凍幹A型肝炎減毒活疫苗及其製備方法

2023-12-09 03:27:06

專利名稱：凍幹A型肝炎減毒活疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及病毒性疫苗的醫用生物製品，具體涉及一種A型肝炎減毒活疫苗及其製備方法。
A型肝炎(A肝)是一種極易傳染和流行的疾病，一旦傳播很易造成大流行。此病主要發生在發展中國家，在一些發達國家的發病人數也較多。我國35歲以上的成年人，A肝抗體陽性率達90％以上，常引起季節性的流行。近年來，隨著經濟的發展，居住的小環境有所改善，但大環境中引起A肝的A型肝炎病毒的汙染及散布條件卻依然存在且更為嚴重，單純靠改善衛生條件難以預防解決A肝嚴重流行的問題。因此，發展安全有效的A肝疫苗是目前預防A肝的主要措施。
自1973年，Feinstone等發現肝炎病毒(Hepatitis A Virus)是傳染性肝炎的的病原體，1979年Provost在體外分離培養肝炎病毒，獲得了A肝病毒株後，為A肝疫苗的研製開闢了道路。目前，世界上有兩類A型肝炎疫苗，即A型肝炎減毒活疫苗和A型肝炎滅活疫苗，國外主要發展滅活疫苗，而活疫苗僅有中國、美國等少數國家在研究和生產。這兩種疫苗各有優缺，減毒活疫苗的缺點是穩定性差，有效的保存期限短，必須在冷凍條件下保存和運輸，優點是價格便宜，免疫原性好，有細胞免疫功能。滅活疫苗的優點是免疫原性很強，免疫後體液抗體很高，疫苗穩定，保存期較長，缺點是細胞免疫功能不如減毒活疫苗，且價格昂貴。我國於1978年開始研究A肝減毒活疫苗，「七五」期間被列為國家重大科技攻關計劃項目，由浙江省醫學科學院、中國醫學科學院生物學研究所以及中國藥品生物製品檢定所合作，選育出了二株(H2株和LA-1株)，並在「八五」、「九五」期間繼續進行了大量研究和臨床試驗，結果表明，國產的兩種A肝減毒活疫苗安全可靠、免疫性良好，其免疫效果與國外滅活疫苗相同。
但從現在國產的兩種A型肝炎減毒活疫苗看，均為液體劑型，其熱穩定性較差，不同滴度的疫苗從實驗檢定到現場注射，感染性滴度都有不同程度的下降，平均下降0.5logCCID50/ml左右，減度活疫苗在2-8℃條件下僅能有效保存三個月，-20℃保存期限僅1年。因此，使產品的推廣和應用受到很大限制。查新檢索結果表明，近年來僅見日本有A型肝炎滅活疫苗的冷凍乾燥劑型的研究及商品，未見有凍幹A型肝炎減毒活疫苗的研究報導。
本發明的目的在於提供一種熱穩定性好，便於運輸和保存的凍幹A型肝炎減毒活疫苗及其製備方法。
本發明的目的可以通過以下技術方案來實現本發明包括液體A型肝炎減毒活性疫苗和凍幹保護劑，凍幹保護劑配方如下(W/V)海藻糖1～15克，胺基酸0.1～5克，明膠0.1～1克，人白蛋白0.1～1克，氯化鈉0.145克，氯化鉀0.185克，磷酸氫鈉0.895克，磷酸二氫鉀0.34克，雙蒸餾水100毫升，其中的胺基酸可為甘氨酸和/或精氨酸和/或賴氨酸。
