齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒及其製備和檢測方法
2023-12-09 06:43:36 1
專利名稱：齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒及其製備和檢測方法
技術領域：
本發明涉及檢測齒蘭環斑病毒的試劑盒及其製備和檢測方法，特別是涉及齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒及製備該試劑盒的方法與應用該試劑盒進行齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測的檢測方法。
背景技術：
齒蘭環斑病毒(Odntoglossum ringspot virus，ORSV)屬菸草花葉病毒屬(Tobamovirus)，是危害蘭科植物的兩種主要病毒之一，分布世界各地，主要危害齒蘭、建蘭等。蘭花一旦感染ORSV，其葉片常產生黃化條紋或不規則褪綠色斑塊，病株花部甚至出現畸形或褪色斑，紅色系花朵褪色斑尤為明顯，對蘭花的觀賞價值和經濟價值造成嚴重影響。我國蘭花資源豐富，但研究表明，無論是盆栽的地生蘭花還是組培的蘭花，該病毒病均相當普遍。鑑於ORSV對我國蘭花產業的危害性，研究其檢測技術已十分重要。
植物病毒檢測常用酶聯免疫吸附測定(ELISA)方法，酶免疫分析是將抗原抗體結合的特異性與酶的高效催化性相結合的技術，具有靈敏度高，特異性強等特點，但操作步驟多，耗時長，且需要相對昂貴的酶標抗體和96孔酶標板。
斑點酶聯檢測是以酶免疫吸附分析的原理為基礎近年來迅速發展起來的檢測方法，曾研究報導該方法用於快速檢測羊胴體中的沙門氏菌與常規分離培養檢測比較，不僅簡便，快捷，而且安全、可靠。而目前尚未有關斑點免疫酶聯用於檢測齒蘭環斑病毒的文獻報導以及用於檢測齒蘭環斑病毒的斑點酶聯檢測試劑盒產品。
發明內容
本發明的目的在於提供簡便、快捷、安全、可靠且經濟實用的齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測的試劑盒。
本發明的另一目的，在於提供製備齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒的方法。
本發明的再一目的，在於提供利用製備的齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒進行斑點酶聯檢測齒蘭環斑病毒的檢測方法。
為實現上述目的，本發明的技術解決方案是
齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒，主要由盒體，設在盒體內的各種瓶裝用液和PVDF膜組成。
所述的各種瓶裝用液包括保溫液I 1瓶保溫液II 1瓶顯色緩衝液 1瓶顯色劑 1支陽性樣品 1支陰性樣品 1支樣品處理液 1瓶洗滌緩衝液 1瓶所述的保溫液I為含有齒蘭環斑病毒多克隆抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩衝液，內含1％明膠。
所述的保溫液II為含有羊抗兔酶標抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩衝液，內含1％明膠。
所述的顯色緩衝液為0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl2g/L的Tris緩衝液。
所述的顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP。
所述的陽性樣品為純化的齒蘭環斑病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml範圍；所述的陰性樣品為封閉緩衝溶液研磨健康葉製備的溶液。
所述的樣品處理液為1-5M，pH9.6的碳酸鹽緩衝液。
所述的洗滌緩衝液為0.005-0.05M，pH7.4的磷酸鹽緩衝液。
所述的齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒的製備方法，它主要包括下列步驟1、齒蘭環斑病毒的提取和純化取莧色藜病葉加0.52倍重量(g)體積(ml)的1/15M，pH7.0的PB緩衝液，同時加入1％巰基乙醇和正丁醇、三氯甲烷，在搗碎機中將病葉搗碎，過濾，將濾液分裝於離心管內，6000rmp離心20分鐘，上清液加入4％體積重量的PEG(MW6000)和2％體積重量的NaCL攪拌溶解，4℃過夜；6000rmp離心20分鐘，沉澱加入1％TritonX-100和1/15M PB懸浮攪拌1小時，7000rmp離心20分鐘；取上清，32000rmp·min(Beckman SW40)離心2小時，沉澱用1/15M PB懸浮，5000rmp·min(BeckmanJA-14)離心15分鐘，上清即為粗提提純病毒製劑。此後進行病毒的精提純，將以上粗提純的病毒10％-40％的蔗糖密度梯度柱上，在超速離心機上以30000rmp離心2.5小時，離心結束後將病毒帶取出。
