使用可選剪接在真核細胞中表達多肽多聚體的方法和構建物的製作方法

2023-12-09 09:30:11

專利名稱：：使用可選剪接在真核細胞中表達多肽多聚體的方法和構建物的製作方法
背景技術：
：發明領域本文公開的發明的某些實施方案涉及使用可選剪接在體外和在體內在真核細胞中表達多肽多聚體的載體和方法。還包括用於生成包含這些載體的細胞的方法，以及這些載體及由其表達的多肽用於治療疾病和用於在體內或在體外高效生產此類多聚體蛋白質的用途。背景和相關技術的描述多肽多聚體是一起形成複合物的兩條或多條多肽的裝配物。構成複合物的多肽通常是不同的。抗體是典型的多肽多聚體，因為它們由一起形成四聚體複合物的兩條抗體輕鏈多肽和兩條抗體重鏈多肽構成。在宿主細胞中表達多肽多聚體是富有挑戰性的過程，因為必須小心協調構成多肽多聚體的每種不同多肽的表達。例如，為了在真核細胞中表達抗體，必須將編碼抗體輕鏈的第一基因和編碼抗體重鏈的第二基因導入細胞，並在可接受的比例範圍內表達。同一細胞或培養系統中不能接受的抗體輕鏈與重鍊表達比例可導致期望的多聚體複合物的生產高度無效，或是導致對細胞或生物體毒性。過去用於在真核細胞中表達多肽多聚體的方法包括導入兩種或多種載體，每種載體分開編碼構成多肽多聚體的每種不同多肽。每種載體通常攜帶驅動複合物一種多肽表達的啟動子，而且至少一種載體通常編碼選擇標記。然後，將載體連續或一起導入細胞(通常通過轉染)，並就兩種選擇標記的表達對細胞進行共選擇。在另一種方法中，將構成多肽複合物的每種多肽的編碼序列與啟動子一起插入單一載體。此方法消除了操作多種載體的需要，但是仍然沒有消除每種編碼序列間啟動子競爭的可能性。同樣，此方法通常不能解決以可接受的比例表達構成蛋白質多聚體的各種多肽從而實現蛋白質多聚體的高效表達的問題。如此，在上述兩種方法中，不能始終在宿主細胞中實現兩種產物的一貫比例。這可能是由於諸如下列因素，不同啟動子活性、啟動子競爭最佳表達所需要的細胞因素、蛋白質多聚體成分多肽的轉錄和/或翻譯效率、和/或導入細胞的每種載體的拷貝數的差異。還已經開發了利用單一剪接供體和剪接受體的剪接載體。美國專利號5,043,270公開了一種小基因，它表達選擇標記，如DHFR，且具有包含編碼目的蛋白質的基因的內含子。美國專利號5,561,053公開了倒轉佔位(inversesituation)，其中編碼目的蛋白質的基因在編碼序列的5』端含有內含子。此內含子含有以剪接供體和受體為界的編碼選擇標記的基因。這種類型的內含子表達載體還描述於Lukas，B.K.等，NucleicAcidsRes.241774-1779，1996。美國專利申請公開號2005/0019925A1公開了具有融合選擇標記的類似內含子載體。它還公開了兩對剪接供體和剪接受體用於表達超過一種目的蛋白質的用途。然而，所有這些發表的構建物依賴成對的剪接供體和剪接受體，即單一剪接受體有一個剪接供體來匹配。每一種這些構建物的效力依賴所有位點的高效剪接。沒有涉及使用單一剪接供體來激活超過一個剪接受體的可選剪接以表達多種多肽。另外，沒有提出需要以不同比例表達多肽或者替換不同剪接受體以控制多肽的相對表達。因此，需要以一貫比例連接兩種或多種基因的表達使得所得基因產物高效生成和裝配的構建物。發明概述通過經由可選剪接的使用連接兩種或多種基因的表達，本發明解決了使用一種表達載體在宿主細胞中表達多肽多聚體的上述問題。因此，可使用具有一個啟動子的單一載體來驅動可剪接成兩種或多種不同mRNA轉錄物的前mRNA的表達，使得所述兩種或多種mRNA轉錄物編碼不同多肽。如此，兩種或多種產物的相對表達不受獨立啟動子的不同活性、啟動子競爭或載體拷貝數的影響。具體而言，本發明提供了用於將使用單一啟動子來驅動單一前mRNA轉錄的單一表達載體導入真核細胞的方法，所述前mRNA隨後可選剪接成兩種或多種不同基因產物，它們隨後可翻譯成兩種或多種不同多肽。在一個實施方案中，所述基因產物編碼多聚體蛋白質的多肽亞基。在另一個實施方案中，所述基因產物是構成抗體的抗體輕鏈和重鏈。因此，本發明具有幾項優勢，包括但不限於下列各項-提供了用於表達多種多肽，特別是異聚體多肽諸如抗體或抗體片段的載體；-在真核細胞諸如動物細胞或酵母細胞中生產多種多肽，例如抗體重鏈和輕鏈多肽的有效方法；-生產用於診斷性或治療性應用的重組抗體的有效方法；和-通過所述方法生產的重組抗體，用於治療需要重組抗體治療的受試者。因此，在一個實施方案中，本發明提供了以5』至3』或順流方向包含啟動子，如CMV啟動子；5』非翻譯區(UTR)，提供如加帽信號；剪接供體；內含子；第一剪接受體；編碼第一多肽的第一外顯子；第二剪接受體；和編碼第二多肽的第二外顯子的表達載體，其中所述啟動子可操作連接所述第一和第二外顯子。剪接位點(即供體和受體)可以是天然存在的剪接位點、經過改造的剪接位點，例如合成的剪接位點、規範的或共有的剪接位點、或非規範的剪接位點，如隱蔽剪接位點。每個外顯子還可包含聚腺苷酸化信號。在此，術語「第一」或「第二」在用於遺傳元件諸如外顯子、內含子、任何剪接位點等時僅僅用於彼此鑑別和區分各種元件，並非涉及所述元件在基因內的實際線性位置或編號或是編碼蛋白質多聚體各個多肽成分的前mRNA分子的表達順序。在另一個實施方案中，所述載體包含一個剪接供體和超過一個剪接受體，例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多剪接受體。每個剪接受體與緊挨著位於該剪接受體下遊的外顯子相連。因此，所述載體包含超過一個外顯子，例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多外顯子。在一個實施方案中，所述第一多肽是抗體重鏈，而所述第二多肽是抗體輕鏈，或者，所述第一多肽是抗體輕鏈，而所述第二多肽是抗體重鏈。在一個相關實施方案中，所述重鏈和/或輕鏈是鼠源的、嵌合的、人源化的或人的。所述輕鏈和重鏈可包含胺基酸改變，諸如在如Fc區中引入或消除糖基化位點。在另一個實施方案中，所述第一和第二多肽以約20∶1至約1∶20、約15∶1至約1∶15、約12∶1至約1∶12、約10∶1至約1∶10、約9∶1至約1∶9、約8∶1至約1∶8、約7∶1至約1∶7、約6∶1至約1∶6、約5∶1至約1∶5、約4∶1至約1∶4、約3∶1至約1∶3、約2∶1至約1∶2、或約1∶1的比例表達。在具體的實施方案中，所述第一和第二多肽以約20∶1、約19∶1、約18∶1、約17∶1、約16∶1、約15∶1、約14∶1、約13∶1、約12∶1、約11∶1、約10∶1、約9∶1、約8∶1、約7∶1、約6∶1、約5∶1、約4∶1、約3∶1、約2∶1、約1∶1、約1∶2、約1∶3、約1∶4、約1∶5、約1∶6、約1∶7、約1∶8、約1∶9、約1∶10、約1∶11、約1∶12、約1∶13、約1∶14、約1∶15、約1∶16、約1∶17、約1∶18、約1∶19、或約1∶20的比例表達。該比例的測定通常使用本領域認可的技術來測定，諸如逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)或Northern印跡(用於測量轉錄物的相對量)或免疫印跡或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)技術(用於測量多肽的相對量)。在一個實施方案中，所述載體包含SEQIDNO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28。在一個相關實施方案中，所述載體包含SEQIDNO29。在另一個實施方案中，本發明提供了包含能夠表達兩種或多種可選剪接基因產物的上述載體的真核細胞。在一個實施方案中，本發明的可選剪接載體整合到細胞的染色體DNA中，而在另一個實施方案中，所述載體是附加體。在相關實施方案中，本發明的可選剪接盒或構建物整合到細胞的染色體DNA中。在另一個相關實施方案中，本發明的可選剪接盒或構建物是附加體。在另一些其它相關實施方案中，本發明的可選剪接載體包含病毒載體。在另一個實施方案中，含有本發明載體的真核細胞是哺乳動物細胞，諸如例如幼倉鼠腎細胞、成纖維細胞、骨髓瘤細胞、NSO細胞、PER.C6細胞或CHO細胞，或是昆蟲細胞，諸如例如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf9)細胞、甘藍銀紋夜蛾(Tricoplusiani)(Tn.TnHigh-Five)細胞或家蠶蛾(Bombyxmori)(BMN)細胞。或者，含有本發明載體的真核細胞是酵母細胞，例如糖酵母(Saccharomyces)細胞、裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces)細胞或畢赤酵母(Pichia)細胞。在另一個實施方案中，本發明提供了用於生產多肽的方法，所述方法包括培養含有本發明可選剪接載體或表達盒或構建物的上述細胞，隨後由所述細胞培養物分離所述第一和所述第二多肽。在該方法的一個實施方案中，所述第一和第二多肽形成多肽多聚體，諸如抗體。在另一個實施方案中，本發明提供了通過該方法生產的上述肽多聚體，用於製造用於治療或預防疾病或紊亂的藥物。在另一個實施方案中，本發明提供了在體內將所述可選剪接載體或可選剪接盒或構建物投遞至患者。在另一個實施方案中，本發明提供了以回體(exvivo)將所述可選剪接載體或可選剪接盒或構建物投遞至患者的細胞或組織。在相關實施方案中，本發明還提供了將包含所述可選剪接載體或可選剪接盒或構建物的患者細胞或組織返還患者體內。根據下文詳述和權利要求，本發明的其它特徵和優勢對於本領域普通技術人員將是顯而易見的。附圖簡述圖1顯示了本發明可選剪接載體的結構和功能方面的示意圖，所述載體設計成容許單一啟動子來驅動單一前mRNA的轉錄，它隨後可以可選剪接成兩種或多種轉錄物。所述兩種或多種轉錄物隨後翻譯成兩種或多種相應多肽。圖2顯示了本發明的表達載體在用於表達抗體輕鏈和重鏈且它們隨後裝配形成成熟四聚體抗體時的示意圖。圖3是為了在真核細胞中生產抗體而設計成由單一啟動子表達抗體輕鏈和重鏈的本發明可選剪接載體的質粒圖譜。該質粒圖譜還指出了剪接位點、克隆位點、聚腺苷酸化序列、及用於在真核細胞中進行選擇(DHFR)和在原核細胞中進行擴增(β-內醯胺酶)的標記的位置和取向。還可參見SEQIDNO29，它提供了載體主鏈的序列。圖4顯示了所測試第一剪接受體的剪接位點、內含子和外顯子區(分別是小寫和大寫)的序列，及相應的質粒名稱和序列標識符。發明詳述為了提供對說明書和權利要求的清楚理解，下文方便的提供了下列定義。定義術語「第一多肽」和「第二多肽」指希望其共表達的多肽。這些包括例如由多個多肽亞基構成的多聚體蛋白質的多肽「鏈」。這些多聚體蛋白質可以是在自然界中發現的，例如本領域所描述的。當然，術語「第一多肽」和「第二多肽」還可在將來用於描述本領域目前尚未描述過的多聚體蛋白質。這些多聚體蛋白質還可以是人造的，如由在自然界中通常發現不締合的多肽構成。另外，所述多肽可以是不締合在一起的，但是為了一些功能目的而共表達，例如選擇標記和目的多肽的共表達。另外，所述多肽可以是天然序列或突變的，諸如通過胺基酸添加、刪除或替代。本領域普通技術人員將容易的認識到本發明的載體適用於廣泛的多肽，而且能夠使用標準分子生物學技術修改所述載體以適應這些多肽的使用。術語「抗體」或「抗體片段」指多肽或多肽片段的裝配物，它們具有針對靶多肽或受體的結合活性，或者具有期望的效應物功能。通常，此類裝配物至少包括抗體輕鏈和重鏈的可變區，例如Fab片段，或是兩條抗體輕鏈和兩條抗體重鏈，四條鏈一起形成四聚體抗體(L:H:H:L)，其可變區能夠結合抗原。本發明的抗體可以是本領域知道的任何形式，例如鼠源的、嵌合的、人源化的、人的或合成的。還可以修飾本發明的抗體以具有其它特徵，諸如改變的糖基化位點或Fc區。術語「UTR」意為非翻譯區，指轉錄成前mRNA和成熟mRNA非翻譯區的核酸序列區段。5』UTR通常擔當轉錄物的5』末端，以起動mRNA轉錄物翻譯成多肽的7-鳥、7-甲基鳥苷帽進行修飾或「加帽」。術語「以...比例表達」指表達成轉錄物或多肽的基因產物的產量比例。該比例的測定通常使用本領域認可的技術來測定，諸如逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)或Northern印跡(用於測量轉錄物的相對量)或免疫印跡或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)技術(用於測量多肽的相對量)。在某些實施方案中，所述第一和第二多肽以約20∶1至約1∶20、約15∶1至約1∶15、約12∶1至約1∶12、約10∶1至約1∶10、約9∶1至約1∶9、約8∶1至約1∶8、約7∶1至約1∶7、約6∶1至約1∶6、約5∶1至約1∶5、約4∶1至約1∶4、約3∶1至約1∶3、約2∶1至約1∶2、或約1∶1的比例表達。在具體的實施方案中，所述第一和第二多肽以約20∶1、約19∶1、約18∶1、約17∶1、約16∶1、約15∶1、約14∶1、約13∶1、約12∶1、約11∶1、約10∶1、約9∶1、約8∶1、約7∶1、約6∶1、約5∶1、約4∶1、約3∶1、約2∶1、約1∶1、約1∶2、約1∶3、約1∶4、約1∶5、約1∶6、約1∶7、約1∶8、約1∶9、約1∶10、約1∶11、約1∶12、約1∶13、約1∶14、約1∶15、約1∶16、約1∶17、約1∶18、約1∶19、和/或約1∶20的比例表達。術語「第一外顯子」指編碼多肽或多肽區的編碼序列或核酸序列，而術語「第二外顯子」指編碼第二多肽區的不同的第二編碼序列或核酸序列。