應用基因表達鑑定產品的方法

2023-12-09 09:18:56

專利名稱：應用基因表達鑑定產品的方法
技術領域：
一般地，本發明涉及產品鑑定領域；更具體地，涉及生物技術系統在標記產品用於鑑定中的應用。
這些系統被用於藥物或新化合物的篩選中。例如，公開於1999年6月3日的國際專利申請WO92/27356涉及到通過將細胞核激素受體、肽傳感器和測試化合物混合鑑定該受體功能的調節劑的方法。該傳感器提供了與該受體的直接結合，然後進行測試試驗以確定該測試化合物是否影響該傳感蛋白與該受體的結合。此外，Evans的美國專利5,071,773涉及到激素受體相關的生物分析，該生物分析作為篩選方法用於確定蛋白質是否是激活轉錄的受體或測試藥劑是否是激活已知受體的配體。
這些受體系統已被提議用於「指紋法」或作為生物傳感器來標識產品用於鑑定。例如，已建議，將經突變與其天然配體的結合發生改變的某些G蛋白偶聯細胞表面受體、酪氨酸canasta受體以及離子通道受體和它們的各種非天然配體之間的相互作用用於產生樣品指紋。該指紋被認為使得可以對產品進行驗證和監測以便實現安全性、可靠性、假貨和質量的控制。見1999年10月14日公開的國際專利申請WO 99/51777；1997年10月2日公開的國際專利申請WO97/35985。1995年1月26日公開的國際專利申請WO95/02823涉及通過如下方式鑑定配體的方法，該方式是用編碼能夠響應配體而影響細胞擴增的受體的DNA轉染細胞，並將該細胞與作為該受體潛在激動劑或拮抗劑的測試底物一起孵育。然後採用標記這些細胞擴增的標記物評價是否發生了細胞擴增。
這些現有檢測系統的一些缺點包括需要在標記的產品中有高濃度的配體，以及能夠用於此檢測方法的配體的數量和特性受到限制。
本領域需要在產品的鑑定中應用其它能夠在低濃度下產生簡單快速信號的受體-配體相互作用。
另一方面，本發明提供類似於上述方法的另一種方法，但其中該檢測組合物還含有編碼與所述配體依賴性轉錄因子相互作用激活或阻遏所述報導基因表達的輔激活物或輔阻遏物的第三核苷酸序列。在本發明方法的再一實施方案中，將產品接觸該檢測組合物及通過和該配體依賴性轉錄因子的相互作用激活或阻遏所述報導基因表達的輔激活物或阻遏物。
另一方面，本發明提供含有與以下將作詳細描述的指定配體標記物相聯繫的液體、固體、分散體(dispersion)、乳劑或膠乳的標記產品。
再一方面，本發明提供含有上述第一核苷酸序列和上述第二核苷酸序列，以及任選的輔激活物或輔阻遏物的一種或多種細胞或穩定的細胞系用於本發明方法。
再一方面，本發明提供用於鑑定標記產品的試劑盒，其包含含有上述第一和第二核苷酸序列的檢測組合物，以及檢測和測量所述信號的方法。
再一方面，本發明提供用於這些用途的檢測組合物。
本發明的其它方面和優點將在以下本發明優選實施方案的詳細描述中作進一步闡述。
發明詳述本發明提供應用參與配體-受體相互作用的天然或合成的配體依賴性轉錄因子從而使得可以快速有效地鑑定產品的方法和組合物。本發明的這些方法和組合物可以在低濃度時產生簡單而快速的信號，因此是安全的，並適用於多種產品和工業。
本發明提供鑑定產品的新方法。根據該方法，首先使產品與配體標記物相聯。作為鑑定該產品來源和/或驗證該產品的真實性的一種手段，在其後的時間點檢測在該產品或該產品的提取物或部分之中或之上是否存在配體標記物和/或存在的量。配體標記物的檢測通過採用「體內」步驟，即通過產品與如下檢測組合物的接觸來進行，其中該檢測組合物含有編碼一或多個天然或合成的配體依賴性轉錄因子並任選地處於第一啟動子的調節控制之下的一或多個第一核苷酸序列。這些轉錄因子含有三種功能區配體結合域、DNA結合域和反式激活域。該檢測組合物的另一部分是編碼處於受體效應元件或修飾或合成的效應元件，以及第二啟動子的調節控制之下的報導基因的第二核苷酸序列。所述配體標記物和至少一個配體結合域的相互作用是高度特異的，並且誘導該報導基因表達的改變。由此該報導基因表達的改變產生可檢測信號，從而可以鑑定產品中配體的存在。更具體地，該配體標記物與該檢測組合物中的配體結合域的結合觸發所述DNA結合域與所述效應元件的結合。當該效應元件發生結合之後，它將激活或抑制該報導基因的表達。任選地，在該方法或該檢測組合物中加入輔激活物或輔阻遏物蛋白或其編碼核苷酸序列。
與上述參考文獻的方法相比，本發明方法的一個優點是人工小分子配體標記物的高度特異性，當存在於消費品中時它們是無害的。此外，配體結合域與配體之間的特異性使得幹擾該方法的可能性極低。而且這些配體標記物易於合成和製備。此外，與其它標記系統不同，本發明能夠採用多種標記物。而且，該方法靈敏度高，能檢測到產品中極低濃度的配體標記物，例如十億分之幾(ppb)到萬億分之幾(ppt)的水平。實際上，在該方法中配體標記物的濃度能夠低至常規化學色譜或質譜分析方法所不能檢測到的濃度。最後，與這些已知方法不同，在此標記物檢測的生物學方法中細胞的增殖不依賴配體標記物的存在。
為了完整地理解本發明，所用下列成分的定義如下A.產品在本發明方法和組合物中，加入一或多種配體標記物的「產品」可以是期望對其進行可鑑定的標記以便確定其來源的任何類型產品。例如，為了控制產品的未許可的複製或違法複製或其它安全目的，或者為了能夠識別摻假產品以保證消費者的安全，該「標記」可能是必需的。該產品可以是任何物理形式。例如，該產品可以是流體或液體、固體、或它們之間的某種中間物例如分散體、乳劑、膠乳、或半固體基質。
典型的固體產品的實例可以包括但不限於，藥物片劑、膠囊和粉劑；農用化學品的固體製劑例如殺昆蟲劑、除草劑、殺真菌劑、消毒劑、其它農用化學品，和種子；爆炸物；紡織品如衣服；錄製材料如唱片、磁帶、軟盤和光碟；電器如電視機、計算機和收音機；汽車元件和照相機；紙例如文件、密件、票據、有價證券、標籤和包裝物；化學製品如墨水、殺生物劑和橡膠；化妝品如面霜；食品；和建築材料如瀝青添加劑、屋頂木瓦、和混凝土塊，以及包裝材料。
流體或液體產品的實例包括但不限於，以油為基礎的產品例如潤滑油、液壓油、潤滑脂、汽油、煤油、原油、柴油、和液化石油產品、汽油酒精混合燃料、生物柴油(biodiesel fuel)、馬達油、潤滑液；油漆、油漆添加劑、塑料添加劑、粘合劑、塗料、陶瓷製品；包括聚合物在內的油田化工產品；香水和其它化妝品；飲料如瓶裝水、牛奶、酒、威士忌酒、雪利酒、杜松子酒和伏特加酒及其它酒精和非酒精飲料；液體藥物製劑例如糖漿、乳劑和懸液；水處理用化學製品，例如聚合物、防垢劑、和鏊合劑；液體農用化學製劑，例如殺蟲劑、殺昆蟲劑和除草劑；以及工業溶劑。所述產品優選是液體。
本領域技術人員可以根據本發明而且無需任何多餘的實驗容易地選擇待引入配體標記物的產品。應當理解，以下詳細描述的配體標記物可以以廣泛多種方式和產品相聯。因此，配體標記物可以存在於產品的全部或部分之中或之上，或存在於與該產品相關的標籤、包裝材料或容器的全部或部分之中或之上。
優選地，例如當產品是液體或半固體或甚至是粉末時，將配體標記物直接地與產品混合。當產品是固體時，配體標記物可以獨立於產品存在，例如配體標記物可以存在於產品的包裝材料、標記或標籤中。或者，當產品是固體時，可以將配體標記物施用於產品的表面並乾燥。將配體標記物施用於固體產品的方法可以包括但不限於，滾筒傳送(rollertransfer)或油漆塗布、噴塗、刷塗和浸塗。必需採用該施用方法，以便產品表面在指定溫度，例如室溫或高於室溫下乾燥。對這些類型的塗布方法的一般描述可以參見常規教科書，例如現代塗布和乾燥技術(ModernCoating and Drying Techniques)，(E.Cohen和E.Gutoff編；VCH出版社)紐約(1992)，以及網絡加工和轉換技術和設備(Web Processingand Converting Technology and Equipment)，(D.Satas編；VanNostrand Reinhold)紐約(1984)。