2、抗血清的製備及純化選用雄性白兔作免疫動物，加等量Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，採用三次肌肉注射和兩次靜脈注射免疫家兔。每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，間隔時間為7天，最後一次注射後7-10天採血2次，析出血清用瓊脂雙擴散法測定效價；通過辛酸沉澱法結合DEAE離子交換層析純化抗體。用2倍體積0.1M醋酸銨調節抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時，5000rpm離心30分鐘，取上清，將透析袋置於10mM Tris-Cl pH8.5緩衝液過夜，透析除鹽。取透析完全的溶液上樣於離子交換柱中，用10mMTris-HCl pH8.5緩衝液5ml/min衝洗15分鐘，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5緩衝液濃度梯度進行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮透析，獲得純化的齒蘭環斑病毒多克隆抗體。
3、陽性、陰性樣品的製備陽性樣品為純化的齒蘭環斑病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml範圍；陰性樣品為封閉緩衝溶液研磨健康葉製備的溶液。
4、各種用液的製備保溫液I為含有齒蘭環斑病毒多克隆抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩衝液，內含1％明膠。
保溫液II為含有羊抗兔酶標抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩衝液，內含1％明膠。
顯色緩衝液為0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl 2g/L的Tris緩衝液。
顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP。
樣品處理液為1-5M，pH9.6的碳酸鹽緩衝液。
洗滌緩衝液為0.005-0.05M，pH 7.4的磷酸鹽緩衝液。
所述的齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒的檢測方法為斑點酶聯檢測法，它包括以下步驟1、試劑準備根據檢測的需要，稀釋樣品處理液和洗滌緩衝液，備用；2、樣品處理取待測樣品加入樣品處理液充分研磨，離心取上清液，再稀釋備用；3、點樣取處理後的樣品在PVDF膜上點樣，同時設立陽性對照和陰性對照；4、吸附將PVDF膜置於37℃恆溫箱乾燥0-60min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；5、孵育I取PVDF膜浸泡於保溫液I中，於37℃保溫30-90min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；6、孵育II取PVDF膜浸泡於保溫液II中，於37℃保溫30-90min。取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；7、顯色將洗滌後的PVDF膜取出浸泡於顯色液中，顯色5-10min；
8、檢測判定根據檢測判定標準，判定檢測結果。
採用上述方案後，本發明由盒體，設在盒體內的各種用液、PVDF膜組裝成經濟實用的檢測試劑盒。試劑盒的製備方法簡便、快捷、安全、可靠且經濟實用。樣品用量少，在較短的時間內就可以完成檢測，且結果易於保存，應用該檢測試劑盒進行斑點酶聯聯檢測的方法與其他血清學檢驗方法相比具有簡單、快速、敏感、特異性強等特點，並具有較高的可重複性、經濟實用等更多的優點，且試劑盒使用不需特殊儀器，直接可用肉眼判定結果，所以便於在基層單位推廣應用。
具體實施例方式
本發明所用的主要試劑齒蘭環斑病毒多克隆抗體為廈門華僑亞熱帶植物引種園製備；PEG6000(聚乙二醇6000)、2-巰基乙醇、Triton-100(曲拉通X-100)、牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma公司；羊抗兔酶標抗體、BCIP、NBT、DEAE離子交換填充物、IgG親合層析填充物購自Pierce公司；試驗中所使用的其他常規藥品和試劑均為國產分析純試劑。
一、試劑盒齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒，主要由盒體，設在盒體內的各種瓶裝用液和PVDF膜組成，各種瓶裝用液包括保溫液I 1瓶保溫液II 1瓶顯色緩衝液 1瓶顯色劑 1支陽性樣品 1支陰性樣品 1支樣品處理液 1瓶洗滌緩衝液 1瓶陽性樣品為純化的齒蘭環斑病毒，其濃度為100μg/ml；陰性樣品為封閉緩衝溶液研磨健康葉製備的溶液。
保溫液I為含有齒蘭環斑病毒多克隆抗體0.05M的磷酸鹽緩衝液，內含1％明膠。
保溫液II為含有羊抗兔酶標抗體0.05M的磷酸鹽緩衝液，內含1％明膠。
顯色緩衝液為0.1M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl 2g/L的Tris緩衝液。
顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP。
樣品處理液為2M，pH9.6的碳酸鹽緩衝液。
洗滌緩衝液為0.01M，pH 7.4的磷酸鹽緩衝液。
二、製備方法本發明齒蘭環斑病毒檢測試劑盒的製備方法，它包括下列步驟1、齒蘭環斑病毒的提取和純化取莧色藜病葉加0.52倍重量(g)體積(ml)的1/15M，pH7.0的PB緩衝液，同時加入1％巰基乙醇和正丁醇、三氯甲烷，在搗碎機中將病葉搗碎，過濾，將濾液分裝於離心管內，6000rmp離心20分鐘，上清液加入4％體積重量的PEG(MW6000)和2％體積重量的NaCL攪拌溶解，4℃過夜；6000rmp離心20分鐘，沉澱加入1％TritonX-100和1/15M PB懸浮攪拌1小時，7000rmp離心20分鐘；取上清，32000rmp·min(Beckman SW40)離心2小時，沉澱用1/15M PB懸浮，5000rmp·min(BeckmanJA-14)離心15分鐘，上清即為粗提提純病毒製劑。此後進行病毒的精提純，將以上粗提純的病毒10％-40％的蔗糖密度梯度柱上，在超速離心機上以30000rmp離心2.5小時，離心結束後將病毒帶取出。
