棉花的一種Myb轉錄因子及其編碼基因與應用的製作方法

2023-12-09 11:14:51

專利名稱：棉花的一種Myb轉錄因子及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域中棉花的一種Myb轉錄因子及其編碼基因與應用。
背景技術：
棉花是一種重要的經濟作物。棉花纖維是由胚珠外珠被上的表皮細胞發育而成的一種單細胞結構表皮毛。由電鏡觀察獲知，胚珠表皮細胞中有大約1/3可以發育為棉纖維，並且這個比例在不同棉花種類之間略有不同。
擬南芥表皮毛是一種特化的單細胞表皮結構，廣泛分布於葉片、莖、蓮座葉、花瓣和根上(Hulskamp et al，1994)。由於這種單細胞表皮毛的發育過程簡單，在植物表面的分布有一定模式，突變體不改變植物發育的其它方面而便於作遺傳分析，因此擬南芥表皮毛的發育過程已成為研究植物細胞命運決定的一種模式系統(Marks，1997)。
GL1是最早克隆到的控制表皮毛啟動的基因。gl-1突變體表現為葉片幾乎沒有表皮毛(Koornneef et al，1982)；γ-輻射可增加野生型擬南芥表皮毛的數目，但對gl1-1卻無效(Nagata et al，1999)，說明GL1是控制擬南芥葉片表皮毛髮育啟動的關鍵基因。gl-1的遺傳背景是擬南芥「Landsberg」生態型(Koornneef et al，1982)，位於擬南芥第四號染色體(Koornneef et al，1983)。GL1編碼一種R2R3類型的MYB蛋白，由228個胺基酸組成，含有3個外顯子和2個內含子(Oppenheimeret al，1991)；3』端存在一段該基因功能發揮必需的增強子序列(Larkin et al，1993)。GL1是表皮毛特異表達的基因，只表達在幼齡的處於發育階段的表皮毛中(Larkin et al，1993)。GL1的過表達會使表皮毛數量減少，表明它對表皮毛的發育啟動還存在負調節作用(Szymanski and Marks，1998)。
擬南芥根毛是發生在根部的另一種單細胞表皮毛。擬南芥根毛的發生是由細胞位置決定的，位於皮層2個細胞之間的表皮細胞即「H型」細胞可發育成為根毛，而僅僅與一個皮層細胞相連的表皮細胞即「N型」細胞，往往只能發育成為非根毛細胞(Dolan et al，1994；Galway et al，1994)。
WER是後來通過遺傳分析發現的控制根毛髮育的MYB基因，它編碼一種R2R3MYB蛋白，與上述擬南芥的另外2個R2R3 MYB蛋白GL1和AtMYB23相似。WER含有3個外顯子和2個內含子，由203個胺基酸殘基組成。Northern結果表明它只在根和下胚軸中表達，而且是只在發育表皮中的「N」類細胞中表達。WER控制著「N」類細胞發育成為非根毛細胞，wer突變體表現為非根毛細胞有90％轉化成了根毛，而野生型則只有5％的類似情況發生；wer突變並不影響葉片表皮毛的發育，也不影響根的結構。
擬南芥中的WER與GL1的序列相似性很高。WER與GL1胺基酸全序列一致性為57％，DNA結合區一致性為91％，編碼區3』端的胺基酸一致性為14/24，涉及與bHLH蛋白相結合的R2重複子的前12個胺基酸的一致性為100％(Lee and Schiefelbein，2001)如此高的序列一致性，意味著它們功能的高度相似性。在WER和GL1的一系列互補實驗中，WER::GL1的植株表型與WER::WER的表型完全相同，GL1::WER的表型也與GL1::GL1的完全相同，表明WER和GL1編碼功能相同的蛋白質，它們在植物發育中不同的生物學作用完全在於啟動子的序列不同(Lee and Schiefelbein，2001)。
棉花纖維的早期發育過程可能類似於擬南芥等植物中表皮毛的形成過程。已經知道，GL1(GLABROUS1)與WER(WEREWOLF)是控制擬南芥表皮毛分化的主要基因之一。那麼，棉纖維作為一種子房胚珠外珠被上的單細胞表皮毛，它的發育啟動機制很可能也受MYB-bHLH-WD40複合體調控機制的控制，而且更類似於擬南芥單細胞表皮毛的發育啟動調節機制。在棉纖維發育早期找尋MYB-bHLH-WD40調控元件的研究是從MYB基因開始的(Loguercio et al，1999)。

發明內容
本發明的目的是提供一種Myb轉錄因子及其編碼基因。
本發明提供的Myb轉錄因子名稱為GhMYB9，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
序列表中序列2胺基酸殘基序列是由234個胺基酸殘基組成的蛋白質。
Myb轉錄因子GhMYB9的編碼基因GhMYB9，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由736個鹼基組成，該基因的讀碼框為自5』端第1到第705位鹼基。該基因與AtMYBGL1及WER高度同源，三者的序列比較如表1所示