在一個實施方案中，配體標記物以萬億分之一(ppt)至約十億分之500(w/w)配記標記物的濃度存在於產品中。在另一個實施方案中，配體標記物以0.1ppb至約100ppb配記標記物的濃度存在於產品中。在再一個實施方案中，配體標記物以0.1至10ppb配記標記物的濃度存在於產品中。
根據本發明的方法，可以通過檢查整個產品、部分產品(例如少量產品)或產品提取物(例如當產品是固體時)，鑑定產品之中或之上配體標記物的存在。
對於產品和產品形式的選擇、在選定的產品中或上摻入配體標記物的方法、以及與產品相聯的配體標記物的量，本發明均沒有進行限制，但它們是本領域技術人員鑑於本文所提供的講授可以容易地進行選擇的變量。
B.配體標記物本發明中有用的配體標記物包括與天然或合成的配體依賴性轉錄因子的配體結合域特異結合的分子。配體標記物能夠特異地與至少一個選定的配體結合域相互作用。優選地，配體標記物是表現出優選與下面詳述的配體結合域特異結合的合成化合物或組合物。正常情況下產品中並不存在配體標記物；例如，它不是生產過程的副產品、正常雜質、或用於產品的標準添加劑。用於本發明的配體標記物的另一優點是，在一定意義上該配體標記物是惰性的，即該配體標記物不和它所標記的產品發生反應。
用於本發明的優選配體標記物包括已知的化合物、或本領域技術人員易於合成的化合物，如美國專利4,954,655；4,985,461；5,117,057；5,530,028；5,378,726；和6,013,836中所公開的。為了定義在本發明中用作配體標記物的某些化合物，將這些專利以參考文獻形式併入本文。因此，該配體標記物可以包括但不限於，松甾酮、松甾酮A、muristeroneA、烷基替醯肼、N，N』-二醯基醯肼、N-取代-N，N』-二醯基醯肼、N-取代-N，N』-雙取代醯肼、二苯甲基醯烷基氰基醯肼、N-烷基-N，N』-二芳醯基醯肼、N-醯基-N-烷基-N』-芳醯基醯肼、3，5-二叔丁基-γ-羥基-N-異丁基苯甲醯胺、8-O-乙醯基哈帕苷。在該配體結合域來源於例如蛻皮激素細胞核受體的實施方案中，可以採用各種烷基替醯肼、N-取代-N，N』-二醯基醯肼、和N-取代-N，N』-雙取代醯肼作為配體標記物[見例如美國專利4,954,655；4,985,461；5,530,028；和6,013,836]。用於以下實施例的一個尤其優選的配體標記物是N』-叔丁基-N』-(3，5-二甲基苯甲醯基)-3-甲氧基-2-甲基苯並醯肼，非正式地稱為methoxyfenoxide。
其它適合用作配體標記物的化合物公開於未決的美國專利申請09/315，451中，該專利也以參考文獻形式併入本文。下式定義了一個這樣的配體標記物 其中E是含有叔碳的(C4-C6)烷基，或含有叔碳的氰基(C3-C5)烷基。
R1是H、Me、Et、異丙基(i-Pr)、F、甲醯基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CH2OMe、CH2CN、CN、C≡CH、1-propynyl、2-propynyl、乙烯基、OH、OMe、OEt、環丙基、CF2CF3、CH≡CHCN、烯丙基、疊氮基、SCN或SCHF2；R2是H、Me、Et、正丙基、異丙基、甲醯基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CH2OMe、CH2CN、CN、C≡CH、1-propynyl、2-propynyl、乙烯基、Ac、F、Cl、OH、OMe、OEt、正丙氧基、OAc、NMe2、NEt2、SMe、SEt、SOCF3、OCF2CF2H、COEt、環丙基、CF2CF3、CH≡CHCN、烯丙基、疊氮基、OCF3、OCHF2、異丙氧基、SCN、SCHF2、SOMe、NH-CN，或與R3及R2和R3所連的苯基碳一起形成亞乙二氧基環、氧鄰近苯基碳的二氫呋喃環、或氧鄰近苯基碳的二氫吡喃環；R3是H、Et、或與R2及R2和R3所連的苯基碳一起形成亞乙二氧基環、氧鄰近苯基碳的二氫呋喃環、或氧鄰近苯基碳的二氫吡喃環；R4、R5和R6獨立地是H、Me、Et、F、Cl、Br、甲醯基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CN、C≡CH、1-propynyl、2-propynyl、乙烯基、OMe、OEt、SMe或SEt；前提是a)當R1是Me且R2是OMe時；則R3是H；並且R4、R5和R6聯合起來是3，5-二甲基、3，5-二甲氧基-4-Me、3，5-二氯或2，5-二氟；b)當R1是Me且R2是OEt時；則R3是H；並且R4、R5和R6聯合起來是3，5-二甲基、3，5-二甲氧基-4-Me、3，5-二氯、3，5-二氟、2，4-或2，5-二氟、2，4-或2，5-二氯；c) 當R1是Et且R2是OMe或OEt時；則R3是H；並且R4、R5和R6聯合起來是i)3，5-二甲氧基-4-Me、3，5-二氯、3，5-二氟、2，4-或2，5-二氟、2，4-或2，5-二氯、3-OMe、2-Cl-5-Me、2-Br-5-Me、2-Cl、2-Br或3-Me；或ii)R6是H，R4是Me且R5是Et、F、Cl、Br、甲醯基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CN、C≡CH、1-propynyl、2-propynyl、乙烯基、OMe、OEt、SMe或SEt；d)當R1是異丙基時；則R2是OMe或OEt；R3是H；而且R4、R5和R6聯合起來是3，5-二甲基；e)當R3是Et時；則R2是H，R1是F或Cl、而且R4、R5和R6聯合起來是3，5-二甲基；f)當R2和R3以及它們所連的苯基碳一起形成亞乙二氧基環時；則R1是Me或Et，而且R4、R5和R6聯合起來是3，5-二甲基；g)當R2和R3以及它們所連的苯基碳一起形成二氫呋喃環或二氫吡喃環時；則R1是Et，而且R4、R5和R6聯合起來是3，5-二甲基；h)當R1是甲醯基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CH2OMe、CH2CN、CN、C≡CH、1-propynyl、2-propynyl、乙烯基、OH、環丙基、CF2CF3、CH≡CHCN、烯丙基、疊氮基、SCN或SCHF2時；則R2是OMe或OEt，R3是H，而且R4、R5和R6聯合起來是3，5-二甲基；和i)當R2是Me、Et、正丙基、異丙基、甲醯基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CH2OMe、CH2CN、CN、C≡CH、1-propynyl、2-propynyl、乙烯基、Ac、F、Cl、OH、正丙氧基、OAc、NMe2、NEt2、SMe、SEt、SOCF3、OCF2CF2H、COEt、環丙基、CF2CF3、CH≡CHCN、烯丙基、疊氮基、OCF3、OCHF2、異丙氧基、SCN、SCHF2、SOMe或NH-CN；則R1是Et，R3是H，而R4、R5和R6聯合起來是3，5-二甲基。
一個尤其理想的配體標記物具有上述指定式，其中E是叔丁基；R1是Me、Et、異丙基或F；R2是OH、OMe、OEt、或與R3及R2和R3所連的苯基碳一起形成氧鄰近苯基碳的亞乙二氧基環或二氫呋喃環；R3是H、Et、或與R2及R2和R3所連的苯基碳一起形成氧鄰近苯基碳的亞乙二氧基環或二氫呋喃環；而且R4、R5和R6獨立地是Me、F、Cl、CH2OH或OMe。另一理想配體具有上述指定式，其中E是叔丁基；R1是Me、Et、異丙基或F；R2是OH、OMe、OEt、或與R3及R2和R3所連的苯基碳一起形成氧鄰近苯基碳的亞乙二氧基環或二氫呋喃環；R3是H、Et、或與R2及R2和R3所連的苯基碳一起形成氧鄰近苯基碳的亞乙二氧基環或二氫呋喃環；而且R4、R5和R6獨立地是Me、F、Cl、CH2OH或OMe。
