一種丹參藥材的提取分離方法

2023-12-08 22:38:41

專利名稱：一種丹參藥材的提取分離方法
技術領域：
本發明屬於醫藥領域，具體而言是涉及丹參提取、分離標準化。
背景技術：
目前，在全球範圍內，中草藥都有一定的市場，隨著人們對健康要求認識水平的增高以及人口的老齡化，亞健康狀態化，人們更加渴望回歸自然，利用純天然程度高的藥物治療、預防一些化學合成藥物所不能解決得問題，因此天然植物藥的應用超出它原來民族傳統文化的背景。從天然藥物中尋求副作用小、且物美價廉的藥物成為世界各國醫藥企業所追逐的目標。歐共體對草藥進行了統一立法，加拿大和澳大利亞等國草藥地位已經合法化，美國政府也已起草了植物藥管理辦法，開始接受天然藥物的複方混合製劑作為治療藥，這些為中藥作為治療藥進入國際醫藥市場提供了良好的國際環境。另一方面，隨著全球經濟一體化進程的加快，特別是我國正式加入WTO，中國醫藥市場融入國際醫藥大市場的廣度和深度將進一步加劇。面臨強大跨國醫藥集團的激烈競爭以及日本、韓國、印度、泰國等亞洲國家傳統醫藥產品和德國、法國等歐洲國家植物藥的巨大衝擊，我國傳統中藥產生的眾多產品由於尚不能符合國際醫藥市場的標準和要求而被拒之門外。
中藥材提取的標準化和中藥製備方法的標準化是中成藥走向國際市場或者真正實現大工業生產的關鍵環節，也是中國醫藥工作者和國外研究天然植物藥的科研人員一直努力研究的方向。目前關於中藥的提取方法是中藥領域研究的重點，科研人員一直將研究的目光著重於採用何種方法才能從中藥材中獲得的更多的有效成分，因此目前的中藥材提取的局面是針對不同的中藥材其有效成分的提取方法也不同，而針對不同的中藥材採用不同的提取方法需要有大量不同的提取設備用於支持中藥材的提取，這不適於中藥材提取的標準化。
丹參，別名血生根、赤根、血參、紅根。丹參來自植物Salvia miltiorrhiza的根莖。丹參入藥始載於漢代的《神農本草經》。中醫認為，其味苦性微寒，具有活血通經、祛淤止痛、清心除煩、涼血消癰之功效，適用於治療月經不調，冠心病，動脈硬化症，高血脂，心絞痛，痛經，經閉，崩漏，帶下，跌打瘀血，失眠，B肝，神經衰弱，血吸蟲病肝脾腫大，骨節疼痛等疾病，尤為婦科、內科及外傷科證屬血淤兼熱者所常用。現代研究表明，丹參中主要含丹參酮I、IIA、IIB(Tanshinone I，IIA，IIB)、異丹參酮I、IIA(Isotanshinone I，IIA)、隱丹參酮(Cryptotanshinone)、異隱丹參酮(Isocryptotanshinone)、甲基丹參酮(Methyltanshinone)、羥基丹參酮等。
如何確定一種提取、分離標準化方法，使丹參中的藥物活性成分不僅能夠提取完全，還可以通過分離方法進一步分離所獲得的藥物活性成分。該提取、分離標準化的確立是目前中藥實現現代化的關鍵因素。

發明內容
本發明的目的在於提供一種丹參提取、分離標準化。具體的說就是將丹參提取物分成若干組分，每個組分包含幾個主要化合物，由這些藥材組分構成了一個藥材組分庫。對藥材組分庫能夠進行藥物篩選，從而發現新藥。
為了實現丹參提取的現代化、標準化，本發明人通過大量的試驗，對目前丹參的有效成分的提取方法進行歸納和整理，以尋求一種可標準化的提取方法，即在該提取條件下採用該標準提取方法對丹參進行提取，可以最大限度的獲得中藥中的有效成分。
本發明所採用的丹參提取、分離標準化是本發明人通過試驗，對同一味中藥材採用不同的提取方法進行比較後，所得到的可適於工業化生產的丹參提取、分離標準化。
本發明可以通過下列步驟實施(1)提取工藝稱取丹參藥材，將其粉碎後過篩，然後加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液fr.1。在藥渣中加入乙醇，加熱提取得提取液fr.2。在藥渣中最後加入水，加熱提取得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏後，用矽膠拌樣，採用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然後改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最後用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮成浸膏後，用甲醇溶解上樣，採用ODS-C18柱對其進行分離，首先用低濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然後改換中等濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最後用純甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)製備分離工藝用製備液相色譜繼續分離前面工藝中得到的fr.5和fr.8。色譜柱為半製備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，在相應的時間段收集餾分，獲得經過了進一步分離的各個組分。
優選的本發明可以通過下列步驟實施
(1)提取工藝稱取丹參藥材，將其粉碎後過篩，然後加入5～12倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合併濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入5～12倍量70％乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合併濾液得提取液fr.2。在藥渣中最後加入水，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合併濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏後，用矽膠拌樣，採用正相矽膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然後改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最後用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮成浸膏後，用2～10％甲醇溶解上樣，採用ODS-C18柱對其進行分離，首先用2～10％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然後改換40～80％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最後用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)製備分離工藝用製備液相色譜繼續分離前面工藝中得到的fr.5和fr.8。色譜柱為半製備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為3ml/min，柱溫為室溫，在相應的時間段收集餾分，獲得經過進一步分離的各個組分。
