判斷重性抑鬱症發病易感性的方法

2023-12-09 09:01:46 1

專利名稱：：判斷重性抑鬱症發病易感性的方法
技術領域：
：本發明屬於基因環境交互作用與疾病易感性之間的關聯分析領域，具體涉及一種通過檢測NET基因和負性生活事件的聯合作用來判斷重性抑鬱症發病易感性的方法。
背景技術：
：重性抑鬱症(MajorDepression,MD)是人類最常見的精神障礙之一，其終生患病率在美國為16.2%，中國為15%。它不僅影響著個體的身心健康、社會功能，而且有很高的自殺風險，約2/3的抑鬱症患者曾有自殺觀念和行為，其中10%15%自殺成功。不僅如此，重性抑鬱症的復發率也很高，並隨患病次數的增加呈上升趨勢。然而，現有的抗抑鬱藥臨床有效率僅為60%70%。晚近WHO資料顯示抑鬱症的疾病負擔逐年升高，在全球疾病負擔中1990年列第5位，預計到2020年將上升至第2位。可見，抑鬱症是導致世界範圍內勞動能力嚴重喪失的主要疾病之一，而且在未來的數十年內將帶來更大的健康、社會和經濟問題。因此，確定抑鬱症的病因，建立有效的防治方法，已成為醫學界乃至整個社會需迫切解決的問題。目前，抑鬱症的發病機制仍不十分清楚，普遍認為MD是遺傳與環境因素共同作用所致的一種多基因遺傳病。就遺傳因素而言，家系、雙生子和寄養子研究調査均證明MD具有明顯的遺傳傾向。就環境因素而言，生活事件是MD的誘發因素，尤其是負性生活事件，與抑鬱的類型、復燃或復發有關。已有多項研究發現基因與應激性生活事件存在有明確的交互作用。去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)作為一種重要的單胺類神經遞質，多項證據表明其與MD發病密切相關，抑鬱症患者體內NE水平發生改變。而且去甲腎上腺素轉運體(norepinephrinetransporter,NET)基因與目前廣泛使用的選擇性去甲腎上腺素再攝取抑制劑(selectivenoradrenalinreuptakeinhibitor,NRI)、選擇性5-羥色胺/去甲腎上腺素再攝取抑制劑(serotoninnoradrenalinreuptakeinhibitors,SNRI)類抗抑鬱藥物(如瑞波西汀、文拉法新)臨床療效相關聯，在抑鬱症的病理生理和藥物治療上起著非常重要的作用，是抑鬱症研究的重點候選基因之一。NET屬於Na+和Cl—依賴性轉運蛋白家族，分子中包含12個跨膜區段，其基因位於16q12.2，長度約45kb，由14個外顯子組成，編碼617個胺基酸。目前國外關於NET基因多態性的研究主要集中在啟動子區SNPrs2242446(T-182C多態性)和第9外顯子區SNPrs5569(G1287A多態性)。其中SNPrs2242446位於NET基因啟動子區上遊182bp處，此區域可能包含一些順式反應原件，能參與調控基因的轉錄和翻譯過程，其T—C突變可能引起DNA結構的改變從而影響NET基因啟動子的轉錄活性；SNPrs5569位於NET基因第9外顯子區，其G—A突變是一個同義突變，所致的編碼序列改變雖不影響其所翻譯的蛋白質的胺基酸序列，但也可能影響蛋白質的功能改變；與其它遺傳標記相比其雜合度較高，更具有代表性。一些研究結果表明NET基因與抑鬱症的發病可能相關，但也有人得出相反的結論。究其原因可能有很多，但其中最重要的一點就是未充分考慮環境因素對其發病的影響。負性生活事件作為一個重要的環境因素，亦有多項研究表明它與抑鬱症的發生密切相關。人體研究以及動物實驗研究均表明某些易感個體在遭受一定的生活事件的刺激時更容易罹患抑鬱症。經對現有技術的國內外文獻檢索，至今未見有NET基因、負性生活事件的聯合作用與抑鬱症相關聯的研究報導。
發明內容本發明為了解決現有技術中存在的單純檢測NET基因或者單純評定負性生活事件尚不能準確判斷重性抑鬱症發病易感性的問題，提供了一種判斷重性抑鬱症發病易感性的方法。本發明是由以下方案實現的，一種判斷重性抑鬱症發病易感性的方法，首先進行常規酚-氯仿法抽提研究對象外周血白細胞DNA，採用聚合酶鏈式反應(Polymerasechainreaction,PCR)及DNA直接測序技術對NET基因SNPsrs2242446和rs5569進行檢測，確定待測人群基因型及等位基因，然後結合生活事件量表評估進行易感人群的篩查與判斷，發現攜帶有NET基因rs2242446多態性鹼基為C、rs5569多態性鹼基為A的個體在遭受一定的生活事件的刺激時更容易罹患抑鬱症。本發明以中國北方地區388例漢族重性抑鬱症患者和388名正常對照為研究對象。