2、抗血清的製備及純化選用雄性白兔作免疫動物，加等量Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，採用三次肌肉注射和兩次靜脈注射免疫家兔。每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，間隔時間為7天，最後一次注射後7-10天採血2次，析出血清用瓊脂雙擴散法測定效價；通過辛酸沉澱法結合DEAE離子交換層析純化抗體。用2倍體積0.1M醋酸銨調節抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時，5000rpm離心30分鐘，取上清，將透析袋置於10mM Tris-Cl pH8.5緩衝液過夜，透析除鹽。取透析完全的溶液上樣於離子交換柱中，用10mMTris-HCl pH8.5緩衝液5ml/min衝洗15分鐘，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5緩衝液濃度梯度進行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮透析，獲得純化的齒蘭環斑病毒多克隆抗體。
3、陽性、陰性樣品的製備陽性樣品為純化的齒蘭環斑病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml範圍；陰性樣品為封閉緩衝溶液研磨健康葉製備的溶液。
4、各種用液的製備保溫液I為含有齒蘭環斑病毒多克隆抗體0.05M的磷酸鹽緩衝液，內含1％明膠。
保溫液II為含有羊抗兔酶標抗體0.05M的磷酸鹽緩衝液，內含1％明膠。
顯色緩衝液為0.1M，pH9.5，含MgCl2 10g/L+NaCl 2g/L的Tris緩衝液；顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP；樣品處理液為2M碳酸鹽緩衝液(pH9.6)；
洗滌緩衝液為0.01M，pH 7.4的磷酸鹽緩衝液。
封閉緩衝溶液為20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脫脂奶粉。
三、檢測方法實施例試劑盒的斑點酶聯(DIBA)檢測方法1、試劑準備根據檢測的需要，稀釋樣品處理液和洗滌緩衝液，備用；2、樣品處理取待測樣品0.1g加入1ml樣品處理液充分研磨，離心取上清液，再稀釋備用；3、點樣取1μL處理後的樣品在PVDF膜上點樣，同時設立陽性對照和陰性對照；4、吸附將PVDF膜置於37℃恆溫箱乾燥30min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；5、孵育I取PVDF膜浸泡於保溫液I中，於37℃保溫45min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；6、孵育II取PVDF膜浸泡於保溫液II中，於37℃保溫45min。取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；7、顯色將洗滌後的PVDF膜取出浸泡於顯色液中，顯色5-10min；8、檢測判定根據檢測判定標準，判定檢測結果。
斑點酶聯檢測判定標準在陽性對照顯色、陰性對照不顯色的情況下，樣品檢測帶有斑點的判斷為陽性，否則為陰性。
1)待測樣品按以上標準，定性判斷待測樣品檢測結果的陰、陽性。
為檢驗斑點酶聯檢測試劑盒檢測效果，用該法檢測了40份蘭花樣品，檢測結果如下附表1 檢測結果
注「+」代表陽性；「-」代表陰性31份由RT-PCR檢測陽性的樣品，DIBA檢測陽性樣品30份，1份陰性；9份由RT-PCR檢測陰性的樣品，DIBA檢測陰性樣品份，陽性樣品1份；由檢測結果可知DIBA的敏感性為96.77％；特異性88.89％；檢測準確性為95％。
權利要求
1.齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒，主要由盒體，設在盒體內的各種瓶裝用液和PVDF膜組成，其特徵在於所述的各種瓶裝用液包括保溫液I 1瓶；保溫液II1瓶；顯色緩衝液 1瓶；顯色劑 1支；陽性樣品1支；陰性樣品1支；樣品處理液 1瓶；洗滌緩衝液 1瓶。
2.如權利要求書1所述的齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒，其特徵在於所述的顯色緩衝液為0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl2g/L的Tris緩衝液；所述的顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP；所述的樣品處理液為1-5M，pH9.6的碳酸鹽緩衝液；所述的洗滌緩衝液為0-0.05M，pH7.4的磷酸鹽緩衝液。
3.如權利要求1或2所述的建蘭花葉病毒斑點酶聯檢測試劑盒，其特徵在於所述的保溫液I為含有齒蘭環斑病毒多克隆抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩衝液，內含1％明膠；所述的保溫液II為含有羊抗兔酶標抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩衝液，內含1％明膠；所述的陽性樣品為純化的齒蘭環斑病毒；所述的陰性樣品為封閉緩衝溶液研磨健康葉製備的溶液。