再一配體標記物具有上述指定式，其中E是叔丁基；R1是Me、Et、異丙基或F；R2是OH、OMe、OEt、或與R3及R2和R3所連的苯基碳一起形成氧鄰近苯基碳的亞乙二氧基環或二氫呋喃環；R3是H、Et、或與R2及R2和R3所連的苯基碳一起形成氧鄰近苯基碳的亞乙二氧基環或二氫呋喃環；而且R4、R5和R6獨立地是Me、F、Cl、CH2OH或OMe。本領域技術人員可以從該指定式選出其它的配體標記物。
這些化合物作為配體標記物是尤其理想的，因為以它們在消費品中例如藥物、化妝品、食物、包裝材料等中的存在濃度而言它們是無害的。而且，本發明的方法能夠檢測到產品中濃度極小的這些配體，例如濃度範圍在十億分之幾到萬億分之幾之間的配體，並對其進行定量。
除了上述分子外，本領域技術人員還可以採用其它分子作為配體標記物，只要該配體標記物能與下述檢測組合物天然或合成的配體依賴性轉錄因子的至少一個選定配體結合域結合即可。
C.檢測組合物本發明的檢測組合物是指含有編碼一或多個天然或合成的配體依賴性轉錄因子的一或多個「第一」核苷酸序列的組合物。該因子優選處於第一啟動子的調節控制之下。該組合物還含有處於受體效應元件或修飾或合成的效應元件，以及第二啟動子的調節控制之下編碼報導基因的「第二」核苷酸序列。任選地，該檢測組合物含有編碼輔激活物或輔阻遏物的「第三」核苷酸序列。這些核苷酸序列可以是RNA或DNA。在一個實施方案中，優選將組成該檢測組合物的這些DNA序列摻入到一個細胞或多個細胞中。更優選地，含有這些核苷酸序列的檢測組合物是穩定的細胞或細胞系。
該檢測組合物的細胞可以是任何真核或原核細胞。真核細胞中優選無脊椎動物的細胞(例如昆蟲細胞)，因為它們可以對優選的受體例如蛻皮激素受體的配體標記物產生最為靈敏的反應。本領域技術人員可以按照本公開選擇其它的細胞和受體組合。故本發明的配體對轉化細胞或整個生物體的生理或其它影響將是微不足道的。因此，細胞能夠生長並表達期望產品，而基本上不受配體本身存在的影響。優選地，在真核細胞中，該檢測組合物的這些核苷酸序列位於細胞核中。
在一個優選實施方案中，含有所述兩種核苷酸序列的該檢測組合物是一種或多種昆蟲細胞，例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)的細胞。昆蟲細胞往往對用於該組合物的多種受體極為靈敏，而且具有極強的耐受性。其它昆蟲細胞包括來源於棉鈴象(Anthomus grandis)的昆蟲細胞系BRL-AG2，參見Stiles等，體外細胞發育生物學(In Vitro CellDev.Biol.)，28A355-363(1992)。還可以採用另一種來源於黃猩猩果蠅(Drosophila melanogaster)Kc細胞系的昆蟲細胞系L57。本領域技術人員還可以選擇其它的昆蟲細胞用於該組合物。
在另一個優選實施方案中，該檢測組合物是一種或多種酵母細胞，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在另一個優選的實施方案中，該檢測組合物是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。用於本發明的另一種優選酵母細胞是Pichia methanolica。用於本發明的其它酵母細胞株包括但不限於酵母屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、Ambrosiozyma、Apiotrichum、Arthroascus、漢遜酵母屬(Hansenula)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、紅酵母屬(Rhodotorula)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)和有孢圓酵母屬(Torulaspora)的多種菌株。
例如，在一個實施方案中，該檢測組合物是哺乳動物細胞。理想的哺乳動物細胞包括但不限於，CHO、BHK、MDCK等細胞，及各種鼠源細胞例如l0T1/2和WEHI細胞，非洲綠猴細胞，適合的靈長類細胞如VER0、COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10，及人類細胞例如WI38、MRC5、A549、人胚胎成視網膜細胞(HER)、人胚胎腎細胞(HEK)、人胚胎肺細胞(HEL)、TH1080細胞。其它適合的細胞可以包括NIH3T3細胞(3T3細胞的亞系)、HepG2細胞(人肝癌細胞系)、Saos-2細胞(人骨原性肉瘤細胞系)、HuH7細胞或HeLa細胞(人癌細胞系)。在一個實施方案中，適當的細胞包括人胚胎腎293T細胞。提供這些細胞的哺乳動物物種的選擇和哺乳動物細胞的類型均不構成對本發明的限制。
含有所述兩種核苷酸序列的本發明其它組合物可以是植物細胞或藻類細胞，例如以下屬的種，這些屬包括但不限於Blastocrithidia、頭孢藻屬(Cephaleuros)、衣藻屬(Chlamydomonas)和小球藻屬(Chlorella)。
當該細胞是原核細胞時，理想的細菌細胞包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)，以及假單孢菌屬(Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和志賀菌屬(Shigella)或其它腸細菌的各個種。然而，優選真核細胞。
在另一個實施方案中，當該檢測組合物的這些核苷酸序列是RNA分子時，還可以將它們作為RNA分子摻入，優選以功能性病毒RNA例如菸草花葉病毒的形式摻入。可以用於本發明組合物中的其它有用病毒包括但不限於痘苗病毒、腺病毒、腺相關病毒、杆狀病毒、布尼亞病毒、冠形病毒、黃病毒、嗜肝DNA病毒、皰疹病毒和皰疹樣病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、細小核糖核酸病毒、痘病毒、呼吸道腸道病毒、逆轉錄病毒和彈狀病毒。
以下對存在於細胞或病毒中形成該檢測組合物的這些核苷酸序列進行描述。
1.第一核苷酸序列該第一核苷酸序列含有至少一個配體依賴性轉錄因子，其優選處於選定啟動子的調節控制之下。在一個實施方案中，配體依賴性轉錄因子是核受體超家族蛋白質或其功能性片段。在另一個實施方案中，配體依賴性轉錄因子是具有核受體超家族蛋白質的轉錄激活性質的修飾蛋白質或合成蛋白質。該超家族的成員包括但不限於，修飾的或天然的類固醇/甲狀腺激素核受體超家族蛋白質，例如蛻皮激素[見Yao，T.P.等(1993)自然，366476-479；Yao，T.-P.等(1992)，細胞(Cell)，7163-72]、雌激素、視黃醛衍生物X(retinoid X)、孕酮、糖皮質激素、維生素D、視黃酸、及過氧物酶體增殖受體蛋白。任選地，該轉錄因子具有與類固醇/甲狀腺激素核受體超家族相似的功能，但常規並不是該超家族的成員。該「任選的」轉錄因子中包括來源於四環素誘導型lac操縱子、IPTG誘導型受體蛋白質、內酯受體蛋白、和阿拉伯糖誘導型蛋白的轉錄因子。
檢測組合物中第一核苷酸序列的配體依賴性轉錄因子含有反式激活域、DNA結合域(「DBD」)、和配體結合域(「LBD」)。每個域可以任選地由具有50-約100個核苷酸任意序列的鉸鏈區分隔開。優選地，該鉸鏈區有100-約500個核苷酸。在一些實施方案中，該鉸鏈區長約200個核苷酸。每個域可以是從其天然來源分離的天然存在的序列，或可以是具有所需功能的天然序列的合成或重組構建序列或片段。優選地，這三個域中的一個或多個的來源可以不同於其它域的來源，以便對於選定的宿主細胞而言「嵌合的」第一核苷酸序列在反式激活活性、與配體的互補結合、及特定效應元件的識別方面獲得最優化。
