一種過渡金屬氧化物的應用的製作方法

2023-07-08 08:55:06 2

專利名稱：一種過渡金屬氧化物的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學物質的檢測和分析，具體的說是一種過渡金屬氧化物的應用。
背景技術：
目前，許多方法已經被用於生物化學物質的檢測和分析。傳統的方法用最大可能數法來控制微生物種群的變化，這種方法需要長時間的預富集，然後再通過相關的生化測試，這一系列複雜的過程需要大概15天的時間。另外，酶聯免疫反應、螢光免疫雜交技術以及改進的最大可能數法也被用於SRB的檢測。儘管這些技術具有很好的應用的前景，當應用與原位在線的檢測的時候也會存在一些問題。比如，因為長時間的增長期，SRB需要幾天的時間得到足夠的代謝產物，從而使得改進的MPN法需要相當長的時間；另外，對於酶鏈免疫反應來說，儘管一些封閉試劑阻礙非特異性吸附，但是這並不是非常有效。分子生物技術儘管準確度高，但是其操作技術複雜，成本高。最近，利用酶聯免疫反應方法來檢測微生物也得到了研究。這種方法主要基於在通過的抗體來識別微生物，然後通過再通過酶的顯色反應來檢測微生物。對於硫酸鹽還原菌來說，目前，最常用的是1958年英國的Rizk[ABD-EL-Malek Y. ；Rizk S.G.. Counting of Sulphate—reducing Bacteria in Mixed Bacterial Populations. Nature，1958，182，538.]在 Nature 上發表改進的 MPN 培養法，利用梯度稀釋培養來檢測和控制硫酸鹽還原菌種群的數量，但是這種方法需要相當長的時間(20 天)。後來採用直接檢測硫酸鹽還原菌的特徵化合物的方法，比如基於硫酸鹽還原菌特有的腺苷-5-磷酸硫酸酐還原酶的檢測方法[Tatnal R. E. ；Stanton K. Μ. ；Ebersole R. C.. Methods of Testing for the Presence of Sulfate-reducing Bacteria. Corrosion, NACE, Houston, 1988，88，1-34.]，這種方法能夠快速的檢測硫酸鹽還原菌的是否存在，但是檢測的靈敏度不高，而且需要破壞微生物細胞。近來，美國、德國以及日本等國開始利用核酸分子技術比如採用聚合酶鏈反應、螢光原位雜交技術和限制性片斷多態長度基於該微生物特有的 16S rRNA來檢測硫酸鹽還原菌[Stubner S. . Quantification of Gram-negative Sulphate-reducing Bacteria in Rice Field Soil by 16S rRNA Gene-targeted Real-time PCR. J. Microbiol. Meth. , 2004,57, 219230 ；Lucker S. ；Steger D. ；Kjeldsen K. U. ；MacGregor B. J. ；Wagner Μ. ；Loy Α. Improved 16S rRNA-targe ted Probe Set for Ana lysis of Sulfate-reducing Bacteriaby Fluorescence in situ Hybridization. J.Microbiol. Meth. ,2007,69,523528 ；Gaylarde C. ；Cook P. . New Rapid Methods for the Identification of Sulphate-reducing Bacteria.Int. Biodeter. Biodegr. ,1990,26, 337-345.]。