所有患者均在統一指導語下，以美國哈佛大學研製的遺傳學研究用診斷檢查表(DiagnosticInvestigationGenetScale,DIGS)為工具，由2名經過嚴格培訓具有豐富臨床經驗的精神科醫師統一按照美國精神障礙診斷與統計手冊第4版(DiagnosticandStatisticalManualofMentalDisorders,FourthEdition,DSM-IV)重性抑鬱症的診斷標準篩選入組對象。所有對照均來自同地區的健康獻血者，無明顯精神、軀體疾病及陽性精神疾病家族史，且無血緣關係。對病例組和對照組兩組人群進行生活事件環境因素的評定，所用量表為楊德森編制的生活事件量表(Lifeeventsscale,LES)。以負性生活事件分為評定指標，以32為界分為輕度生活事件組和嚴重生活事件組。本發明通過NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih,gov/mapviewer)資料庫，獲f導NET基因序列。通過http:〃www.ncbi.nlm,nih.gov/SNP及http:〃snp.cshl.org/資料庫，在NET基因上選擇單核苷酸多態性SNPsrs2242446和rs5569。常規酚-氯仿法抽提研究對象外周血白細胞DNA。採用聚合酶鏈式反應(Polymerasechainreaction,PCR)對NET基因SNPsrs2242446和rs5569進行擴增。引物設計通過引物設計軟體primer5.0進行，將通過軟體設計得到的多對引物輸入到美國國立圖書館資料庫的BLAST中(網址www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行引物的同源性比較，選出同源性最小而Tm值合適的引物確定為PCR反應引物。依據相應的鹼基序列合成引物。SNPrs2242446為正向引物5，-CTGTGGCTGTTGAAGTGTCGC-3，，反向引物GGCTCTGCTTGGATAAAGGGAAA國3'。SNPrs5569為正向引物5，-GGGTTTTGGTGTTTTACTGCTT國3，，反向引物5，-CTGTGGTGCTGTTGTATTGACG-3，。PCR反應體系為25ul體系，其中含有基因組DNA60ng，200pMdNTPs，正反向引物各0.2nM，10xPCRbuffer2.5pL，lnL(10mmol/L),2UTaqDNA聚合酶。PCR條件94'C預變性5min;9fC變性30s，63°C、59'C退火30s，72。C延伸30s，35個循環；最末72'C延伸10分鐘，PCR產物4匸保存。最後使用美國ABIPRISM3700DNA自動測序儀，利用雙脫氧核苷酸末端終止法進行PCR產物的序列分析。應用社會科學統計軟體包11.5(StatisticalPackageforSocialScience,SPSS11.5)進行數據統計。應用擬和優度/檢驗(Goodness-of-fitchi-squaretest)分析基因型頻率的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，基因型及等位基因頻率分布比較採用f檢驗。採用UNPHASED軟體進行單倍體分析。採用非參數分析方法即多因子降維法(MultifactorDimensionalityReduction,MDR)進行基因與基因、基因與環境之間的關聯分析。%2檢驗顯示兩組間SNPrs2242446的基因型分布及等位基因頻率有顯著性差異(/=6.865，/M).034;/=6.458，屍=0.011)(表1)。患者組CC基因型(10.6%)以及C等位基因頻率(33.0%)均高於對照組，提示C等位基因可能增加MD的發病風險。未發現SNPrs5569與抑鬱相關(表2)。引入環境因素負性生活事件，MDR結果發現負性生活事件與NET基因的聯合作用與MD有關(表3):NegativeLES隱誦rs2242446(CV是IO，PE是35.26%);NegativeLES—rs2242446—rs5569(CV是IO，PE是34.87%)。進一步進行NET基因SNPsrs2242446、rs5569和NegativeLES交互作用的相對危險度分析(表4)，結果顯示以T、G等位基因和ModerateNegativeLES(MN)作參照，逐步引入C、A等位基因以及SevereNegativeLES(MN)等變量，其OR值呈梯度增加，OR值由1.172驟升為7.388，提示NET基因與負性生活事件的聯合作用可進一步增加MD的發病風險。