a.配體結合域該第一核苷酸序列的LBD僅特異地與本發明的配體標記物結合。在一個實施方案中，該LBD，一般在其羧基端序列，還含有反式激活域或反式激活功能，以致無需單獨的反式激活域。配體標記物與LBD的結合觸發DNA結合域與所述效應元件的結合，這將激活或抑制該報導基因的表達，籍此產生或改變信號。在該轉錄因子的一個實施方案中，該LBD是從類固醇/甲狀腺激素核受體超家族成員中獲得的分離的天然配體結合域，例如來自昆蟲超家族(如蛻皮激素受體蛋白)的LBD。或者，該LBD是來自該超家族成員的該域的合成或重組修飾的配體結合域，或片段。再或者，該LBD是能僅與以上定義的配體標記物結合併觸發上述一序列事件的完全合成序列。從以上來源鑑定的LBD可以通過分離、合成或重組製備的方式獲得。這些LBD一般長約500-約1000個核苷酸。在一些實施方案中，該LBD長約750個核苷酸。對於本方法尤其優選的LBD包括蛻皮激素受體LBD和USP。該蛻皮激素受體CfEcR的LBD序列描述於R.Kothapali等，Dev.Genet.17(4)319-330(1995)；也參見Genbank登錄號U29531。
在本發明的一個實施方案中，單獨一個第一核苷酸僅含有一個LBD，該LBD優選與一個配體標記物結合併觸發級聯事件導致可檢測信號的改變(例如可檢測信號的產生、抑制、增強或消失)。在另一個實施方案中，多個不同的LBD存在於一個或多個第一核苷酸序列中。例如，兩個或多個LBD可以相聯(例如形成同二聚體或異二聚體)以產生單一一個針對該配體標記物的轉錄因子或受體。
b.DNA結合域產品中的配體標記物與檢測組合物的一或多個LBD的結合使得該配體依賴性轉錄因子的一或多個DBD可以以激活的形成與所述第二核苷酸序列的效應元件結合，由此導致所述外源報導基因的改變(例如表達或抑制)。在所述轉錄因子的一個實施方案中，該DBD是從類固醇/甲狀腺激素核受體超家族成員獲得的分離的天然DNA結合域，例如來自該昆蟲超家族如蛻皮激素受體蛋白質的DBD。或者，該DBD是來自該超家族成員的該域的合成或重組修飾的DNA結合域，或片段。再或者，該DBD可以是來自另一轉錄因子的DNA結合域。該DBD可以是酵母細胞的DNA結合域例如GAL4 DBD，或來自病毒的DNA結合域，或來自植物細胞的DNA結合域。可以在本發明核苷酸序列中用作DBD的其它DNA結合域包括LexA的DNA結合域或細菌LacZ基因的DNA結合域。該域的其它選擇包括人工鋅指區。再或者，該DBD是當存在與該LBD結合的配體標記物時介導上述一序列事件的完全合成序列。本發明的DBD還可以包括任何上述來源的天然DBD的合成或重組類似物、組合或修飾。
在一個實施方案中，單獨一個第一核苷酸序列含有一個DBD。在另一個實施方案中，一或多個第一核苷酸序列含有不止一個DBD。在該一個或多個第一核苷酸序列中該DBD可以與所述的一或多個LBD異源。或者，該DBD可以與該LBD同源。再或者，當有兩個或多個DBD存在於該第一核苷酸序列中時，這些DBD可以相同或不同。該DBD域可以是天然的、修飾的、或異源受體蛋白的不同DNA結合域的嵌合體。從上述來源鑑定的DBD可以通過分離、合成或重組製備的方式獲得。這些DBD優選長約100至約1000個核苷酸。在一個實施方案中，該DBD域長約750個核苷酸。作為一個實例，蛻皮激素來源的DBD的特徵在於在兩個胺基酸基序P盒和D盒兩側存在兩個半胱氨酸鋅指，它們賦予了對蛻皮激素效應元件的特異性。對於本方法一個尤其優選的DBD是CfEcR的DBD，描述於R.Kothapalli等，Dev.Genet.17(4)319-330(1995)；也參見Genbank登錄號U29531。其它DBD序列是本領域已知的。
c.反式激活域當產品中的配體標記物與檢測組合物中的LBD結合後，該配體依賴性轉錄因子的反式激活域將加強該配體依賴性轉錄因子的構象改變。該反式激活域可以是提供激活功能的LBD的羧基端序列。或者，該反式激活域可以是獨立於LBD的序列。可以有一或多個反式激活域存在於一或多個該第一核苷酸序列上。該反式激活域可以是天然的、修飾的、或異源受體蛋白質的不同反式激活域的嵌合體。有用的反式激活域可以來源於類固醇/甲狀腺激素核受體的激活域、合成的或嵌合的激活域、聚穀氨醯胺激活域、鹼性或酸性胺基酸激活域、病毒激活域、植物病毒激活域、或VP16、GAL4、NF-kB或BP64激活域。同樣地，這些域可以通過修飾上述任意一種域來製備，或通過採用任意一種這些激活域的片段來製備。在本發明的第一核苷酸序列中，為了增加激活強度可以採用一個以上的激活域。
有用的反式激活域一般是長約16-約500個核苷酸的核苷酸序列。優選地，為了增加激活的強度在該第一核苷酸序列中採用不止一個激活域。從上述來源鑑定的反式激活域可以通過分離、合成或重組製備的方式獲得。用於本發明方法的尤其優選反式激活域是公開於P.E.Pellett等，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82(17)5870-5874(1985)中的VP16反式激活域，和本領域技術人員已知的其它反式激活域。VP16反式激活域的序列也參見Swiss Prot.登錄號PO4486。
d.啟動子該第一核苷酸序列還任選地含有調節至少一個配體依賴性轉錄因子在選定的細胞或病毒中表達的啟動子。在本發明方法中，根據期望的最終結果，即控制表達的時間選擇和定位，本領域技術人員可以容易地選擇用於驅動該配體依賴性轉錄因子表達的啟動子。術語「啟動子」是指由RNA聚合酶識別的特定核苷酸序列。該啟動子序列是能在適當條件下特異地起始轉錄的位點。可以選擇許多種啟動子來調節第一核苷酸序列的轉錄因子表達，例如組成型啟動子、可誘導調節的啟動子、組織特異性啟動子(僅在特定類型的細胞中表達)或生物體某些發育狀態所特異的啟動子。
然而，優選地，用於第一核苷酸序列的啟動子是組成型啟動子。可以選擇的組成型啟動子的例子包括但不限於逆轉錄勞斯肉瘤病毒的LTR啟動子、巨細胞病毒啟動子、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、α-肌動蛋白啟動子、甘油磷酸激酶啟動子、EF1α啟動子、T7聚合酶啟動子、蛻皮激素昆蟲啟動子、骨骼α肌動蛋白啟動子、肌球蛋白輕鏈2A啟動子、肌營養不良蛋白啟動子、肌肉肌酸激酶啟動子、合成的肌肉啟動子、肝啟動子、B型肝炎病毒核心啟動子、甲胎蛋白啟動子、肌動蛋白啟動子、IE1啟動子、IR2和其它杆狀病毒啟動子、HSP70啟動子、35S植物啟動子、CSV植物啟動子、酵母GAL1啟動子、酵母ADH1啟動子、和酵母MET25啟動子。目前優選的啟動子是存在於AcMNPV序列中的杆狀病毒IE1啟動子，其描述於M.D.Ayres等，Virol.202(2)586-605(1994)；也參見Genbank登錄號NC001623。可以從本領域已知的那些序列中選擇其它啟動子序列。
優選地在第一核苷酸序列中，該啟動子位於LBD的5』端，LBD位於DBD的5』端，而DBD位於反式激活域的5』端。可以通過啟動子的3』核苷酸與LBD的5』核苷酸融合，以及LBD的3』核苷酸與DBD的5』核苷酸融合等方式，直接將這些域彼此連接起來。或者，當反式激活域是LBD的部分時，僅將LBD直接地或通過間隔區與DBD連接起來。在另一個可替代方案中，一個「第一」核苷酸序列含有一個LBD和DBD，而另一個「第一」核苷酸序列含有相同的LBD和DBD或不同的LBD和DBD，以及任選的反式激活域，籍此該多個「第一」核苷酸序列的這些LBD和DBD及反式激活域以同二聚體或異二聚體的形式形成單一一個轉錄因子。該多個LBD、DBD和反式激活域可以存在於單個核苷酸序列或多個分開的核苷酸序列中。或者，每個這些域均優選地由任選的約16-約30個核苷酸的間隔區分隔開。例如，可以採用6-約10個甘氨酸殘基，如18-約30個核苷酸作為間隔區。