這種方法不能夠得到普及應用的主要原因在於檢測的成本高，而且需要專業的技術人員。因此，研究一種有效的快速的檢測硫酸鹽還原菌的方法具有很重要的應用價值。相對於傳統的方法來說，近二十年來蓬勃發展的納米生物傳感器的方法具有高的靈敏度、低的檢測限和實時在線檢測的能力，這使得這種方法成為了近十年來微生物快速檢測研究領域的熱點原因之一。隨著研究方法的進步，研究的內容和結果也更加的深入。根據從kiFinder Scholar上的檢索結果，早在1992年英國官方分析化學師協會採用了 Gibson 等[Gibson D. Μ. ；Coombs P. ；Pimbley D. W. . Automated conductance method for the detect ion of Salmonella in foods-collaborative study. J. AOAC Int., 1992,75,293-302.]研究的基於電導的電化學方法來檢測雞蛋、魚以及牛奶等食物中的沙門桿菌。1996 年美國的 Brewster 等[Brewster J. D. ；Gehring A. G. ；Mazenko R. S.； Van Houten L J. ；Crawford C. J. . Immunoelectrochemical Assays for Bacteria :Use of Epifluorescence Microscopy And Rapid-Scan Electrochemical Techniques in Development of an Assay for Salmonella. Anal. Chem.，1996，68，4153-4159.]通過生物化學中的酶鏈免疫反應建立了基於方波伏安法的生物傳感器來檢測沙門桿菌。2001年力口拿大的 Mikkelsen 等[Ertl P. ；Mikkelsen S. R. . Electrochemical Biosensor Array for the Ident ification of Microorganisms Based on Lectin-Lipopolysaccharide Recognition. Anal. Chem.，2001，73,4241-4248.]利用凝集素特異性的識別微生物， 通過計時電量法來區分和檢測蠟樣桿菌、金黃色釀朧葡萄球、普通變形桿菌、大腸桿菌、產氣腸桿菌以及釀酒酵母等六種微生物。2002年Rimn等[Rimn C. ；Ymg L. ；Li Y. ；Immunobiosensor Chips for Detection of Escherichia coli 0157 :H7 Using Electrochemical Impedance Spectroscopy. Anal.Chem.，2002，74，4814-4820.]發表了使用電化學交流阻抗技術來檢測大腸桿菌。近年來，電位型以及陽極溶出伏安型生物傳感器也在微生物的檢測中得到應用[Bohem D.A. ；Gottlieb P. Α. ；Hua S. 1.. On-chip Microfluidic Biosensor for Bacterial Detect and Identification. Sensor. Actuat. B-Chem. , 2007,126, 508-514 ；Dungchaia W. ；Siangprohb W. ；Chaicumpac W. ；Tongtawed P. ；Chailapakula 0..Salmonella typhi Determination using Voltammetric Amplification of Nanoparticles :A Highly Sensitive Strategy for Metalloimmunoassay Based on a Copper-enhanced Gold Label. Talanta,2008,77,727 732.]