TrkB抗體用於治療呼吸病症的用途的製作方法

2023-12-01 14:57:16

專利名稱：TrkB抗體用於治療呼吸病症的用途的製作方法
TrkB抗體用於治療呼吸病症的用途
背景技術：
酪氨酸激酶受體B (TrkB)屬於單跨膜受體酪氨酸激酶家族，該家族還包括TrkA和 TrkC0這些酪氨酸激酶受體(trks)介導神經營養蛋白的活性。神經營養蛋白是神經元的存 活和發育所必需的，其通過調節神經元結構和突觸可塑性來調控突觸傳遞。神經營養蛋白 包括但不限於神經生長因子(NGF)、腦衍生神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白-3 (NT-3) 和神經營養蛋白-4/5(NT-4/5) (Lo, KY et al.，(2005) T. Biol. Chem. ,280 :41744_52)。TrkB是BDNF 的高親和性受體(Minichiello，et al. ,Neuron 21:335-45(1998))， 其在腦中，特別是新皮層、海馬、紋狀體和腦幹中高水平表達；還在肌肉組織中發現了同 種型。神經營養蛋白與trk結合，活化受體，使得受體細胞內結構域上的特定酪氨酸殘 基二聚化並且自磷酸化(Jing，etal.，(1992)Neuron 9 1067-1079 ；Barbacid, (1994) T. Neurobiol. 25 :1386_1403 ；Bothwell, (1995)Ann. Rev. Neurosci. 18 :223_253 ；Segal andGreenberg, (1996)Ann. Rev. Neurosci. 19 :463_489 ；Kaplan and Miller, (2000)Curr. Opinion Neurobiol. 10 =381-391) 0這些磷酸酪氨酸殘基作為細胞內信號級聯元件的停靠 點發揮作用，導致對神經元死亡的抑制(suppression)、對神經突(neurite)長出的促進作 用以及神經營養蛋白的其它作用。例如，3&、？1 -2、5!128、『4 5和？11^通過磷酸化的酪 氨酸殘基與TrkB發生相互作用。這些銜接分子與活化的TrkB的聯結導致信號途徑(包括 有絲分裂原活化的蛋白激酶、磷脂醯肌醇3-激酶和PLC γ途徑)的啟動，由此介導神經營 養蛋白的作用(Lo，KY et al.，(2005) T. Biol. Chem.，280 41744~52)。雷特症候群(RTT)最初由Dr. Andreas Rett於1966年鑑定出來，其是來自 晚期神經發育缺陷的破壞性的CNS病症。其幾乎僅僅影響所有種族的女童，發病率為 1/10，000-15，000出生人口。一些患有RTT的個體在童年時死亡，但是，很多可以活到成年 階段並高度殘障。高達25%的患者死於心臟//呼吸衰竭。迄今為止對該疾病沒有有效治 療。表觀正常發育期之後，受到影響的女童在6至18個月期間發展出RTT症狀，症 狀在未來數年來不斷惡化。症狀包括出生時正常頭圍之後頭部生長減速；獲得性語言能 力喪失；交流障礙；認知受損；有目的的手部技能被刻板的手部運動代替(扭曲絞手、洗手 (hand washing)、拍手(clapping)、輕拍(patting)等)；受損或變差的運動能力(步態共 濟失調(gait ataxia)、缺乏柔性(stiffness)等)；清醒時呼吸困難；從嬰兒期早期開始受 損的睡眠模式；異常肌肉緊張伴肌肉消瘦和肌張力失常；外周血管舒縮障礙；進行性脊柱 側凸或駝背和生長遲緩。該病症特徵還在於中樞自主功能障礙，並且Rett患者顯示出下述症狀中的一些 或全部由屏氣、淺呼吸、換氣過度、延長的呼吸暫停期構成的多種呼吸節律障礙；心律不 齊伴隨基線心迷走緊張的降低；h和心壓力感受器反射敏感性。這些症狀威脅生命，並且使 得Rett患者處於猝死風險中。他們顯示出腦幹不成熟，並且在覺醒期間缺乏心肺網絡中的 和來自下丘腦或邊緣皮層的綜合抑制。此外，在Rett患者中報導了腦幹神經營養蛋白信號 (NGF和BDNF)的改變，以及單胺(5-羥色胺、去甲腎上腺素)和神經肽(物質P)水平的降低。RTT是單基因型疾病，在絕大多數情況下，是X染色體連鎖的基因mecp2的突變導 致的，該基因編碼轉錄阻遏子MeCP2 (甲基-CpG胞嘧啶結合蛋白2)。MeCP2與甲基化的DNA 優先結合。神經營養蛋白因子BDNF是MeCP2的已知的直接靶標，是去甲腎上腺素和5_羥色 胺神經元的重要營養性因子。令人驚奇地，Mecp2-K0小鼠是腦BDNF缺陷的，腦BDNF的遺 傳過量表達可增加其壽命，並且彌補其運動缺陷。目前需要尋找BDNF治療策略，包括用於 雷特症候群和其它呼吸病症等狀況的策略；此類策略包括靶向BDNF的此類結合伴侶，例如 酪氨酸激酶受體TrkB。

發明內容
本發明提供了治療、診斷、預防和/或改善呼吸病症(例如，雷特症候群(RTT))的 方法，所述方法包括施用酪氨酸激酶受體B (TrkB)的經分離的抗體激動劑(在本文中還稱 為「TrkB激動性抗體」、「TrkB結合分子」等)。在一些實施方式中，抗體是人源化抗體。在 其它實施方式中，抗體是單鏈抗體。在一些實施方式中，抗體不與酪氨酸激酶受體A或酪氨 酸激酶受體C結合。在一些實施方式中，抗體能結合人的TrkB，並且不與其它物種的TrkB 結合。在一些實施方式中，抗體既能結合人的TrkB，也能與其它物種的TrkB結合(即，能交 叉反應)(包括，例如，與小鼠、大鼠和/或非人靈長類(例如，獼猴或恆河猴))。在一些實施方式中，抗體與TrkB的配體結合結構域(LBD)結合。在一些實施方式 中，抗體與腦衍生神經營養因子(BDNF)競爭結合TrkB。