最佳的本發明可以通過下列步驟實施(1)提取工藝稱取丹參藥材，將其粉碎後過篩，然後加入8倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液fr.2。在藥渣中最後加入水，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏，用矽膠拌樣，採用正相矽膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然後改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最後用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮成浸膏，用5％甲醇溶解上樣，採用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然後改換60％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最後用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)製備分離工藝本發明中為了從步驟(2)中獲得丹參提取物中fr.5和fr.8更加具體的有效成分，用製備液相色譜繼續分離fr.5和fr.8。
fr.5的分離條件色譜柱為漢邦半製備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)；採用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為3ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為50％的水，流動相B為50％的乙腈溶液；35min時，流動相A為20％的水，流動相B為80％的乙腈溶液；
45min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；55min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結果由製備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間2.0-5.6min；組分fr.52，收集時間5.6-14.0min；組分fr.53，收集時間14.0-18.2min；組分fr.54，收集時間18.2-27.1min；組分fr.55，收集時間27.1-30.3min；組分fr.56，收集時間30.3-35.2min；組分fr.57，收集時間35.2-38.4min；組分fr.58，收集時間38.4-41.9min；組分fr.59，收集時間41.9-46.2min；組分fr.59，收集時間46.2-54.5min。
fr.8分離條件色譜柱為Agilent製備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；採用梯度洗脫，流動相為0.1％HAc水溶液(A)和乙腈溶液(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為85％的0.1％HAc水溶液，流動相B為15％的乙腈溶液；10in時，流動相A為79％的0.1％HAc水溶液，流動相B為21％的乙腈溶液；15min時，流動相A為69％的0.1％HAc水溶液，流動相B為31％的乙腈溶液；30min時，流動相A為63％的0.1％HAc水溶液，流動相B為37％的乙腈溶液；35min時，流動相A為15％的0.1％HAc水溶液，流動相B為85％的乙腈溶液；45min時，流動相A為15％的0.1％HAc水溶液，流動相B為85％的乙腈溶液；fr.8分離結果由製備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間2.0-12.1min；組分fr.82，收集時間12.1-17.5min；組分fr.83，收集時間17.5-23.6min；組分fr.84，收集時間23.6-27.5min；組分fr.85，收集時間27.5-36.0min；組分fr.86，收集時間36.0-45min。
為了獲得具體的丹參有效成分，最佳的本發明提取分離方法為
(1)提取工藝稱取丹參藥材250g，將其粉碎後過篩，然後加入8倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液fr.2。在藥渣中最後加入水，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮得17.2g浸膏，用矽膠拌樣，採用正相矽膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然後改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，濃縮得2.5g樣品，最後用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮得138.3g浸膏，取20g浸膏用5％甲醇溶解上樣，採用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然後改換60％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，濃縮得2g樣品，最後用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)製備分離工藝本發明中為了從步驟(2)中獲得丹參提取物中fr.5和fr.8更加具體的有效成分，用製備液相色譜繼續分離fr.5和fr.8。