。 隨著生物化學以及材料科學的發展，研究內容也從不同生物傳感器在微生物檢測的應用擴展到基於不同材料的免疫反應在微生物檢測中的應用中來。特別納米材料科學和技術的發展，常見的納米顆粒被廣泛應用到微生物的檢測[Alivisatos P.. The Use of Nanocrystals in Biological Detect ion. Nat. Biotechnol.，2004，22 (1)， 47-52 ；Batt C. Α. . Food Pathogen Detection, Science，2007，316，1579—1580. ]。 Bunz 等[Phillips R. L. ；Miranda 0. R. ；You C. -C. ；Rotello V. Μ. ；Bunz U. H. F. . Rapid and Eifficient Identification of Bacteria Using Gold-Nanoparticle-Poly (para-phenyleneethynylene) Construct s. AngeW. Chem. Int. Ed.，2008，47，2590-2594.] 通過在納米金顆粒的覆蓋一層螢光聚合物，然後在其表面加一層螢光淬滅劑。微生物與納米顆粒結合後，就會使螢光淬滅劑釋放出來，體系的螢光強度就會得到增加來檢測微生物。Xu 等[Gu H. ；Ho P. -L. ；Tsang K. W. T. ；Wang L. ；Xu B. . Using Biofunctional Magnetic Nanoparticles to Capture Vancomycin-Resistant Enterococci and other Gram-Positive Bacteria at Uitralow Concentration. J. Am. Chem.Soc. ,2003,125, 15702-15703.]報導在磁性納米顆粒表面覆蓋一層特異性抗體識別微生物，最後通過磁分離來檢測凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。Maroto等[Villamizar R. A. ；Maroto A. ；Rius F. X. ；Inza I. ；FiguerasM. J. . Fast detection of Salmonella Infantis with carbon nanotube field effect transistors. Biosens. Bioelectron., 2008，24，279-觀3.]提出用單壁納米炭管作為導電通道，同時在納米炭管表面修飾一層特異性的抗體，通過場效應電晶體來檢測沙門桿菌的芽孢。但是對於納米顆粒應用到電化學生物傳感器的微生物檢測中的研究才剛剛起步。最近以來只有少量的文獻報導，Lin 等[Lin Y. -H. ；Chen S. -H. ；Chuang Y. -C. ；Lu Y. -C. ；Shen T. Y. ；Chang C. A.； Lin C. -S. . Disposable amperometric immunosensing strips fabricated by Au nanoparticles—modified screen-printed carbon electrodes for the detection of foodborne pathogen Escherichia coli 0157 :H7. Biosens. Bioelectron.，2008，23， 1832-1837.]利用基於納米金標記酶技術催化過氧化氫的電化學生物傳感器的方法檢測大腸桿菌。