表1兩組間rs2242446多態性的等位基因頻率及基因型分布比較tableseeoriginaldocumentpage7*P<0.05表2兩組間rs5569多態性的等位基因頻率及基因型分布比較tableseeoriginaldocumentpage8表3MDR分析結果tableseeoriginaldocumentpage8表4NET基因與負性生活事件聯合作用的相對危險度分析tableseeoriginaldocumentpage8MN-輕度負性生活事件，SN-重度負性生活事件本發明所述的方法，通過NET基因SNPsrs2242446和rs5569多態性檢測和負性生活事件評估可進行抑鬱症易感人群的篩查。可以判斷攜帶有NET基因rs2242446多態性鹼基為C、rs5569多態性鹼基為A的個體為抑鬱症的易感人群。對抑鬱症易感人群在日常生活中應儘量減少負性生活事件刺激等誘發因素，從而有效降低抑鬱症的發病率，有利於疾病的預防、早期診斷和預防，這是本發明的一個重要用途。表5構建好的MDR資料庫tableseeoriginaldocumentpage9具體實施方式實施例11.1研究對象研究對象包括2004年5月至2007年3月山西醫科大學第一醫院精神衛生科門診重性抑鬱症(MD)患者以及同期健康志願者。病例組共入組403例，排除掉無rs2242446基因多態性分子生物實驗結果10例，無rs5569基因多態性實驗結果5例，最終388例納入研究。其中男性185例，女性203例，年齡1663歲，平均(32.26±12.20)歲，均為漢族。所有患者在統一指導語下，以美國哈佛大學研製的遺傳學研究用診斷檢查表(DiagnosticInvestigationGenetScale,DIGS)為工具，由2名經過嚴格培訓具有豐富臨床經驗的精神科醫師統一按照美國精神障礙診斷與統計手冊第4版(DSM-IV)重性抑鬱症的診斷標準篩選入組對象。入組患者均詳細登記疾病史、住院史及臨床用藥史，排除任何遺傳性疾病、嚴重軀體性疾病和其它精神障礙。對照組共入組395例，排除掉無rs2242446基因多態性分子生物實驗結果5例，無rs5569基因多態性實驗結果2例，最終388例納入研究。其中男性176例，女性212例，年齡1664歲，平均(30.35±12.57)歲，均為漢族。所有對照均來自同地區的健康獻血者，無明顯精神、軀體疾病及陽性精神疾病家族史，且無血緣關係。所有研究對象均自願參加本次研究並籤署知情同意書。1.2生活事件評定對病例組和對照組兩組人群進行生活事件社會心理因素的評定，所用量表為楊德森編制的生活事件量表(Lifeeventsscale,LES)。以負性生活事件分為評定指標，以中位數32為界分為輕度生活事件組和嚴重生活事件組。LES:該量表對個體的精神剌激評定不使用常模標準化計分，而是做分層化或個體化處理，是國內唯一一個分別評估正性、負性生活事件影響作用的生活事件量表。在國內臨床和研究中已得到廣泛的應用，是目前國內公認的生活事件評估工具。該量表由患者自行答題完成，包括家庭生活、工作學習、社交及其它三方面的問題，由填寫者根據自身的實際感受而不是按常理或倫理道德觀念去判斷那些經歷過的事對本人來說是好事或是壞事？影響程度如何？影響持續的時間有多久？由評定人員計算正性事件刺激量、負性事件刺激量、生活事件總刺激量、家庭事件刺激量、工作學習事件刺激量和社交事件剌激量。生活事件刺激量的計算方法-某事件剌激量=該事件影響程度分X該事件持續時間分X該事件發生次數正性生活事件刺激量二全部好事刺激量之和負性生活事件剌激量=全部壞事刺激量之和1.3基因分型常規酚-氯仿法抽提研究對象外周血白細胞DNA。採用聚合酶鏈式反應(Polymerasechainreaction,PCR)對NET基因SNPsrs2242446和rs5569多態性進行擴增。引物設計通過引物設計軟體primer5.0進行，將通過軟體設計得到的多對引物輸入到美國國立圖書館資料庫的BLAST中進行引物的同源性比較，選出同源性最小而Tm值合適的引物確定為PCR反應引物。聚合酶鏈反應(PCR)條件及產物分析①含有rs2242446多態性片段的擴增，上遊引物為5，-CTGTGGCTGTTGAAGTGTCGC-3，，下遊引物為GGCTCTGCTTGGATAAAGGGAAA-3'。