本發明的第一和第二外顯子還包含5』剪接受體序列。術語「宿主細胞」或「真核宿主細胞」指使用本發明的表達系統生成或表達所述第一和第二外顯子的基因產物的任何真核細胞。這包括例如哺乳動物細胞，諸如幼倉鼠腎細胞、成纖維細胞、骨髓瘤細胞(如NS0細胞)、人PER.C6細胞或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。可用於表達的昆蟲細胞包括例如草地夜蛾(Sf9)細胞、甘藍銀紋夜蛾(Tn.TnHigh-Five)細胞或家蠶蛾(BMN)細胞。可用於表達的酵母細胞包括例如糖酵母細胞、裂殖糖酵母細胞或畢赤酵母細胞。此類細胞易於從公開的和商業性的來源獲得，諸如美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。術語「內含子」指進行轉錄且存在於前mRNA中但由剪接機制根據剪接供體和剪接受體的序列切除因而在成熟mRNA轉錄物中不存在的核酸序列區段。術語「可操作連接」指各成分處於容許它們以其設定方式發揮功能的相互關係的並置方式(如功能性連接)。術語「聚腺苷酸化信號」指RNA轉錄物中存在的、在存在酶聚腺苷醯轉移酶時容許轉錄物聚腺苷酸化的核酸序列。本領域知道許多聚腺苷酸化信號，它們可用於本發明。實例包括人變體生長激素聚腺苷酸化信號、SV40晚期聚腺苷酸化信號和牛生長激素聚腺苷酸化信號。術語「啟動子」指足以指導轉錄的最小序列，優選在真核細胞中。可用於本發明的啟動子包括例如提供高水平表達的病毒、哺乳動物、昆蟲和酵母啟動子，如哺乳動物巨細胞病毒或CMV啟動子、SV40啟動子、或本領域知道的適用於在真核細胞中表達的任何啟動子。術語「剪接位點」指能夠被真核細胞的剪接機制識別而適於切割和/或與相應剪接位點連接的特定核酸序列。剪接位點容許切除前mRNA轉錄物中存在的內含子。通常，將剪接位點的5』部分稱為剪接供體，而將3』相應剪接位點稱為受體剪接位點。術語剪接位點包括例如天然存在的剪接位點、經過改造的剪接位點，例如合成的剪接位點、規範的或共有的剪接位點、和/或非規範的剪接位點，例如隱蔽剪接位點。術語「與...剪接」指剪接供體與剪接受體相互作用從而容許剪接機制(如剪接體)剪接轉錄物。如上所述，剪接即切除轉錄物中以剪接供體和剪接受體為界的部分(內含子)。對於每條轉錄物，剪接供體只與一個剪接受體剪接。對於可選剪接，在轉錄物集合中，剪接供體與超過一個剪接受體剪接。例如，剪接供體可與一條轉錄物的第一剪接受體剪接，但是在另一條轉錄物上，剪接供體與第二剪接受體剪接，生成轉錄物的異質集合(heterogeneouspool)。術語「剪接轉錄物」指在剪接供體和第一或第二任一剪接受體之間已進行過剪接的、包含第一或第二外顯子的、由本發明可選剪接載體轉錄的RNA。術語「載體」指在導入宿主細胞或宿主細胞提取物後能夠賦予基因產物以表達的核酸分子(DNA或RNA任一)。此術語可與「可選剪接載體」、「表達載體」、「表達盒」或「構建物」互換。此類載體或表達盒或構建物可包含本發明的可選剪接元件以及用於在細胞中擴增載體、載體侵入細胞和後續表達的額外序列、選擇標記、或任何其它功能性元件。此類元件是本領域眾所周知的，而且可根據需要使用標準分子生物學技術互換。術語「病毒載體」或其變化(諸如「腺病毒載體」)指包含本發明的可選剪接載體或表達盒或構建物的減毒型或複製缺陷型病毒顆粒。如下文更為詳細描述的，此類病毒載體可用於將本發明的可選剪接載體或表達盒或構建物插入宿主細胞。詳述1.概觀通過提供包含驅動兩個或多個外顯子表達的單一啟動子的載體或表達盒或構建物，其中所述外顯子經過改造可選剪接成兩種或多種可表達轉錄物，本發明部分提供了用於在真核細胞中表達兩種或多種基因產物的方法。如此，所述載體或表達盒或構建物適用於表達兩種或多種多肽，特別是多肽多聚體，例如通常作為兩條輕鏈和兩條重鏈抗體多肽的裝配物的抗體(或抗體片段)。此外，因為本發明的載體或表達盒或構建物使用單一啟動子來驅動前mRNA的表達，它隨後可選剪接成兩種或多種基因產物，本發明避免了多個啟動子的使用、因使用多個啟動子的啟動子競爭、或獨立啟動子的不同活性。另外，經由多個剪接受體的使用，本發明具有如下優勢，即在真核細胞中以期望比例提供多種基因產物的表達，使得例如所得多肽裝配物，例如四聚體抗體高效生成。另外，本發明提供了通過改變剪接元件，特別是第一剪接受體的序列來改變所編碼多肽的表達比例。改變所表達多肽比例的能力通過以最佳數量提供多肽而容許更加有效的多聚化或多肽的其它功能性方面。如此，本發明的載體或表達盒或構建物容許以足以生成一種或多種期望蛋白質的數量表達所述多肽。如此，本發明還提供了適用於使用可選剪接表達多肽多聚體，如抗體的載體，以及包含所述載體的細胞和由此類細胞生成的抗體及其在例如在受試者例如人類患者中預測、診斷、預防、改善或治療紊亂或疾病中的用途。另外，本發明提供了適用於通過將載體直接或經由回體(exvivo)技術投遞至受試者而在體內表達多肽的載體。2.用於表達多肽多聚體的載體或表達盒或構建物的設計本發明的方法採用使用(以5』至3』或順流方向)包含啟動子；5』非翻譯區(UTR)(它可以包含或不包含編碼序列)；單一5』剪接供體；以3』剪接受體結束的內含子，所述3』剪接受體以優選約5-95％的效率使用(取決於期望的產物比例)(例示性的3』剪接受體效率包括但不限於5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％)；含有第一基因和，任選地，聚腺苷酸化信號的外顯子；以效率高於50％(在優選的實施方案中，3』剪接受體的效率高於75％(如80％、85％、90％、95％或100％)，效率高於85％(如90％、95％或100％)，效率高於90％(如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)，或者，在高度優選的實施方案中，效率高於95％(如96％、97％、98％、99％或100％)的3』剪接受體結束的內含子序列；和含有第二基因和，任選地，聚腺苷酸化信號的外顯子的載體(見圖1)。可將本發明的載體、表達盒或構建物導入宿主細胞，它在其中生成可選剪接mRNA轉錄物。這些兩種或多種mRNA轉錄物編碼不同的多肽，它們隨後以足以生成一種或多種期望多聚體蛋白質的數量表達。如果需要，可經由合適剪接位點的選擇，如較弱或較強的剪接受體來改變兩種或多種產物的比例。在具體的實施方案中，可經由只選擇第一剪接受體來改變兩種或多種產物的比例。通常，前mRNA剪接涉及精確切除內含子序列，且部分基於剪接機制如剪接體對內含子-外顯子邊界處特定序列即供體和受體剪接位點的識別。這些邊界序列通常符合共有序列，內含子5』端的MAG/GURAGU(SEQIDNO30)和內含子3』端的Y10NCAG/G(SEQIDNO31)(其中M＝A或C，標有下劃線的是不變的核苷酸，Y10＝10個連續的C或T核苷酸，而N＝任何核苷酸)。內含子和外顯子中的序列以及內含子長度也已證明在剪接效率中發揮作用(參見如Chabot，B.，TrendsinGenetics12472-478，1996)。在本發明的某些實施方案中，可選剪接能夠調控由本發明載體或表達盒或構建物的外顯子編碼的每種多肽的表達。對於每條獨立的剪接轉錄物，剪接供體只與一個剪接受體剪接，或者根本不剪接。然而，可選剪接形成轉錄物的異質集合，因為剪接供體可與一條轉錄物上的第一剪接受體剪接，而與另一條轉錄物上的第二剪接受體剪接。如此，單一剪接供體與多個剪接受體的剪接將調控細胞中由本發明載體或表達盒或構建物生成的第一和第二(或更多)外顯子的剪接轉錄物水平。不同剪接轉錄物水平的相對數量將取決於剪接供體多麼頻繁的連接特定剪接受體，這稱為剪接事件效率。特定剪接事件在轉錄物中發生的頻率越高，則表示與該剪接事件相關的剪接供體和剪接受體效率越高或越強。在本發明的某些實施方案中，優選的是，剪接供體和3』末端剪接受體(例如第二剪接受體)高度有效，因此整體剪接高度有效且第一剪接受體的強度控制剪接外顯子轉錄物的相對水平。未剪接轉錄物的翻譯效率通常很低，因此最大限度剪接促進多肽表達。例如，如果剪接供體和第二剪接受體高度有效，那麼大多數新生mRNA將被剪接。如果第一剪接受體強(即高效)，那麼細胞內將存在相對較高水平的包含第一外顯子的剪接轉錄物，導致第一多肽較之第二多肽高比例表達。。如果第一剪接受體較弱，那麼細胞內將存在相對較低水平的包含第一外顯子的剪接轉錄物，導致第一多肽較之第二多肽低比例表達。因為翻譯高度依賴包含指定外顯子的剪接轉錄物的水平，所以由第一或第二外顯子編碼的多肽的表達依賴利用緊挨著外顯子上遊的剪接受體的剪接水平。因此，在某些實施方案中，因為剪接影響包含由本發明載體或表達盒或構建物編碼的每種外顯子的成熟轉錄物的水平，所以使用可選剪接來調控由外顯子編碼的多肽的表達。剪接供體和剪接受體在本領域是眾所周知的，且任何剪接供體和剪接受體都可用於本發明。這些元件尤其可在本領域中找到或衍生自共有序列，或是根據經驗插入、刪除或替代核苷酸，或是使用能夠預測剪接序列的軟體，諸如2.4版Netgene2。可在本發明中對此類剪接元件測試合適性，諸如使用實施例中描述的方法。本發明部分引入和改進此類序列以經由遺傳工程在真核細胞中實現兩種或多種期望重組基因產物的可選剪接。本發明的載體或表達盒或構建物可用於表達多種異多聚體蛋白質。實例包括但不限於異二聚體諸如糖蛋白激素(如絨毛膜促性腺激素(CG)、促甲狀腺素(TSH)、促黃體素(LH)、和促卵泡素(FSH))或整聯蛋白家族的成員。還可使用由兩對相同亞基組成的異四聚體。適宜異四聚體的實例包括抗體、胰島素受體(α2β2)和轉錄起始因子TFIIE(α2β2)。另外，使用生成2∶1表達比例的剪接受體對，載體或表達盒或構建物可用於表達異三聚體，諸如淋巴毒素α1β2。通過組合不同剪接受體改變表達比例可生成能夠以不同比例表達多聚體的載體或表達盒或構建物，容許許多不同異多聚體蛋白質的高效表達。在某些實施方案中，根據剪接供體和/或剪接受體信號的序列來預測表達比例。在其它實施方案中，根據經驗確定表達比例。此外，可使用本發明的可選剪接系統用於生成多肽多聚體例如抗體的基因序列可從許多不同來源獲得。例如，多種人蛋白質基因可從公眾可獲得的基因序列保藏物和/或質粒、克隆、細胞等的保藏物獲得。許多蛋白質序列和蛋白質編碼序列已經發表，且可由這些序列諸如本文所述合成合適的基因。或者，可使用本領域認可的技術選擇並培養蛋白質生成細胞系。在其它實施方案中，基因序列是經由登錄訂閱的資料庫獲得的。本領域普通技術人員將知道許多方法適於獲得基因序列信息。例如，可通過標準技術從最初生成抗體的雜交瘤細胞或從其它轉化細胞分離編碼抗體的RNA，諸如異硫氰酸胍提取和沉澱，後續離心或層析。在需要時，可通過標準技術從總RNA分離mRNA，諸如在寡dT纖維素上進行的層析。適於這些目的的技術對於本領域普通技術人員而言是熟悉的。編碼抗體輕鏈和重鏈的cDNA可依照眾所周知的方法使用逆轉錄酶和DNA聚合酶同時或分開製備。可用共有恆定區引物或以例如發表的抗體輕鏈和重鏈DNA和胺基酸序列為基礎的更特異引物起始。如上所述，PCR也可用於分離編碼抗體輕鏈和重鏈的DNA克隆。在這種情況中，可用共有引物或較大同源探針諸如小鼠恆定區探針篩選文庫。或者，抗體和抗體片段可使用衍生自眾所周知的計算機建模技術的序列合成。此類建模技術可用於預測在由保守胺基酸序列定義的指定抗體框架的背景下將結合預測配體結構的抗體序列。通過使用這種已知關係，本領域技術人員能夠設計期望抗體或抗體片段的胺基酸序列，然後合成編碼期望多肽的核酸序列。此類設計的抗體或抗體片段稱為「合成的」。本發明的組合物和方法適於任何抗體，或實際上任何多鏈或多聚體蛋白質。與本發明的這個實施方案相容的寡核苷酸合成技術是本領域普通技術人員所熟知的，且能夠使用幾種商品化自動化合成儀任何一種來進行。另外，編碼本文列出的幾種重鏈和輕鏈類型的DNA序列可經由商業DNA賣主獲得。然後可改變或修飾使用任何上述方法獲得遺傳材料以提供與本發明及此類抗體的期望用途相容的抗體。多種不同抗體類型可依照本發明表達。例如，對某一抗原如腫瘤相關抗原、病原體、或涉及自身免疫病的自身抗原具有特異免疫反應性的抗體或抗體片段。可修飾抗體(或其片段)使得一個或多個恆定區刪除或以其它方式改變，從而提供期望的功能活性諸如血清半衰期、或效應物功能。Kuby，J.，《Immunology》，第3版，W.H.FreemanandCo.，1997中描述了許多此類抗體。適於使用本發明的方法在真核細胞中表達的抗體包括五個截然不同的抗體類別IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。雖然所有五類都屬於本發明的範圍之內，但是下面的討論主要針對IgG類分子。本領域普通技術人員能夠容易的使下面的討論適應其它類別的免疫球蛋白。IgG分子通常包含兩條相同的抗體輕鏈，每條分子量約23kD，和兩條相同的抗體重鏈，每條分子量約53-70kD。在圖2所示構造中，鏈間二硫鍵連接這四條鏈。另外，抗體輕鏈和重鏈二者都分成結構和功能同源性的區域。術語「恆定」和「可變」在功能上使用。在這點上，本領域普通技術人員將領會，抗體輕鏈(VL)和重鏈(VH)的可變區決定抗原識別和特異性。相反，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3)的恆定區賦予重要的生物學特性，諸如分泌、經胎盤遷移、Fc受體結合、補體結合、和其它效應物功能。輕鏈分為入κ或λ鏈。可發現每類重鏈或與κ或與λ輕鏈結合。一般而言，輕鏈和重鏈彼此共價鍵合，且在由雜交瘤、B細胞或經過遺傳工程改造的宿主細胞生成免疫球蛋白時兩條重鏈的「尾」部通過共價二硫鍵彼此鍵合(見圖2)。