發明內容
本發明目的在於提供一種過渡金屬氧化物的應用。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種過渡金屬氧化物的應用過渡金屬氧化物用作信號標記用於檢測特異性識別生物分子的含量大小。所述過渡金屬氧化物微納米級，大小為Ι-lOOOnm。所述過渡金屬氧化物為氧化錳、 氧化鈷、氧化鎳、氧化釩或氧化釩。所述過渡金屬氧化物催化的底物為多巴胺，鄰苯二胺、2， 2』-吖嗪-(3-乙醯苯基噻唑磺酸-6)、四甲基聯苯胺、4-氨基安替比林或苯酚耦聯底物對。本發明所具有的優點本發明利用過渡態金屬氧化物(氧化錳、氧化鈷、氧化鎳、 氧化釩和氧化釩)作為信號標記來快速檢測和分子生物分子，比如蛋白因子、核酸、微生物、病毒等，其是結合微生物與抗體的特異性識別和過渡態金屬氧化物納米材料具有的類催化酶的特性，用其檢測檢測控制微生物種群的變化，能夠快速檢測對人體和環境有害的微生物。相對於傳統的可見光光密度的測量，利用過渡態金屬氧化物這種特性對所檢測的微生物具有顯著的特異性，同時準確性高。利用過渡態金屬氧化物納米材料標記的免疫反應，具有穩定性好，不容易失活，價格便宜等優勢。


圖1為本發明實施例提供的基於過氧化物酶酶聯免疫反應實驗流程圖和基於過渡態金屬氧化物(以氧化錳納米材料為例)標記的免疫反應實驗流程圖。圖2為本發明實施例提供的氧化錳納米片(a)、氧化錳納米球(b)、氧化錳納米線 (C)、氧化錳納米複合物(d)、氧化錳納米幫(e)的掃描電子顯微鏡照片和在沒有過氧化物體系中氧化錳納米線催化底物顯色的變化圖。圖3為本發明實施例提供的氧化錳納米片(a)、氧化錳納米球(b)、氧化錳納米線 (C)、氧化錳納米複合物(d)和氧化錳納米幫(e)的催化動力學實驗圖(圖A)和雙倒數圖 (圖 B)。圖4為本發明實施例提供的氧化錳納米線(a)和HRP酶(b)的催化活性隨著PH(圖A)、溫度(圖B)和過氧化氫濃度(圖C)的變化對於氧化錳的效應圖(其中，PH為 5.1、溫度為50°C，在沒有過氧化氫條件下的催化活性最大。對於HRP酶來說ρ H為3、溫度為40°C，過氧化氫條件濃度為IOmM的催化活性最大。)。圖5為本發明實施例提供的不同pH對於氧化錳納米線材(a)料和過氧化物酶(b) 穩定性的影響圖(圖A)；不同溫度對於材料和酶穩定性的影響圖(圖B)(其中氧化錳納米線最適應的存放PH為pH5. 0，而溫度的存放對其活性影響不大。HRP酶最是存放溫度低於 40°C，最適 pH 為 5-7。)。圖6為本發明實施例提供的基於氧化錳(a)、右旋糖甘修飾的氧化錳(b)、海藻酸修飾的氧化錳(c)和殼聚糖修飾的氧化錳材料(d)的四種抗體修飾後的納米材料活性分析圖(圖A)；基於氧化錳(a)、右旋糖甘修飾的氧化錳(b)、海藻酸修飾的氧化錳(c)和殼聚糖修飾的氧化錳材料(d)的四種抗體修飾後的定性分析抗體修飾的量分析圖(圖B)。圖7為本發明實施例提供的採用HRP標記技術來檢測微生物的效果圖(圖A)；採用氧化錳納米線標記技術來檢測微生物的效果圖(圖B)。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步說明。同時本發明實施例中提供的二氧化錳納米線10 μ g mr1或;3ng mL—1辣根過氧化物酶(HRP)在0. 2M醋酸鈉緩衝液實施例1 二氧化錳納米片的製備，參見J. Am. Chem. Soc. 2008，130，15938-15943相關文獻報導。具體為20mL載有0. 6M TMA和3% H2O2溶液加入10毫升0. 3M的氯化錳溶液。