本發明的製備方法包括以下步驟1、配製凍幹保護劑將海藻糖1～15克，胺基酸0.1～5克，明膠0.1～1克，人白蛋白0.1～1克，氯化鈉0.145克，氯化鉀0.185克，磷酸氫鈉0.895克和磷酸二氫鉀0.34克加入到100毫升雙蒸餾水中，其中胺基酸可為甘氨酸和/或精氨酸和/或賴氨酸；2、取現有的液體A型肝炎減毒活疫苗與上述保護劑按體積比為1∶1的比例混合均勻後待用；3、在壓力為15磅、溫度為112℃-115.6℃的條件下滅菌30分鐘後，在37℃的條件下培養7天備用；4、將凍幹箱內溫度預先降至-4℃，將分裝好的疫苗與保護劑的混合液放入凍幹箱內，以0.37℃/分鐘的速度降溫度至-30℃，維持2小時後，抽真空至8×10-3託時，以0.3℃/分鐘的速度將溫度升至-4℃後，維持14小時，在此期間每隔1小時抽真空1次至0託，並檢測水份含量，當殘餘水份≤3％時，升溫至20℃，升溫速度為0.24℃/分鐘，並維持7-9小時後，塞上瓶塞，出箱即可，整個凍幹過程為25-48小時。
下面對本發明的試驗條件及方法等技術細節作詳細描述1、生產疫苗用毒種及毒種繼代生產疫苗用毒種是已經大規模用於製造A型肝炎減毒活性疫苗的A型肝炎減毒活疫苗減毒株——H2株，由中國藥品生物製品檢定所和衛生部指定的單位保管、發放。經過衛生部批准符合疫苗製造要求的人二倍體細胞(KMB17)繁殖，病毒的繁殖周期為28天。凍幹疫苗生產用的病毒代次為7代(H2M20K7)，允許使用的代次為7-14代，即H2M20K7-H2M20K14。
(1)毒種檢定早代毒種、生產用毒種由生產部門、質量檢定部門會同檢測。
(2)無菌試驗按《生物製品無菌試驗規程》進行。
(3)病毒滴度取毒種樣品，作10倍系列稀釋，取至少三個稀釋度分別接種人二倍體細胞，在35℃培養至病毒增殖高峰期，用ELISA或免疫螢光等檢定所認可的方法判定結果。病毒滴度應大於6.5logCCID50/ml方可使用。
(4)純毒試驗用A肝病毒特異性高效價免疫血清及A肝抗體陰性血清與500-1000logCCID50/mlA肝病毒等量混合，置於37℃水浴中60分鐘，接種人二倍體細胞，35℃培養至病毒增殖高峰期，用ELISA或免疫螢光法或其他方法判定，結果A肝病毒應完全被中和。
(5)外原因子檢查①血吸附試驗每消化一批細胞應留5％(不少於500ml)作為細胞對照，觀察細胞至少14天。取其中25％培養瓶於第七天時，用雞、豚鼠紅細胞混合液進行吸附試驗，於4-8℃放置30分鐘後判定，如為陰性，再移至20-25℃放置30分鐘後判定，結果應為陰性。
凡有可疑細胞病變或血吸附試驗可疑陽性者，應用同種不同批的細胞，另取10ml接種人和猴傳代細胞，各留一瓶細胞在對照，置於35-37℃觀察14天，結果應為無細胞病變。
②非血吸附病毒檢查在對照細胞觀察結束後，取10ml細胞培養合併液，接種同種不同批的細胞，另取10ml接種人和猴傳代細胞，各留一瓶細胞作對照，置於35-37℃觀察14天，結果應為無細胞病變。
③病毒液外原因子檢查取純毒試驗中和後的病毒液接種人、猴傳代細胞及同種不同批的人二倍體細胞，各設未接種的細胞作對照，觀察14天。若未證明有外源因子，並在觀察期間因非特異性原因廢棄的細胞不超過20％，試驗為通過。
④猴體試驗每早代毒種、生產用毒種批做猴體試驗。取HAV抗體陰性，ALT指標正常，體重1.5-4.5kg的健康恆猴或紅面猴5隻，於下肢靜脈注射1.0ml毒種樣品。猴體於0、4、8周肝穿做組織病理檢查。0、2、4、6、8周採血檢測ALT及HAV抗體。
判定符合下列情況者判定合格。
a、至少4隻猴血抗體陽轉；b、血清ALT有一過性(1周次)升高者超過2隻猴；c、肝組織無與接種樣品有關的病理改變。
有下列情況者應重試a、接種猴抗體陽轉率低於4/5；b、抗體陽轉率前後兩周內血清ALT異常升高超過兩周次；d、試驗猴不能排除其它原因所致的肝組織病理改變。
重試方法與初試相同，重試後仍出現上述情況之一者，判定不合格。