N端是可變區，而C端是恆定區。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，其中還有亞類。這條鏈的本質決定抗體的「分類」是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。免疫球蛋白亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，已經充分鑑定且已知賦予功能特化。應當理解本發明的第一外顯子或第二外顯子可用於二選一地編碼抗體輕鏈或重鏈，只要所得載體編碼一條輕鏈和一條重鏈。抗原結合位點由每條VH和VL鏈上的三個互補決定區(CDR)決定。每個單體抗體上存在的六個CDR是較短的非連續胺基酸序列，它們的具體佔位使得抗體在水性環境中採取三維構象時形成抗原結合位點。重鏈和輕鏈可變區的剩餘部分在胺基酸序列上顯示較低的分子間可變性，稱為框架區。框架區大部分採取β-摺疊構象，而CDR形成連接β-摺疊結構的環，且在有些情況中構成β-摺疊的一部分。如此，框架區的作用是形成支架，通過鏈間非共價相互作用為正確取向的六個CDR提供定位。由定位的CDR形成的抗原結合位點決定與免疫反應性抗原上表位的表面互補性。此互補表面促進抗體與免疫反應性抗原表位的非共價結合。抗體片段適於使用本發明的可選剪接載體或表達盒或構建物表達。此類片段是期望抗體的任何一個或多個部分，且可包括如Fab片段、F(ab』)2片段、和Fc片段。另外，抗體片段可包括單鏈抗體或包含少於全長四聚體抗體蛋白質的其它抗體衍生多肽。本領域普通技術人員將領會，使用本發明的可選剪接載體或表達盒或構建物表達的抗體可包含提供抗體與選定抗原結合的任何類型的可變區。在這點上，可變區可包含任何類型的哺乳動物的或衍生自能夠誘導引起體液應答並生成針對期望抗原的免疫球蛋白的任何類型的哺乳動物。因此，經修飾抗體的可變區可以是例如鼠源的、非人靈長類的、或人源的。在衍生自不同物種時，通常是鼠源可變區與人源恆定區融合，將該抗體稱為嵌合抗體。在優選的實施方案中，抗體的可變區和恆定區二者都是人源的。在其它選定實施方案中，相容抗體的可變區(通常衍生自非人來源)可進行改造或特定剪裁以改進分子的結合特性(如親和力成熟)或降低免疫原性。在這點上，可用於本發明的可變區可進行人源化或以其它方式改變，即經由包含引入的DNA或胺基酸序列。此類具有自另一種物種移植的CDR的人抗體稱為人源化抗體。另外，可變區可以是經過改造的，或合成的，正如先前所述。任何上述抗體可進一步修飾以具有改變的糖基化位點、適於PEG化的位點、和/或賦予抗體以改變的效應物功能的位點，如改變的補體結合、改變的Fc受體結合、和/或改變的免疫細胞相互作用活性。為了本發明的目的，可採用許多可選剪接表達載體系統。例如，本發明的可選剪接載體或表達盒或構建物可含有衍生自動物病毒的DNA元件，諸如人或牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆狀病毒、逆轉錄病毒(如HIV)、巨細胞病毒、或SV40病毒。另外，可通過導入一種或多種容許選擇受到轉染的宿主細胞的標記來選擇能夠將可選剪接載體或表達盒或構建物整合到其染色體中或作為附加體維持載體或表達盒或構建物的細胞。選擇標記基因可以直接連接待表達的DNA序列，或者通過共轉染導入同一細胞。下文討論了適於導入本發明載體或表達盒或構建物的宿主細胞。3.在培養物中的真核細胞中表達多肽多聚體可使用本領域普通技術人員熟知的技術將本發明的可選剪接載體或表達盒或構建物導入適當的宿主細胞。這些包括例如轉染(包括電泳和電穿孔)、原生質體融合、磷酸鈣沉澱、使用包膜DNA的細胞融合、顯微注射、和病毒感染(參見如Ridgway，A.A.G.，「MammalianExpressionVectors」，第24.2章，第470-472頁，《Vectors》，Rodriguez和Denhardt編，Butterworths，Boston，Mass.，1988)。如上所述，本發明的載體或表達盒或構建物可整合到宿主細胞的染色體中，以附加體形式維持，或者瞬時表達。經轉化細胞在適於生成其中所編碼多肽，如抗體輕鏈和重鏈的條件下培養，並測定多肽合成。用於鑑定和測量多肽合成的例示性測定技術包括如酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、螢光共振能量轉移(FRET)、放射免疫測定法(RIA)、螢光激活細胞分揀分析(FACS)、和免疫組織化學。用於蛋白質表達的宿主細胞系優選真核起源，例如哺乳動物起源，或者酵母或昆蟲。例示性宿主細胞系包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)系、HeLa(人宮頸癌)、CVI(猴腎細胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中國倉鼠成纖維細胞)、BALBC/3T3(小鼠成纖維細胞)、HAK(倉鼠腎細胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、NS0(骨髓瘤)、BEC(牛肉皮細胞)、RAJI(人淋巴細胞)、293(人腎)、PER.C6(人)、草地夜蛾(Sf9)(昆蟲)、甘藍銀紋夜蛾(Tn.TnHigh-Five)(昆蟲)、家蠶蛾(BMN)(昆蟲)、糖酵母(酵母)、裂殖糖酵母(酵母)和畢赤酵母(酵母)。宿主細胞系通常可從商業服務機構諸如AmericanTissueCultureCollection(美國典型培養物保藏中心)或出版的文獻獲得。體外生產容許擴大規模以生成大量的使用本發明可選剪接系統生產的期望多肽，優選抗體。用於組織培養條件下的真核如哺乳動物和酵母細胞培養的技術是本領域普通技術人員所熟知的，包括同質懸浮培養，如在氣升式反應器中或在連續攪拌式反應器中，或者固定化或圈閉式(entrapped)細胞培養，如在中空纖維中、微囊、在瓊脂糖微珠上、陶瓷筒、或在發酵罐中。為了分離和回收依照本發明生產的多聚體蛋白質，特別是就抗體而言，可首先濃縮培養物上清液中的蛋白質(如免疫球蛋白)，如通過硫酸銨沉澱，針對吸溼材料諸如PEG透析，和經選擇性膜過濾。如果必需和/或期望的話，通過慣例的層析方法純化多聚體蛋白質(如多價抗體)的濃縮液，例如凝膠過濾、離子交換層析、DEAE-纖維素的層析、或免疫親和層析(如蛋白質A或蛋白質G)。本發明還涵蓋在使用本發明的可選剪接系統表達時締合生成功能性抗體的任何抗體輕鏈和重鏈序列的表達，所述功能性抗體如特異結合靶抗原諸如腫瘤相關抗原、病原體或自身抗原或者具有期望效應物功能的抗體。重要的是，可選擇可選剪接構建物中抗體輕鏈和重鏈基因的拷貝數，從而獲得優選的輕鏈/重鏈比例。在某些實施方案中，輕鏈以範圍通常為相對於重鏈的約10/1、約5/1、約3/1或約1/1的水平表達。在相關實施方案中，輕鏈和重鏈多肽以約20∶1至約1∶20、約15∶1至約1∶15、約12∶1至約1∶12、約10∶1至約1∶10、約9∶1至約1∶9、約8∶1至約1∶8、約7∶1至約1∶7、約6∶1至約1∶6、約5∶1至約1∶5、約4∶1至約1∶4、約3∶1至約1∶3、約2∶1至約1∶2、或約1∶1的比例表達。在具體的實施方案中，輕鏈和重鏈多肽以約20∶1、約19∶1、約18∶1、約17∶1、約16∶1、約15∶1、約14∶1、約13∶1、約12∶1、約11∶1、約10∶1、約9∶1、約8∶1、約7∶1、約6∶1、約5∶1、約4∶1、約3∶1、約2∶1、約1∶1、約1∶2、約1∶3、約1∶4、約1∶5、約1∶6、約1∶7、約1∶8、約1∶9、約1∶10、約1∶11、約1∶12、約1∶13、約1∶14、約1∶15、約1∶16、約1∶17、約1∶18、約1∶19、和/或約1∶20的比例表達。本發明還提供了選擇任何期望比例的方法，通過篩選具有不同剪接位點的載體使得如在指定細胞系中獲得所述期望的比例(參見如實施例2)。這在高效表達抗體時尤其至關重要，因為已經觀察到某些輕鍊表達水平可能有助於指導抗體重鏈和輕鏈的適當裝配，而過量未成對的重鏈可能誘導細胞毒性。此外，輕鏈還在內質網中指導裝配好的抗體重鏈和輕鏈摺疊以生成功能性抗原結合抗體中至關重要。因此，在某些實施方案中，抗體輕鏈通常以相對於抗體重鏈的約10/1至1/1表達(例示性的輕鏈/重鏈比例包括但不限於約10/1、9/1、8/1、7/1、6/1、5/1、4/1、3/1、2/1和1/1)。在某些實施方案中，依照本發明表達系統表達的抗體可以是對任何期望抗原特異的。優選的是，抗體將是引發治療性效果的功能性抗體，諸如可用於治療自身免疫性、炎性、傳染性、變應性或贅生性疾病的抗體。抗體可為了協同作用而聯合其它治療劑。例如，抗體可聯合如其它抗體、小分子、或用作癌症化療劑的放射源。在某些實施方案中，本發明的可選剪接載體或表達盒或構建物聯合併非有意依賴可選剪接來表達多種多肽的其它載體或表達盒或構建物使用。4.藥用組合物本發明還特別提供了包含使用本發明的方法和/或載體或表達盒或構建物表達的多聚體蛋白質的治療性組合物，用於治療有所需要的受試者或患者。本發明的組合物可經由施用通過本發明方法生成的治療性多肽或通過包含本發明可選剪接載體或表達盒或構建物的基因療法而用於治療有所需要的受試者(即患者)。有所需要的受試者指患有或有風險患上可通過施用本發明組合物來治療或預防的疾病、紊亂或狀況的受試者。所述受試者可以是哺乳動物受試者。優選的受試者是人類受試者。在某些實施方案中，此類治療性組合物在藥學上可接受載體中包含此類多聚體蛋白質。在優選的實施方案中，此類治療性組合物在藥學上可接受載體中包含至少一種本發明生產的重組抗體或抗體片段。「藥學上可接受載體」指至少一種通常用於施用活性成分的藥用製劑成分。因此，載體可含有本領域使用的任何藥用賦形劑和用於施用的任何形式媒介物。組合物可以是例如注射液、水性懸浮液或溶液、非水性懸浮液或溶液、固體或液體口服劑型、藥膏、凝膠劑、油膏、皮內貼劑、乳膏、洗劑、片劑、膠囊劑、持續釋放劑型、諸如此類。額外賦形劑可包括例如著色劑、掩味劑、助溶劑、懸浮劑、壓模劑、腸衣、持續釋放助劑、諸如此類。本發明的試劑常常作為包含活性治療劑和多種其它藥學上可接受成分的藥用組合物而施用。參見《Remintong’sPharmaceuticalScience》，第15版，MackPublishingCompany，Easton，Pennsylvania，1980。優選形式取決於預定施用模式和治療應用。根據期望劑型，組合物還可包含藥學上可接受的、無毒的載體或稀釋劑，它們的定義是常用於配製動物或人類施用的藥用組合物的媒介物。選擇的稀釋劑應不影響組合物的生物學活性。此類稀釋劑的實例包括但不限於蒸餾水、生理學磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer氏溶液、右旋糖溶液和Hank氏溶液。另外，藥用組合物或製劑還可包含其它載體、佐劑、或無毒的、無治療作用的、無免疫原性的穩定劑。通常，此類組合物以治療有效量施用，即足以對患有或有風險患上可受本發明組合物治療影響的疾病、紊亂或狀況的受試者或患者引起可檢測的，優選在醫學上有益的效果的數量。依照本發明生產的多聚體蛋白質可以注射或植入製劑的形式施用，它們可以這樣一種方式配製以容許持續釋放活性成分。在一個優選的實施方案中，此類多聚體蛋白質是抗體。一種例示性組合物包含5mg/ml單克隆抗體，在由50mML-組氨酸、150mMNaCl組成且用HCl調至pH6.0的水性緩衝液中配製。通常，組合物製備成注射劑，即液態溶液或懸浮液；也可製備成適於在注射前溶解或懸浮在液態媒介物中的固體形式。如上所述，所述製劑還可在脂質體或微粒諸如聚交酯、聚乙醇酸交酯或共聚物中乳化或裝囊以增強輔助效果(參見Langer，Science2491527，1990；及Hanes，AdvancedDrugDeliveryReviews2897，1997)。5.預防和治療方法在某些實施方案中，本發明致力於適於預防、緩解或治療任何疾病、紊亂或狀況的蛋白質的生產。此類紊亂或疾病包括癌症、癌前狀態、和遺傳性疾病或狀況諸如肌肉營養不良。可受通過本發明方法生產的蛋白質治療影響的疾病、紊亂或狀況包括諸如下列狀況，遺傳病(即可歸於一種或多種基因缺陷的疾病狀況)、獲得性病理學(即不可歸於先天缺陷的病理學狀況)和預防方法(即預防疾病或不期望的醫學狀況)。獲得性病理學可以是表現為異常生理學、生物化學、細胞、結構或分子生物學狀態的疾病或症候群。可受通過本發明方法生產的蛋白質治療影響的疾病、紊亂或狀況可以是感染，包括病毒和細菌感染、過度增殖性疾病或紊亂，包括癌症和癌前狀況、免疫紊亂，諸如類風溼性關節炎、遺傳性免疫缺陷狀況，諸如高IgM症候群、原發性或混合型免疫缺陷狀況，包括特徵為嗜中性粒細胞減少的狀況、以及神經學紊亂、心血管紊亂，諸如缺血、和內分泌紊亂，諸如糖尿病、甲狀腺紊亂和不孕不育。可受通過本發明方法生產的蛋白質治療影響的疾病、紊亂或狀況可以是過度增殖性疾病或紊亂，包括癌症。此類疾病或紊亂可涉及任何細胞、組織或器官，包括腦、肺、鱗狀細胞、膀胱、胃、胰、乳房、頭、頸、肝、腎、卵巢、前列腺、結腸、直腸、食道、鼻咽、甲狀腺和皮膚。癌症可以是黑素瘤、淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、肉瘤或癌症。癌症可以是實體瘤，或者可涉及體液，諸如血液。