由此產生的懸浮液是在室溫下攪拌12小時，然後離心，用Milli-Q水和無水乙醇洗滌，然後冷凍乾燥。與此同時，其他二氧化錳納米粒子，即納米球。二氧化錳納米針和納米棒，參見J. Cry. Grow. 2008，310，716-722相關文獻報導的水熱法來合成方法。具體為2mM高錳酸鉀硫酸錳和2mM的硫酸錳溶解在MiIli-Q水(80毫升)。然後被轉移到反應釜，密封，並在160°C的加熱水熱反應時間為0. 5 8，至72小時這些產品，然後離心，與Mili-Q水清洗，最後冷凍乾燥(見圖2)。通過葡聚糖(DT)、殼聚糖(⑶)或海藻酸(AA)交聯二氧化錳和抗體，從而得到抗體修飾的二氧化錳複合物。二氧化錳通過聚合物修飾和抗體固定二氧化錳納米線(50mg)和25mg的葡聚糖(DT)、殼聚糖(CS)或海藻酸(AA)的混合於50mL Milli-Q水。該混合物在室溫下攪拌72h，直到懸浮液改為黃色至棕褐色，(說明穩定葡聚糖，殼聚糖，海藻酸或鍍二氧化錳納米粒子的形成)而後離心和用Milli-Q水洗去多餘的聚合物，最後冷凍乾燥。將上述葡聚糖，殼聚糖或海藻酸包覆二氧化錳納米線被用作抗硫酸鹽還原菌抗體固定化載體。與抗體偶聯之前，Img ml/1葡聚糖修飾的氧化錳納米線(IOmL)與^iig ml/1的高碘酸鈉(ImL)混合反應。激活的二氧化錳納米線表面修飾的葡聚糖，然後用0. Img mL—1 孵育抗硫酸鹽還原菌抗體在4°C 12小時抗體固定，使用Img mL—1硼氫化鈉QmL)終止反應。 抗體修飾的二氧化錳納米線存放在4°CImg πιΓ1殼聚糖修飾的氧化錳納米線(IOmL)與^iig mL—1的高碘酸鈉(ImL)混合反應。激活的二氧化錳納米線表面修飾的殼聚糖，然後用0. Img ml/1孵育抗硫酸鹽還原菌抗體在4°C 12小時抗體固定，使用Img mL—1硼氫化鈉QmL)終止反應。抗體修飾的二氧化錳納米線存放在4°CImg ml/1海藻酸修飾的氧化錳納米線(IOmL)與^iig mL—1的高碘酸鈉(ImL)混合反應。激活的二氧化錳納米線表面修飾的海藻酸，然後用0. Img ml/1孵育抗硫酸鹽還原菌抗體在4°C 12小時抗體固定，使用Img mL—1硼氫化鈉QmL)終止反應。抗體修飾的二氧化錳納米線存放在4°C一個100 μ L 0. Img ml/1抗體修飾的二氧化錳納米顆粒與100 μ L 0. Img mL^FITC 標記的蛋白A來確定反SRB的抗體，該抗體修飾的納米二氧化錳溶液的濃度為0. 2 μ L的培養。由此產生的複合物進行衝洗0. IM的PBS緩衝液含0. 牛血清白蛋白(ρΗ值7.2)，以除去多餘的螢光素標記的蛋白Α，和螢光分析和測量懸浮(見圖6)。實施例2分別取上述實施例所得氧化錳納米片(a)、氧化錳納米球(b)、氧化錳納米線(C)、 氧化錳納米複合物(d)各10 μ g，分別加入50至800 μ MTMB,反應5min，然後測定反應產物吸光度。繪製TMB濃度與吸光度的曲線，然後通過米氏方程時，V = VmaxX [S]/(Km+[S])計算動力學常數(見圖3)。同時分別檢測二氧化錳納米線和HRP對ρΗ值(1-12)，溫度(5_95°C )催化活性的依賴(見圖4)，採用過氧化氫濃度(0-400mM)進行了研究。納米線的二氧化錳和HRP在ρΗ 和溫度穩定性進行了一系列研究(見圖5)。前面提到的通過改變反應條件下進行的進行動力學實驗，在沒有過氧化氫濃度條件下，由50至800 μ M TMB的反應速率機制研究。所有的測量，觀察在在652nm波長下，使用貝克曼DU650分光光度計波長吸光度。這種酶動力學和動力學參數進行了估計基礎上， 米氏方程時，V = VmaXX[S]/(Km+[S])，其中V是當前的反應速度，Vmax是最大反應速率， [s]是底物濃度，Km為米氏常數。