⑤免疫原性檢測每代生產用毒種製備的首批疫苗，按常規接種A肝易感染者，於免疫前、免疫後6-8周採血，血清抗體陽轉率不應低於95％，可供分析人數不少於40人。如不合格，該批生產用毒種及所製備的疫苗均應廢棄。
2、疫苗製造(1)人二倍體細胞所用細胞為衛生部批准的人二倍體細胞株，如KMB17等人二倍體細胞株。二倍體細胞傳代，使用及檢定按《中國生物製品規程》「人二倍體細胞建株，檢定及製備疫苗規程」中「B二倍體細胞用於疫苗生產的要求」進行。
(2)培育方法取生產用毒種按一定比例稀釋，接種於人二倍體細胞，35℃培養至病毒增殖高峰期間，洗換培養液。疫苗液經過凍融及超聲波等後處理即可。
3、配製保護劑將保護劑各組份按常規方法配製成溶液後，15磅高壓滅菌30分鐘後，在37℃的溫度條件下培養7天備用。
4、疫苗凍幹取上述檢測合格的液體疫苗按體積比1∶1的比例加入保護劑，混合均勻後及時在冰浴中進行分裝，每隻西林瓶中裝1ml混合液，然後採用適宜的凍幹工藝進行凍幹處理後即可。
5、產品的檢驗(1)物理檢驗產品應為白色疏鬆體，溶解後應為無色透明、澄清無異物的液體。
(2)殘餘水份含量≤3％。
(3)無菌檢查按《生物製品無菌試驗規程》進行，成品不做支原體檢查。
(4)病毒滴定及穩定性試驗每批凍幹疫苗，取3-5支樣品混合進行病毒滴定，再取3-5支放37℃7天，與前者同時進行病毒滴定。置於37℃下放7天後滴度下降不得超過1個logCCID50/ml，疫苗滴度不得低於logCCID50/ml。
(5)安全試驗用1-16g小白鼠4隻，每隻腹腔注射1ml，注射後應密切觀察，30分鐘內不應有異常反應，觀察3天應健康存活。
(6)殘餘牛血清蛋白含量測定用檢定所認可的方法測定，殘餘牛血清蛋白含量應≤50ng/ml。
實施例1(1)按下列組分配製保護劑溶液(W/V)
海藻糖 2克 賴氨酸 0.5克明 膠 0.2克 人白蛋白1克NaCl0.145克 KCl 0.185克Na2HPO40.895克 KH2PO40.34克雙蒸餾水100毫升上述配製好的保護劑溶液在壓力為15磅、溫度為112℃條件下高壓下滅菌30分鐘後，在37℃的條件下培養7天後待用。
(2)在100級超淨臺內將液體A型肝炎減毒活疫苗與配製好的保護劑按體積比為1∶1的比例混合均勻後，分裝在西林瓶中，每瓶一人份，每瓶1ml。
(3)將凍幹箱內溫度預先降至-4℃，將分裝好的疫苗與保護劑的混合液放入凍幹箱內，以0.37℃/分鐘的速度降溫度至-30℃，維持2小時後，抽真空至8×10-3託時，以0.3℃/分鐘的速度將溫度升至-4℃後，維持14小時，在此期間每隔1小時抽真空1次至0託，並檢測水份含量，當殘餘水份≤3％時，將溫度高至20℃，升溫速度為0.24℃/分鐘，並維持7-9小時後，塞上瓶塞，出箱即可。整個凍幹過程持續48小時。
實施例2(1)按下列組分配製保護劑溶液(W/V)海藻糖 6克 精氨酸 1克明 膠 0.5克人白蛋白 0.8克NaCl0.145克 KCl 0.185克Na2HPO40.895克 KH2PO40.34克雙蒸餾水100毫升上述配製好的保護劑溶液在壓力為15磅、溫度為115.6℃條件下高壓下滅菌30分鐘後，在37℃的條件下培養7天後待用。
(2)在100級超淨臺內將液體A型肝炎減毒活疫苗與配製好的保護劑按體積比為1∶1的比例混合均勻後，分裝在西林瓶中，每瓶一人份，每瓶1毫升。