fr.5的分離條件色譜柱為漢邦半製備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)；採用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為3ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為50％的水，流動相B為50％的乙腈溶液；35min時，流動相A為20％的水，流動相B為80％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；55min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結果取組分fr.5共1.2g，用乙醇溶解進樣，由製備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間2.0-5.6min，49.3mg；組分fr.52，收集時間5.6-14.0min，28.0mg；組分fr.53，收集時間14.0-18.2min，7.3mg；組分fr.54，收集時間18.2-27.1min，11.5mg；組分fr.55，收集時間27.1-30.3min，5.0mg；組分fr.56，收集時間30.3-35.2min，6.6mg；組分fr.57，收集時間35.2-38.4min，8.0mg；組分fr.58，收集時間38.4-41.9min，6.2mg；組分fr.59，收集時間41.9-46.2min，6.1mg；組分fr.59，收集時間46.2-54.5min，28.3mg。
fr.8分離條件色譜柱為Agilent製備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；採用梯度洗脫，流動相為0.1％HAc水溶液(A)和乙腈溶液(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為85％的0.1％HAc水溶液，流動相B為15％的乙腈溶液；10min時，流動相A為79％的0.1％HAc水溶液，流動相B為21％的乙腈溶液；15min時，流動相A為69％的0.1％HAc水溶液，流動相B為31％的乙腈溶液；30min時，流動相A為63％的0.1％HAc水溶液，流動相B為37％的乙腈溶液；35min時，流動相A為15％的0.1％HAc水溶液，流動相B為85％的乙腈溶液；45min時，流動相A為15％的0.1％HAc水溶液，流動相B為85％的乙腈溶液；fr.8分離結果取組分fr.8共1.5g，用20％的甲醇溶解進樣，由製備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間2.0-12.1min，9.8mg；組分fr.82，收集時間12.1-17.5min，29.7mg；組分fr.83，收集時間17.5-23.6min，618.7mg；組分fr.84，收集時間23.6-27.5min，351.0mg；組分fr.85，收集時間27.5-36.0min，84.0mg；組分fr.86，收集時間36.0-45min，33.5mg。
本發明中，丹參各組分中所含化合物見表1，其分析鑑定方法參見實施例三。
表1.丹參各組分中所含化合物

以上丹參、提取溶液在工業化提取時可按照相應的比例增大或減少，如大規模生產可以以公斤或以噸為單位，小規模生產也可以以克為單位，重量可以增大或減小，但其重量配比比例不變。
本發明所建立的提取、分離標準化可以適用於目前中藥中的任何一種中藥材，例如可用於阿魏、艾葉、安息香、柏子仁、鱉甲、檳榔、薄荷、蓖麻子、蓄、補骨脂、板藍根、蓽茇、巴豆、巴戟天、北豆根、北沙參、白及、白頭翁、白芍、白芷、白附子、白茅根、白果、白前、白扁豆、白蘞、白鮮皮、白薇、半邊蓮、半枝蓮、半夏、百合、冰片、柴胡、蟬蛻、楮實子、常山、椿皮、穿山甲、穿心蓮、赤小豆、赤石脂、赤芍、蒼朮、蒼耳子、沉香、垂盆草、側柏葉、草烏、草烏葉、草豆蔻、草果、川貝母、川牛膝、川烏、川芎、川楝子、車前子、淡豆豉、黨參、淡竹葉、杜仲、獨活、膽南星、大薊、大腹皮、牡丹皮、煅石膏、冬瓜皮、冬蟲夏草、地龍、地膚子、地骨皮、熟地黃、地錦草、地榆、當歸、燈心草、丁香、刀豆、大青葉、大棗、大黃、鵝不食草、莪朮、兒茶、榧子、浮萍、萆解、覆盆子、佛手、附子、茯苓、防己、防風、番瀉葉、蜂蜜、蛤蚧、桂枝、葛根、藁本、高良姜、骨碎補、谷芽、谷精草、狗脊、枸杞子、枸骨葉、鉤藤、甘松、甘草、甘遂、瓜蔞、瓜蔞子、瓜蔞皮、關木通、乾薑、炮姜、乾漆、鶴蝨、黃芪、黃精、海藻、槐花、海風藤、荷葉、黃芩、黃連、黃柏、花椒、何首烏、虎杖、胡黃連、厚樸、化橘紅、火麻仁、合歡皮、合歡花、紅大戟、紅花、黑芝麻、菊花、僵蠶、桔梗、橘核、薑黃、雞血藤、雞冠花、金果欖、金沸草、金蕎麥、金錢草、金銀花、降香、荊芥、韭菜子、決明子、款冬花、訶子、苦杏仁、苦參、苦楝皮、萊菔子、雷丸、凌霄花、鹿銜草、漏蘆、路路通、蓮子、絡石藤、蘆薈、蘆根、兩頭尖、兩面針、連翹、靈芝、羅布麻葉、羅漢果、荔枝核、龍膽、龍眼肉、老鸛草、墨旱蓮、麻黃、蔓荊子、滿山紅、滿山紅油、密蒙花、梅花、麻黃、麥冬、麥芽、玫瑰花、明黨參、馬鞭草、馬兜鈴、馬錢子、馬錢子粉、馬勃、馬齒莧、木瓜、木香、木賊、南沙參、女貞子、牛蒡子、牛膝、藕節、蒲黃、蒲公英、枇杷葉、佩蘭、片薑黃、瞿麥、秦皮、拳參、芡實、羌活、青木香、青風藤、青皮、青葙子、青蒿、青黛、茜草、牽牛子、前胡、千年健、千金子、秦艽、蕤仁、肉豆蔻、肉蓯蓉、肉桂、人參、人參葉、石菖蒲、鎖陽、桑葉、商陸、桑椹、蛇床子、桑白皮、桑枝、桑枝、桑寄生、娑羅子、酸棗仁、射幹、蘇合香、沙苑子、使君子、柿蒂、砂仁、山豆根、山茱萸、山藥、山慈菇、山楂、小薊、升麻、水牛角、水牛角濃縮粉、石韋、石決明、石斛、石榴皮、生薑、絲瓜絡、三七、三稜、葶藶子、菟絲子、桃仁、通草、檀香、天花粉、天竺黃、天南星、天麻、天葵子、太子參、土荊皮、土茯苓、吳茱萸、威靈仙、王不留行、五加皮、五味子、五倍子、瓦楞子、烏藥、烏梅、夏天無、續斷、旋覆花、豨薟草、薤白、夏枯草、辛夷、香加皮、香附、香櫞、香薷、小茴香、仙茅、仙鶴草、玄參、玄明粉、西洋參、血餘炭、血竭、徐長卿、淫羊藿、益母草、銀杏葉、薏苡仁、銀柴胡、遠志、芫花、鬱李仁、鬱金、魚腥草、茵陳、鴉膽子、月季花、玉竹、延胡索、浙貝母、豬牙皂、紫蘇子、紫菀、紫花地丁、紫草、豬苓、皂角刺、知母、澤蘭、澤瀉、珍珠母、枳實、梔子。