PCR反應體系為25ul體系，其中含有基因組DNA60ng，200pMdNTPs，上下遊引物各0.2pM，10xPCRbuffer2.5pL，ljaL(10mmol/L)，2UTaqDNA聚合酶。PCR條件為94。C預變性5min;94""C變性30s，63。C退火30s，72。C延伸30s，35個循環；最末72。C延伸10分鐘，PCR產物4。C保存。②含有rs5569多態性片段的擴增，上遊引物為5'-GGGTTTTGGTGTTTTACTGCTT-3，，下遊弓|物為5，-CTGTGGTGCTGTTGTATTGACG-3'。PCR反應體系為25ul體系，其中含有基因組DNA60ng，200pMdNTPs，上下遊引物各0.2pM，10xPCRbuffer2.5pL，l|iL(10mmol/L)，2UTaqDNA聚合酶。PCR條件94。C預變性5min;94。C變性30s，59。C退火30s，72。C延伸30s，35個循環；最末72。C延伸IO分鐘，PCR產物4"保存。最後使用美國ABIPRISM3700DNA自動測序儀，利用雙脫氧核苷酸末端終止法進行PCR產物的序列分析。1.4數據處理應用社會禾鬥學統計軟體包11.5(StatisticalPackageforSocialScience,SPSS11.5)進行數據統計。應用擬和優度/檢驗(Goodness-of-fitchi-squaretest)分析基因型頻率的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，基因型及等位基因頻率用構成比(％)表示，基因型及等位基因頻率分布比較採用f檢驗，顯著性水平為P0.05。採用UNPHASED軟體進行單倍型分析。採用非參數分析方法即多因子降維法(MultifactorDimensionalityReduction,MDR)進行基因與基因、基因與環境之間的關聯分析。MDR採用數據降維的策略，以解決在有限的樣本量條件下，分析高維數據之間交互作用的問題。它可以將多個因素的相互作用有效地分成高危險和低危險因素兩類，用crossvalidation對模型進行一致性評估和錯誤預測，對於一致性高而錯誤預測低的模型進行pemmtatkm檢驗，估計顯著性水平。數據結果輸出主要用兩個參數來選取最佳模型檢驗樣本的錯誤預測概率值(PE)和交叉驗證一致性(CV)，PE越小、CV越大說明模型越好。權利要求1、一種判斷重性抑鬱症發病易感性的方法，其特徵在於首先進行常規酚-氯仿法抽提研究對象外周血白細胞DNA，採用聚合酶鏈式反應及DNA直接測序技術對NET基因SNPsrs2242446和rs5569多態性進行檢測，確定待測人群基因型及等位基因，然後結合生活事件量表評估進行易感人群的篩查與判斷，發現攜帶有NET基因rs2242446多態性鹼基為C、rs5569多態性鹼基為A的個體在遭受一定的生活事件的刺激時更容易罹患抑鬱症。2、根據權利要求1所述的判斷重性抑鬱症發病易感性的方法，其特徵在於聚合酶鏈式反應中包括特異性擴增NET基因單核苷酸多態性rs2242446和rs5569的引物兩組。①含有rs2242446多態性片段的擴增，上遊引物為5，-CTGTGGCTGTTGAAGTGTCGC-3，，下遊引物為GGCTCTGCTTGGATAAAGGGAAA-3'，②含有rs5569多態性片段的擴增，上遊引物為5'-GGGTTTTGGTGTTTTACTGCTT-3，，下遊引物為5，-CTGTGGTGCTGTTGTATTGACG-3，。全文摘要本發明屬於基因環境交互作用與疾病易感性之間的關聯分析領域，具體涉及一種通過檢測NET基因和負性生活事件的聯合作用來判斷重性抑鬱症發病易感性的方法。解決現有技術中存在的單純檢測NET基因或者單純評定負性生活事件尚不能準確判斷重性抑鬱症發病易感性的問題。首先進行常規酚-氯仿法抽提研究對象外周血白細胞DNA，採用聚合酶鏈式反應及DNA直接測序技術對NET基因SNPsrs2242446和rs5569多態性進行檢測，確定待測人群基因型及等位基因，然後結合生活事件量表評估進行易感人群的篩查與判斷，發現攜帶有NET基因rs2242446多態性鹼基為C、rs5569多態性鹼基為A的個體在遭受一定的生活事件的刺激時更容易罹患抑鬱症。文檔編號C12Q1/68GK101294220SQ20081005523公開日2008年10月29日申請日期2008年6月18日優先權日2008年6月18日發明者寧孫,燕孫,張克讓,彭菊意,勇徐,杜巧榮,紅楊,段慧君,王彥芳申請人:山西醫科大學