表1、GhMYB9與0。GL1和WER序列一致性比較全序列 DNA結合區 R2中前12個胺基酸 編碼區3』端24個胺基酸GhMYB9與WER 52％ 83％10/12 11/24GhMYB9與GL1 50％ 81％9/1210/24WER與GL1 57％ 91％12/12 14/24擴增GhMYB9中任一片段的引物對也在本發明的保護範圍之內，其中，上遊引物和下遊引物之間的距離在50到1000個鹼基之間；該引物對中的每一個引物的長度為15到30個鹼基。
利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的GhMYB9基因導入植物細胞，可獲得纖維數量和性狀得到改變的轉基因細胞系及轉基因植株。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記或具有抗性的抗生素標記物。攜帶有本發明GhMYB9基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導等常規生物技術方法導入植物細胞，被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發明的基因對培育纖維植物新品種，特別是培育棉花新品種具有重要意義。當本發明的基因被用於改變棉花纖維數量、質量性狀時，可採用以下方法1、將本發明基因的反義GhMYB9基因克隆到植物轉化載體中；2、將所構建的植物轉化載體轉化可再生棉花組織(或器官)並使本發明的基因在轉化的組織中表達；3、將被轉化的組織(或器官)培養成植株。
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。


圖1為GhMYB9的Southern分析結果。
圖2為GhMYB9的Northern分析結果。
圖3為GhMYB9的原位雜交分析結果。
具體實施例方式
實施例中所用的植物材料在棉花花期，掛牌觀察開花時間，採集花苞、花蕾、花和幼鈴於冰浴中帶回到實驗室中，用滅菌的器具迅速分別採集花前約5天的子房、花前3天的胚珠、花期胚珠和花後1-3天的胚珠於液氮中速凍，-80℃保存備用。同時，做原位雜交的材料用FAA固定，做掃描電鏡的材料用戊二醛固定。
實施例1、棉花GhMYB9基因的克隆用Plant RNeasy Kit(QIAGEN)提取棉花總RNA，經1％瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性。ss cDNA和ds cDNA的合成按照SMARTTMPCR cDNA Library ConstructionKit(CLONTECH)的方法，合成單鏈(ss)和雙鏈(ds)cDNA。
將合成的雙鏈cDNA稀釋50倍，作為以下PCR反應的模板30μl體系，內含10×PCR Buffer 3μl，2.5mM dNTP mix 2.4μl，5μM的Primer1和Primer2各2.4μl，TAQ enzyme(15U/μl)0.5μl。在PE9600或9700或MJ PCR儀上擴增94℃60s，41℃90s，72℃2min，共計2個循環；94℃60s，55℃90s，72℃2min，共計28個循環。引物為簡併引物，參考Romero et al(1998)的方法設計。5』端的引物1共有6條，分別為Y1935』cgg aat tc(a/g/t)(g/t)(a/g/t/c)a a(a/g)a g(c/t)t g(c/t)ag 3』；Y1945』cgg aat tc(a/g/t)(g/t)(a/g/t/c)a a(a/g)a g(c/t)t g(c/t)cg 3』；Y1955』cgg aattc(a/g/t)(g/t)(a/g/t/c)aa(a/g)tc(a/g/t/c)tg(c/t)ag 3』；Y1965』cgg aattc(a/g/t)(g/t)(a/g/t/c)aa(a/g)tc(a/g/t/c)tg(c/t)cg 3』；Y1975』ccc ggg tg(c/t)gg(a/g/t/c)aa(a/g)tc(a/g/t/c)tg 3』；Y1985』gga att ctg(c/t)gg(a/t/c/g)aa(a/g)ag(t/c)tg 3』。
3』端的引物2共有3條，分別為Y1995』cgg aat tct t(a/g/t/c)a(c/t)(a/g/t/c)g c(a/g)t t(a/g)tc(a/g/c/t)g 3』；Y2005』cgg att tct t(a/g/t)at(c/t)t c(a/g)t t(a/g)t c(a/t/c/g)g t 3』；Y2015』ccg aat tct t(a/g/c/t)a(c/t)(a/g/t/c)t(t/g)(a/g)t t(a/g)tc(a/g/t/c)g t 3』。
共計引物組合18對。