按照本發明方法所獲得的丹參有效成分可以製成藥劑學上任何一種形式，包括針劑和口服製劑。其中針劑包括注射液、滴注液、粉針劑；口服製劑包括顆粒劑、片劑、衝劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。
對於本領域技術人員而言，根據本發明所公開的技術內容，本領域技術人員將很清楚本發明的其它實施方案，本發明實施例僅作為示例。在不違反本發明主旨及範圍的情況下，可對本發明進行各種改變和改進，例如所選用的溶液可以是其他低級醇或者是其他有機溶劑，但只要使用本發明所述的提取方法，均在本發明保護範圍之內。


下面給出丹參指紋圖譜，丹參水溶性各組分紫外光譜圖、丹參水溶性各組分質譜圖、丹參脂溶性各組分紫外光譜圖、丹參脂溶性各組分質譜圖旨在進一步說明本發明，但對本發明並不構成限制。
圖1丹參指紋圖譜圖2丹參水溶性各組分紫外圖譜圖3丹參水溶性各組分質譜4丹參脂溶性各組分紫外圖譜圖5丹參脂溶性各組分質譜圖具體實施方式
實施例一(1)提取工藝稱取丹參藥材250g，將其粉碎後過篩，然後加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液fr.1。在藥渣中加入乙醇，加熱提取得提取液fr.2。在藥渣中最後加入水，加熱提取得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮得16.8g浸膏，用矽膠拌樣，採用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然後改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，濃縮得2.3g樣品，最後用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮得133.6g浸膏，取20g浸膏用甲醇溶解上樣，採用ODS-C18柱對其進行分離，首先用低濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然後改換中等濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，濃縮得1.88g樣品。最後用純甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)製備分離工藝用製備液相色譜繼續分離前面工藝中得到的fr.5和fr.8。色譜柱為半製備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，在相應的時間段收集餾分，獲得經過了進一步分離的各個組分。
fr.5分離結果取組分fr.5共1.2g，用乙醇溶解進樣，由製備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間2.0-5.6min，47.1mg；組分fr.52，收集時間5.6-14.0min，26.8mg；組分fr.53，收集時間14.0-18.2min，6.5mg；組分fr.54，收集時間18.2-27.1min，10.2mg；組分fr.55，收集時間27.1-30.3min，4.8mg；組分fr.56，收集時間30.3-35.2min，6.1mg；組分fr.57，收集時間35.2-38.4min，7.6mg；組分fr.58，收集時間38.4-41.9min，5.9mg；組分fr.59，收集時間41.9-46.2min，5.7mg；組分fr.59，收集時間46.2-54.5min，26.6mg。
fr.8分離結果取組分fr.8共1.5g，用20％的甲醇溶解進樣，由製備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間2.0-12.1min，9.1mg；組分fr.82，收集時間12.1-17.5min，28.6mg；組分fr.83，收集時間17.5-23.6min，610.3mg；組分fr.84，收集時間23.6-27.5min，348.5mg；組分fr.85，收集時間27.5-36.0min，81.8mg。
組分fr.86，收集時間36.0-45min，32.4mg。
實施例二(1)提取工藝稱取丹參藥材500g，將其粉碎後過篩，然後加入5～12倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合併濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入5～12倍量70％乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合併濾液得提取液fr.2。在藥渣中最後加入水，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合併濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮得33.6g浸膏，用矽膠拌樣，採用正相矽膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然後改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，濃縮得4.6g樣品，最後用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮得268.4g浸膏，取40g浸膏用2～10％甲醇溶解上樣，採用ODS-C18柱對其進行分離，首先用2～10％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然後改換40～80％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，濃縮得3.88g樣品，最後用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)製備分離工藝用製備液相色譜繼續分離前面工藝中得到的fr.5和fr.8。色譜柱為半製備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為3ml/min，柱溫為室溫，在相應的時間段收集餾分，獲得經過進一步分離的各個組分。