在一些實施方式中，抗體與下述競 爭抗體針對與TrkB的結合競爭，所述競爭抗體包含包含SEQ ID NO 3的重鏈可變區和包 含SEQ ID NO :4的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含包含SEQ ID NO 7的重鏈可 變區和包含SEQ ID NO 8的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含包含SEQ ID NO 11的重鏈可變區和包含SEQ ID NO 12的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含包含 SEQ ID NO: 15的重鏈可變區和包含SEQ ID NO 16的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗 體包含包含SEQ IDNO :7、SEQ ID NO 11和/或SEQ ID NO 15的重鏈可變區和包含SEQ IDN0:8、SEQ ID N0:12和/或SEQ ID NO 16的輕鏈可變區的組合。在一些實施方式中，抗 體包含包含SEQ ID NO 3的重鏈可變區和包含SEQ IDNO 4的輕鏈可變區。在一些實施方式中，本發明方法的抗體作為BDNF模擬物發揮作用，其能例如重現 所述配體的營養性活性(因此能施加神經保護性和神經營養性作用)。在一些實施方式中，抗體不與TrkB的配體結合結構域(LBD)結合。在一些實施方 式中，抗體不與腦衍生神經營養因子(BDNF)競爭結合TrkB。在一些實施方式中，在一些實 施方式中，抗體與下述競爭抗體競爭結合TrkB，所述競爭抗體包含包含SEQ ID N0:1的 重鏈可變區和包含SEQ ID NO :2的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含包含SEQ IDNO :5的重鏈可變區和包含SEQ ID NO :6的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含 包含SEQ ID NO 9的重鏈可變區和包含SEQ ID NO 10的輕鏈可變區。在一些實施方式中， 抗體包含包含SEQ ID NO 13的重鏈可變區和包含SEQ ID NO 14的輕鏈可變區。在一些 實施方式中，抗體包含包含SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :9和/或SEQ ID NO: 13的重鏈可變 區和包含SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:10和/或SEQ ID NO 14的輕鏈可變區的組合。在一些實施方式中，抗體包含包含SEQ ID NO :1的重鏈可變區和包含SEQ ID NO 2的輕鏈可變區。TrkB激動性抗體與TrkB相互作用，其因此能調節TrkB功能。TrkB激動性結合分 子可用於促進TrkB途徑信號傳遞；因此，TrkB激動性結合分子可用於例如診斷、改善與異 常低的TrkB途徑信號傳遞水平相關的呼吸病症(例如，由於患病受試者中TrkB或其蛋白 相互作用者之一的突變形式導致的)，提供保護以抵抗所述呼吸病症以及治療所述呼吸病 症。與對TrkB信號傳遞異常下調相關的病症的非限制性例子(例如，由於TrkB或其蛋白 相互作用者之一的突變形式導致的)是(i)雷特症候群(RTT)，其特徵在於編碼MeCP2(與 BDNF直接結合)的基因中的突變；和(ii)由於TrkB功能喪失突變導致的嚴重肥胖和發育 遲緩(Giles, S.，et al. (2004)Nature Neuroscience 7 1187-9)。本發明還提供了治療、診斷、預防和/或改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT)) 的方法，所述方法包括施用包含治療或預防有效量的TrkB激動性抗體和藥物載體的藥物 組合物。在一些實施方式中，藥物組合物還包含能治療、診斷、預防和/或改善呼吸性窘迫 的症狀(例如呼吸困難)的分開的、獨立的試劑，例如去甲腎上腺素和/或5-羥色胺途徑的 小分子活化劑(例如三環類抗抑鬱劑地昔帕明(DMI)、5_羥色胺IA受體部分激動劑、丁螺 旋酮以及可能更具選擇性的抗抑鬱劑氟西汀和瑞波西汀)、穀氨酸能AMPA受體的活化劑 AMPAkine CX546、前列腺素、孕酮或TrkB活性的增強劑(例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑)。在一些實施方式中，向個體施用與TrkB的抗體激動劑(或含有其的藥物組合物) 組合的治療和/或預防有效量的有效治療、診斷、預防和/或改善呼吸病症(例如雷特綜合 徵(RTT))或呼吸窘迫的症狀的第二種試劑。在一些實施方式中，第二種試劑和TrkB的抗 體激動劑(或含有其的藥物組合物)作為混合物施用。在一些實施方式中，第二種試劑選 自下述物質構成的組去甲腎上腺素和/或5-羥色胺途徑的小分子活化劑(例如三環類抗 抑鬱劑地昔帕明(DMI)、5_羥色胺IA受體部分激動劑、丁螺旋酮以及可能更具選擇性的抗 抑鬱劑氟西汀和瑞波西汀)、穀氨酸能AMPA受體的活化劑=AMPAkine CX546、前列腺素、孕 酮或TrkB活性的增強劑(例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑)。本發明還提供了治療、診斷、預防和/或改善呼吸窘迫(例如通常隨呼吸病症發現 的那些)的方法，所述方法包括施用TrkB激動性抗體(或包含其的藥物組合物)。