將獲得的PCR產物混合，作1％瓊脂糖凝膠電泳，切取約140bp的目的片段，用Wizard PCR Preps DNA Purification System純化。然後克隆到pBluescript-T載體上，轉化到E.coli DH5α感受態細胞中。經藍白篩選，用載體上的引物RP和UP擴增片段挑選陽性克隆，提取質粒，用Beckman CEQ2000進行測序。將所得序列作BLAST分析，得出其中MYB9片段與擬南芥WER基因及GL1基因高度同源。
以ds cDNA為模板，用MYB9片段的5』特異引物Y2255』TGA ATT ACC TGA GTCCTA ACG，和SMARTTMPCR cDNA Library Construction Kit提供的3』引物CDS III/3』PCR Primer以及用MYB9片段的3』特異引物Y2335』TGG CTG CCT CAT CAA CAT GAC，和Kit提供的5』引物5』PCR Primer組合，分別作PCR反應，30μl體系(同上)，PCR程序如下94℃1min，58℃1min，72℃1min，共計35個循環。1％瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，挑選最大分子量的條帶，LMP瓊脂糖凝膠電泳分離，用WizardPCR Preps DNA Purification System Kit(PROMEGA)純化。再經基因特異的嵌套式PCR擴增驗證目標PCR產物，然後測序，得到MYB9的全長核苷酸序列，並將其命名為GhMYB9。
實施例2、GhMYB9的Southern分析棉花基因組DNA的提取按Paterson et al(1993)的方法進行。取20μg基因組DNA，分別用BamHI、EcoRI和HindIII(Takara產品)酶切。酶切產物經0.7％瓊脂糖凝膠電泳(30-50V，O/N)分離，然後用常規方法在搖床上處理電泳膠經0.125N HCl浸洗15min，變性液(1.5M NaCl，0.5N NaOH)浸洗30min，中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH7.2)浸洗30min。最後用20×SSC將DNA印跡到HybondN+尼龍膜上。
預雜交、雜交均按常規方法進行(金冬燕等，1996；Hybond N+mannual，Amersham)。
探針標記用Promega公司的Primer-a-Gene試劑盒進行，標記過夜。雜交前用Qiagen公司的PCR Purification試劑盒進行探針純化。
洗膜用高嚴緊方法進行(Hybond N+mannual，Amersham)2×SSC，0.1％SDS，15min；1×SSC，0.1％SDS，65℃，15min；2×SSC，0.1％SDS，65℃，15min。
保鮮膜包裹雜交膜，-70℃下對X光片曝光。
結果如圖1所示，從圖中可以看出，該基因在BamHI的酶切泳道中雜交到一條約6.5kb和一條5kb的條帶；在HindIII的酶切泳道中雜交到一條約1.9kb和一條約1.0kb的條帶；在EcoRI的酶切泳道中雜交到一條8kb和一條5kb的條帶。可以確定，GhMYB9來自於棉花基因組，在棉花基因組中以單拷貝的形式存在。
實施例3、GhMYB9的表達分析1、Northern雜交以徐州142和徐州142無絮2個品種為材料，如實施例1分別提取棉花-5DPA子房(花前5天，DPA代表Days Post Anthesis)，-3DPA(花前3天)胚珠，0DPA(花期)胚珠和3DPA(花後3天)胚珠中的總RNA。經1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性後，用紫外分光光度計和電泳方法相結合作精確定量。調整各樣品上樣量均為15μg，然後進行1.2％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳。
甲醛變性膠的製作1.2％FA凝膠150ml是由1.5g瓊脂糖加15ml 10×FA凝膠緩衝液配置，在微波爐中熔化後，65℃水浴中冷卻，再加2.7ml 37％的甲醛原液製成的。電泳前須在1×FA緩衝液中平衡至少30min。1×FA緩衝液600ml的配方為50ml 10×FA緩衝液、10ml 37％甲醛原液和440ml DEPC處理的SDW。上樣時，每4份RNA樣品加1份5×RNA上樣緩衝液，混勻後65℃水浴中加熱3-5min，冰浴冷卻。5×RNA上樣緩衝液10ml中內含16μl飽和溴酚藍溶液、80μl 500mM EDTA pH8.0、720μl 37％甲醛原液、2ml甘油、3084μl甲醯胺和4ml 10×FA緩衝液。
電泳結束後，切下分子標記泳道用EB染色，旁邊放一螢光尺精確指示位置。樣品部分的膠用DEPC處理的SDW搖床上浸洗30min，再用DEPC處理的10×SSC浸洗30min。然後將RNA用DEPC處理的20×SSC轉至Hybond N+膜上，膜經預雜交，放射性探針雜交，高嚴緊性洗膜後，於-70℃下對X光片曝光。