可受通過本發明方法生產的蛋白質治療影響的疾病、紊亂或狀況可以是遺傳上繼承的疾病，諸如亨庭頓氏病(Huntington’sdisease)、雙相型障礙(bipolardisorder)、帕金森氏病(Parkinson’sdisease)、腕管症候群(CarpalTunnelSyndrome)、囊性纖維化、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-MerzbacherDisease)、多發性硬化或迪謝內肌營養不良(DuchenneMuscularDystrophy)。可受通過本發明方法生產的蛋白質治療影響的疾病、紊亂或狀況可以是傳染病，諸如結核病、瘧疾、黃熱病、或由B肝病毒、皰疹病毒、人免疫缺陷病毒等感染引起的疾病。在具體的實施方案中，本發明還特别致力於適於預防或治療紊亂或疾病如免疫系統的紊亂或疾病的抗體或抗體片段的生產。因此，在某些實施方案中，本發明的抗體或抗體片段可用於預防或治療免疫紊亂，包括例如腎小球腎炎、硬皮病、硬化、多發性硬化、狼瘡腎炎、動脈粥樣硬化、炎性腸病、變態反應或類風溼性關節炎。在另一個實施方案中，本發明的抗體或抗體片段可用於治療或預防炎性紊亂，包括但不限於阿耳茨海默氏病、重度哮喘、特應性皮炎、惡病質、CHF缺血、冠狀動脈再狹窄、克羅恩氏病、糖尿病腎病、淋巴瘤、銀屑病、纖維化/輻射誘發的、幼年型關節炎、中風、由外傷引起的腦或中樞神經系統炎症、和潰瘍性結腸炎。可用依照本發明生產的抗體或抗體片段來預防或治療的其它炎性紊亂包括由於角膜移植、慢性阻塞性肺病、C型肝炎、多發性骨髓瘤和骨關節炎的炎症。在另一個實施方案中，本發明的抗體和抗原結合片段可用於預防或治療瘤形成，包括但不限於膀胱癌、乳房癌、頭和頸癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma)、黑素瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、胃癌、白血病/淋巴瘤、和多發性骨髓瘤。其它瘤形成疾病包括宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、非鱗狀細胞肺癌和前列腺癌。在另一個實施方案中，本發明的抗體或抗體片段可用於預防或治療神經變性性紊亂，包括但不限於阿耳茨海默氏病、中風、和外傷性腦或中樞神經系統損傷。其它神經變性性紊亂包括ALS/運動神經元疾病、糖尿病性周圍神經病、糖尿病性視網膜病、亨庭頓氏病、黃斑變性和帕金森氏病。在臨床應用中，根據展現疾病或紊亂的至少一種體徵或症狀來鑑定具有上述疾病之一或有患上述疾病之一風險的受試者。以足以治療例如上文所述的疾病或紊亂的至少一種症狀的數量施用本發明的至少一種抗體或其抗體片段或者包含至少一種本發明抗體或其抗原結合片段的組合物。因此，本發明的蛋白質適於作為治療劑在受試者中產生有益治療響應的條件下施用於受試者，例如用於預防或治療疾病或紊亂，例如本文所述。本發明的治療劑通常是基本上純的，不含不想要的雜質。這意味著試劑通常是至少約50％w/w(重量/重量)純，以及基本上不含幹擾性蛋白質和雜質。試劑有時是至少約80％w/w純，且更優選至少90％或約95％w/w純。然而，使用常規蛋白質純化技術，例如本文所述，可獲得至少99％w/w的同質肽。所述方法可用於無症狀患者和目前顯示疾病症狀的患者二者。此類方法使用的抗體可以是人源的、人源化的、嵌合的或非人源的抗體或其片段(如抗原結合片段)，且可以是單克隆的或多克隆的。在另一個實施方案中，本發明的特色是與藥學上載體一起作為藥用組合物施用依照本發明方法生產的抗體。或者，可通過施用編碼至少一條抗體鏈的多核苷酸將抗體施用於受試者。所述多核苷酸在受試者中表達，生成抗體鏈。因此，所述多核苷酸編碼抗體重鏈和輕鏈。所述多核苷酸在受試者中表達，生成重鏈和輕鏈。在例示性實施方案中，對受試者監測受試者血液中所施用抗體的水平。6.基因投遞本發明還涵蓋基因療法，由此為有所需要的患者提供包含可選剪接載體的核酸。可治療、改善或預防與上文關於使用通過本發明方法生產的多肽進行治療所述相同的疾病、紊亂和狀況。將DNA轉移或投遞至細胞以表達基因產物蛋白質的各種方法，其它地方稱為基因療法，公開於「GeneTransferintoMammalianSomaticCellsinvivo」，N.Yang，Crit.Rev.Biotechn.12(4)335-356，1992，將其引入本文作為參考。基因療法涵蓋將DNA序列導入體細胞或種系細胞以用於回體(exvivo)或體內療法。基因療法的功能是替換基因，提高正常或異常基因功能，及抗擊感染性疾病和其它病理學狀況。通過基因療法來治療這些醫學問題的策略包括治療性策略，諸如鑑定缺陷基因，然後添加功能性基因以替換缺陷基因的功能或加強略有功能的基因；或是預防性策略，諸如添加其產物蛋白質將治療該狀況或將使得組織或器官更易受到治療方案影響的基因。或者，可轉移賦予免疫力的基因，諸如通過在本發明的可選剪接載體中提供針對特定抗原的抗體。用於基因療法的基因轉移方法分成三大類物理的(如電穿孔、直接基因轉移和微粒轟擊)、化學的(基於脂質的載體或其它非病毒載體)和生物學的(病毒衍生載體和受體攝取)。例如，可使用非病毒載體，包括複合有DNA的脂質體。此類脂質體/DNA複合物可直接靜脈內注射到患者體內。認為脂質體/DNA複合物在肝中集中，在此它們將DNA投遞給巨噬細胞和Kupffer細胞。這些細胞長期存活，並因此提供所投遞DNA的長期表達。另外，基因的載體或「裸露的」DNA可直接注射到期望器官、組織或腫瘤中以靶向投遞治療性DNA。基因療法方法學還可通過投遞部位來描述。用於投遞基因的基礎方法包括回體(exvivo)基因轉移、體內基因轉移和體外基因轉移。在回體基因轉移中，從患者採集細胞並在細胞培養物中培養。將DNA轉染到細胞中，在數量上擴增轉染細胞，然後植回患者體內。在體外基因轉移中，方法是相同的，只是轉染細胞是在培養物中生長的細胞，諸如組織培養細胞，而非來自各個患者的細胞。體內基因轉移涉及在細胞位於患者體內時將DNA導入患者細胞。方法包括使用病毒介導的基因轉移，其中使用非感染性病毒將基因投遞到患者體內，或者將裸露的DNA注射到患者體內某部位並由一定百分比的細胞攝取，在該細胞中表達基因產物蛋白質。另外，本文描述的其它方法，諸如使用機械或化學方法，也可用於本發明核酸的體內轉移。DNA投遞的機械方法包括直接注射DNA，諸如將DNA顯微注射到生殖細胞或體細胞中，由壓縮空氣推動投遞DNA包被的微粒，諸如「基因槍」中使用的金微粒，及無機化學方法，諸如磷酸鈣轉染。另一種方法，配體介導的基因療法，涉及將DNA與特定配體複合，形成配體-DNA偶聯物，以將DNA投遞至特定細胞或組織。基因療法的化學方法可涉及化學製品以結合細胞和/或運送DNA穿過細胞膜，諸如促融合脂質囊泡諸如脂質體或用於膜融合的其它囊泡、DNA摻入陽離子脂質中的脂質微粒諸如脂轉染試劑、或多賴氨酸介導的DNA轉移。脂轉染試劑或細胞轉染試劑，結合帶負電荷的DNA的基於脂質的陽離子，構成能夠穿越細胞膜的複合物並在細胞內部提供DNA。另一種化學方法使用基於受體的胞吞作用，它涉及使特定配體結合細胞表面受體並將它包裹和轉運穿過細胞膜。配體結合DNA，而整個複合物轉運進入細胞。將配體-基因複合物注射到血流中，然後具有受體的靶細胞將特異結合配體，並將配體-DNA複合物轉運到細胞內。許多基因療法方法學採用病毒載體以將基因導入細胞，而且能夠進行改造以包含本發明的可選剪接載體。例如，經過改變的逆轉錄病毒載體已經用於回體(exvivo)方法以將基因導入外周的和浸潤腫瘤的淋巴細胞、肝細胞、表皮細胞、肌細胞、或其它體細胞。然後將這些經過改變的細胞導入患者以由插入的DNA提供基因產物。病毒載體還已經用於使用體內方案將基因導入細胞(參見如Eck，S.L和J.M.Wilson，「GeneBasedTherapy」，《GoodmanGilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics》，第9版，pp.77-101，McGraw-Hill，NewYork，1996)。為了指導外來基因的組織特異性表達，可使用已知具有組織特異性的順式作用調控元件或啟動子。或者，這可以通過在體內將DNA或病毒載體原位投遞至特定解剖學部位來實現。例如，在體內將基因轉移至血管是通過在動脈壁的選定部位植入體外轉導的內皮細胞來實現的。病毒感染同樣表達基因產物的周圍細胞。可將病毒載體直接投遞至體內部位，例如通過導管，由此只容許某些區域受到病毒的感染，並提供長期的、部位特異的基因表達。通過將經過改變的病毒注射到通向器官的血管中，還在乳房組織和肝組織中驗證了使用逆轉錄病毒載體的體內基因轉移。已經用於基因療法方案的病毒載體包括但不限於逆轉錄病毒、其它RNA病毒諸如脊髓灰質炎病毒或辛德比斯病毒(Sindbisvirus)、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、SV40、牛痘和其它DNA病毒。複製缺陷型鼠逆轉錄病毒載體和腺病毒載體是最廣泛使用的基因轉移載體。鼠白血病逆轉錄病毒由與核核心蛋白質和聚合酶(pol)複合，裝入蛋白質核心(gap)並由決定宿主範圍的糖蛋白包膜(env)圍繞的單鏈RNA構成。逆轉錄病毒的基因組結構包括由5』和3』長末端重複序列(LTR)包圍的gag、pol和env基因。逆轉錄病毒載體系統利用這樣的事實，即倘若在包裝細胞系中反式提供病毒結構蛋白質，那麼含有5』和3』LTR和包裝信號的最小載體足以容許載體包裝、感染和整合到靶細胞中。逆轉錄病毒載體用於基因轉移的根本優勢包括在大多數細胞類型中的高效感染和基因表達，精確的單拷貝載體整合到靶細胞染色體DNA中，和逆轉錄病毒基因組的易操作性。腺病毒由與核心蛋白質複合並以衣殼蛋白質包圍的線性雙鏈DNA構成。分子病毒學的發展導致了利用這些生物體的生物學來創建能夠在體內將新型基因序列轉導到靶細胞中的載體的能力。基於腺病毒的載體將以高水平表達基因產物肽。腺病毒載體具有高效感染性，甚至是低滴度的病毒。另外，病毒作為無細胞病毒體具有完全感染性，所以不必注射生產者細胞系。腺病毒載體的另一項潛在優勢是在有些細胞類型中實現長期異源基因表達的能力。腺病毒載體衍生自不能進行複製的腺病毒，它們通常在E1基因中含有刪除。將此類載體轉染到細胞中，諸如293人胚腎細胞系，它容許E1刪除的腺病毒複製。轉染後，任選腺病毒載體在這些特化輔助細胞中複製並形成感染性顆粒，收集並純化。這些顆粒能夠感染廣泛的宿主細胞，用於表達轉基因，如本發明的可選剪接載體，但是不能在沒有添加額外病毒因子的情況中複製。為了降低能進行複製的腺病毒混有腺病毒製品的可能性，可使用在病毒基因組中具有額外刪除或突變的腺病毒載體，諸如E1/E3刪除的載體或所有或大多數病毒基因遭到滅活的「無內容(gutless)」載體。或者，可使用含有倒置蛋白質pIX基因的腺病毒載體，正如美國申請號60/621,782和60/631,246中所述。發現將質粒DNA注射到肌肉細胞中產生高百分比的受到轉染且持續表達標記基因的細胞。質粒DNA可整合到細胞的基因組中或不然。不整合的轉染DNA將容許轉染和基因產物蛋白質在末端分化的、非增殖組織中表達較長一段時間而無需害怕細胞或線粒體基因組中的突變性插入、刪除或改變。長期但不必永久的將治療性基因轉移到特定細胞中可為治療或預防遺傳病。可定期重複注射DNA以維持基因產物水平而受體細胞基因組中不會發生突變。不整合的外源DNA可容許一個細胞中存在多種不同外源DNA構建物，所有構建物表達各種或多種基因產物。微粒介導的基因轉移方法最初用於轉化植物組織。憑藉微粒轟擊裝置，或「基因槍」，產生原動力，將DNA包被的高密度微粒(諸如金或鎢)加速至容許穿透靶器官、組織或細胞的高速率。微粒轟擊可用於體外系統，或者與回體(exvivo)或體內技術一起用於將DNA導入細胞、組織或器官。用於基因轉移的電穿孔使用電流使細胞或組織易受電穿孔介導的基因轉移的影響。使用指定電場強度的簡短電脈衝來提高膜的通透性，使得DNA分子能夠穿透進入細胞。這種技術可用於體外系統，或者與回體或體內技術一起用於將DNA導入細胞、組織或器官。載體介導的體內基因轉移可用於將外來DNA轉染到細胞中。載體-DNA複合物可方便的導入體液或血流，然後部位特異的指向體內的靶器官或組織。可使用脂質體和聚陽離子二者，諸如多賴氨酸、脂轉染試劑或細胞轉染試劑。可製備細胞特異的或器官特異的脂質體，由此脂質體攜帶的外來DNA將由靶細胞攝取。注射靶向某些細胞上的特定受體的免疫脂質體可作為常規方法用於將DNA導入攜帶該受體的細胞。已經使用的另一種載體系統是用於將DNA攜帶至肝細胞用於體內基因轉移的脫唾液酸糖蛋白/多賴氨酸偶聯物系統。轉染DNA還可複合有其它種類的載體，使得DNA被攜帶至受體細胞，然後駐留在胞質或核質中。DNA可在特定改造的囊泡複合物中偶聯載體核蛋白質並直接被攜帶至核。例如，可用表達抗腫瘤多肽的本發明載體轉染從患者切除的腫瘤細胞，並重新導回入患者體內。轉染的腫瘤細胞在患者體內生成抑制腫瘤生長的蛋白質水平。患者可以是人或非人哺乳動物。還可以通過本領域知道的物理或化學方法轉染細胞，諸如電穿孔、離子穿孔(ionoporation)、或經由「基因槍」。另外，包含本發明可選剪接載體的核酸可直接注射到患者體內，無需藉助載體。具體而言，可將載體DNA注射到皮膚、肌肉或血液中。用於將本發明載體轉染到患者中的基因療法方案可以是經由將載體DNA整合到細胞的基因組中或微型染色體中，或是作為細胞胞質或核質中分開的複製或不複製DNA構建物。蛋白質表達可持續較長一段時間，或者可定期重新注射以維持細胞、組織或器官中期望的蛋白質水平或預定的血液水平。7.