fr.5分離結果取組分fr.5共2.4g，用乙醇溶解進樣，由製備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間2.0-5.6min，96.6mg；組分fr.52，收集時間5.6-14.0min，54.3mg；組分fr.53，收集時間14.0-18.2min，13.2mg；組分fr.54，收集時間18.2-27.1min，20.9mg；組分fr.55，收集時間27.1-30.3min，9.3mg；組分fr.56，收集時間30.3-35.2min，11.9mg；組分fr.57，收集時間35.2-38.4min，15.5mg；組分fr.58，收集時間38.4-41.9min，11.0mg；組分fr.59，收集時間41.9-46.2min，11.3mg；組分fr.59，收集時間46.2-54.5min，54.4mg。
fr.8分離結果取組分fr.8共3.0g，用20％的甲醇溶解進樣，由製備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間2.0-12.1min，17.8mg；組分fr.82，收集時間12.1-17.5min，58.6mg；組分fr.83，收集時間17.5-23.6min，1229.5mg；組分fr.84，收集時間23.6-27.5min，697.3mg；組分fr.85，收集時間27.5-36.0min，160.9mg。
組分fr.86，收集時間36.0-45min，63.7mg。
實施例三一、丹參藥材的提取分離(1)提取工藝稱取丹參藥材250g，將其粉碎後過篩，然後加入8倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液fr.1。在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液fr.2。在藥渣中最後加入水，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液fr.3。
(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮得17.2g浸膏，用矽膠拌樣，採用正相矽膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然後改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，濃縮得2.5g樣品，最後用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6。將提取液fr.2濃縮得138.3g浸膏，取20g浸膏用5％甲醇溶解上樣，採用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然後改換60％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，濃縮得2g樣品，最後用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9。
(3)製備分離工藝本發明中為了從步驟(2)中獲得丹參提取物中fr.5和fr.8更加具體的有效成分，用製備液相色譜繼續分離fr.5和fr.8。
fr.5的分離條件色譜柱為漢邦半製備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)；採用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為3ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為50％的水，流動相B為50％的乙腈溶液；35min時，流動相A為20％的水，流動相B為80％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；55min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結果取組分fr.5共1.2g，用乙醇溶解進樣，由製備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間2.0-5.6min，49.3mg；組分fr.52，收集時間5.6-14.0min，28.0mg；組分fr.53，收集時間14.0-18.2min，7.3mg；組分fr.54，收集時間18.2-27.1min，11.5mg；組分fr.55，收集時間27.1-30.3min，5.0mg；組分fr.56，收集時間30.3-35.2min，6.6mg；組分fr.57，收集時間35.2-38.4min，8.0mg；組分fr.58，收集時間38.4-41.9min，6.2mg；
組分fr.59，收集時間41.9-46.2min，6.1mg；組分fr.59，收集時間46.2-54.5min，28.3mg。
fr.8分離條件色譜柱為Agilent製備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；採用梯度洗脫，流動相為0.1％醋酸水溶液(A)和乙腈(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為85％的0.1％HAc水溶液，流動相B為15％的乙腈溶液；10min時，流動相A為79％的0.1％HAc水溶液，流動相B為21％的乙腈溶液；15min時，流動相A為69％的0.1％HAc水溶液，流動相B為31％的乙腈溶液；30min時，流動相A為63％的0.1％HAc水溶液，流動相B為37％的乙腈溶液；35min時，流動相A為15％的0.1％HAc水溶液，流動相B為85％的乙腈溶液；45min時，流動相A為15％的0.1％HAc水溶液，流動相B為85％的乙腈溶液；fr.8分離結果取組分fr.8共1.5g，用20％的甲醇溶解進樣，由製備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間2.0-12.1min，9.8mg；組分fr.82，收集時間12.1-17.5min，29.7mg；組分fr.83，收集時間17.5-23.6min，618.7mg；組分fr.84，收集時間23.6-27.5min，351.0mg；組分fr.85，收集時間27.5-36.0min，84.0mg。
組分fr.86，收集時間36.0-45min，33.5mg。