所述症 狀包括但不限於呼吸困難(例如喘鳴或喘息，屏氣、淺呼吸、換氣過度、延長的呼吸暫停)、 不良或減少的血氧(例如青紫)(例如，由於氧吸收受損、不足的肺血液灌注等導致的)、降 低的去甲腎上腺素(NE)含量、髓質中表達酪氨酸羥化酶的神經元減少以及胸痛。在一些實 施方式中，所述方法包括向個體施用治療或預防有效量的酪氨酸激酶受體B(TrkB)的抗體 激動劑。在一些實施方式中，所述方法包括向個體施用藥物組合物，所述組合物包含治療或 預防有效量的TrkB激動性抗體和藥物載體。在一些實施方式中，個體有一種或多種呼吸病 症和/或正在經歷一種或多種呼吸窘迫的症狀。在一些實施方式中，個體對呼吸窘迫的症 狀易感。在一些實施方式中，個體具有雷特症候群。本發明提供了抑制神經細胞死亡的方法，所述方法包括施用TrkB激動性抗體(或 包含其的藥物組合物)。在一些實施方式中，抗體是人源化抗體。在其它一些實施方式中， 抗體是單鏈抗體。在一些實施方式中，抗體不與酪氨酸激酶受體A或酪氨酸激酶受體C結 合。在一些實施方式中，抗體不與神經營養蛋白受體P75NR結合。在一些實施方式中，抗體能結合人的TrkB，但是不結合其它物種的TrkB。在一些實施方式中，抗體既能結合人的 TrkB,也能結合其它物種的TrkB(即能交叉反應)(包括，例如，與小鼠、大鼠和/或非人靈 長類(例如，獼猴或恆河猴))。在一些實施方式中，抗體是人源化抗體。在多種實施方式中，本發明提供了用調節(或促進)TrkB的一種或多種生物功能 的TrkB激動性抗體來治療、診斷、預防和/或改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT))或 呼吸窘迫症狀的方法，或抑制神經細胞死亡的方法。例如，TrkB激動劑抗體可調節TrkB的 二聚化，以及隨後TrkB細胞內結構域上特定酪氨酸殘基的自身磷酸化。進一步舉例而言， TrkB激動劑抗體可初始化TrkB相關的細胞內信號級聯(例如，有絲分裂原活化的蛋白激 酶、磷脂醯肌醇3-激酶和PLC γ途徑)，由此導致對神經元死亡的抑制、對神經突長出的促 進和神經營養蛋白的其它作用。TrkB激動性抗體包括，例如，與TrkB結合(例如，在TrkB的特定結構域或表位內， 例如，與TrkB的配體結合結構域結合或者配體結合結構域之外)的抗體和包括此類抗體的 抗原結合部分的多肽。TrkB激動性抗體還包括下述分子其中，結合部分並不源於抗體，例 如源於具有免疫球蛋白樣摺疊的多肽的TrkB激動性抗體，並且，其中，通過隨機化、選擇和 親和性成熟對抗原結合部分進行了工程改造，以與TrkB結合。在多種實施方式中，本發明提供了用下述TrkB激動劑抗體來治療、診斷、預防和/ 或改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT))或呼吸窘迫的症狀的方法或抑制神經細胞死亡 的方法，所述抗體能結合人TrkB內的表位並且能與非人靈長類(例如，獼猴或恆河猴)的 TrkB蛋白(或其部分)交叉反應。在多種實施方式中，所述TrkB激動劑抗體能與嚙齒類物 種的TrkB (例如，小鼠TrkB、大鼠TrkB)交叉反應。在多種實施方式中，所述TrkB激動劑抗 體能與人TrkA或TrkC交叉反應。在其它一些實施方式中，本發明提供了用下述TrkB抗體來治療、診斷、預防和/或 改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT))或呼吸窘迫的症狀的方法或抑制神經細胞死亡的 方法，所述抗體與人TrkB內的表位結合，但是不與非人靈長類(例如，獼猴或恆河猴)的 TrkB蛋白(或其部分)交叉反應。在多種實施方式中，所述TrkB激動劑抗體不與嚙齒類物 種的TrkB (例如，小鼠TrkB、大鼠TrkB)交叉反應。在多種實施方式中，所述TrkB激動劑抗 體不與人TrkA或TrkC或神經營養蛋白受體p75NR交叉反應。在多種實施方式中，本發明方法的TrkB激動性抗體的抗原結合部分與線性表位 結合。在多種實施方式中，所述抗原結合部分與非線性表位結合。在多種實施方式中，本發明方法的TrkB激動性抗體的抗原結合部分以等於或低 於1ηΜ、0. 5nM、0. 25nM或0. InM的解離常數(Kd)與TrkB結合。在一些實施方式中，抗體能結合人的TrkB，但是不結合其它物種的TrkB。在一些 實施方式中，抗體既能結合人的TrkB，也能結合其它物種的TrkB (即能交叉反應)(包括，例 如，與小鼠、大鼠和/或非人靈長類(例如，獼猴或恆河猴))。在多種實施方式中，本發明方法的TrkB激動性抗體的抗原結合部分以等於或低 於0. 3nM的Kd與非人靈長類(例如，獼猴或恆河猴)的TrkB結合。在多種實施方式中，所述抗原結合部分以等於或低於0. 5nM的Kd與小鼠TrkB結
I=I O
在一種實施方式中，本發明方法的TrkB激動性抗體是人抗體。在另一實施方式 中，所述TrkB激動劑抗體是非人抗體。在另一實施方式中，所述TrkB激動劑抗體是嵌合 (例如，人源化、人工程化)抗體。在一種實施方式中，本發明方法的TrkB激動性抗體的抗原結合部分是人抗體的 抗原結合部分。所述抗原結合部分可以是單克隆抗體或多克隆抗體的抗原結合部分。本發明方法的TrkB激動性抗體包括例如，抗體的Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2或 Fv片段。在一些實施方式中，本發明方法的TrkB激動劑抗體是聚乙二醇化的。在一些實施 方式中，TrkB激動劑抗體是聚乙二醇化的Fab片段。在一種實施方式中，本發明方法的TrkB激動劑抗體包括單鏈Fv。在一種實施方式中，本發明方法的TrkB激動劑抗體包括雙抗體(例如單鏈雙抗體 或具有兩條多肽鏈的雙抗體)。