(3)將凍幹箱內溫度預先降至-4℃，將分裝好的疫苗與保護劑的混合液放入凍幹箱內，以0.37℃/分鐘的速度降溫度至-30℃，維持2小時後，抽真空至8×10-3託時，以0.3℃/分鐘的速度將溫度升至-4℃後，維持14小時，在此期間每隔1小時抽真空1次至0託，並檢測水份含量，當殘餘水份≤3％時，將溫度高至20℃，升溫速度為0.24℃/分鐘，並維持7-9小時後，塞上瓶塞，出箱即可。整個凍幹過程持續48小時。
實施例3(1)按下列組分配製保護劑溶液(W/V)海藻糖 14克 甘氨酸 4克明 膠 0.8克 人白蛋白0.4克NaCl 0.145克 KCl 0.185克Na2HPO40.895克 KH2PO40.34克雙蒸餾水 100毫升上述配製好的保護劑溶液在壓力為15磅、溫度為113℃的條件下高壓下滅菌30分鐘後，在37℃的條件下培養7天後待用。
(2)在100級超淨臺內將液體A型肝炎減毒活疫苗與配製好的保護劑按體積比為1∶1的比例混合均勻後，分裝在西林瓶中，每瓶一人份，每瓶1毫升。
(3)將凍幹箱內溫度預先降至-4℃，將分裝好的疫苗與保護劑的混合液放入凍幹箱內，以0.37℃/分鐘的速度降溫度至-30℃，維持2小時後，抽真空至8×10-3託時，以0.3℃/分鐘的速度將溫度升至-4℃後，維持14小時，在此期間每隔1小時抽真空1次至0託，並檢測水份含量，當殘餘水份≤3％時，將溫度高至20℃，升溫速度為0.24℃/分鐘，並維持7-9小時後，塞上瓶塞，出箱即可。整個凍幹過程持續48小時。
上述實施例給出了本發明的優選操作條件，但本發明的技術內容不受實施例的局限。表1凍幹劑型與液體劑型的A肝減毒活性疫苗在45℃下感染性滴度變化疫苗批號 45℃0天 45℃1天 45℃3天(logCCID50/ml) (logCCID50/ml)(logCCID50/ml)960112 6.836.8 5.33960112液體苗6.835.17 ＜4.0960122 7.0 7.0 5.83960122液體苗7.0 5.5 ＜4.0960227 7.5 7.33 6.17960227液體苗7.5 6.33 ＜4.0表2凍幹劑型與液體劑型A肝減毒活性疫苗在37℃下感染性滴度變化單位(logCCID50/ml)疫苗批號 0天 2天 5天 7天 10天 14天 21天 30天9607036.7 6.7 6.67 6.7 6.33 6.17 5.83 4.59607036.7 6.7 6.33 5.83 5.55.04.5 ＜3.0(液體苗)9607047.0 7.0 7.0 6.8 6.67 6.56.17 5.09607047.0 7.0 6.83 6.33 6.05.77 5.0 3.67(液體苗)9607056.67 6.67 6.67 6.7 6.33 6.17 5.83 ＜4.09607056.67 6.67 6.5 5.83 5.17 4.0＜3.0＜3.0(液體苗)9703167.67 7.67 7.7 7.6 7.33 7.05.83 ＜4.09703167.67 7.67 7.5 6.77 6.04.33 ＜3.0＜3.0(液體苗)9706246.0 6.0 6.0 5.83 5.55.04.0 ＜3.09706246.0 6.0 6.0 5.17 4.53.5＜3.0＜3.0(液體苗)9708216.5 6.5 6.5 6.33 6.05.54.17 ＜3.09708216.5 6.5 6.33 5.5 4.46 