理想地該第一核苷酸序列是單鏈DNA或RNA；或者，它們可以是雙鏈DNA或RNA。可以將該第一序列製備成直鏈形式，但優選環狀質粒。在另一個實施方案中，一個第一序列可以位於一個質粒之上，另一個第一序列可以位於相同的質粒或不同的質粒之上；而所述第二核苷酸序列可以位於再另一個質粒之上。再一個實施方案提供了存在於相同質粒之上的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，前提是它們由一個或多個轉錄封閉序列或polyA序列分隔開。這些序列的其它實施方案可以採用來源於病毒、噬菌體和其它分子的序列。
2.第二核苷酸序列檢測組合物的第二核苷酸序列編碼處於受體效應元件(例如天然的、修飾的或合成的)及第二啟動子的調節控制之下的報導基因。
a.效應元件術語「效應元件」(「RE」)是指一個或多個順式作用DNA元件，它們通過與第一核苷酸分子的配體依賴性轉錄因子的DBD相互作用賦予啟動子反應性。當產品中存在配體標記物時，第一核苷酸分子的DBD與該第二核苷酸分子的RE結合，起始或抑制處於該效應元件調節之下的下遊報導基因和第二啟動子的轉錄。
該RE可以在其序列中具有迴文結構(完全或不完全的)，或由可變數量的核苷酸分隔開的序列基序或半位點組成。這些半位點可以相似或一致，並呈正向或反向重複排列。該RE優選地是從以上所定義的類固醇/甲狀腺激素核受體超家族成員獲得的受體效應元件，或從鑑定DBD的其它來源中獲得，或合成製備。對於本方法尤其優選的RE有來自GAL4的效應元件、來自類固醇/甲狀腺激素核受體的效應元件、人工鋅指、LexA操縱子、lac操縱子的效應元件、及識別合成DBD的合成或重組製備的效應元件。
從以上來源鑑定的RE可以通過分離、合成或重組製備的方式獲得，而且一般長約10-約40個核苷酸。優選地，該RE長約12-約36個核苷酸。作為一個具體例子，天然蛻皮激素受體的RE的DNA序列包括RRGG/TTCANTGAC/ACYY[Chrebas L.等(1991)，Genes Dev.5，120-131]；AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N(n)可以是一個或多個間隔區核苷酸[D』Avino PP.等(1995).Mol.Cell Endocrinol.113，1-9]；和GGGTTGAATGAATTT[Antoniewski C.等(1994)，Mol.Cell Biol.14，4465-4474]。此外，效應元件本身可以用針對其它DNA結合蛋白域，例如來自酵母的GAL4蛋白[Sadowski等(1988)自然335563-564]或來自大腸桿菌的LexA蛋白[Brent和Ptashne(1985)，細胞43729-736]的效應元件進行修飾或替代。
b.報導基因第二核苷酸序列的報導基因是表達時能夠直接或間接地產生可檢測信號的基因。該基因可以容易地從本領域的大量這類報導基因中選出。例如，該報答基因可以編碼能夠產生光學可檢測信號或比色信號的蛋白質或酶。該報答基因可以是編碼螢光或發光蛋白質的基因。或者，該報導基因可以編碼與底物相互作用產生可檢測信號的蛋白質。該報導基因可以直接或間接地引起該檢測信號的發射或吸收光譜(例如UV、可見光、NMR等)的紅移或藍移。該報導基因編碼的蛋白質可以是能夠催化產生可檢測信號的酶。
該報導基因的幾個具體例子包括編碼綠色螢光蛋白、螢光素酶、β-半乳糖苷酶、藍色螢光蛋白、及分泌型鹼性磷酸酶的基因。優選地，該信號由該報導分子本身或通過該報導分子與其底物的相互作用產生。正如本領域技術人員已知的，大多數報答酶具有一種以上的底物。報導酶和底物之間的反應產生通過目測、顯微鏡檢測、紫外光檢測、電檢測、電容值的改變、雜交、紅外檢測、螢光檢測和核磁共振可以檢測到的信號。本領域技術人員可以容易地從大量已知並且是商業上可獲得的符合這些描述的報導基因中進行選擇。也參見以下的實施例。
c.第二啟動子第二核苷酸序列的啟動子與效應元件一起控制報導基因的表達。該啟動子可以和檢測組合物的第一核苷酸分子中的啟動子相同。優選地，該第二啟動子是不同的誘導型啟動子。作為誘導型啟動子，該第二啟動子調節報導分子在選定細胞中的可誘導表達，並僅在有由該配體標記物、配體依賴性轉錄因子和效應元件形成的複合物存在時起始或抑制該報導基因的轉錄。更優選地，該第二啟動子可被該效應元件例如蛻皮激素的RE誘導。在一個實施方案中，該第二啟動子是RE誘導型最小啟動子，例如醇脫氫酶的最小啟動子或合成的TATA盒。最優選的啟動子是蛻皮激素誘導型啟動子。其它誘導型啟動子的例子包括但不限於鋅指誘導型綿羊金屬硫蛋白啟動子、地塞米松誘導型小鼠乳癌病毒啟動子、四環素阻抑型啟動子、四環素誘導型啟動子、RU486誘導型啟動子和納巴黴素誘導型啟動子。
該啟動子的功能是修飾報導基因的表達，以便誘導可檢測信號的改變。例如，在某些實施方案中，該第二啟動子打開報導基因的表達。在其它實施方案中，該第二啟動子關閉報導基因的表達。在再其它的實施方案中，該第二啟動子誘導報導基因表達的改變，例如抑制或降低表達或增加表達。
優選地，在第二核苷酸分子中該RE位於第二啟動子的5』端，第二啟動子位於報導基因的5』端。在一個實施方案中，EcR RE與合成的TATA盒連接，該TATA盒與該報導基因連接。第二核苷酸序列的這些元件可以直接地以3』核苷酸和5』核苷酸進行連接。或者，這些域的每一個均優選地由任選的約16-約30個核苷酸的間隔區分隔開。例如，可以採用約6-約10個甘氨酸殘基，如18-約30個核苷酸作為間隔區。第二核苷酸序列可以是單鏈RNA或DNA，或雙鏈RNA或DNA。可以將該第二序列製備成直鏈形式，或優選地作為環狀質粒。在另一個實施方案中，第一序列可以位於一個質粒之上，而第二核苷酸序列可以位於另一個質粒之上。在再一實施方案中，提供了存在於相同質粒上的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，前提是它們由轉錄封閉序列或polyA序列分隔開。其它實施方案中，這些序列可以採用來源於病毒、噬菌體和其它分子的序列。
3.任選的輔因子該檢測組合物的一個任選部分是編碼輔因子的核苷酸序列。取決於該檢測組合物轉染的細胞類型，這些輔因子可能是有用的或必需的，它們包括一般稱作輔激活物(又稱銜接子(adapter)或介導子(mediator))或輔阻遏物(又稱阻抑物、沉默子或沉默介導子)的蛋白質。
輔激活物不與DNA發生序列特異性結合，也不參與基礎轉錄。本發明檢測組合物中的輔激活物與配體依賴性轉錄因子相互作用，以激活報導基因的表達。它們可以通過多種機制發揮它們的轉錄激活作用，這些機制包括刺激激活子與DNA的結合、影響染色體結構、或介導激活子與起始複合物的相互作用。這些輔激活物的例子包括RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及混棲輔激活物C效應元件B結合蛋白CBP/p300。綜述參見CK Glass等，Curr.Opin.Cell Biol.9222-232(1997)。
當缺少配體標記物時，有效地抑制轉錄激活可能需要輔阻遏物。本發明檢測組合物中的輔阻遏物與配體依賴性轉錄因子相互作用，以抑制報導基因的表達。這些輔阻遏物可以與未結合配體的蛻皮激素受體相互作用，使效應元件的活性沉默。目前的證據提示配體的結合改變了受體的構象，這導致輔阻遏物的釋放和上述輔激活物的重新結合，由此消除了輔阻遏物的沉默作用。輔阻遏物的例子包括N-CoR和SMRT。綜述參見K.B.Horwitz等，Mol.Endocrinol.101167-1177(1996)。