在一些實施方式中，本發明方法的TrkB激動劑的抗原結合部分源於下述同種型 之一的抗體IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施方式中，所述抗體的抗原結合部分源於 IgA或IgE同種型的抗體。本發明方法的TrkB激動劑抗體可以展示出大量生物活性中的一種或多種。在多 種實施方式中，TrkB激動劑抗體抑制TrkB與BDNF、與神經營養蛋白4(NT_4)和/或與神經 營養蛋白5(NT-5)的結合。例如，相對於對照而言(例如，相對於不存在TrkB激動劑抗體 的情況下的結合而言)，TrkB激動劑抗體將TrkB與BDNF、NT-4和/或NT-5的結合抑制至 少5 %、10 %、15 %、25 %或50 %。在其它一些實施方式中，TrkB激動劑抗體不抑制TrkB與 BDNF、NT-4和/或NT-5的結合，並且不以任何方式與其競爭。在一種實施方式中，本發明方法的TrkB激動劑抗體與BDNF競爭結合TrkB，由此調 節TrkB途徑信號傳導的生物活性和後果。非限制性地舉例而言，本發明方法的TrkB激動 劑抗體能活化、增強或延長TrkB途徑活化和信號傳導(例如通過與BDNF競爭結合TrkB)。 在一些實施方式中，所述TrkB激動劑抗體與TrkB配體結合結構域結合，由此與BDNF競爭 結合TrkB。在一些實施方式中，本發明方法的抗體作為BDNF模擬物發揮作用，其能，例如，重 現所述配體的營養性活性(因此能施加神經保護性和神經營養性作用)。在其它一些實施方式中，本發明方法的TrkB激動劑抗體不結合TrkB配體結合結 構域，並且不與BDNF競爭結合TrkB，但是其仍然可調節TrkB信號途徑(例如活化、增強或 延長TrkB途徑活化和信號傳導)。在多種實施方式中，本發明提供了用下述TrkB激動劑抗體來治療、診斷、預防和/ 或改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT))或呼吸窘迫的症狀的方法或抑制神經細胞死亡 的方法，所述抗體能調節通常由TrkB以直接或間接方式調節的下遊生物活性。所述活性的 非限制性例子包括調節TrkB的二聚化，以及隨後TrkB細胞內結構域上酪氨酸殘基的自身 磷酸化；啟動TrkB相關的細胞內信號級聯(例如，有絲分裂原活化的蛋白激酶、磷脂醯肌醇 3-激酶和PLCy途徑)；以及抑制神經元死亡、促進神經突長出和神經營養蛋白的其它作 用。例如，相對對照(例如相對不存在TrkB激動劑抗體的情況下的活性)而言，本發明方 法的TrkB激動劑抗體將神經元死亡抑制至少5 %、10 %、15 %、25 %或50 %。進一步舉例而言，相對對照(例如相對不存在TrkB激動劑抗體的情況下的活性)而言，所述TrkB激動劑 抗體將TrkB蛋白水平穩定至少5%、10%、15%、25%或50%。在多種實施方式中，本發明提供了用非抗體TrkB激動性分子來治療、診斷、預防 和/或改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT))或呼吸窘迫的症狀的方法或抑制神經細胞 死亡的方法。非抗體TrkB激動劑分子包括下述TrkB結合結構域，其具有源於非抗體多肽 的免疫球蛋白樣(Ig樣)摺疊的胺基酸序列，例如下述之一生腱蛋白(tenascin)、N-鈣 黏著蛋白、E-鈣黏著蛋白、ICAM、肌聯蛋白(titin)、GCSF-受體、細胞因子受體、糖苷酶抑制 劑、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、⑶8、⑶4、⑶2、I類MHC、T-細胞抗原受體、⑶1、 C2和VCAM-I的I-組結構域、肌球蛋白結合蛋白C的I-組免疫球蛋白結構域、肌球蛋白結 合蛋白H的I-組免疫球蛋白結構域、端蛋白(telokin)的I-組免疫球蛋白結構域、NCAM、 顫搐蛋白、神經膠質蛋白(neuroglial!)、生長激素受體、促紅細胞生成素受體、促乳素受 體、幹擾素_ Y受體、-半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、-葡糖苷酸酶、轉穀氨醯胺酶、T-細胞抗 原受體、超氧化物歧化酶、組織因子結構域、細胞色素F、綠色螢光蛋白、GroEL或奇甜蛋白 (thaumatin)。通常，TrkB結合結構域的胺基酸序列相對於免疫球蛋白樣摺疊的胺基酸序 列而言有所改變，使得TrkB結合結構域與TrkB特異性結合(S卩，其中免疫球蛋白樣摺疊不 與TrkB特異性結合)。在多種實施方式中，TrkB結合結構域的胺基酸序列與纖連蛋白、細胞因子受體或 鈣黏著蛋白的免疫球蛋白樣摺疊的胺基酸序列至少60 %相同(例如至少65 %、75 %、80 %、 85%或90%相同)。在多種實施方式中，TrkB結合結構域與下述之一的免疫球蛋白樣摺疊的胺基酸序 列至少60%、65%、75%、80%、85%或90%相同生腱蛋白、N-鈣黏著蛋白、E-鈣黏著蛋白、 ICAM、肌聯蛋白、GCSF-受體、細胞因子受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分 子P0、CD8、CD4、CD2、I類MHC、T-細胞抗原受體、CDl、C2和VCAM-1的I-組結構域、肌球 蛋白結合蛋白C的I-組免疫球蛋白結構域、肌球蛋白結合蛋白H的I-組免疫球蛋白結構 域、端蛋白的I-組免疫球蛋白結構域、NCAM、顫搐蛋白、神經膠質蛋白、生長激素受體、促紅 細胞生成素受體、促乳素受體、幹擾素_ Y受體、_半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、_葡糖苷酸酶、 轉穀氨醯胺酶、T-細胞抗原受體、超氧化物歧化酶、組織因子結構域、細胞色素F、綠色螢光 蛋白、GroEL或奇甜蛋白。