3.5＜3.03.0(液疫苗)9709116.83 6.83 6.77 6.77 6.33 6.04.5 ＜3.09709116.83 6.83 6.5 5.67 4.53.5＜3.0＜3.0(液體苗)表3凍幹劑型與液體劑型A肝減毒活性疫苗在室溫下感染性滴度變化單位(logCCID50/ml)疫苗批號0周 2周 4周 8周 12周960703 6.7 6.7 6.7 6.33 5.0960703 6.7 6.175.334.0 ＜3.0(液體苗)960704 7.0 7.0 7.0 6.5 5.0960704 7.0 6.676.0 5.0 4.0(液體苗)960705 6.67 6.676.676.5 5.33960705 6.67 6.175.5 4.5 3.0(液體苗)970316 7.67 7.677.5 7.5 6.0970316 7.67 7.676.775.5 4.0(液體苗)970911 6.83 6.836.676.5 5.33970911 6.83 6.836.175.0 4.0(液體苗)表4凍幹劑型與液體劑型A肝減毒活性疫苗在2-8℃下感染性滴度變化單位(logCCID50/ml)疫苗批號0天對照 6月 12月 18月 24月960112 6.83 6.836.8 6.77 6.5960112液體苗6.83 6.5 5.23 ＜3.0＜3.0960122 7.0 7.176.83 7.0 7.0960122液體苗7.0 6.675.5 ＜3.0＜3.0960227 7.5 7.677.33 7.5 7.33960227液體苗7.5 7.336.33 4.5 ＜3.0960303 7.17 7.177.0 7.0 7.0960303液體苗7.17 7.336.0 4.67 ＜3.0970316 7.67 7.7 7.67 7.5 7.5970316液體苗7.67 7.5 6.83 4.0 ＜3.表5 對不同批次凍幹疫苗接種小白鼠安全性觀察疫苗批次接種數量(只)不良反應數量(只)不良反應率(％)9601125 0 09601125 0 09602275 0 09603035 0 09603205 0 09603165 0 09706245 0 09708215 0 09709115 0 0表6恆猴免疫後抗-HAV總抗體水平
表7恆猴免疫後血清ALT變化疫苗 恆猴數ALT水平-1 2 4 6810 12液體疫苗15 31±3.2 34±2.2 35±1.7 28±3.1 22±4.7 30±4.1 31±2.8凍幹疫苗15 29±3.7 38±1.1 36±1.3 31±3.8 29±3.7 28±3.3 30±2.1空白對照526±1.7 30±3.1 26±2.8 33±3.5 27±2.2 29±2.6 31±1.7表8 恆猴免疫後肝臟病理變化疫苗 恆猴數 肝臟病理檢測0 4 8 12液體疫苗 15 0 0 0 0凍幹疫苗 15 0 0 0 0空白對照 5 0 0 0 0