二、分析2.1試劑與儀器Agilent 1100高效液相色譜-質譜聯用儀(美國安捷倫公司)，配在線真空脫氣機、四元低壓泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、1946D電噴霧四級杆質譜檢測器、Chemstation色譜工作站；R-200型旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)；飛鴿牌TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；METTLER-AE240型電子天平(梅特勒-託利多儀器有限公司)。
乙腈為色譜純試劑(MERCK)，水為娃哈哈純淨水(杭州娃哈哈集團)，乙酸為分析純(杭州試劑廠)。
2.2分析方法樣品來源丹參組分fr.51 1.35mg、fr.52 1.33mg、fr.53 1.29mg、fr.54 1.34mg、fr.551.32mg、fr.56 1.31mg、fr.57 1.30mg、fr.58 1.32mg、fr.59 1.38mg、fr.510 1.27mg。
樣品製備樣品用1ml乙醇溶解，超聲，離心(10000r/min)，備用。
色譜條件色譜柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；採用梯度洗脫，流動相A相為0.2％冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為90％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為10％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；10分鐘時，流動相A為30％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為70％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時，流動相A為5％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為95％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.5mL/min；檢測波長全波長；柱溫30℃；進樣量5μl。
質譜條件正負離子掃描模式，掃描範圍100-2000；乾燥氣(N2氣)流速10L/min，霧化溫度350℃，毛細管電壓3500V，裂解電壓100V。
ELSD條件氮氣1.4L/min，漂移管溫度100℃。
樣品來源丹參組分fr.81 1.38mg、fr.82 1.29mg、fr.83 1.32mg、fr.84 1.36mg、fr.851.39mg、fr.86 1.38mg。
樣品製備樣品用1ml 50％甲醇水溶解，超聲，離心(10000r/min)，備用。
色譜條件色譜柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；採用梯度洗脫，流動相A相為0.2％冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為80％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為20％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；15分鐘時，流動相A為50％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為50％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；20分鐘時，流動相A為50％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為50％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.5mL/min；檢測波長全波長；柱溫30℃；進樣量5μl。
質譜條件正負離子掃描模式，掃描範圍100-2000；乾燥氣(N2氣)流速10L/min，霧化溫度350℃，毛細管電壓3500V，裂解電壓100V。
ELSD條件氮氣1.8L/min，漂移管溫度105℃。
2.3分析結果分析結果圖2是丹參水溶性各組分紫外圖譜，圖3是丹參水溶性各組分質譜圖，圖4是丹參脂溶性各組分紫外圖譜，圖5是丹參脂溶性各組分質譜圖。
丹參組分中各化合物鑑定結果[1-5]見表2。
表2.丹參組分化合物鑑定結果

參考文獻1、DNP(天然化合物資料庫)。
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5、周長新，羅厚薇，丹羽正武，丹參水溶性化學成分的研究，中國藥科大學學報，30(1999)，411-416。
三、丹參組分藥效篩選實驗3.1藥理模型乳鼠心肌細胞缺血缺氧模型原代心肌細胞培養 出生1～3天SD乳鼠處死後，取心臟，經PBS液清洗後剪成1mm3左右的碎塊。用0.125％胰蛋白酶(Sigma，USA)+0.05％膠原酶II(Gibco，USA)於37℃消化3～4次。差速貼壁法分離成纖維細胞1.5小時後，細胞懸液轉移至48孔板中(每孔約4×105細胞)。經DMEM(Gibco，USA)加10％胎牛血清(Falcon，USA)培養3～6天的細胞供藥效篩選。篩選前1天替換為無血清培養液。培養3～6天的心肌細胞，PBS洗滌後加入含藥培養液。置於95％N2和5％CO2培養箱中缺氧6小時。然後在CO2培養箱中復氧3小時。取細胞上清液測定LDH含量。
給藥方案 提取得到的丹參提取物用無糖Hanks液配成10-4g/mL供試液，脂溶性成分可加入少量DMSO助溶(DMSO終濃度控制在0.2％以下)。各組分在培養液中的終濃度控制在10-5g/mL。
乳酸脫氫酶含量測定 細胞培養液中乳酸脫氫酶含量能夠表示細胞損傷程度。漏入上清液中的乳酸脫氫酶含量越高，表明細胞損傷也顯著。乳酸脫氫酶測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。測定方法為取30μl細胞上清液，加入50μl基質緩衝液及10μl乳酸脫氫酶輔酶，37℃振蕩15分鐘，再加入50μl 2，4-二硝基苯肼，37℃振蕩15分鐘。平行空白。取反應液50μl加入200μl 0.4mol/L氫氧化鈉溶液，靜置3～4分鐘後，用酶標儀於450nm測定光度值。
