[0064]Primer R 下遊引物:1 U L
[0065]DNA: I u L
[0066]Taq:0.5 U L
[0067]ddH20:37.5 U L
[0068]步驟3:按照上述體系混合之後，將PCR管放入PCR儀器進行擴增。PCR程序如下:
[0069]I預變性 94°C 10分鐘
[0070]2變性 94 °C I分鐘
[0071]3復性 56 °C I分鐘
[0072]4延伸 72 °C I分鐘
[0073]2至4循環30次
[0074]5 延伸 72°C 10 分鐘
[0075]PCR 酶採用的是 Taq 酶(TAKARA)
[0076]步驟4:電泳觀察。取出PCR終產物5 ii L與I ii L上樣緩衝液混合，80V, 1%瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，在凝膠電泳成像儀下紫外觀察，結果見圖2所示，其中，泳道M為marker，泳道1-4為土壤樣品。可見泳道2和泳道3可特異性擴增出280bp的條帶，泳道I和泳道4未有目標條帶出現。將擴增出的條帶回收後進行測序。測序結果表明，所擴增的280bp條帶即為引物設計時糖絲菌屬的目標基因片段，其序列如SEQ ID N0.3所示，為糖絲菌DNA擴增產物。則據此判定泳道2和泳道3的土壤樣品含有糖絲菌，泳道I和泳道4的土壤樣品則不含有糖絲菌。對泳道1-4的樣品進行培養鑑定，與用本發明所述引物進行PCR擴增的鑑定結果一致。
[0077]實施例3:本發明所述引物擴增糖絲菌DNA的穩定性試驗
[0078]參照實施例1和實施例2，選取含有糖絲菌的混合菌株純培養物，提取其基因組DNA。
[0079]步驟2:以步驟I得到的DNA為模板，配製為100_200ng/ ii L的DNA樣品，與10-20pmol/ii L的PCR引物配成如下50 y L反應體系，進行PCR擴增反應:
[0080]PCR buffer:5 U L
[0081]dNTP:4u L
[0082]Primer F 上遊引物:1 ii L
[0083]Primer R 下遊引物:1 U L
[0084]DNA: I u L
[0085]Taq:0.5 U L[0086]ddH20:37.5u L
[0087]步驟3:按照上述體系混合之後，將PCR管放入PCR儀器進行擴增。PCR程序如下:
[0088]1預變性 94°C 10分鐘
[0089]2變性 94 °C 1分鐘
[0090]3復性 54 °C I分鐘
[0091]4延伸 72 °C I分鐘
[0092]2至4循環30次
[0093]5 延伸 72°C 10 分鐘
[0094]PCR 酶採用的是 Taq 酶(TAKARA )
[0095]步驟4:電泳觀察。取出PCR終產物5 ii L與I ii L上樣緩衝液混合，80V, 1%瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，在凝膠電泳成像儀下紫外觀察。結果見圖3所示，其中，泳道M為marker，泳道I和2為同一混合菌基因組DNA樣品。可見泳道I和泳道2均可特異性擴增出280bp的條帶。將擴增出的條帶回收後進行測序。將擴增出的280bp條帶回收後進行測序。測序結果表明，所擴增的280bp條帶為引物設計時紅球菌屬的目標基因片段，其序列如SEQ IDN0.3所示，為糖絲菌DNA擴增產物。對樣品進行培養鑑定，與用本發明所述引物進行PCR擴增的鑑定結果一致。說明本發明所述引物擴增糖絲菌DNA重複性好，
[0096]結果穩定。
[0097]實施例4:本發明所述引物擴增糖絲菌DNA的靈敏度試驗
[0098]取純化的糖絲菌基因組DNA配製梯度濃度的DNA溶液，原液所含DNA為200ng，依次稀釋為 DNA 濃度為 200 X 10 — Sg、200 X 10 — 2ng、200 X 10 — 3ng、200 X 10 — 4ng、200 X 10 —5ng,參照實施例1所述方法進行PCR擴增，取擴增產物進行凝膠電泳，結果可見在DNA含量在200X 10 —3ng處，仍可擴增出280bp目的條帶，而DNA含量在200X 10 —4ng和200 X 10 一5處，無任何條帶出現(見圖4)，說明在DNA模板含量為200X 10 —3ng時，引物仍可準確擴增出紅球菌目標條帶，靈敏度高。
[0099]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一對擴增糖絲菌DNA的PCR引物，其特徵在於，其上遊引物序列如SEQ ID N0.1所示，下遊引物序列如SEQ ID N0.2所示。
2.一種檢測糖絲菌的試劑盒，其特徵在於，包含用於擴增的PCR引物，其上遊引物序列如SEQ ID N0.1所示，下遊引物序列如SEQ ID N0.2所示。
3.—種檢測糖絲菌的方法，包含以下步驟: 步驟1:配製PCR反應體系，94°C預變性10分鐘進行30個PCR循環，循環完畢後72°C延伸10分鐘；所述PCR反應體系中上遊引物序列如SEQ ID N0.1所示，下遊引物序列如SEQID N0.2 所示； 步驟2:檢測擴增結果並進行測序比對。
4.根據權利要求3的方法，其特徵在於，步驟I所述PCR循環參數為:94°C變性lmin、56°C復性 lmin、72°C延伸 lmin。
5.根據權利要求3的方法，其特徵在於，步驟I中所述PCR反應體系為: PCR緩衝液:5 ii L
dNTP:4u L Primer F上遊引物:1 U L Primer R下遊引物:1 U L 樣品 DNA:1ii L` Taq:0.5 u L ddH20:37.5u L 其中，樣品DNA濃度為10-200ng/iiL，上遊引物及下遊引物濃度為10-20pmol/y L。
6.根據權利要求3的方法，其特徵在於，步驟2所述檢測為瓊脂糖電泳檢測280bp的條帶出現。
【文檔編號】C12Q1/68GK103614488SQ201310689164
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月16日 優先權日:2013年12月16日
【發明者】梅海, 郝純, 李雪, 張勇 申請人:盎億泰地質微生物技術（北京）有限公司