治療方案和劑量在預防性應用中，以足以消除或降低風險、減輕嚴重程度、或延遲疾病發作，包括疾病的生物化學、組織學和/或行為症狀、其併發症和疾病發展過程中呈現的中間病理學表型的數量，對患有可用本發明重組蛋白質治療的疾病例如免疫系統疾病的受試者施用藥用組合物或藥物。在治療性應用中，以足以治癒或至少部分阻止疾病的症狀(生物化學、組織學和/或行為方面的)，包括其併發症和疾病發展過程中的中間病理學表型的數量，對懷疑或早就患有此類疾病的受試者施用組合物或藥物。本發明的多肽對於調控駐留在血液中的細胞表面抗原的生物學活性特別有用，其中所治療或預防的疾病至少部分是由抗原的異常高或低生物學活性引起的。在有些方法中，本發明組合物的施用降低或消除免疫紊亂，例如炎症。將適於實現治療性或預防性處理的數量定義為治療或預防有效量。在預防性和治療性兩種方案中，製劑通常以幾個劑量施用直至獲得足夠的免疫應答。本發明組合物用於治療上文所述狀況的有效劑量隨許多不同因素而變化，包括施用手段、靶位點、受試者的生理學狀態、受試者是人還是動物、施用的其它藥物、及處理是預防性的還是治療性的。通常，受試者是人，但是也可以處理非人哺乳動物，包括轉基因哺乳動物。可以使用本領域普通技術人員知道的配製方法在藥學上可接受製劑中作為分離的和基本上純的蛋白質和蛋白質片段提供由上文所述本發明可選剪接載體或表達盒或構建物表達的多肽和蛋白質。這些製劑可通過標準路徑來施用。一般而言，可通過局部、經皮、腹膜內、顱內、腦室內、大腦內、陰道內、子宮內、口服、直腸或腸胃外(如靜脈內、脊柱內、皮下或肌肉內)路徑來施用組合物。另外，可將多肽摻入容許持續釋放化合物的生物可降解聚合物，將該聚合物植入需要投遞藥物的部位附近，例如腫瘤部位，或者植入是為了系統的緩慢釋放多肽。還可使用滲透微泵來提供高濃度多肽的受控投遞，經套管到達目的部位，諸如直接進入轉移性生長或進入該腫瘤的血管供應。生物可降解聚合物及其用途詳細描述於例如Brem等，J.Neurosurg.74441-446，1991。本發明多肽的劑量將取決於所治療的疾病狀態或狀況及其它臨床因素，諸如人或動物的體重和狀況及化合物的施用路徑。對於治療人或動物，可施用約0.5mg/kg至500mg/kg多肽。根據多肽在特定動物或人中的半衰期，可在每天幾次至每周一次之間施用多肽。還應當理解，本發明可應用於人和獸醫用途二者。本發明的方法涵蓋單次以及多次施用，或是同時的或是在較長一段時間裡。對於使用抗體的被動免疫，劑量範圍為約0.0001-100mg/kg，且更常用的0.01-20mg/kg宿主體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或10mg/kg體重，或者在1-10mg/kg的範圍內，優選至少1mg/kg。可對受試者每天、隔天、每周或依照經驗分析決定的任何其它時間表施用此類劑量。一種例示性治療需要在較長一段時間例如至少六個月裡施用多個劑量。其它例示性治療方案需要每兩周一次或每月一次或每3-6個月一次施藥。例示性劑量時間表包括連續每天1-10mg/kg或15mg/kg、隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在有些實施方案中，同時施用具有不同結合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在這種情況中每種抗體的施用劑量落在所示範圍內。通常在多個時刻施用抗體。單一劑量之間的時間間隔可以是每周、每月或每年。在有些方法中，調整劑量以獲得血漿抗體濃度1-1000μg/ml，而在有些方法中是25-300μg/ml。或者，可作為持續釋放製劑來施用抗體，在這種情況中需要較低頻率的施用。劑量和頻率隨抗體在受試者中的半衰期而變化。一般而言，人源抗體顯示最長的半衰期，隨後是人源化抗體、嵌合抗體和非人源抗體。施用的劑量和頻率可隨處理是預防性的或治療性的而變化。在預防性應用中，將含有本發明抗體或其混合物的組合物施用於尚未處於疾病狀態的受試者以增強受試者的抵抗力。將此量定義為「預防有效量」。在此用途中，精確數量再次取決於受試者的健康和總體免疫(generalimmunity)狀態，但是通常範圍為每劑0.1-25mg，尤其是每劑0.5-2.5mg。在較長一段時間以相對稀疏的間隔施用相對較低劑量。有些受試者在其餘生持續接受治療。在治療性應用中，有時需要相對較短間隔的相對較高劑量(如每劑約1-200mg抗體，更常用5-25mg的劑量)，直至疾病的進展減緩或停止，且優選直至受試者顯示疾病症狀部分或完全緩解。此後，可對患者施行預防性方案。編碼抗體的核酸的劑量範圍為每名受試者約10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg、或30-300μgDNA。感染性病毒載體的劑量將隨所用病毒載體類型而變化，但體內使用將在每劑1×105至1×1020個病毒體之間。對於體外劑量，通常將使用每個細胞約0.5至100個病毒體。治療劑可通過腸胃外、局部、靜脈內、口服、皮下、動脈內、顱內、腹膜內、鼻內或肌肉內手段來施用以用於預防性和/或治療性處理。蛋白質藥物最典型的施用路徑是血管內、皮下或肌肉內，儘管其它路徑也可能是有效的。在有些方法中，將製劑直接注射到特定組織，在此積累沉積物(deposit)，例如顱內注射。在有些方法中，將抗體作為持續釋放組合物或裝置施用，諸如MedipadTM裝置。蛋白質藥物還可經呼吸道施用，如使用乾粉吸入裝置。本發明的試劑可任選聯合在本發明所針對的紊亂的治療中至少部分有效的其它製劑施用。出於例示的目的提供下面的實施例，而不應當解釋為對本發明的限制。將貫穿此說明書引用的任何專利、專利申請、專利出版物(國家的和國際的)(具體包括序列表)和參考文獻的內容完整引入本文作為參考。例示貫穿實施例，使用了下列材料和方法，除非另有說明。材料和方法一般而言，本發明的實踐採用分子生物學、重組DNA技術、及腫瘤學、神經學和免疫學的常規技術，尤其是如抗體技術，除非另有說明。參見如Sambrook、Fritsch和Maniatis，《MolecularCloning》，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989；AntibodyEngineeringProtocols，《MethodsinMolecularBiology》，510，Paul，S.，HumanaPress，1996；AntibodyEngineeringAPracticalApproach，《PracticalApproachSeries》，169，McCafferty編，IrlPress，1996；《AntibodiesALaboratoryManual》，Harlow等，C.S.H.L.Press，1999；及《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，Ausubel等編，JohnSons，1992。將可選剪接載體導入真核細胞為了在真核細胞中表達多肽，通常使用0.4cm電擊杯(BioRad，Hercules，CA)在0.8mlHEBS(20mMHepespH7.05、137mMNaCl、5mMKCl、0.7mMNa2HPO4、6mM右旋糖)中以0.28kV和950μF通過電穿孔將本發明的載體導入CHO細胞。每次電擊使用約5×106個細胞。電擊後，容許細胞在電擊杯中於室溫保溫5-10分鐘，然後轉移到裝有10ml無血清CHO培養基的離心管中，並以1,000rpm離心5分鐘。然後將細胞沉澱物重懸於10ml無血清CHO培養基，接種T75燒瓶，並在加溼溫箱中於36℃和5％CO2保溫。轉染後3-5天，收穫條件培養基並通過ELISA測定抗體滴度。轉染進行雙份。多肽多聚體表達分析表達分析通常使用DHFR選擇來進行。轉染後將穩定轉染細胞在不含核苷的無血清CHO培養基中培養約2周。未用DNA轉染的細胞(陰性對照)死亡，而含有選擇標記的細胞生長。為了評估細胞的特定多肽多聚體生產力，更換培養基，以2×105至3×105個存活細胞/ml接種細胞，並容許細胞生長2-3天，然後測定抗體滴度和細胞密度。所有滴度使用FRET測定法或者對抗體可變區特異的ELISA和/或對抗體Fc區特異的ELISA來測定。簡而言之，以10μg/mlAffiniPure山羊抗人IgGFcγ片段(產品目錄編號109-005-098，JacksonImmunoresearch，WestGrove，PA)或特定抗原的PBS溶液，以50μl/孔包被平板並於4℃保溫過夜。使用前，除去包被液，並用PBS、0.05％Tween-20清洗3次，然後用200μl/孔PBS、0.05％Tween-20、1％BSA(PBST/BSA)封閉至少1小時。除去封閉液，並針對標準曲線分析樣品。通常在PBST/BSA中稀釋標準品和未知樣品，於室溫保溫2小時，然後如上所述清洗。使用等分50μl/孔偶聯有過氧化物酶的AffiniPure驢抗人IgG(H+L)(JacksonImmunosearch，產品目錄編號709-035-149)來檢測抗體的存在。將偶聯物在PBST/BSA中1∶10,000稀釋，並於室溫保溫1.5小時，然後除去，並如上所述清洗。然後加入等分100μl/孔底物(溶於0.1M乙酸鈉緩衝液pH4.9的420mM四甲基聯苯胺和0.05％過氧化氫)來解析結合的抗原，即與底物一起保溫2分鐘，隨後用100μl/孔停止緩衝液2N硫酸固定。使用Softmax軟體(MolecualrDevices，Sunnyvale，CA)在MolecularDevicesSpectraMaxPlus讀板儀上於450nm讀取所得吸光度。對於FRET測定法，將50μl條件培養基樣品與75μl在含1％BSA的PBS(Dulbecco氏磷酸鹽緩衝鹽水溶液，產品目錄編號9280，IrvineScientific，SantaAna，CA；BSA，Sigma，產品目錄編號CA-7906)中稀釋的1.67μg/mlLanceTMEu-IDEC-152(用銪標記的IgG1單克隆抗體)(PerkinElmer，Boston，MA)混勻。加入經標記抗體後，加入75μl在含1％BSA的PBS中稀釋的含有6.67μg/mlPhycolink山羊抗人IgG(Fc特異的)-XLAllophycocyanin(APC)偶聯物(產品目錄編號PJ253，ProzymeSanLeandro，CA)的測定混合液。將樣品加混合液在帶蓋的全孔未處理96孔黑板(FullwellNon-Treat96WellBlackPlate)(產品目錄編號237105，NalgeNuncInternational，Rochester，NY)中保溫，並使用TiterPlateShaker(滴定板搖床，產品目錄編號4625，VWR#57019-600，Bamstead/Lab-Line，MelrosePark，IL)搖動超過15分鐘。使用1420MultilabelCounter(多標記物計數器，Wallac，Gaithersburg，MD)以時間解析螢光模式讀板，激發337nm和發射665nm。使用Softmax軟體(MolecularDevices)分析數據。實施例實施例1用於改造使用可選剪接來表達多種多肽的載體的方法下面的實施例描述了用於構建適用於通過可選剪接在真核細胞中表達兩種或多種基因產物的載體的方法。本文描述的表達載體是美國申請號10/237,067中描述的表達載體pV80的衍生物，其含有帶天然CMV剪接供體和剪接受體的天然CMV內含子。簡而言之，構建了如下DNA構建物，它(以5』至3』或順流方向)包含細胞巨化病毒立即早期1(CMVIE1)啟動子，包括CMVIE1內含子(人細胞巨化病毒株AD169)前面的5』非翻譯區及CMVIE1內含子的5』部分，包括天然剪接供體序列(SD)。CMVIE1內含子的經修飾3』部分包含用於方便更換可選剪接受體(SA1)的克隆多接頭(SwaI-BstBI)。另外，緊挨著SA1的下遊添加了第一編碼序列的克隆位點(AscI)，其中克隆了人源化輕鏈基因，以及變體人生長激素(hGH)聚腺苷酸化區。再往下，向載體中引入了CMVIE1內含子的3』部分，包括天然剪接受體(SA2)序列。緊挨著SA2的下遊添加了第二編碼序列的克隆位點(BamHI)，其中克隆了人源化IgG1重鏈基因，以及變體人生長激素(hGH)聚腺苷酸化區。在載體中分開的位置引入了二氫葉酸還原酶(DHFR)選擇標記。該選擇標記衍生自pSI(Genbank編號#U47121，Promega，Madison，WI)，且在轉錄方面受到SV40啟動子/增強子、人工內含子(與可選剪接載體分開的)和SV40晚期聚腺苷酸化序列的控制。為了在原核細胞中克隆和擴增可選剪接載體，添加了衍生自pUC19、包含β-內醯胺酶基因的序列。圖3顯示了由上述改造步驟得到的載體(即pHL005)(還可見SEQIDNO29，它提供了AscI和BamHI位點中沒有插入外顯子編碼序列的載體主鏈序列)。在此實施例中，人源化抗體輕鏈和重鏈序列已經分別克隆到AscI和BamHI位點中。此載體還容許在緊挨著第一編碼序列上遊的限制性位點(SwaI-BstBI)處插入各種剪接受體，從而任選改變輕鏈和重鍊表達的比例。還構建了其它表達載體，其中刪除了緊挨著剪接受體5』端的內含子部分以生成pHLP005的載體主鏈。pHLP005的內含子序列包含PflMI位點和BspEI位點，分別在SwaI位點5』端的約310bp和110bp處。為了生成這些刪除，通過PflMI或BspEI任一的部分消化將pHLP005質粒線性化，然後用BspEI完全消化，並凝膠純化。