在米氏動力學是一種酶動力學，其中介紹了有關的反應速率為底物濃度不可逆酶反應速率模型。實施例3而後將抗硫酸鹽還原菌抗體(0. 5mg mL—1)加入上述聚苯乙烯多孔板的板孔再次過夜孵育4°C，然後在每孔中加入BSA進行封閉非特異性位點並用PBS洗三次(ρΗ值7. 4)； 最後再在每孔中滴加不同稀釋濃度的SRB到96孔板中培育兩個小時(從1. 8 X IO1Cfu mL—1 到1. 8 X IO8Cfu πιΓ1)，再加入稀釋1/2000的用HRP標記的兔抗鼠免疫球蛋白(武漢博士德生物工程有限公司)或二氧化錳標記的抗硫酸鹽還原菌抗體(0. Img mL—1)，1小時孵育最後，對辣根過氧化物酶標記的第二抗體或二氧化錳標記的抗體結合在過氧化物酶的細菌細胞表面活性測定，加入底物溶液(50μΜ的TMB，pH值5. 1)。將上述實施例所得二氧化錳納米材料樣品分別添加到多孔板上，每孔100 μ L(10yg mL—1)，並在室溫下進行進行孵化。每次孵化後，多孔板在用含0. 05% Tween20的PBS溶液進行四次清洗。10分鐘後，反應停止， 測量450nm處的吸光度。通過測定SRB濃度從1. 8X IO1Cfu mL—1到1.8X 108cfu mL—1的吸光度數值，然後繪製微生物濃度與吸光度值的曲線(如圖7所示)。實施例4而後將抗硫酸鹽還原菌抗體(0. 5mg mL—1)加入上述聚苯乙烯多孔板的板孔再次過夜孵育4°C，然後在每孔中加入1 % BSA進行封閉非特異性位點並用PBS洗三次(pH值 7. 4)；最後再在每孔中滴加不同稀釋濃度的SRB到96孔板中培育兩個小時(從1. SXlO1Cfu mL—1到1. 8X IO8Cfu mL—1)，再加入稀釋1/2000的用HRP標記的兔抗鼠免疫球蛋白(武漢博士德生物工程有限公司)或氧化鈷標記的抗硫酸鹽還原菌抗體(0. Img mL-1)，1小時孵育最後，對辣根過氧化物酶標記的第二抗體或氧化鈷標記的抗體結合在過氧化物酶的細菌細胞表面活性測定，加入底物溶液(50μΜ的TMB，pH值5. 1)。將上述實施例所得氧化鈷納米材料樣品分別添加到多孔板上，每孔100 μ L(10yg mL—1)，並在室溫下進行進行孵化。每次孵化後，多孔板在用含0. 05% Tween20的PBS溶液進行四次清洗。10分鐘後，反應停止，測量 450nm處的吸光度。通過測定SRB濃度從1. 8 X IO1Cfu mL—1到1. 8 X KfcfumL—1的吸光度數值，然後繪製微生物濃度與吸光度值的曲線(如圖7所示)。實施例5而後將抗硫酸鹽還原菌抗體(0. 5mg mL—1)加入上述聚苯乙烯多孔板的板孔再次過夜孵育4°C，然後在每孔中加入1 % BSA進行封閉非特異性位點並用PBS洗三次(pH值 7. 4)；最後再在每孔中滴加不同稀釋濃度的SRB到96孔板中培育兩個小時(從1. SXlO1Cfu mL—1到1. 8X IO8Cfu mL—1)，再加入稀釋1/2000的用HRP標記的兔抗鼠免疫球蛋白(武漢博士德生物工程有限公司)或氧化鎳標記的抗硫酸鹽還原菌抗體(0. Img mL-1)，1小時孵育最後，對辣根過氧化物酶標記的第二抗體或氧化鎳標記的抗體結合在過氧化物酶的細菌細胞表面活性測定，加入底物溶液(50μΜ的TMB，pH值5. 1)。將上述實施例所得氧化鎳納米材料樣品分別添加到多孔板上，每孔100 μ L(10yg mL—1)，並在室溫下進行進行孵化。每次孵化後，多孔板在用含0. 05% Tween20的PBS溶液進行四次清洗。10分鐘後，反應停止，測量 450nm處的吸光度。通過測定SRB濃度從1. 8 X IO1Cfu mL—1到1. 8 X KfcfumL—1的吸光度數值，然後繪製微生物濃度與吸光度值的曲線。