在多種實施方式中，TrkB結合結構域以等於或低於InM的Kd與TrkB結合(例如 0. 5nM、0. InM)。在一些實施方式中，Ig樣摺疊是纖連蛋白的Ig樣摺疊，例如III型纖連蛋白的Ig 樣摺疊(例如III型纖連蛋白的模塊10的Ig樣摺疊)。本發明還涉及使用包括本文所述的TrkB激動劑抗體的藥物組合物的方法。所述 組合物包括，例如TrkB激動劑抗體和可藥用載體。在一個方面，本發明涉及通過施用治療和/或預防有效量的TrkB的抗體激動劑 (或含有其的藥物組合物)來抑制神經細胞死亡或促進神經突長出的方法。這些方法包括 將組織或生物樣品(例如表達TrkB的神經元細胞)與治療和/或預防有效量的TrkB的抗 體激動劑(或含有其的藥物組合物)相接觸，由此活化和/或穩定TrkB信號途徑，以及針 對神經營養蛋白(例如BDNF)的作用提供保護。TrkB激動劑抗體(或含有其的藥物組合物)可以以有效抑制神經細胞死亡或促進神經突長出的量施用。在一些實施方式中，所述方法涉及腹膜內注射施用TrkB的抗體激動劑(或含有其 的藥物組合物)。本發明一個或多種實施方式的細節在附圖和下文說明書中詳細示出。本發明的其 它特徵、目的和優點將從說明書和附圖以及權利要求中顯而易見。附圖簡述

圖1圖示了在施用TrkB激動劑抗體的Mecp2敲除小鼠中觀察到的體重和食物攝 入的下降。在圖IA中，最頂上的線(白色方塊示出數據點)代表施用鹽水的Mecp2野生 型小鼠。次頂部的線(黑色方塊示出數據點)代表施用TrkB激動劑抗體的Mecp2野生型 小鼠。次底部的線(白色圓圈示出數據點)代表施用鹽水的Mecp2敲除小鼠。最底部的線 (黑色圓圈示出數據點)代表施用TrkB激動劑抗體的Mecp2敲除小鼠。圖IB中，白色的條 形代表施用鹽水的Mecp2野生型小鼠。黑色的條形代表施用TrkB激動劑抗體的Mecp2野 生型小鼠。淺灰色條形代表施用鹽水的Mecp2敲除小鼠。深灰色的條形代表施用TrkB激 動劑抗體的Mecp2敲除小鼠。圖IB左邊部分代表在6周齡時進行的測量，右邊部分代表在 8周齡時進行的測量。圖2A和2B分別圖示了施用TrkB激動劑抗體的Mecp2敲除小鼠中握力和體脂肪 組成的改善。圖2中，方塊示出的數據點代表用鹽水(SAL)或TrkB激動劑抗體C20處理過 的野生型(WT)小鼠；圓圈示出的數據點代表用鹽水(SAL)或TrkB激動劑抗體C20處理過 的敲除(KO)小鼠。圖2A的左邊部分代表後肢測量，右邊是前肢測量。圖2B的左邊代表體 脂肪含量，右邊是瘦肉質含量。圖3圖示了施用TrkB激動劑抗體的Mecp2敲除小鼠中觀察到的增加的壽命。圖 3A中，敲除小鼠被描述為K0，野生型描述為WT。SAL表示施用鹽水，C20表示施用TrkB激動 劑抗體。圖3B中，敲除小鼠被描述為K0，TrkB激動劑抗體描述為C20。如圖3所示，TrkB 激動劑mAb處理過的敲除小鼠(K0-C20)存活時間是鹽水處理的KO小鼠的至少兩倍。發明詳述本發明提供了用酪氨酸激酶受體B(TrkB)的經分離的抗體激動劑(本文中也被稱 為「TrkB激動性抗體」等等)治療、診斷、預防和/或改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT)) 的方法。所述方法可利用任何TrkB激動劑抗體，具體列出的那些被認為是非限制性的實 施方式。本發明提供了與TrkB結合的分子(「TrkB激動性抗體」)，特別是人抗體或其部 分，其能與人TrkB結合併調節其功能。還提供了 TrkB的表位和結合這些表位的試劑。全長人TrkB序列以Genbank 檢索號AAB33109 (GI =913718)發現，其有822個 殘基。其由Genbank 檢索號S76473 (GI :913717)的mRNA序列編碼。TrkB是在腦中廣 泛分布的神經營養蛋白受體。其是多結構域跨膜蛋白，由細胞外配體結合結構域(LBD)、跨 膜區域和細胞內酪氨酸激酶結構域構成。TrkB是BDNF的高親和性受體，其也能結合神經營 養蛋白4(NT-4)。在一些實施方式中，抗體是人源化抗體。在其它一些實施方式中，抗體是單鏈抗 體。在一些實施方式中，抗體不與酪氨酸激酶受體A或酪氨酸激酶受體C結合。在一些實施方式中，抗體能結合人的TrkB，並且不與其它物種的TrkB結合。在一些實施方式中，抗體 既能結合人的TrkB，也能與其它物種的TrkB結合(即，能交叉反應)(包括，例如，與小鼠、 大鼠和/或非人靈長類(例如，獼猴或恆河猴))。在一些實施方式中，抗體與TrkB的配體結合結構域(LBD)結合。在一些實施方式 中，抗體與腦衍生神經營養因子(BDNF)競爭結合TrkB。在一些實施方式中，抗體與下述競 爭抗體競爭結合TrkB，所述競爭抗體包含包含SEQ ID NO 3的重鏈可變區和包含SEQ ID NO 4的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含包含SEQ ID NO 7的重鏈可變區和包 含SEQ ID NO :8的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含包含SEQID NO: 11的重鏈可 變區和包含SEQ ID NO :12的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含包含SEQ ID NO: 15的重鏈可變區和包含SEQ IDNO 16的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含包含 SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:11 和 / 或 SEQ ID NO 15 的重鏈可變區和包含 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :12和/或SEQ ID NO 16的輕鏈可變區的組合。