結果如圖2所示，其中1-5 DPA子房；2-3 DPA胚珠；30 DPA胚珠；43 DPA胚珠。從圖中可以看出，在花前5天的幼小子房、花前3天的胚珠、花期胚珠和花後胚珠的組織中都雜交到了大約1.3kb的條帶，它代表了GhMYB9的cDNA全長大小，包括編碼區和5』及3』可能的非編碼區域在內。雖然2個品種4個組織中都有GhMYB9的表達信號，但可以發現在2個品種的花前3天胚珠中都高表達，隨著棉纖維的發育，徐州142無絮胚珠表面不長棉纖維，該基因的表達逐漸降低，而徐州142中胚珠表面棉纖維增多，該基因表達也逐漸增強，到花後3天達到最強。說明這是一個在棉纖維發育啟動時期高表達，而且隨著棉纖維的發育進程表達加強的基因。由此推測，GhMYB9很可能是一個與棉纖維發育高相關程度的調控基因2、組織原位雜交1)包埋材料固定取花前5天的子房、花前3天和花期、花後1-2天的胚珠，放入有固定液FAA(50％乙醇，10％甲醛，5％冰乙酸)的小瓶中，真空抽氣3小時，使固定液完全滲入到材料中，換固定液，室溫放置過夜。
脫水材料經下列乙醇梯度系列脫水30％乙醇30min，50％乙醇30min，70％乙醇30min，85％乙醇30min，90％乙醇30min，100％乙醇1小時，100％乙醇1小時，100％乙醇1小時。
透明材料經過下列二甲苯梯度透明25％二甲苯+75％乙醇1小時，50％二甲苯+50％乙醇1小時，75％二甲苯+25％乙醇1小時，二甲苯1小時，二甲苯1小時，二甲苯1小時，室溫放置過夜。
包埋將58-60℃融化的石蠟(Sigma，)緩慢倒入浸有材料的二甲苯溶液中，石蠟和二甲苯的比例為1∶1，室溫放置過夜，42℃放置1天，58-60℃放置2天，期間換3-4次石蠟，最後將材料和石蠟一起倒入小濾紙盒中，冷水中速凝，完全凝固後放4℃保存。
2)切片和展片切片將蠟塊修成小梯形塊，用Leica全自動切片機將材料切成連續的蠟帶，切片厚度為6μm。
展片用毛筆和解剖針將蠟帶按切割順序放到蠟光紙上，選取不同位置的蠟片，在光學顯微鏡下做鏡檢，確定含有合適材料的蠟帶。然後，輕輕地將蠟帶正面向上放在滴有RNase-free Water的載玻片上。該載玻片為Sigma公司的Lysine-coated載玻片。接著將載玻片放在45℃燙板上展片5min。待蠟帶透明後，小心將玻片傾斜，用滅菌濾紙條將多餘的水分吸乾淨。42℃展片24-48小時。
3)切片脫蠟和脫水脫蠟所有器皿185℃烘烤3-4小時，所有溶液均用DEPC水配製。展片後的材料進行脫蠟處理二甲苯20min，二甲苯20min，50％二甲苯+50％乙醇20min，100％乙醇5min，100％乙醇5min，90％乙醇5min，70％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，DEPC處理水5min，DEPC處理水5min，DEPC處理水5min。
蛋白酶K消化37℃預熱蛋白酶K Buffer(0.1M Tris-HCl pH7.5，0.05M EDTA)後加入蛋白酶K至終濃度1-5μg/ml，37℃處理切片30min後，RNase-free Water洗3次。
脫水2×SSC，5min；2×SSC，5min；30％乙醇5min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，90％乙醇3min，100％乙醇3min，100％乙醇3min。室溫下乾燥後，片子可直接用於雜交或保存於-20℃。
3)探針的製備用Y283和Y285為引物擴增出一段651bp的PCR產物。PCR產物純化後克隆到pBlueScriptII KS載體中，挑選陽性質粒。用UP、RP、Y2835』ATA ACA TAG TCT CTAGCT AAG ATG，和Y2855』ATG GCC GGG GAT ACA AAA AGG GA，的引物組合鑑定插入方向。質粒提取後，分別用HindIII和EcoRI酶切，酶切產物用酚氯仿抽提一次，氯仿抽提兩次，乙醇沉澱後，沉澱溶解於RNase free SDW中，一般濃度為300-400ng/μl。取1-2μg量進行探針標記。按DIG RNA Labeling Kit上敘述的方法進行。最後，轉錄後的探針溶於50μl RNase free SDW中。半定量檢測探針標記效率和濃度。一般濃度為100-400ng/μl。
4)雜交每張片子大約用100-150μl雜交液，雜交液由A和B組成。比例為200μl雜交液由154.4μl雜交液A加45.6μl雜交液B組成。
雜交液A(7.72ml)5000μl甲醛，1000μl 50％葡聚糖，1000μl 10×blocking reagent，600μl 5M NaCl，100μl 1M Tris-HCl pH7.5，20μl 500mMEDTA pH7.5。雜交液B(現用現配，45.6μl)5μl 20μg/μl poly A；3μl 10mg/ml tRNA；37.6μl探針和RNase free SDW。雜交液B在80℃加熱5分鐘變性探針，立即置於冰上。雜交液A和B混合後，探針終濃度為100-400ng/ml。在大培養皿中放入0.3M NaCl-50％甲醯胺溶液形成溼室，將需要雜交的片子放在溼室中42℃雜交過夜。