當檢測組合物所轉染的細胞內缺乏內源性的這些輔因子時，可以外來地將編碼一個或多個輔因子的核苷酸序列加入該細胞中作為檢測組合物的部分。在一個實施方案中，編碼輔因子的序列可以作為檢測組合物的第一或第二核苷酸序列的部分被包括在內。可以將該輔因子置於受調節的或未受調節的啟動子(上述的組成型或誘導型啟動子)的控制之下，或可以對該核苷酸序列進行改造使其由上述第一個或第二啟動子表達。在另一個實施方案中，可以將該輔因子序列置於單獨的「第三」核苷酸序列上，例如置於單獨的直鏈或環狀質粒之上。作為第三可選擇的方案，可以將選定的輔因子蛋白質加入產品或產品的部分或提取物中作為上述方法的一個獨立步驟。
4.檢測組合物的製備一旦第一和第二核苷酸分子(及任選的第三核苷酸分子或序列)的各個域或區段成分已按上述討論的方法選定，即可藉助已知的化學合成技術，例如固相化學合成，如描述於Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.，852149-2154(1963)，及J.Stuart和J.Young，Solid Phase PeptideSynthelia，Pierce Chemical公司，Rockford，IL(1984)，或詳細描述於以下實施例中的方法，常規地製備在本發明方法中有用的核苷酸序列。或者，可以通過已知的重組DNA技術和遺傳工程技術，如聚合酶鏈式反應，在宿主微生物或細胞中克隆和表達攜帶上述定義的核酸序列的DNA片段等方式[見例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(MolecularCloning.A Laboratory Mannal.)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，紐約(1989)；Ausubel等(1997)，當代分子生物學實驗指南(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley Sons，紐約]，製備和組裝在本發明方法中有用的這些核苷酸序列。這些第一和第二分子可以是獨立的直鏈或環狀核苷酸結構。或者，它們可以是環狀質粒。再或者，它們可以被置於單個分子上。作為另一種可選擇的方案，由第一核苷酸序列產生的兩個或多個蛋白質可以相聯形成同二聚體或異二聚體，以產生單個轉錄因子。
一旦製備完成，即可以通過任何常觀方法例如轉染、電穿孔、脂質體遞送、膜融合技術、高速的DNA包被丸粒、病毒感染和原生質體融合等，將這些分子導入選定的細胞中。或者，當這些分子被製成RNA分子時，可以通過常規重組技術將它們設計成作為所選病毒的部分。對於昆蟲和植物細胞，實施本發明可能僅需要含有LBD、DBD和反式激活域的一個第一核苷酸序列和一個第二核苷酸序列。對於哺乳動物細胞和酵母細胞，可能需要至少兩個「第一」核苷酸序列和一個第二核苷酸序列以及任選的輔因子來實施本方法。
為了易於本發明的使用，優選將檢測組合物的細胞或病毒製備成活的未冰凍形式或活的凍幹形式。上述定義的任何一種細胞一旦轉錄了第一和第二核苷酸分子之後，即可以通過常規方法例如那些在常規教科書中講授的方法進行凍幹。
甚至更優選地，將該凍幹細胞或病毒檢測組合物固定在固相支持物上。適合的固相支持物包括微量比色池、微膠囊、微量滴定板、小珠和生物晶片。有用的支持物包括那些尤其是描述於如下文獻中的支持物1999年6月3日公開的國際專利申請WO99/27351；或1999年6月3日公開的國際專利申請WO99/27140；美國專利6,096,273；2000年3月16日公開的國際專利申請WO00/14197。用於固定檢測組合物的細胞或凍幹細胞的這些固相支持物可以從許多已知的商業上可獲得類型中進行選擇；而且這些支持物的廠商提供了用於將該細胞或病毒結合在這些支持物上的方法。在再一個實施方案中，該支持物可以是用於例如固體產品的粘合劑。
D.方法的實施因此本發明方法依賴於本發明所選產品之中或之上配體標記物的存在。為了檢測產品中配體標記物的存在或對其進行定量，將該產品與以上定義的一或多個檢測組合物接觸。如果將配體標記物施用於固體產品，而非液體產品，則可以從該固體產品中提取配體標記物。為了便於應用，優選該檢測組合物含有固定化的上述轉染細胞或RNA病毒。例如，當產品試樣被置於固定在生物晶片上的檢測組合物之上時，配體標記物優選與該固定化細胞中的LBD結合。該結合導致配體依賴性轉錄因子的構象改變，從而使DBD與第二核苷酸分子上的RE形成複合物。DBD和RE之間形成的複合物激活第二啟動子，從而調節外源報導基因的表達。
各種成分彼此結合的順序，即配體標記物與LBD-DBD-反式激活域序列的結合以及DBD與效應元件的結合的順序，並不是關鍵的。然而，標記配體的存在對於開啟報導基因表達或關閉報導基因表達或改變報導基因表達，並籍此產生指示該配體標記物存在的可檢測信號或可檢測的信號改變是絕對必需的。如果產品中不存在配體標記物，則不能檢測到信號改變。
E.檢測試劑盒可以容易地將本方法的成分製備成試劑盒，該試劑盒含有適於檢測液體或固體產品中配體標記物的一或多個檢測組合物、用於在適合保存報導基因或報導基因系統所產生信號的可檢測性質的環境中容納樣品和/或大量本發明檢測組合物的適合容器、和/或與報導基因產物相互作用產生可檢測信號的適合底物。本發明的試劑盒可以含有相同或不同的檢測組合物，因此可以採用相同的檢測組合物或多種檢測組合物檢測許多樣品。此外，如果需要的話，這些試劑盒還可以含有培養所述細胞所必需的試劑；和/或重新活化該凍幹細胞或裂解物所必需的試劑；實施檢測試驗的說明書、該檢測組合物所預先吸附的凍幹狀態的底物、稀釋劑和緩衝液、用於比較信號的指示圖、一次性手套、排除汙染的說明書、敷藥籤或容器，及樣品準備杯。為了方便，優選提供冰凍、凍幹、或者其它方式保存的細胞，這些細胞在重新活化後表達本發明的檢測組合物。本發明的試劑盒可以含有組成型表達本發明報導蛋白質的完整細胞，或僅在誘導後表達該報導蛋白質的細胞，或只要不加入抑制劑即可表達的細胞。優選地在這些試劑盒中包括相應的誘導劑或抑制劑。而且，該試劑盒優選包括重新活化保存的表達系統所必需的溶液。只要所用的表達系統需要，該試劑盒還優選含有必需的緩衝物質或培養基。
本發明試劑盒對於快速篩選大量樣品是否存在配體標記物是有用的。因此，根據本發明的應用與以上已詳細討論的本發明方法一致，由此使用本發明試劑盒使得用戶可以以一種簡單快速的方式確定產品的來源或摻假，本發明試劑盒優選提供用戶所有必需的成分。
F.實施例以下實施例舉例說明了本發明的這些方法和組合物的幾個實施方案。這些實施例僅是說明性的，並不限制本發明的範圍。
受體質粒pIE1VP16CfEcRCDEF含有與VP16激活域融合併且其表達處於杆狀病毒IE1啟動子的控制之下的CfEcR CDEF域。該質粒的構建有兩個步驟。為了構建載體pIE1VP16，採用附有NdeI和Bg1II限制性酶位點的引物擴增AcMNPV(描述於Ayres等，引文同上)的IE1啟動子區。將該擴增產物克隆至含有VP16激活域(描述於Pellett等，見上)、和多克隆位點及隨後的SV40 polyA信號的質粒載體中。採用附有BamHI和XbaI的引物擴增CfEcR CDEF域(描述於Kothapalli等，見上)。然後將該擴增的CfEcRCDEF克隆至pIE1VP16載體中。
報導質粒pMK43.2含有來自熱休克蛋白質27基因(描述於Riddihough和Pelham，EMBO J.63729-3734(1987))的6X蛻皮激素效應元件，其克隆在醇脫氫酶最小啟動子和大腸桿菌β-半乳糖苷酶報導基因的上遊。該質粒的構建描述於M.R.Koelle等，細胞6759-77(1991)。