為了生成具有不同第一剪接受體(SA1)的表達載體，將具有PflMI和BspEI或BspEI和BspEI相容位點的寡核苷酸(SEQIDNOs1-28)連接到各自pHLP005經消化載體中並給予新的載體名稱(圖4)。然後通過DNA序列分析驗證所有構建物。所得載體以5』至3』或順流方向包含天然CMV剪接供體(SD)、選自SEQIDNOs1-28的第一剪接受體(SA1)、用於插入第一多肽的第一限制性位點(AscI)、作為第二剪接受體(SA2)的天然CMV剪接受體、和用於引入第二多肽的第二限制性位點(BamHI)。使用基於引物的聚合酶鏈式反應(PCR)製備抗體輕鏈和重鏈序列，並使用標準遺傳工程技術將所得產物引入載體。所用引物包含用於插入AscI和BamHI位點的與編碼區鄰接的限制性位點。例如，5』引物可以是用於輕鏈的TTTTGGCGCGCCATGN(20)(SEQIDNO32)和用於重鏈的TTTTGGATCCATGN(20)(SEQIDNO33)。3』引物可以是用於輕鏈的GCACGGCGCGCCCTAN(20)(SEQIDNO34)和用於重鏈的GCAGGGATCCTCAN(20)(SEQIDNO35)。對於這些引物，N(20)代表對編碼期望重鏈或輕鏈的DNA特異的核苷酸序列。實施例2用於測定可選剪接效率的方法在此實施例中，描述了用於測定使用可選剪接來表達由與不同剪接受體鄰接的外顯子編碼的兩種不同基因產物的效率的方法和構建物。雖然剪接是由外顯子/內含子接合處的共有序列介導的，但是不能僅憑這些序列來決定剪接效率的精確預報。為此，必需用經驗方法來鑑定將會生成適當比例的產物的剪接受體序列，這在本文中可作為所生成多聚體蛋白質的總量來測量。因此，本發明提供了用於在任何指定細胞系中高效篩選期望剪接位點組合的便利載體。為了生成具有可選剪接位點的各種表達載體，製備了具有平端和BstBI相容末端的寡核苷酸，用於插入pHLP005載體的SwaI和BstBI位點。通過DNA序列分析驗證所有構建物。圖4和序列表(即SEQIDNOs1-28)提供了所測試剪接位點的序列。使用通過電穿孔實現的瞬時或穩定轉染比較所生成的具有各種剪接受體的載體。用於轉染的宿主細胞是二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷型中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系DG44(Urlaub等，Cell33405-412，1983)。所有DNA使用Megaprep試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)製備。轉染前，DNA用乙醇(EtOH)沉澱，用70％EtOH清洗，乾燥，重懸於HEBS，並在轉染前定量。陰性對照不含DNA轉染且用作轉染對照。mAb特異ELISA和IgG特異ELISA二者都測量分泌到細胞培養物培養基中的總抗體。表1提供了瞬時轉染細胞的總抗體表達水平。結果證明，某些剪接位點，如pHLP0015和pHLP0018，在測試中在CHO細胞中瞬時生成高水平總抗體方面比其它剪接位點更有效。表1來自瞬時轉染的抗體滴度實施例3可選剪接基因產物在真核細胞中的表達在此實施例中描述了可選剪接基因產物，特別是裝配好的IgG抗體的表達。簡而言之，通過電穿孔用本發明的可選剪接載體轉染CHO細胞，並如上所述容許在選擇性培養基中恢復約2周以生成穩定轉染細胞。3-5天後，收穫條件培養基並通過ELISA測定抗體滴度。在第一個實驗中，將50μg編碼抗體輕鏈和重鏈的分開載體的DNA、50μg編碼抗體輕鏈和重鏈二者的可選剪接載體、或根本沒有DNA導入真核細胞(CHO)，並作為抗體結合活性的函數來測定由細胞生成的功能性多肽多聚體的數量(表2)。表2穩定集合的單位生產率(SpecificProductivityofStablePools)第一個實驗的結果證明了有可能由可選剪接載體生成功能性多肽多聚體，如單克隆抗體產物的原理。在其它實驗中，將25μg編碼抗體輕鏈和重鏈的分開載體的DNA、50μg編碼抗體輕鏈和重鏈二者的可選剪接載體、或根本沒有DNA導入真核細胞(CHO)，並作為抗體結合活性的函數來測定由細胞生成的功能性多肽多聚體的數量(表3-6)。這些實驗的結果證明有可能由可選剪接載體生成功能性多肽多聚體，如單克隆抗體產物。數據說明pHLP015是比其它所測試載體更好的可選剪接載體，因為它具有生成高水平功能性抗體的能力。表3來自瞬時轉染的抗體滴度表4穩定集合的單位生產率表5來自瞬時轉染的抗體滴度表6穩定集合的單位生產率因此，得出結論，可在真核細胞中使用可選剪接載體以瞬時和穩定兩種方式生成功能性多肽多聚體，如抗體。因此，證明了經由可選剪接表達超過一種多肽的單一載體系統的容易和效用。實施例4載體可生成具有優良表達潛力的細胞系的證明本發明的載體設計用於優化抗體表達的輕鏈和重鏈比例。免疫球蛋白重鏈不會分泌，除非與輕鏈一起裝配，而多數輕鏈可作為游離分子分泌。如此，過量的游離輕鏈將指示需要進一步優化載體以提高重鏈對輕鏈的產量比例。為了評估游離輕鏈的產量，生成了含有一種本發明載體的細胞系，並評估了它們的條件培養基，其中含有分泌的重組游離輕鏈和/或裝配好的抗體多聚體產物(表7)。載體構建如實施例1和2中所述製備基於pHLP015的載體。如上所述將此載體導入CHO細胞並選擇穩定轉染。如上所述衍生擴增的細胞系，將單位生產率的工業標準的目標設定為根據FRET分析測量的每天每個細胞生成超過10皮克蛋白質。下文提供的結果證明了此表達載體在構建抗體生產可接受的細胞系中的有效性。RT-PCR結果驗證了預測的剪接位點為了驗證輕鏈和重鏈mRNA的剪接接合處符合構建表達載體設計預測的接合處，對細胞RNA進行逆轉錄並隨後對cDNA進行聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。自使用質粒pHLP015進行的轉染之一分離穩定轉染細胞系並製備總RNA(RNAwiz，Ambion，Austin，TX)。使用與重鏈mRNA近似中心互補的引物，使用逆轉錄酶(SuperscriptII逆轉錄酶，Invitrogen，Carlsbad，CA)生成cDNA。然後將cDNA作為模板用於PCR(VentDNA聚合酶，NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)，其中使用CMV5』非翻譯區(剪接供體的5』端)中的引物和編碼區(重鏈編碼序列中剪接受體的3』端)中的引物。將此PCR產物測序，並驗證CMV內含子中的剪接供體和緊挨著重鏈編碼序列5』端的剪接受體之間的預測剪接產物。使用寡(dT)15作為引物，使用逆轉錄酶(逆轉錄系統，Promega，Madison，WI)由細胞RNA生成cDNA。然後將此cDNA作為模板用於PCR(VentDNA聚合酶，NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)，其中使用CMV5』非翻譯區(剪接供體的5』端)中的引物和編碼區(輕鏈編碼序列中剪接受體的3』端)中的引物。將此PCR產物測序，並驗證CMV內含子中的剪接供體和緊挨著輕鏈編碼序列5』端的剪接受體之間的預測剪接產物，指示表達載體如預期一樣通過可選剪接發揮功能。條件培養基的SDS-PAGE分析由使用來自實施例1-3的質粒pHLP015(表7中的mAb#1-1)進行的轉染分離穩定轉染細胞系。另外，使用另一種基於pHLP015的載體(在此實施例中生成，表7中的mAb#2-1至5)生成許多穩定轉染細胞系。為了純化完整mAb和游離輕鏈二者，將約50ml條件培養基加樣到1.3ml蛋白質L-瓊脂糖(產品目錄編號P3351，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)柱上，用15ml3xPBS清洗柱子，然後是5ml1xPBS清洗，再用100mMNaH2PO4pH2.8洗脫，其中等分收集量0.3ml，並立即用75μl1MHepespH8中和。通過280nm的UV吸收定位蛋白質峰，並使用消光係數1.5A280/mg/ml測定蛋白質濃度。將適當體積的峰樣品在樣品緩衝液中稀釋至15μl中加載1.5μg蛋白質。將基於Laemmli的樣品緩衝液(0.25MTris-HClpH6.8、8％SDS、40％甘油、和0.01％溴酚藍)的4x儲液與新鮮的100mMNEM一起配製以用於非還原性凝膠。將樣品於100℃加熱5分鐘，並將15μl施加到PAGErGoldPrecast4-20％tris-甘氨酸凝膠(產品目錄編號59517，Cambrex，EastRutherford，NJ)上。將凝膠在Laemmli緩衝液中以45mA運行40分鐘。運行後，將凝膠用約100ml考馬斯藍Cleveland染料(50％甲醇、10％乙酸、0.1％考馬斯藍)染色，即微波1分鐘和搖動10分鐘。然後將凝膠在約100ml10％甲醇、10％乙酸中脫色，即微波2分鐘和搖動過夜並吸收泡沫(withabsorbentfoam)。在BioradGS-800CalibratedDensitometer(校準密度計)上掃描凝膠，並用BioradQuantityOne軟體對完整抗體和游離輕鏈條帶定量。表7顯示了表述為總分泌蛋白質(完整抗體+游離輕鏈)百分數的游離輕鏈數量。表7來自基於pHLP015細胞系的條件培養基中完整抗體和游離輕鏈相對數量的評估如圖7所示，沒有檢測到高水平的游離輕鏈，說明該載體很好地平衡了輕鏈相對於重鏈的表達。實施例5生成多聚體蛋白質的載體本發明的載體和表達盒或構建物可用於表達任何多聚體蛋白質，包括但不限於上文詳述中描述的多聚體蛋白質。許多此類蛋白質是本領域眾所周知的，且適用於本發明的載體和表達盒或構建物。待表達的多肽數目可以不同。例如，如上所述可表達兩種多肽。額外的多肽可通過在載體中插入更多編碼多肽的外顯子來表達，優選插入第一外顯子和第二剪接受體之間。每個額外外顯子將在該外顯子的5』端具有剪接受體，從而通過單一剪接供體和各個剪接受體之間發生的剪接來調控轉錄。如此，超過一種多肽可使用同一剪接供體和不同剪接受體來表達，其中以一定比例表達各種多肽以優化一種或多種期望蛋白質的表達。如上述實施例所述製備包含剪接受體的載體或表達盒或構建物，所述剪接受體容許以優化多聚體蛋白質表達的比例進行剪接及後續多肽鏈的翻譯。首先，使用標準技術克隆或擴增編碼多肽鏈的基因，諸如使用對鏈特異的引物的RT-PCR和含有表達期望多肽的基因的適當文庫。然後將所述基因插入能夠以適當比例表達多肽的本發明載體或表達盒或構建物，所述比例足以表達高水平的多聚體蛋白質。此載體或表達盒或構建物可具有便利的限制性位點以便於插入剪接位點、外顯子和其它期望元件。例如，可使用pHLP0015。或者，如實施例2和3中所述，將編碼多肽的基因插入超過一種載體或表達盒或構建物，每個具有不同的第一剪接受體，以篩選容許適當表達水平的剪接受體。最後，將編碼多肽的一種或多種載體或表達盒或構建物導入適當細胞系，如哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞，並表達。然後可由細胞培養物培養基(如果分泌的話)或者由裂解細胞(如果蛋白質是細胞內蛋白或膜結合蛋白)收集多聚體蛋白質。將本文引用的所有參考文獻完整引入本文作為參考。等同方案對於本領域普通技術人員，使用常規實驗時，可找到與本文描述的本發明具體實施方案等同的許多方案。所附權利要求涵蓋此類等同方案。序列表110比奧根艾迪克MA公司120使用可選剪接在真核細胞中表達多肽多聚體的方法和構建物1302159.0310001150US60/553,4781512004-03-1516035170PatentInversion3.3210121122212DNA213人工序列220223剪接位點盒4001aaatctgcagtcttcgaacagg22210221122212DNA213人工序列220223剪接位點盒4002tttagacgtcagaagcttgtcc22210321121212DNA213人工序列220223剪接位點盒4003aattctgcagtcaccgtcctt21210421123212DNA213人工序列220223剪接位點盒4004ttaagacgtgagtggcaggaagc23210521121212DNA213人工序列220223剪接位點盒4005aattctgcactcaccgtcctt21210621123212DNA213人工序列220223剪接位點盒4006ttaagacgtgagtggcaggaagc23210721121212DNA213人工序列220223剪接位點盒4007aattgtgcagtcaccgtcctt21210821123212DNA213人工序列220223剪接位點盒4008ttaacacgtcagtggcaggaagc23210921121212DNA213人工序列220223剪接位點盒4009aattctgcaatcaccgtcct212101021123212DNA213人工序列220223剪接位點盒40010ttaagacgttagtggcaggaagc232101121121212DNA213人工序列220223剪接位點盒40011aagctagcagtcaccgtcctt212101221123212DNA213人工序列220223剪接位點盒40012ttcgatcgtcagtggcaggaagc232101321121212DNA213人工序列220223剪接位點盒40013aattctgcggtcaccgtcctt212101421123212DNA213人工序列220223剪接位點盒40014