5)洗片洗片4×SSC，5min；4×SSC，5min；4×SSC，5min(均在室溫下進行)。
RNase處理37℃RNase buffer(500mM NaCl，1mM EDTA，10mM Tris-HClpH7.5)加RNase A至終濃度25μg/ml，放入切片37℃保溫30min。RNase buffer37℃洗三次，每次15分鐘。在800ml 2×SSC溶液中輕微攪拌洗片，室溫30分鐘，重複一次。
6)顯色1×PBT(1％Tween20，8mM Na2HPO4，2mM NaH2PO4，0.13M NaCl，3mM KCl pH7.5)中洗5分鐘。0.5％Blocking reagent(用1×PBT配製)中洗60分鐘。1×PBT中洗5分鐘。加入anti-Dig-AP，室溫放置60分鐘。(2.75u/ml抗體溶液300μl 1×PBT，30μl 10mg/ml BSA，1μl anti-Dig-AP)。1×PBT中洗兩次，每次20分鐘。1×TNM50中洗5分鐘(TNM50 buffer100mM Tris-HCl pH9.5，100mM NaCl，50mM MgCl2)。顯色黑暗中顯色30分鐘-12小時(顯色buffer600μl TNM50，12μl NBT/BCIP貯液)。脫水，封片，鏡檢並拍照。
實施例5、轉化在基因的5』和3』端分別設計含SacI和XbaI酶切位點的引物，以GhMyb9基因的cDNA為模板，進行PCR擴增。引物為GhMyb9正義
Y285Xba5』ATA TCT AGA ATG GCC GGG GAT ACA AAA AGGY283Sac3』ATA GAG CTC TAA CAT AGT CTC TAG CTA AGGhMyb9反義Y284Xba3』TAT TCT AGA CCC GAA TCT AAT AAC ATA GTCY285Sac5』ATA GAG CTC ATG GCC GGG GAT ACA AAA AGG將擴增產物用Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)純化後，用SacI和XbaI雙酶切，酚/氯仿抽提後，乙醇沉澱，溶於少量SDW中。提取pBI121質粒，也用SacI和XbaI雙酶切，跑電泳後割膠純化分子量大的載體帶(Wizard PCRPreps DNA Purification System)。用T4連接酶做連接反應分別連接正反義基因片段與載體，熱激轉化大腸桿菌DH5α。在大腸桿菌內鑑定連接正確後再將構建的質粒轉入農桿菌GV3101中。用真空滲透法轉化擬南芥。得到轉基因植株。
序列表16022101211736212DNA213棉屬陸地棉種(Gossypium hirsutum)4001atgctcccgg ccgccatggc ggccgcggga attcgattat ggccggggat acaagaaagg 60gattatggcc ggggatacaa aaagggatta tgggcaatgg aggaagacaa gttactcatt120gattatgtca atgtccatgg aaaaggacaa tggaacaaaa tagccaacag aacaggtttg180aagagaagtg ggaaaagttg tcggctaagg tggatgaatt acctgagtcc taacgttaaa240aagggtgatt tttctgaaga agaagaagac ctcgtcatta gacttcataa gcttcttgga300aacaggtggt ctttgattgc gaaacgagtt ccaggtcgaa ctgacaatca agtcaagaat360tactggaata gtcatttgag gaagaaacta gggatcattg atcaaaacaa gacaaggatc420gatttttgtc aaagttcaaa gcaagtcaaa gtgtgtcatg ttgatgaggc agccacggat480ccaagtcctg gacatggaac aaccactgaa accacgggta taacagtgga tcagagtaac540cagcaggaag tcattgatca tcgggtctta aacaatacta ctcaagaatc aatgaccagt600gagagttata tcaacacttt ctggattcct gaccatgatt atgagctaag tacacttgcc660atgattgacc acttccatga atgttcttct tttcatctta gctagagact atgttagacg720gctcccaaat attcaa7362102211234212PRT213棉屬陸地棉種(Gossypium hirsutum)4002Met Leu Pro Ala Ala Met Ala Ala Ala Gly Ile Arg Leu Trp Pro1 5 10 15Gly Ile Gln Glu Arg Asp Tyr Gly Arg Gly Tyr Lys Lys Gly Leu20 25 30Trp Ala Met Glu Glu Asp Lys Leu Leu Ile Asp Tyr Val Asn Val35 40 45