當這兩個質粒被轉染至宿主細胞中後，該基因開關按如下方式運作。在上述受體質粒中杆狀病毒IE1啟動子組成型地產生EcR蛋白質，該蛋白質以無活性形式表達在該所選宿主細胞的細胞質中。在另一實施方案中，可以將該EcR蛋白置於組織特異性誘導型或發育調節型啟動子的控制之下，以控制EcR在宿主中表達的時間選擇和位置。該EcR蛋白向細胞核遷移並與存在於上述報導質粒中的稱作效應元件的特異DNA序列結合。該效應元件是宿主DNA中天然所沒有的獨特DNA序列，被EcR蛋白質特異識別。該效應元件功能上與目的受調節基因相連，在該實施方案中該目的受調節基因是報導基因β-半乳糖苷酶。
當該細胞在例如實施例3或4的分析試驗之一暴露於該細胞的樣品中與配體標記物接觸後，該配體標記物與EcR受體結合，並激活該受體，「打開」該β-半乳糖苷酶基因的表達並由此產生該基因所編碼的蛋白質。以下描述的分析試驗被設計用於對該報導基因進行鑑定和測量。實施例2標記溶液的製備向100ml容量瓶中加入1.0166g配體標記物，methoxyfenoxide(N』-叔丁基-N』-(3，5-二甲基苯甲醯基)-3-甲氧基-2-甲基苯並醯肼)。用無水乙醇將該溶液稀釋至100ml體積，獲得溶液A。1ml溶液A含有大約10mg配體標記物。
將10ml(±0.04ml)上述溶液A加入100ml容量瓶中製備溶液B。用無水乙醇將所獲得的溶液稀釋至100ml體積。所獲的溶液B 1ml含有大約1mg配體標記物。
將10ml(±0.04ml)上述溶液B加入100ml容量瓶中製備溶液C。用無水乙醇將所獲得的溶液稀釋至100ml體積。所獲的溶液C 1ml含有大約0.1mg配體標記物。
為了製備用於在以下的酵母和昆蟲分析試驗中進行測試的樣品溶液，將1ml(±0.12ml)A、B或C貯存液加入大約100g汽油或伏特加酒中，總結於下表1中
將表1中的樣品以1∶100稀釋在乙腈/水(1/1)中後，通過液相色譜/質譜分析(LC/MS)在HP1000-VG平臺上對每個汽油和伏特加酒樣品中的配體標記物濃度進行定量。LC包括採用25μl的注射體積在3×50mm C-18柱(Polaris Metachem)上進行的梯度分離。該MS採用信號離子監測模式特異檢測配體標記物分子的離子。所有的HPLC標準品均在乙腈/水(1/1)中製備。通過分析物濃度(面積)和在每套配體標記物(汽油或伏特加酒的A、B和C溶液)之前和之後分析的5個標準濃度(面積)之間的比較，進行定量。結果總結在表2中。
表2
這些結果說明，可以採用常規分析化學檢測(例如色譜方法)檢測汽油和伏特加酒樣品中配體標記物的存在。實施例3基於昆蟲細胞的配體標記物分析試驗昆蟲細胞系BRL-AG2來源於棉鈴象(Anthomus grandis)(參見Stiles等，In Vitro Cell Dev.Biol.，28A355-363(1992))。修飾黃猩猩果蠅Kc細胞系使蛻皮激素受體的表達沉默，製備了另一個昆蟲細胞系L57。用以上實施例1描述的受體質粒和報導質粒轉染每一個昆蟲細胞系。
在該基於昆蟲細胞的配體標記物分析試驗中，在48孔板的每孔中分配200,000個上述轉染的BRL-AG2細胞或L57細胞。向這些細胞中加入0.5μl陰性對照例如BMSO，或實施例2的標記產品(伏特加酒或汽油)。這些細胞在含有實施例2的配體標記物溶液或陽性對照(即溶在乙醇中的methoxyfenoxide)或陰性對照(僅乙醇)的培養基中25℃維持48小時。收穫這些細胞並將其重懸在報導裂解緩衝液(Promega公司，Madison，WI)中15分鐘。採用Galacto-StarTM化學發光報導基因分析系統(Tropix公司，Bedford，MA)，分析含有該重懸細胞的10μl緩衝液試樣的β-半乳糖苷酶活性。通過用無配體標記物時的相對光單位(RLU)除配體標記物存在時的RLU，計算誘導倍數。
結果列表於下表3和4中。
表3伏特加酒中標記物的檢測
表4汽油中標記物的檢測
這些細胞甚至在50μl伏特加酒或汽油時仍表現健康。配體標記物導致大約20-50倍誘導的報導活性。每ml標記產品含有0.5μl配體標記物已足以觀察到報導活性的明顯改變。這些結果顯示了與實施例3的化學方法相比，配體標記物增加了至少10×的靈敏性。因為該生物學分析試驗在所測試的最低濃度時已達到飽和，所以可以對該生物學分析試驗中的標記物溶液作進一步稀釋。該生物學分析試驗結果類似化學分析，因為這些汽油樣品也表現出較低的配體標記物濃度。這個跡象可能是由於在計算這些汽油樣品中配體標記物濃度時產生的誤差所致。
所有以上引用的文獻均以參考文獻形式併入本文。本發明的多種修改和變動也包括在以上給出的說明書中，並應當是本領域技術人員所明了的。對本發明組合物和方法進行的這些修改和變動被認為包括在此後所附及的權利要求的範圍內。
權利要求
1.鑑定產品的方法，所述方法包括步驟(a)使所述產品與配體標記物相聯；(b)作為鑑定該產品的一種手段，在其後的時間點通過所述產品與如下組合物接觸，檢測所述產品、所述產品的部分或所述產品的提取物中的所述配體標記物，其中所述組合物含有(1)編碼一個或多個天然或合成的配體依賴性轉錄因子的一個或多個第一核苷酸序列，其中所述因子含有至少一個配體結合域、至少一個DNA結合域和至少一個反式激活域；和(2)編碼處於受體效應元件或者修飾或合成的效應元件、及第二啟動子的調節控制之下的報導基因的第二核苷酸序列；其中所述配體標記物和所述至少一個配體結合域之間的相互作用是高度特異的，並誘導所述報導基因表達的改變，所述改變產生可檢測信號，從而能夠鑑定所述產品中所述配體的存在。
2.根據權利要求1的方法，其中所述轉錄因子處於第一啟動子的調節控制之下。
3.根據權利要求1的方法，其中所述反式激活域是配體結合域增強激活的羧基端部分。
4.根據權利要求1的方法，其中所述反式激活域是獨立於所述配體結合域的序列。
5.根據權利要求1的方法，其中所述組合物還含有編碼與配體依賴性轉錄因子相互作用從而激活或抑制所述報導基因表達的輔激活物或輔阻遏物的第三核苷酸序列。
6.根據權利要求1的方法，其中將所述產品與和配體依賴性轉錄因子相互作用從而激活或抑制所述報導基因表達的輔激活物或輔阻遏物接觸。
7.根據權利要求1的方法，其中所述配體依賴性轉錄因子是核受體超家族蛋白質或其功能性片段。
8.根據權利要求1的方法，其中所述配體依賴性轉錄因子是具有核受體超家族蛋白質的轉錄激活性質的修飾蛋白質或合成蛋白質。
9.根據權利要求7的方法，其中所述因子是修飾的昆蟲核受體超家族蛋白質。
10.根據權利要求7的方法，其中所述因子選自由蛻皮激素、雌激素、視黃醛衍生物X、孕酮、據皮質激素、維生素D、視黃酸和過氧化物酶體增殖受體蛋白組成的核受體超家族成員。
11.根據權利要求1的方法，其中所述因子選自四環素誘導型lac操縱子和IPTG誘導型受體蛋白、內酯受體蛋白和阿拉伯糖誘導型蛋白。
12.根據權利要求1的方法，其中所述組合物是含有所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列的細胞。
13.根據權利要求12的方法，其中所述細胞是真核細胞。
14.根據權利要求12的方法，其中所述細胞是原核細胞。
15.根據權利要求12的方法，其中將所述細胞被固定在固相支持物上。
16.根據權利要求1的方法，其中所述配體標記物與所述配體結合域的所述結合觸發該DNA結合域與所述效應元件的結合，其中所述結合的效應元件激活或抑制所述報導基因的表達。
17.根據權利要求1的方法，其中所述組合物含有多個不同的配體結合域，它們相互聯接以提供單個受體。
18.根據權利要求1的方法，其中所述組合物含有單個配體結合域。