表9恆猴免疫後排毒情況疫苗 恆猴子 免疫若干天后排毒情況編號24681216182022262830液體疫苗1++ABA B B C B A + -2++AAA B C C A A + +3++ABB B C C A B + +4++ABB B C C B A + -5++AAB B B C B A + -凍幹疫苗6++ABB B C C A B + -7++AAA B C C B A - -8++ABA B B C A A - -9++ABB B C C B A + +10 ++ABB B C C B B + +空白對照11 ----- - - - - - - -12 ----- - - - - - - -13 ----- - - - - - - -14 ----- - - - - - - -15 ----- - - - - - - -注+表示陽性A表示1∶10陽性B表示1∶100陽性C表示1∶1000陽性-表示陰性上述試驗表明，凍幹疫苗在45℃、37℃及室溫下分別保存1天、7天、28天，其感染性滴度維持不變，而在相同條件下液體疫苗的感染性滴度則明顯下降，凍幹疫苗在2-8℃下保存24個月，其感染性滴度無顯著變化，而液體疫苗在6個月後其感染性滴度則明顯下降，到18個月時感染性滴度平均下降2.5-3.0logCCID50/ml。這說明凍幹疫苗的穩定性明顯高於液體疫苗。此外，小鼠、猴體試驗證明凍幹A型肝炎減毒活疫苗具有良好的安全性和免疫效果。
權利要求
1.一種凍幹A型肝炎減毒活疫苗，該疫苗包括液體A型肝炎減毒活性疫苗和凍幹保護劑，其特徵在於凍幹保護劑配方如下(W/V)海藻糖1～15克，胺基酸0.1～5克，明膠0.1～1克，人白蛋白0.1～1克，氯化鈉0.145克，氯化鉀0.185克，磷酸氫鈉0.895克，磷酸二氫鉀0.34克，雙蒸餾水100毫升。
2.根據權利要求1所述的凍幹A型肝炎減毒活疫苗，其特徵在於其中的胺基酸可為甘氨酸和/或精氨酸和/或賴氨酸。
3.一種權利要求2所述的凍幹A型肝炎減毒活疫苗的製備方法，該方法包括以下步驟(1)配製凍幹保護劑將海藻糖1～15克，胺基酸0.1～5克，明膠0.1～1克，人白蛋白0.1～1克，氯化鈉0.145克，氯化鉀0.185克，磷酸氫鈉0.895克和磷酸二氫鉀0.34克加入到100毫升雙蒸餾水中，其中的胺基酸可為甘氨酸和/或精氨酸和/或賴氨酸；(2)取現有的液體A型肝炎減毒活疫苗與上述保護劑按體積比為1∶1的比例混合均勻後待用；(3)在壓力為15磅、溫度為112℃-115.6℃的條件下滅菌30分鐘後，在37℃的條件下培養7天備用；(4)將凍幹箱內溫度預先降至-4℃，將分裝好的疫苗與保護劑的混合液放入凍幹箱內，以0.37℃/分鐘的速度降溫度至-30℃，維持2小時後，抽真空至8×10-3託時，以0.3℃/分鐘的速度將溫度升至-4℃後，維持14小時，在此期間每隔1小時抽真空1次至0託，並檢測水份含量，當殘餘水份≤3％時，升溫至20℃，升溫速度為0.24℃/分鐘，並維持7-9小時後，塞上瓶塞，出箱即可，整個凍幹過程為25-48小時。
全文摘要
本發明公開了一種凍幹A型肝炎減毒活疫苗及其製備方法,屬於病毒性疫苗的醫用生物製品。它包括液體A型肝炎減毒活性疫苗和凍幹保護劑,凍幹保護劑由海藻糖,胺基酸,明膠,人白蛋白,氯化鈉,氯化鉀,磷酸氫鈉,磷酸二氫鉀,雙蒸餾水組成,並經過與之相適應的凍幹工藝處理製得。該疫苗穩定性好,可在2—8℃的條件下有效保存1—2年。
文檔編號A61K9/19GK1247091SQ9911503
公開日2000年3月15日 申請日期1999年7月22日 優先權日1999年7月22日
發明者胡云章, 邵聰文, 譚順革, 金煒翔, 侯宗柳, 何繼紅, 姬秋彥, 陳洪波, 任麗萍, 龍潤鄉 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所