His Gly Lys Gly Gln Trp Asn Lys Ile Ala Asn Arg-Thr Gly Leu50 55 60Lys Arg Ser Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu65 70 75Ser Pro Asn Val Lys Lys Gly Asp Phe Ser Glu Glu Glu Glu Asp80 85 90Leu Val Ile Arg Leu His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu95 100 105Ile Ala Lys Arg Val Pro Gly Arg Thr Asp Asn Gln Val Lys Asn110 115 120Tyr Trp Asn Ser His Leu Arg Lys Lys Leu Gly Ile Ile Asp Gln125 130 135Asn Lys Thr Arg Ile Asp Phe Cys Gln Ser Ser Lys Gln Val Lys140 145 150Val Cys His Val Asp Glu Ala Ala Thr Asp Pro Ser Pro Gly His155 160 165Gly Thr Thr Thr Glu Thr Thr Gly Ile Thr Val Asp Gln Ser Asn170 175 180Gln Gln Glu Val Ile Asp His Arg Val Leu Asn Asn Thr Thr Gln185 190 195Glu Ser Met Thr Ser Glu Ser Tyr Ile Asn Thr Phe Trp Ile Pro200 205 210Asp His Asp Tyr Glu Leu Ser Thr Leu Ala Met Ile Asp His Phe215 220 225His Glu Cys Ser Ser Phe His Leu Ser230 23權利要求
1.Myb轉錄因子GhMYB9，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的轉錄因子，其特徵在於它是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質。
3.Myb轉錄因子GhMYB9的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
4.根據權利要求3所述的基因，其特徵在於所述Myb轉錄因子GhMYB9的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根據權利要求4所述的基因，其特徵在於該基因的讀碼框為自5』端第1到第705位鹼基。
6.擴增權利要求4中任一片段的引物對，其中，上遊引物和下遊引物之間的距離在50到1000個鹼基之間；該引物對中的每一個引物的長度為15到30個鹼基。
7.含有權利要求4所述基因的表達載體。
8.含有權利要求4所述基因的細胞系。
9.權利要求2所述基因在培育纖維植物新品種中的應用。
10.權利要求2所述基因在培育棉花新品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了棉花的一種Myb轉錄因子及其編碼基因與應用。本發明提供的Myb轉錄因子名稱為GhMYB9，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。Myb轉錄因子GhMYB9的編碼基因GhMYB9，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。本發明的基因對培育纖維植物新品種，特別是培育棉花新品種具有重要意義。
文檔編號A01H1/00GK1491962SQ0214596
公開日2004年4月28日 申請日期2002年10月25日 優先權日2002年10月25日
發明者索金鳳, 梁小娥, 張燕生, 薛勇彪 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所