藥效結果 所有數據用均值±方差表示。採用單邊方差分析和T檢驗進行統計學分析。與模型組相比，P＜0.05認為顯著有效。藥效篩選結果見表3。根據心肌細胞乳酸脫氫酶(LDH)篩選結果，丹參組分fr.8，fr.82，fr.84，fr.86對降低LDH釋放有非常顯著效果。
表3.心肌細胞篩選結果

3.2臍靜脈內皮細胞缺氧復氧模型原代臍靜脈內皮細胞培養 取健康新生兒臍帶，用30～50ml Hanks液洗淨靜脈血管內的殘留血跡。視臍帶長度加入相應量的0.1％膠原酶I，轉入培養箱消化15～20分鐘。隨後將臍帶內消化液小心收集到燒杯中，並用Hanks液將燒杯潤洗兩次，一併收集到燒杯中分裝於離心管，900rpm離心10分鐘。吸去上清液，用M199培養液(含10％胎牛血清，100U/ml雙抗，0.15mg/ml Heparin，10μM VC)充分溶解沉澱。將所得細胞懸液分裝於5cm2培養瓶，置於培養箱內培養。第二天換成採用含30μg/ml ECGS的M199培養液，之後每三天換一次培養液直至細胞鋪滿底面。所用細胞均為原代內皮細胞。造模前將培養瓶內細胞接種至96孔板並培養一天，所用細胞量為3.5～4萬/孔。造模時，吸棄舊的M199培養液，加入含藥無酚紅M199培養液，每孔總量為100μl。置於95％N2和5％CO2培養箱中缺氧12小時，然後在CO2培養箱中復氧2小時。取細胞上清液測定LDH含量和NO含量。
給藥方案 提取得到的丹參提取物用無糖Hanks液配成10-4g/mL供試液，脂溶性成分可加入少量DMSO助溶(DMSO終濃度控制在0.2％以下)。各組分在無酚紅M199培養液中的終濃度控制在10-5g/mL。
乳酸脫氫酶含量測定 細胞培養液中乳酸脫氫酶含量能夠表示細胞損傷程度。漏入上清液中的乳酸脫氫酶含量越高，表明細胞損傷也顯著。乳酸脫氫酶測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。測定方法為取30μl細胞上清液，加入50μl基質緩衝液及10μl乳酸脫氫酶輔酶，37℃振蕩15分鐘，再加入50μl 2，4-二硝基苯肼，37℃振蕩15分鐘。平行空白。取反應液50μl加入200μl 0.4mol/L氫氧化鈉溶液，靜置3～4分鐘後，用酶標儀於450nm測定光度值。
藥效結果 所有數據用均值±方差表示。採用單邊方差分析和T檢驗進行統計學分析。與模型組相比，P＜0.05認為顯著有效。藥效篩選結果見表4。根據內皮細胞LDH(乳酸脫氫酶)篩選結果，丹參fr.84對降低LDH釋放有非常顯著效果，丹參fr.51有效果。
表4.內皮細胞LDH篩選結果

以上試驗結果說明，採用本發明中藥材標準化提取方法獲得的中藥材有效成分可以用作製備藥物。
權利要求
1.丹參提取、分離標準化方法，包括以下步驟(1)提取工藝稱取丹參藥材，將其粉碎後過篩，然後加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液fr.1；在藥渣中加入乙醇，加熱提取得提取液fr.2；在藥渣中最後加入水，加熱提取得提取液fr.3；(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏後，用矽膠拌樣，採用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然後改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最後用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6；將提取液fr.2濃縮成浸膏後，用甲醇溶解上樣，採用ODS-C18柱對其進行分離，首先用低濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然後改換中等濃度的甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最後用純甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9；(3)製備分離工藝用製備液相色譜分離fr.5和fr.8；色譜柱為半製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，在相應的時間段收集餾分，獲得經過了進一步分離的各個組分。
2.如權利要求1所述的丹參提取、分離標準化方法，包括如下步驟(1)提取工藝稱取丹參藥材，將其粉碎後過篩，然後加入5～12倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合併濾液得提取液fr.1；在藥渣中加入5～12倍量70％乙醇，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合併濾液得提取液ff.2；在藥渣中最後加入水，加熱回流0.5～3小時，提取1～3次，合併濾液得提取液fr.3；(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏後，用矽膠拌樣，採用正相矽膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然後改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最後用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6；將提取液fr.2濃縮成浸膏後，用2～10％甲醇溶解上樣，採用ODS-C18柱對其進行分離，首先用2～10％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然後改換40～80％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最後用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9；(3)製備分離工藝用製備液相色譜離fr.5和fr.8；色譜柱為半製備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為3ml/min，柱溫為室溫，在相應的時間段收集餾分，獲得經過進一步分離的各個組分。