實施例6而後將抗硫酸鹽還原菌抗體(0.5mg mL-1)加入上述聚苯乙烯多孔板的板孔再次過夜孵育4°C，然後在每孔中加入1 % BSA進行封閉非特異性位點並用PBS洗三次(pH值 7. 4)；最後再在每孔中滴加不同稀釋濃度的SRB到96孔板中培育兩個小時(從1. SXlO1Cfu mL—1到1. 8X IO8Cfu mL—1)，再加入稀釋1/2000的用HRP標記的兔抗鼠免疫球蛋白(武漢博士德生物工程有限公司)或氧化鎳標記的抗硫酸鹽還原菌抗體(0. Img mL-1)，1小時孵育最後，對辣根過氧化物酶標記的第二抗體或氧化鎳標記的抗體結合在過氧化物酶的細菌細胞表面活性測定，加入底物溶液(50μΜ的TMB，pH值5. 1)。將上述實施例所得氧化鎳納米材料樣品分別添加到多孔板上，每孔100 μ L(10yg mL—1)，並在室溫下進行進行孵化。每次孵化後，多孔板在用含0. 05% Tween20的PBS溶液進行四次清洗。10分鐘後，反應停止，測量 450nm處的吸光度。通過測定SRB濃度從1. 8 X IO1Cfu mL—1到1. 8 X KfcfumL—1的吸光度數值，然後繪製微生物濃度與吸光度值的曲線。實施例7而後將抗硫酸鹽還原菌抗體(0.5mg mL—1)加入上述聚苯乙烯多孔板的板孔再次過夜孵育4°C，然後在每孔中加入1 % BSA進行封閉非特異性位點並用PBS洗三次(pH值 7. 4)；最後再在每孔中滴加不同稀釋濃度的SRB到96孔板中培育兩個小時(從1. SXlO1Cfu mL—1到1. 8X IO8Cfu mL—1)，再加入稀釋1/2000的用HRP標記的兔抗鼠免疫球蛋白(武漢博士德生物工程有限公司)或氧化釩標記的抗硫酸鹽還原菌抗體(0. Img mL-1)，1小時孵育最後，對辣根過氧化物酶標記的第二抗體或氧化釩標記的抗體結合在過氧化物酶的細菌細胞表面活性測定，加入底物溶液(50μΜ的TMB，pH值5. 1)。將上述實施例所得氧化釩納米材料樣品分別添加到多孔板上，每孔100 μ L(10yg mL—1)，並在室溫下進行進行孵化。每次孵化後，多孔板在用含0. 05% Tween20的PBS溶液進行四次清洗。10分鐘後，反應停止，測量 450nm處的吸光度。通過測定SRB濃度從1. 8 X IO1Cfu mL—1到1. 8 X KfcfumL—1的吸光度數值，然後繪製微生物濃度與吸光度值的曲線。實施例8而後將抗硫酸鹽還原菌抗體(0.5mg mL—1)加入上述聚苯乙烯多孔板的板孔再次過夜孵育4°C，然後在每孔中加入1 % BSA進行封閉非特異性位點並用PBS洗三次(pH值 7. 4)；最後再在每孔中滴加不同稀釋濃度的SRB到96孔板中培育兩個小時(從1. SXlO1Cfu mL—1到1. 8X IO8Cfu mL—1)，再加入稀釋1/2000的用HRP標記的兔抗鼠免疫球蛋白(武漢博士德生物工程有限公司)或氧化釩標記的抗硫酸鹽還原菌抗體(0. Img mL-1)，1小時孵育最後，對辣根過氧化物酶標記的第二抗體或氧化釩標記的抗體結合在過氧化物酶的細菌細胞表面活性測定，加入底物溶液(50μΜ的TMB，pH值5. 1)。將上述實施例所得氧化釩納米材料樣品分別添加到多孔板上，每孔100 μ L(10yg mL—1)，並在室溫下進行進行孵化。每次孵化後，多孔板在用含0. 05% Tween20的PBS溶液進行四次清洗。10分鐘後，反應停止，測量 450nm處的吸光度。通過測定SRB濃度從1. 8 X IO1Cfu mL—1到1. 8 X KfcfumL—1的吸光度數值，然後繪製微生物濃度與吸光度值的曲線。實施例9而後將抗硫酸鹽還原菌抗體(0. 5mg mL—1)加入上述聚苯乙烯多孔板的板孔再次過夜孵育4°C，然後在每孔中加入BSA進行封閉非特異性位點並用PBS洗三次(pH值7. 4)； 最後再在每孔中滴加不同稀釋濃度的SRB到96孔板中培育兩個小時(從1. 