4.如權利要求3所述的齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒，其特徵在於所述的陽性樣品為純化的齒蘭環斑病毒，濃度為0.1μg-100μg/ml。
5.如權利要求1所述的齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於所述的製備方法主要包括下列步驟1)、齒蘭環斑病毒的提取和純化取莧色藜病葉加0.52倍重量(g)體積(ml)的1/15M，pH7.0的PB緩衝液，同時加入1％巰基乙醇和正丁醇、三氯甲烷，在搗碎機中將病葉搗碎，過濾，將濾液分裝於離心管內，6000rmp離心20分鐘，上清液加入4％體積重量的PEG(MW6000)和2％體積重量的NaCL攪拌溶解，4℃過夜；6000rmp離心20分鐘，沉澱加入1％TritonX-100和1/15M PB懸浮攪拌1小時，7000rmp離心20分鐘；取上清，32000rmp·min(Beckman SW40)離心2小時，沉澱用1/15M PB懸浮，5000rmp·min(BeckmanJA-14)離心15分鐘，上清即為粗提提純病毒製劑，此後進行病毒的精提純，將以上粗提純的病毒10％-40％的蔗糖密度梯度柱上，在超速離心機上以30000rmp離心2.5小時，離心結束後將病毒帶取出；2)、抗血清的製備及純化選用雄性白兔作免疫動物，加等量Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，採用三次肌肉注射和兩次靜脈注射免疫家兔，每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，間隔時間為7天，最後一次注射後7-10天採血2次，析出血清用瓊脂雙擴散法測定效價；通過辛酸沉澱法結合DEAE離子交換層析純化抗體，用2倍體積0.1M醋酸銨調節抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時，5000rpm離心30分鐘，取上清，將透析袋置於10mM Tris-Cl pH8.5緩衝液過夜，透析除鹽，取透析完全的溶液上樣於離子交換柱中，用10mMTris-HCl pH8.5緩衝液5ml/min衝洗15分鐘，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5緩衝液濃度梯度進行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮透析，獲得純化的齒蘭環斑病毒多克隆抗體；3)、陽性、陰性樣品的製備陽性樣品為純化的齒蘭環斑病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml範圍；陰性樣品為封閉緩衝溶液研磨健康葉製備的溶液；4)、各種用液的製備所述的保溫液I為含有齒蘭環斑病毒多克隆抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩衝液，內含1％明膠；所述的保溫液II為含有羊抗兔酶標抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩衝液，內含1％明膠；所述的顯色緩衝液為0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl2g/L的Tris緩衝液；所述的顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP；所述的樣品處理液為1-5M，pH9.6的碳酸鹽緩衝液；所述的洗滌緩衝液為0-0.05M，pH7.4的磷酸鹽緩衝液。
6.如權利要求1所述的齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒的檢測方法，其特徵在於，所述的檢測方法為斑點酶聯檢測法，它包括以下步驟1)、試劑準備根據檢測的需要，稀釋樣品處理液和洗滌緩衝液，備用；2)、樣品處理取待測樣品加入樣品處理液充分研磨，離心取上清液，再稀釋備用；3)、點樣取處理後的樣品在PVDF膜上點樣，同時設立陽性對照和陰性對照；4)、吸附將PVDF膜置於37℃恆溫箱乾燥0-60min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；5)、孵育I取PVDF膜浸泡於保溫液I中，於37℃保溫30-90min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；6)、孵育II取PVDF膜浸泡於保溫液II中，於37℃保溫30-90min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；7)、顯色將洗滌後的PVDF膜取出浸泡於顯色液中，顯色5-10min；8)、檢測判定根據檢測判定標準，判定檢測結果。
全文摘要
本發明公開了齒蘭環斑病毒斑點酶聯檢測試劑盒及其製備方法和檢測方法，試劑盒由盒體，設在盒體內的各種用液和PVDF膜組裝成經濟實用的檢測試劑盒。試劑盒的製備方法簡便、快捷、安全、可靠且經濟實用。樣品用量少，在較短的時間內就可以完成檢測，且結果易於保存，應用該檢測試劑盒進行斑點酶聯檢測的方法與其他血清學檢驗方法相比具有簡單、快速、敏感、特異性強等特點，並具有較高的可重複性、經濟實用等更多的優點，所以便於在基層單位推廣應用。
文檔編號G01N33/543GK1975426SQ20061016443
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月8日 優先權日2006年2月10日
發明者明豔林, 鄭國華, 童慶宣, 李梅, 陳良華 申請人:廈門華僑亞熱帶植物引種園