在一些實施方式中，抗體包含包含 SEQ ID NO 3的重鏈可變區和包含SEQ ID NO 4的輕鏈可變區。在一些實施方式中，本發明方法的抗體作為BDNF模擬物發揮作用，其能例如重現 所述配體的營養性活性(因此能施加神經保護性和神經營養性作用)。在一些實施方式中，本發明的TrkB激動劑抗體結合TrkB配體結合位點和/或與 BDNF競爭結合TrkB。與TrkB的配體結合位點結合的示例性抗體是抗體A10F18. 2 (在本文 中還被稱為「A10F18」或「A10」)。抗體AlO的重鏈可變區在SEQ ID NO 3中例示，抗體AlO 的輕鏈可變區在SEQID NO 4中例示。因此，本發明提供了與包含含SEQ ID NO :3的重鏈可變區以及含SEQID N0:4的輕 鏈可變區的抗體競爭結合TrkB的激動劑抗體。在一些實施方式中，本發明的抗體包含SEQ ID NO :3和/或4的互補決定區(⑶Rs)中的至少之一。不限制本發明的範圍的情況下，我 們認為，CDR3在抗體AlO的結合中具有顯著作用。因此，在一些實施方式中，本發明的抗體 包含SEQ ID N0s:7和/或8。但是，⑶Rl和/或⑶R2也在結合中具有作用。因此，在一些 實施方式中，本發明的抗體包含SEQ ID NOs 11和/或12或15和/或16。在一些實施方式中，抗體不與TrkB的配體結合結構域(LBD)結合。在一些實施方 式中，抗體不與腦衍生神經營養因子(BDNF)競爭結合TrkB。在一些實施方式中，抗體與下 述競爭抗體競爭結合TrkB，所述競爭抗體包含包含SEQ ID NO 1的重鏈可變區和包含SEQ ID NO 2的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含包含SEQ ID NO 5的重鏈可變區和 包含SEQ ID NO 6的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含包含SEQ ID NO 9的重 鏈可變區和包含SEQ ID NO :10的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含包含SEQ ID NO 13的重鏈可變區和包含SEQID NO 14的輕鏈可變區。在一些實施方式中，抗體包含包 含 SEQ IDNO :5、SEQ ID NO :9 禾口 / 或 SEQ ID NO 13 的重鏈可變區和包含 SEQ IDNO :6、SEQ ID N0:10和/或SEQ ID NO 14的輕鏈可變區的組合。在一些實施方式中，抗體包含包含 SEQ ID NO 1的重鏈可變區和包含SEQ IDNO 2的輕鏈可變區。在一些實施方式中，本發明的TrkB激動劑抗體不結合TrkB配體結合位點和/或 不與BDNF競爭結合TrkB。不結合TrkB的配體結合位點的示例性抗體是抗體C20. i. 1. 1(本 文中還被稱為「C20. il」、「C20. II」和「C20」)。抗體C20的重鏈可變區在SEQ ID NO 1中示 例。因此，本發明提供了激動劑抗體，其與包含含SEQ ID NO :1的重鏈可變區以及含SEQIDNO 2的輕鏈可變區的抗體競爭結合TrkB。在一些實施方式中，本發明的抗體包含SEQ ID NO :1和/或2的互補決定區(CDRs)中的至少之一。不限制本發明的範圍的情況下，我們 認為，⑶R3在抗體C20的結合中具有重要作用。因此，在一些實施方式中，本發明的抗體包 含SEQ ID N0s:5和/或6。但是，⑶Rl和/或⑶R2也在結合中具有作用。因此，在一些實 施方式中，本發明的抗體包含SEQ ID NOs :9和/或10或13和/或14。TrkB激動性抗體與TrkB相互作用，由此能調節TrkB功能。TrkB激動性結合分子 可用於促進TrkB途徑信號傳導；因此，TrkB激動性結合分子可用於例如診斷、改善下述呼 吸病症，提供保護以抵擋下述呼吸病症以及治療下述呼吸病症，所述呼吸病症是與異常低 水平的TrkB途徑信號傳導相關的(例如，由於患病受試者中TrkB或其蛋白相互作用者之 一的突變形式導致的)。與對TrkB信號傳導異常下調相關的病症的非限制性例子(例如， 由於TrkB或其蛋白相互作用者之一的突變形式導致的)是雷特症候群(RTT)，其特徵在於 編碼MeCP2 (與BDNF直接結合)的基因中的突變。本發明還提供了用包含治療或預防有效量的TrkB激動性抗體和藥物載體的藥物 組合物治療、診斷、預防和/或改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT))的方法。在一些實 施方式中，藥物組合物還包含能治療、診斷、預防和/或改善呼吸病症的症狀(例如呼吸困 難)的分開的、獨立的試劑，例如去甲腎上腺素和/或5-羥色胺途徑的小分子活化劑(例 如三環類抗抑鬱劑地昔帕明(DMI)、5_羥色胺IA受體部分激動劑、丁螺旋酮以及可能更具 選擇性的抗抑鬱劑氟西汀和瑞波西汀)、穀氨酸能AMPA受體的活化劑AMPAkine CX546、前 列腺素、孕酮或TrkB活性的增強劑(例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑)。所述方法可利用包含治療或預防有效量的任何TrkB激動劑抗體的藥物組合物， 具體列出的那些抗體被認為是非限制性的實施方式。本發明還提供了治療、診斷、預防和/或改善呼吸窘迫症狀(例如通常隨呼吸病症 發現的那些)的方法。所述症狀包括但不限於呼吸困難(例如喘鳴或喘息，屏氣、淺呼吸、 換氣過度、延長的呼吸暫停)、不良或減少的血氧(例如青紫)(例如，由於氧吸收受損、不足 的肺血液灌注等導致的)以及胸痛。