3.如權利要求2所述的丹參提取、分離標準化方法，包括如下步驟(1)提取工藝稱取丹參藥材，將其粉碎後過篩，然後加入8倍量體積比為1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液fr.1；在藥渣中加入8倍量70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液fr.2；在藥渣中最後加入水，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液fr.3；(2)分離工藝將提取液fr.1濃縮成浸膏，用矽膠拌樣，採用正相矽膠柱對其進行分離，首先用體積比為50∶1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液fr.4，然後改換體積比為10∶1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液fr.5，最後用甲醇作為流動相，得洗脫液fr.6；將提取液fr.2濃縮成浸膏，用5％甲醇溶解上樣，採用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.7，然後改換60％甲醇作為流動相，得洗脫液fr.8，最後用100％甲醇溶液作為流動相，得洗脫液fr.9；(3)製備分離工藝用製備液相色譜離fr.5和fr.8；fr.5的分離條件色譜柱為漢邦半製備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)；採用梯度洗脫，流動相為水(A)和乙腈(B)，流速為3ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為50％的水，流動相B為50％的乙腈溶液；35min時，流動相A為20％的水，流動相B為80％的乙腈溶液；45min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；55min時，流動相A為5％的水，流動相B為95％的乙腈溶液；fr.5分離結果由製備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.51，收集時間2.0-5.6min；組分fr.52，收集時間5.6-14.0min；組分fr.53，收集時間14.0-18.2min；組分fr.54，收集時間18.2-27.1min；組分fr.55，收集時間27.1-30.3min；組分fr.56，收集時間30.3-35.2min；組分fr.57，收集時間35.2-38.4min；組分fr.58，收集時間38.4-41.9min；組分fr.59，收集時間41.9-46.2min；組分fr.510，收集時間46.2-54.5min；fr.8分離條件色譜柱為Agilent製備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；採用梯度洗脫，流動相為0.1％HAc水溶液(A)和乙腈溶液(B)，流速為10ml/min，柱溫為室溫，洗脫梯度如下0min時，流動相A為85％的0.1％Hac水溶液，流動相B為15％的乙腈溶液；10min時，流動相A為79％的0.1％Hac水溶液，流動相B為21％的乙腈溶液；15min時，流動相A為69％的0.1％Hac水溶液，流動相B為31％的乙腈溶液；30min時，流動相A為63％的0.1％Hac水溶液，流動相B為37％的乙腈溶液；35min時，流動相A為15％的0.1％Hac水溶液，流動相B為85％的乙腈溶液；45min時，流動相A為15％的0.1％Hac水溶液，流動相B為85％的乙腈溶液；fr.8分離結果由製備液相色譜分離得到的組分及相應的收集時間如下組分fr.81，收集時間2.0-12.1min；組分fr.82，收集時間12.1-17.5min；組分fr.83，收集時間17.5-23.6min；組分fr.84，收集時間23.6-27.5min；組分fr.85，收集時間27.5-36.0min；組分fr.86，收集時間36.0-45min。
4.如權利要求3所述的丹參提取、分離標準化方法，其特徵在於組分fr.52中主要化合物為Neocryptotanshinone；組分fr.53中主要化合物為Paeoniflorin；組分fr.54中主要化合物為Trijuganone C，Dihydrotanshinone I；組分fr.55中主要化合物為Dihydrotanshinone I；組分fr.57中主要化合物為6，7-Dihydroxy-8，13-abietadiene-11，12-dione，(6a，7b)-form，6-Deoxy；組分fr.59中主要化合物為1，2，15，16-Tetrahydro；1，2-Didehydro或Nortanshinone或Tanshinone I，Danshenxinkun B或Methylenedihydrotanshinquinone。
5.如權利要求3所述的丹參提取、分離標準化方法，其特徵在於組分fr.81中主要化合物為Linthospermic acid，Salvianolic acid B；組分fr.82中主要化合物為Protocatechuic aldehyde，Linthospermic acid；組分fr.83中主要化合物為Salvianolic acid B，Salvianolic acid E或Salvianolic acid B isomer；組分fr.84中主要化合物為Salvianolic acid B，Salvianolic acid E或Salvianolic acid B isomer；組分fr.86中主要化合物為Neocryptotanshinone。
全文摘要
本發明公開了丹參標準化提取分離方法，採用該方法可較大程度地將中藥材中化學成分提取出來並進一步分離獲得丹參中不同極性的化學組分；具體的說就是將丹參藥材按極性分成若干化學組分，每個組分中僅包含幾個主要化合物，由這些藥材組分構成一個藥材組分庫。對藥材組分庫能夠進行藥物篩選，從而發現新藥。該標準化提取分離方法不需要對每個藥材都建立一套提取分離方法，大大縮短了藥材提取分離的周期，同時也減少人力物力的消耗；該方法簡便、推廣性好，適用大部分藥材。
文檔編號A61P15/00GK1903250SQ20051001227
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月29日 優先權日2005年7月29日
發明者程翼宇, 賀慶, 王毅, 王學偉, 李雲飛, 胡興江, 葛志偉 申請人:天津天士力現代中藥研究開發有限公司