8 X IO1Cfu mL—1 到1. 8 X IO8Cfu πιΓ1)，再加入稀釋1/2000的用HRP標記的兔抗鼠免疫球蛋白(武漢博士德生物工程有限公司)或氧化鈷標記的抗硫酸鹽還原菌抗體(0. Img mLla小時孵育最後， 對辣根過氧化物酶標記的第二抗體或氧化鈷標記的抗體結合在過氧化物酶的細菌細胞表面活性測定，加入底物溶液(50 μ M的2，2，-吖嗪-(3-乙醯苯基噻唑磺酸-6)，ρΗ值5. 1)。 將上述實施例所得氧化鈷納米材料樣品分別添加到多孔板上，每孔100 μ L (10 μ g mL—1)，並在室溫下進行進行孵化。每次孵化後，多孔板在用含0. 05%Tween20的PBS溶液進行四次清洗。10分鐘後，反應停止，測量425nm處的吸光度。通過測定SRB濃度從1. 8X IO1Cfu mL—1 到LSXlO8Cfu mL-1的吸光度數值，然後繪製微生物濃度與吸光度值的曲線。實施例10而後將抗硫酸鹽還原菌抗體(0. 5mg mL—1)加入上述聚苯乙烯多孔板的板孔再次過夜孵育4°C，然後在每孔中加入BSA進行封閉非特異性位點並用PBS洗三次(pH值7. 4)； 最後再在每孔中滴加不同稀釋濃度的SRB到96孔板中培育兩個小時(從1. 8 X IO1Cfu mL—1 到1. 8 X IO8Cfu πιΓ1)，再加入稀釋1/2000的用HRP標記的兔抗鼠免疫球蛋白(武漢博士德生物工程有限公司)或氧化鈷標記的抗硫酸鹽還原菌抗體(0. Img mLla小時孵育最後， 對辣根過氧化物酶標記的第二抗體或氧化鈷標記的抗體結合在過氧化物酶的細菌細胞表面活性測定，加入底物溶液(50 μ M的多巴胺，pH值5. 1)。將上述實施例所得氧化鈷納米材料樣品分別添加到多孔板上，每孔100 μ L (10 μ g mL—1)，並在室溫下進行進行孵化。每次孵化後，多孔板在用含0. 05% Tween20的PBS溶液進行四次清洗。10分鐘後，反應停止，測量 300nm處的吸光度。通過測定SRB濃度從1. 8 X IO1Cfu mL—1到1.8 X 108cfu mL—1的吸光度數值，然後繪製微生物濃度與吸光度值的曲線。
權利要求
1.一種過渡金屬氧化物的應用，其特徵在於過渡金屬氧化物用作信號標記用於檢測特異性識別生物分子的含量大小。
2.按權利要求1所述的過渡金屬氧化物的應用，其特徵在於所述過渡金屬氧化物微納米級，包括納米線，納米球，多孔納米材料，大小為1-lOOOnm。
3.按權利要求1或2所述的過渡金屬氧化物的應用，其特徵在於所述過渡金屬氧化物為氧化錳、氧化鈷、氧化鎳或者氧化釩。
4.按權利要求1所述的過渡金屬氧化物的應用，其特徵在於所述過渡金屬氧化物催化的底物為多巴胺，鄰苯二胺、2，2』-吖嗪-(3-乙醯苯基噻唑磺酸-6)、四甲基聯苯胺、4-氨基安替比林或苯酚耦聯底物對。
全文摘要
本發明涉及生物化學物質的檢測和分析，具體的說是一種過渡金屬氧化物的應用。過渡金屬氧化物用作信號標記用於檢測特異性識別生物分子的含量大小。本發明利用過渡態金屬氧化物作為信號標記來快速檢測和分子生物分子，比如蛋白因子、核酸、微生物、病毒等，其是結合微生物與抗體的特異性識別和過渡態金屬氧化物納米材料具有的類催化酶的特性，用其檢測檢測控制微生物種群的變化，能夠快速檢測對人體和環境有害的微生物。相對於傳統的可見光光密度的測量，利用過渡態金屬氧化物這種特性對所檢測的微生物具有顯著的特異性，同時準確性高。利用過渡態金屬氧化物納米材料標記的免疫反應，具有穩定性好，不容易失活，價格便宜等優勢。
文檔編號G01N33/569GK102384974SQ20111021113
公開日2012年3月21日 申請日期2011年7月22日 優先權日2011年7月22日
發明者萬逸, 張盾 申請人:中國科學院海洋研究所