19.根據權利要求1的方法，其中所述配體結合域選自類固醇/甲狀腺激素核受體超家族成員的配體結合域、其合成或重組修飾的域、所述域的片段、和其類似物。
20.根據權利要求1的方法，其中所述DNA結合域介導所述配體依賴性轉錄因子與所述第二核苷酸序列的所述效應元件結合。
21.根據權利要求20的方法，其中所述DNA結合域與所述配體結合域異源。
22.根據權利要求20的方法，其中所述DNA結合域選自GAL4的DNA結合域、LexA的DNA結合域、轉錄因子的DNA結合域、類固醇/甲狀腺激素核受體超家族成員的DNA結合域、細菌LacZ的DNA結合域、酵母細胞的DNA結合域、植物細胞的DNA結合域、病毒的DNA結合域、人工鋅指區、它們的合成或重組的類似物、組合或修飾。
23.根據權利要求1的方法，其中當該配體與所述配體結合域結合時，所述反式激活域加強了該配體依賴性轉錄因子的構象改變。
24.根據權利要求23的方法，其中所述反式激活域選自類固醇/甲狀腺激素核受體激活域、合成的或嵌合的激活域、聚穀氨醯胺激活域、鹼性或酸性胺基酸激活域、病毒激活域、植物病毒激活域、或VP16、GAL4、NF-kB或BP64激活域、修飾的激活域、任一所述激活域的片段和它們的修飾物。
25.根據權利要求24的方法，其中採用一個以上的激活域來增加激活的強度。
26.根據權利要求1的方法，其中所述效應元件選自GAL4、類固醇/甲狀腺激素核受體的效應元件、人工鋅指、LexA操縱子、lac操縱子的效應元件、以及合成的或重組製備的識別DNA結合域的效應元件。
27.根據權利要求1的方法，其中所述第一啟動子調節所述因子在所選擇的宿主細胞或病毒中的表達。
28.根據權利要求2的方法，其中所述第一啟動子是組成型啟動子。
29.根據權利要求1的方法，其中所述第二啟動子調節所述報導分子在選擇的宿主細胞中的誘導型表達，並僅當存在由該配體標記物、該配體依賴性轉錄因子和所述效應元件形成的複合物時起始或抑制所述報導基因的轉錄。
30.根據權利要求2的方法，其中所述第一個和第二啟動子相同。
31.根據權利要求30的方法，其中所述第二啟動子是誘導型啟動子。
32.根據權利要求1的方法，其中所述報導基因所產生的信號可以通過選自以下的方法來檢測目測、顯微鏡檢測、紫外光檢測、電檢測、電容值的改變、雜交、紅外檢測、螢光檢測和核磁共振。
33.根據權利要求32的方法，其中所述報導基因是編碼螢光蛋白或發光蛋白的基因。
34.根據權利要求32的方法，其中所述報導基因編碼與底物相互作用產生可檢測信號的蛋白質。
35.根據權利要求32的方法，其中所述報導基因直接或間接地導致所述可檢測信號的發射光譜的紅移或藍移。
36.根據權利要求34的方法，其中所述蛋白質是能夠催化產生可檢測信號的酶。
37.根據權利要求1的方法，其中所述配體標記物是與所述配體結合域特異結合的分子。
38.根據權利要求37的方法，其中所述配體標記物是能夠特異地與選定的配體結合域相互作用的小分子。
39.根據權利要求35的方法，其中所述配體是合成的化合物。
40.根據權利要求38的方法，其中所述配體標記物選自松甾酮A、muristerone A、烷基替醯肼、N，N』-二醯基醯肼、N-取代-N，N』-二醯基醯肼、N-取代-N， N』-雙取代醯肼、二苯甲醯烷基氰基醯肼、N-烷基-N，N』-二芳醯基醯肼、N-醯基-N-烷基-N』-芳醯基醯肼、3，5-二叔丁基-γ-羥基-N-異丁基苯甲醯胺、8-O-乙醯基哈帕苷。
41.根據權利要求1的方法，其中所述產品選自液體、固體、分散體、乳劑或膠乳。
42.根據權利要求41的方法，其中所述配體標記物直接與所述產品相混合。
43.根據權利要求41的方法，其中該產品是固體，將該配體標記物施加在該產品的表面，或與該產品相關的標籤或包裝材料上。
44.根據權利要求41的方法，其中所述配體以十億分之0.1至10的濃度存在於所述液體產品中。
45.根據權利要求41的方法，其中所述配體以十億分之10至約500的濃度存在於所述固體產品中。
46.含有與如下配體標記物相聯的液體、固體、分散體、乳劑或膠乳的標記產品，其中所述配體標記物選自松甾酮A、muristerone A、烷基替醯肼、N，N』-二醯基醯肼、N-取代-N，N』-二醯基醯肼、N-取代-N，N』-雙取代醯肼、二苯甲醯烷基氰基醯肼、N-烷基-N，N』-二芳醯基醯肼、N-醯基-N-烷基-N』-芳醯基醯肼、3，5-二叔丁基-γ-羥基-N-異丁基苯甲醯胺、8-O-乙醯基哈帕苷。
47.一或多種細胞，其含有(a)編碼一個或多個天然或合成的配體依賴性轉錄因子的一個或多個第一核苷酸序列，其中所述因子含有至少一個配體結合域、至少一個DNA結合域和至少一個反式激活域；和(b)編碼處於受體效應元件或者修飾或合成的效應元件、及第二啟動子的調節控制之下的報導基因的第二核苷酸序列；其中所述配體標記物和所述至少一個配體結合域之間的相互作用是高度特異的，並誘導所述報導基因表達的改變，所述改變產生鑑定所述配體標記物存在的可檢測信號。
48.鑑定標記產品的試劑盒，其含有(a)檢測組合物，其含有(1)編碼一個或多個天然或合成的配體依賴性轉錄因子的一個或多個第一核苷酸序列，其中所述因子含有至少一個配體結合域、至少一個DNA結合域和至少一個反式激活域；和(2)編碼處於受體效應元件或者修飾或合成的效應元件、及第二啟動子的調節控制之下的報導基因的第二核苷酸序列；其中所述配體標記物和所述至少一個配體結合域之間的相互作用是高度特異的，並誘導所述報導基因表達的改變，所述改變產生鑑定所述配體標記物存在的可檢測信號；和(b)檢測和測量所述信號的方法。
49.根據權利要求48的試劑盒，其中所述組合物(a)選自一種或多種細胞和一種或多種凍幹細胞。
50.根據權利要求48的試劑盒，其還含有至少一種選自以下的成分培養所述一種或多種細胞所必需的試劑、重新活化所述一種或多種凍幹細胞或細胞裂解物所必需的試劑；實施檢測分析試驗的說明書、該組合物預先吸附的凍幹狀態的底物、稀釋劑和緩衝劑、用於信號比較的指示圖、一次性手套、消除汙染的說明書、敷藥籤或容器、和樣品準備杯。
51.檢測組合物，其含有(a)活細胞，其含有(1)編碼一個或多個天然或合成的配體依賴性轉錄因子的一個或多個第一核苷酸序列，其中所述因子含有至少一個配體結合域、至少一個DNA結合域和至少一個反式激活域；和(2)編碼處於受體效應元件或者修飾或合成的效應元件、及第二啟動子的調節控制之下的報導基因的第二核苷酸序列；其中所述配體標記物和所述至少一個配體結合域之間的相互作用是高度特異的，並誘導所述報導基因表達的改變，所述改變產生鑑定所述配體標記物存在的可檢測信號；和(b)固定所述細胞的固相支持物。
52.根據權利要求51的組合物，其中所述支持物選自微量比色池、微膠囊、微量滴定板、小珠和生物晶片。
53.根據權利要求51的組合物，其中所述一種或多種細胞是凍幹的。
全文摘要
鑑定產品的方法,其包括步驟:(1)使該產品與配體標記物聯接;和(2)作為鑑定該產品的一種手段在其後的時間點通過該產品與檢測組合物接觸,檢測該產品中的配體標記物。該檢測組合物含有編碼一個或多個天然或合成的配體依賴性轉錄因子的一個或多個第一核苷酸序列,其中所述因子含有至少一個配體結合域、至少一個DNA結合域和至少一個反式激活域;和編碼處於受體效應元件或者修飾或合成的效應元件,及第二啟動子的調節控制之下的報導基因的第二核苷酸序列。該檢測組合物、含有該第一和第二核苷酸序列的細胞系、採用它們的試劑盒、及用該特異配體標記物標記的產品在此方法中均是有用的。
文檔編號C12Q1/02GK1350062SQ01135800
公開日2002年5月22日 申請日期2001年10月17日 優先權日2000年10月17日
發明者B·溫斯坦, L·H·凱勒, S·R·帕裡 申請人:羅姆和哈斯公司