在一些實施方式中，所述方法包括向個體施用治療或 預防有效量酪氨酸激酶受體B(TrkB)的抗體激動劑。在一些實施方式中，所述方法包括向 個體施用藥物組合物，所述組合物包含治療或預防有效量的TrkB激動性抗體和藥物載體。 在一些實施方式中，個體有一種或多種呼吸病症和/或正在經歷呼吸窘迫的一種或多種症 狀。在一些實施方式中，個體對呼吸病症的症狀易感。在一些實施方式中，個體具有雷特綜 合徵。所述方法可利用任何TrkB激動劑抗體(或包含任何TrkB激動劑抗體的藥物組合 物)，具體列出的那些抗體被認為是非限制性的實施方式。在一些實施方式中，向個體施用與TrkB的抗體激動劑(或含有其的藥物組合物) 組合的治療和/或預防有效量的第二種有效治療、診斷、預防和/或改善呼吸病症(例如雷 特症候群(RTT))的試劑。在一些實施方式中，第二種試劑和TrkB的抗體激動劑(或含有 其的藥物組合物)作為混合物施用。在一些實施方式中，第二種試劑選自下述物質構成的 組去甲腎上腺素和/或5-羥色胺途徑的小分子活化劑(例如三環類抗抑鬱劑地昔帕明 (DMI)、5_羥色胺IA受體部分激動劑、丁螺旋酮以及可能更具選擇性的抗抑鬱劑氟西汀和 瑞波西汀)、穀氨酸能AMPA受體的活化劑=AMPAkine CX546、前列腺素、孕酮或TrkB活性的增強劑(例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑)。在一些實施方式中，抗體是人源化抗體。在多種實施方式中，本發明提供了用能調節(或促進)TrkB的一種或多種生物功 能的TrkB激動性抗體來治療、診斷、預防和/或改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT))或 呼吸窘迫症狀的方法。例如，TrkB激動劑抗體可調節TrkB的二聚化，以及隨後TrkB細胞 內結構域上特定酪氨酸殘基的自身磷酸化。進一步舉例而言，TrkB激動劑抗體能啟動TrkB 相關的細胞內信號級聯(例如，有絲分裂原活化的蛋白激酶、磷脂醯肌醇3-激酶和PLCy 途徑)，由此導致對神經元死亡的抑制、對神經突長出的促進和神經營養蛋白的其它作用。TrkB激動性抗體包括，例如，與TrkB結合(例如，在TrkB的特定結構域或表位內， 例如，與TrkB的配體結合結構域結合或者配體結合結構域之外)的抗體和包括此類抗體的 抗原結合部分的多肽。TrkB激動性抗體還包括下述分子其中，結合部分並不源於抗體，例 如源於具有免疫球蛋白樣摺疊的多肽的TrkB激動性抗體，並且，其中，通過隨機化、選擇和 親和性成熟對抗原結合部分進行了工程改造，以與TrkB結合。在多種實施方式中，本發明提供了用下述TrkB激動劑抗體來治療、診斷、預防和/ 或改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT))或呼吸窘迫的症狀的方法，所述抗體能結合人 TrkB內的表位並且能與非人靈長類(例如，獼猴或恆河猴)的TrkB蛋白(或其部分)交叉 反應。在多種實施方式中，所述TrkB激動劑抗體能與嚙齒類物種的TrkB (例如，小鼠TrkB、 大鼠TrkB)交叉反應。在多種實施方式中，所述TrkB激動劑抗體能與人TrkA或TrkC交叉 反應。在其它一些實施方式中，本發明提供了用下述TrkB抗體來治療、診斷、預防和/或 改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT))或呼吸窘迫的症狀的方法，所述抗體與人TrkB內 的表位結合，但是不與非人靈長類(例如，獼猴或恆河猴)的TrkB蛋白(或其部分)交叉 反應。在多種實施方式中，所述TrkB激動劑抗體不與嚙齒類物種的TrkB (例如，小鼠TrkB、 大鼠TrkB)交叉反應。在多種實施方式中，所述TrkB激動劑抗體不與人TrkA或TrkC或神 經營養蛋白受體P75NR交叉反應。在多種實施方式中，本發明方法的TrkB激動性抗體的抗原結合部分與線性表位 結合。在多種實施方式中，所述抗原結合部分與非線性表位結合。在多種實施方式中，本發明方法的TrkB激動性抗體的抗原結合部分以等於或低 於1ηΜ、0. 5nM、0. 25nM或0. InM的解離常數(Kd)與TrkB結合。在一些實施方式中，抗體能結合人的TrkB，但是不結合其它物種的TrkB。在一些 實施方式中，抗體既能結合人的TrkB，也能結合其它物種的TrkB (即能交叉反應)(包括，例 如，與小鼠、大鼠和/或非人靈長類(例如，獼猴或恆河猴))。在多種實施方式中，本發明方法的TrkB激動性抗體的抗原結合部分以等於或低 於0. 3nM的Kd與非人靈長類(例如，獼猴或黑猩猩)的TrkB結合。在多種實施方式中，所述抗原結合部分以等於或低於0. 5nM的Kd與小鼠TrkB結
口 O在一種實施方式中，本發明方法的TrkB激動性抗體是人抗體。在另一實施方式 中，所述TrkB激動劑抗體是非人抗體。在另一實施方式中，所述TrkB激動劑抗體是嵌合 (例如，人源化、人工程化)抗體。