ttaagacgccagtggcaggaagc232101521121212DNA213人工序列220223剪接位點盒40015aagaggcctctcaccgtcctt212101621123212DNA213人工序列220223剪接位點盒40016ttctccggagagtggcaggaagc232101721121212DNA213人工序列220223剪接位點盒40017aagggggcagtcaccgtcctt212101821123212DNA213人工序列220223剪接位點盒40018ttcccccgtcagtggcaggaagc232101921121212DNA213人工序列220223剪接位點盒40019aagctagcagtcgaccacctt212102021123212DNA213人工序列220223剪接位點盒40020ttcgatcgtcagctggtggaagc232102121124212DNA213人工序列220223剪接位點盒40021ccggagggggcagtcaccgtcctt242102221122212DNA213人工序列220223剪接位點盒40022tcccccgtcagtggcaggaagc222102321123212DNA213人工序列220223剪接位點盒40023atgggggggcagtcaccgtcctt232102421128212DNA213人工序列220223剪接位點盒40024ttgtacccccccgtcagtggcaggaagc282102521124212DNA213人工序列220223剪接位點盒40025ccggattctgcagtcaccgtcctt242102621122212DNA213人工序列220223剪接位點盒40026taagacgtcagtggcaggaagc222102721123212DNA213人工序列220223剪接位點盒40027atggttctgcagtcaccgtcctt232102821128212DNA213人工序列220223剪接位點盒40028ttgtaccaagacgtcagtggcaggaagc28210292116801212DNA213人工序列220223人工載體40029agcttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttca60tagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgacc120gcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaat180agggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagt240acatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcc300cgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatcta360cgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtgg420atagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagttt480gttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgac540gcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaa600ccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccggga660ccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagag720tgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcttatgcatgcta780tactgtttttggcttggggtctatacacccccgcttcctcatgttataggtgatggtata840gcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactcccctattggtgacgata900ctttccattactaatccataacatggctctttgccacaactctctttattggctatatgc960caatacactgtccttcagagactgacacggactctgtatttttacaggatggggtctcat1020ttattatttacaaattcacatatacaacaccaccgtccccagtgcccgcagtttttatta1080aacataacgtgggatctccacgcgaatctcgggtacgtgttccggaacggtggagggcag1140tgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagac1200taacagactgttcctttccatgggtatttaaatctgcagtcttcgaacaggcgcgccgtg1260cgatccctgcccgggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggtcgtggaa1320ggtgctactccagtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgttt1380gactaggtgtccttgtataatattatggggtggaggcgggtggtatggagcaaggggcag1440gttgggaagacaacctgtagggccttcagggtctattgggaaccaggctggagtgcagtg1500gcacgatcttggctcgctgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcag1560tctcccgaatagttgggattccaggcatgcacgaccaggctcagctaatttttgtatttt1620tggtagagacggggtttcaccatattggccagtctggtctccatctcctgacctcaggta1680atccgcccgcctcggcctcccaaattgctgggattacaggtatgagccactgggcccttc1740cctgtcctgtgattttaaaataattataccagcagaaggacgtccagacacagcatgggc1800tacctggccatgcccagccagttggacatttgagttgtttgcttggcactgtcctctcat1860gaattcgatatccggaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgc1920gcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtctttt1980ctgcagtcaccgtccttgacacgggatccctgcccgggtggcatccctgtgacccctccc2040cagtgcctctcctggtcgtggaaggtgctactccagtgcccaccagccttgtcctaataa2100aattaagttgcatcattttgtttgactaggtgtccttgtataatattatggggtggaggc2160gggtggtatggagcaaggggcaggttgggaagacaacctgtagggccttcagggtctatt2220gggaaccaggctggagtgcagtggcacgatcttggctcgctgcaatctccgcctcctggg2280ttcaagcgattctcctgcctcagtctcccgaatagttgggattccaggcatgcacgacca2340ggctcagctaatttttgtatttttggtagagacggggtttcaccatattggccagtctgg2400tctccatctcctgacctcaggtaatccgcccgcctcggcctcccaaattgctgggattac2460aggtatgagccactgggcccttccctgtcctgtgattttaaaataattataccagcagaa2520ggacgtccagacacagcatgggctacctggccatgcccagccagttggacatttgagttg2580tttgcttggcactgtcctctcatgaattcgtcgacagatctgcgcagcaccatggcctga2640aataacctctgaaagaggaacttggttaggtaccttctgaggcggaaagaaccagctgtg2700gaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgca2760aagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcagg2820cagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactcc2880gcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaat2940tttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtg3000aggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttgattcttctgacacaacagt3060ctcgaacttaagctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttac3120aagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcg3180tttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgt3240ccactcccagttcaattacagctcttaaggctagagtacttaatacgactcactataggc3300tagcatggttcgaccattgaactgcatcgtcgccgtgtcccaaaatatggggattggcaa3360gaacggagacctaccctggcctccgctcaggaacgagttcaagtacttccaaagaatgac3420cacaacctcttcagtggaaggtaaacagaatctggtgattatgggtaggaaaacctggtt3480ctccattcctgagaagaatcgacctttaaaggacagaattaatatagttctcagtagaga3540actcaaagaaccaccacgaggagctcattttcttgccaaaagtttggatgatgccttaag3600acttattgaacaaccggaattggcaagtaaagtagacatggtttggatagtcggaggcag3660ttctgtttaccaggaagccatgaatcaaccaggccacctcagactctttgtgacaaggat3720catgcaggaatttgaaagtgacacgtttttcccagaaattgatttggggaaatataaact3780tctcccagaatacccaggcgtcctctctgaggtccaggaggaaaaaggcatcaagtataa3840gtttgaagtctacgagaagaaagactaactcgagaattcacgcgtggtacctctagagtc3900gacccgggcggccgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaacca3960caactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttat4020ttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgt4080ttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtg4140gtaaaatcgataaggatctgtcgacgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgact4200gggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagct4260ggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatg4320gcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgca4380tatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacc4440cgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagac4500aagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaac4560gcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataa4620tggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtt4680tatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgc4740ttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattc4800ccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaa4860aagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcg4920gtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaag4980ttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgcc5040gcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatctta5100cggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactg5160cggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcaca5220acatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccatac5280caaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactat5340taactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcgg5400ataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgata5460aatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggta5520agccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaa5580atagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaag5640tttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctagg5700tgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccact5760gagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg5820taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatc5880aagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaata5940ctgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgccta6000catacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtc6060ttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacgg6120ggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctac6180agcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccgg6240taagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggt6300atctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgct6360cgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctgg6420ccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggata6480accgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgca6540gcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgc6600gttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtg6660agcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacacttta6720tgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaaca6780gctatgaccatgattacgcca6801210302119212RNA213人工序列220223剪接位點盒220221misc_feature222(1)..(1)223m是′a′或′c′220221misc_feature222(6)..(6)223r是′g′或′a′40030magguragu92103121115212RNA213人工序列220223剪接位點盒220221misc_feature222(1)..(10)223y是′c′或′t′220221misc_feature222(11)..(11)223n是任何核苷酸40031yyyyyyyyyyncagg152103221120212DNA213人工序列2202235′輕鏈引物220221misc_feature222(16)..(20)223n是任何核苷酸40032ttttggcgcgccatgnnnnn202103321120212DNA213人工序列2202235′重鏈引物220221misc_feature222(14)..(20)223n是任何核苷酸40033ttttggatccatgnnnnnnn202103421120212DNA213人工序列2202233′輕鏈引物220221misc_feature222(16)..(20)223n是任何核苷酸40034gcacggcgcgccctannnnn202103521120212DNA213人工序列2202233′重鏈引物220221misc_feature222(14)..(20)223n是任何核苷酸40035gcagggatcctcannnnnnn20權利要求1.一種表達載體，其包含啟動子；5』UTR；單一剪接供體；內含子；第一剪接受體；編碼第一多肽的第一外顯子；第二剪接受體；和編碼第二多肽的第二外顯子，其中，所述啟動子可操作連接所述第一和第二外顯子，在進入細胞後，所述單一剪接供體與所述第一剪接受體剪接，形成容許所述第一外顯子轉錄的剪接轉錄物，並與所述第二剪接受體剪接，形成容許所述第二外顯子轉錄的剪接轉錄物，且所述第一多肽和所述第二多肽由所述剪接轉錄物表達。2.權利要求1的載體，其中所述啟動子是CMV啟動子。3.權利要求1的載體，還包含與所述第一外顯子或第二外顯子可操作連接的聚腺苷酸化信號。4.權利要求1的載體，其中所述載體還包含一個或多個額外剪接受體和編碼額外多肽的額外外顯子，其中在進入細胞後，所述單一剪接供體與所述額外剪接受體剪接，形成容許所述額外外顯子轉錄的額外剪接轉錄物，且所述額外多肽由所述額外剪接轉錄物表達。5.權利要求1的載體，其中所述第一或第二外顯子或二者編碼選擇標記。6.權利要求1的載體，其中所述第一和第二多肽形成多聚體。7.權利要求6的載體，其中所述多聚體蛋白質是異二聚體、異三聚體或異四聚體。8.權利要求1的載體，其中所述第一多肽以相對於所述第二多肽約10∶1至約1∶10的頻率表達。9.權利要求1的載體，其中所述第一多肽以相對於所述第二多肽約3∶1至約1∶3的頻率表達。10.權利要求1的載體，其中所述第一多肽以相對於所述第二多肽約1∶1的頻率表達。11.權利要求1的載體，其中所述第一或第二剪接受體包含任何一種選自下組的序列SEQIDNO1-28。12.權利要求11的載體，其中所述剪接供體和所述第二剪接受體衍生自CMV，而所述第一剪接受體包含任何一種選自下組的序列SEQIDNO1-28。13.權利要求1的載體，其中所述載體是病毒載體。14.權利要求1的載體，包含SEQIDNO29。15.包含權利要求1的載體的真核細胞。16.權利要求15的細胞，其中所述載體整合到所述細胞的染色體DNA中。17.權利要求15的細胞，其中所述載體是附加體。18.權利要求15的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞或酵母細胞。19.權利要求18的細胞，其中所述細胞選自下組幼倉鼠腎細胞、成纖維細胞、骨髓瘤細胞、NS0細胞、PER.C6細胞或CHO細胞。20.權利要求19的細胞，其中所述細胞是CHO細胞。21.用於生產多肽的方法，所述方法包括在培養物中培養權利要求15的細胞並由所述培養物分離所述第一多肽和所述第二多肽。22.通過權利要求21的方法生產的第一多肽和第二多肽。23.包含權利要求22的第一多肽和第二多肽的組合物，還包含藥學上可接受載體。24.用權利要求23的組合物治療有所需要的患者的方法。25.一種表達載體，其包含啟動子；5』UTR；單一剪接供體；內含子；第一剪接受體；編碼第一抗體多肽或其片段的第一外顯子；第二剪接受體；和編碼第二抗體多肽或其片段的第二外顯子，其中，所述啟動子可操作連接所述第一和第二外顯子，在進入細胞後，所述單一剪接供體與所述第一剪接受體剪接，形成容許所述第一外顯子轉錄的剪接轉錄物，並與所述第二剪接受體剪接，形成容許所述第二外顯子轉錄的剪接轉錄物，且所述第一抗體多肽或其片段和所述第二抗體多肽或其片段由所述剪接轉錄物表達且締合形成抗體或抗體片段。26.權利要求25的載體，其中所述第一外顯子或所述第二外顯子或二者編碼抗體片段。27.權利要求25的載體，其中所述第一多肽是抗體重鏈或其片段，而所述第二多肽是抗體輕鏈或其片段。28.權利要求25的載體，其中所述第一多肽是抗體輕鏈或其片段，而所述第二多肽是抗體重鏈或其片段。29.權利要求27的載體，其中所述輕鏈或重鏈或二者是鼠源的、嵌合的、人源化的、人的或合成的。30.權利要求28的載體，其中所述輕鏈或重鏈或二者是鼠源的、嵌合的、人源化的、人的或合成的。31.權利要求25的載體，其中所述第一抗體多肽或其片段以相對於所述第二抗體多肽或其片段約3∶1至約1∶3的頻率表達。32.權利要求25的載體，其中所述第一抗體多肽或其片段以相對於所述第二抗體多肽或其片段約1∶1的頻率表達。33.權利要求25的載體，其中所述第一剪接受體或所述第二剪接受體包含任何一種選自下組的序列SEQIDNO1-28。34.權利要求33的載體，其中所述剪接供體和所述第二剪接受體衍生自CMV，而所述第一剪接受體包含任何一種選自下組的序列SEQIDNO1-28。35.權利要求25的載體，其中所述載體是病毒載體。36.權利要求25的載體，包含SEQIDNO29。37.包含權利要求25的載體的真核細胞。38.權利要求37的細胞，其中所述載體整合到所述細胞的染色體DNA中。39.權利要求37的細胞，其中所述載體是附加體。40.權利要求37的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞或酵母細胞。41.權利要求40的細胞，其中所述細胞選自下組幼倉鼠腎細胞、成纖維細胞、骨髓瘤細胞、NS0細胞、PER.C6細胞或CHO細胞。42.權利要求41的細胞，其中所述細胞是CHO細胞。43.用於生產抗體或抗體片段的方法，所述方法包括在培養物中培養權利要求37的細胞並由所述培養物分離所述第一多肽和所述第二多肽。44.通過權利要求43的方法生產的抗體或抗體片段。45.包含權利要求44的抗體或抗體片段的組合物，還包含藥學上可接受載體。46.用權利要求45的組合物治療有所需要的患者的方法。全文摘要本發明提供了使用單一表達載體在真核細胞中生產多種多肽，諸如抗體或抗體片段的方法。所述表達載體經過改造包含在單一啟動子控制下的兩種或多種表達盒，其中所述表達盒具有容許其可選剪接並以期望比例表達成兩種或多種獨立基因產物的剪接位點。公開了所述載體用於在真核宿主細胞中高效表達重組抗體的用途，以及此類抗體在診斷性和治療性應用中的用途。文檔編號C07H21/00GK1961071SQ200580015621公開日2007年5月9日申請日期2005年3月15日優先權日2004年3月15日發明者霍利·普倫蒂斯申請人:比奧根艾迪克Ma公司