在一種實施方式中，本發明方法的TrkB激動性抗體的抗原結合部分是人抗體的 抗原結合部分。所述抗原結合部分可以是單克隆抗體或多克隆抗體的抗原結合部分。本發明方法的TrkB激動性抗體包括例如，抗體的Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2或 Fv片段。在一些實施方式中，本發明方法的TrkB激動劑抗體是聚乙二醇化的。在一些實施 方式中，TrkB激動劑抗體是聚乙二醇化的Fab片段。在一種實施方式中，本發明方法的TrkB激動劑抗體包括單鏈Fv。在一種實施方式中，本發明方法的TrkB激動劑抗體包括雙抗體(例如單鏈雙抗體 或具有兩條多肽鏈的雙抗體)。在一些實施方式中，本發明方法的TrkB激動劑抗體的抗原結合部分源於下述同 種型之一的抗體IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施方式中，所述抗體的抗原結合部分 源於IgA或IgE同種型的抗體。在一種實施方式中，本發明方法的TrkB激動劑抗體與BDNF競爭結合TrkB，由此 調節TrkB途徑信號傳導的生物活性和後果。作為非限制性實例，本發明方法的TrkB激動 劑抗體可活化、增強或延長TrkB途徑活化和信號傳導(例如通過與BDNF競爭結合TrkB)。 在一些實施方式中，所述TrkB激動劑抗體與TrkB配體結合結構域結合，由此與BDNF競爭 結合TrkB。在一些實施方式中，本發明方法的抗體作為BDNF模擬物發揮作用，其能，例如，重 現所述配體的營養性活性(因此能施加神經保護性和神經營養性作用)。在其它一些實施方式中，本發明方法的TrkB激動劑抗體不結合TrkB配體結合結 構域，並且不與BDNF競爭結合TrkB，但是其可調節TrkB信號途徑(例如活化、增強或延長 TrkB途徑活化和信號傳導)。在多種實施方式中，本發明提供了用下述TrkB激動劑抗體來治療、診斷、預防和/ 或改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT))或呼吸窘迫的症狀的方法，所述抗體能調節通常 由TrkB以直接或間接方式調節的下遊生物活性。所述活性的非限制性例子包括調節TrkB 的二聚化，以及隨後TrkB細胞內結構域上酪氨酸殘基的自身磷酸化；啟動TrkB相關的細胞 內信號級聯(例如，有絲分裂原活化的蛋白激酶、磷脂醯肌醇3-激酶和PLCy途徑)；以及 抑制神經元死亡、促進神經突長出和神經營養蛋白的其它作用。例如，相對對照(例如相對 不存在TrkB激動劑抗體的情況下的活性)而言，本發明方法的TrkB激動劑抗體將神經元 死亡抑制至少5%、10%、15%、25%或50%。進一步舉例而言，相對對照(例如相對不存在 TrkB激動劑抗體的情況下的活性)而言，所述TrkB激動劑抗體將TrkB蛋白水平穩定至少 5%、10%、15%、25%或 50%。在多種實施方式中，本發明提供了用非抗體TrkB激動性分子來治療、診斷、預防 和/或改善呼吸病症(例如雷特症候群(RTT))或呼吸窘迫的症狀的方法。非抗體TrkB激 動劑分子包括下述TrkB結合結構域，其具有源於非抗體多肽的免疫球蛋白樣(Ig樣)摺疊 的胺基酸序列，例如下述之一生腱蛋白、N-鈣黏著蛋白、E-鈣黏著蛋白、ICAM、肌聯蛋白、 GCSF-受體、細胞因子受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、 ⑶2、1類1^(、11-細胞抗原受體、^1丄2和VCAM-I的I-組結構域、肌球蛋白結合蛋白C的 I-組免疫球蛋白結構域、肌球蛋白結合蛋白H的I-組免疫球蛋白結構域、端蛋白的I-組免疫球蛋白結構域、NCAM、顫搐蛋白、神經膠質蛋白、生長激素受體、促紅細胞生成素受體、 促乳素受體、幹擾素_ Y受體、「半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、「葡糖苷酸酶、轉穀氨醯胺酶、 T-細胞抗原受體、超氧化物歧化酶、組織因子結構域、細胞色素F、綠色螢光蛋白、GroEL或 奇甜蛋白。通常，TrkB結合結構域的胺基酸序列相對於免疫球蛋白樣摺疊的胺基酸序列而 言有所改變，使得TrkB結合結構域與TrkB特異性結合(即，其中免疫球蛋白樣摺疊不與 TrkB特異性結合)。在多種實施方式中，TrkB結合結構域的胺基酸序列與纖連蛋白、細胞因子受體或 鈣黏著蛋白的免疫球蛋白樣摺疊的胺基酸序列至少60 %相同(例如至少65 %、75 %、80 %、 85%或90%相同)。在多種實施方式中，TrkB結合結構域與下述之一的免疫球蛋白樣摺疊的胺基酸序 列至少60%、65%、75%、80%、85%或90%相同生腱蛋白、N-鈣黏著蛋白、E-鈣黏著蛋白、 ICAM、肌聯蛋白、GCSF-受體、細胞因子受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分 子P0、CD8、CD4、CD2、I類MHC、T-細胞抗原受體、CDl、C2和VCAM-1的I-組結構域、肌球 蛋白結合蛋白C的I-組免疫球蛋白結構域、肌球蛋白結合蛋白H的I-組免疫球蛋白結構 域、端蛋白的I-組免疫球蛋白結構域、NCAM、顫搐蛋白、神經膠質蛋白、生長激素受體、促紅 細胞生成素受體、促乳素受體、幹擾素_ Y受體、_半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、_葡糖苷酸酶、 轉穀氨醯胺酶、T-細胞抗原受體、超氧化物歧化酶、組織因子結構域、細胞色素F、綠色螢光 蛋白、GroEL或奇甜蛋白。在多種實施方式中，TrkB結合結構域以等於或低於InM的Kd與TrkB結合(例如 0. 5nM、0. InM)。在一些實施方式中，Ig樣摺疊是纖連蛋白的Ig樣摺疊，例如III型纖連蛋白的Ig 樣摺疊(例如III型纖連蛋白的模塊10的Ig樣摺疊)。本發明還涉及使用包括本文所述的TrkB激動劑抗體的藥物組合物的方法。所述 組合物包括，例如TrkB激動劑抗體和可藥用載體。在一個方面，本發明涉及通過施用治療和/或預防有效量的TrkB的抗體激動劑 (或含有其的藥物組合物)來抑制神經細胞死亡或促進神經突長出的方法。這些方法包括 將組織或生物樣品與治療和/或預防有效量的TrkB的抗體激動劑(或含有其的藥物組合 物)相接觸，由此活化和/或穩定TrkB信號途徑。TrkB激動劑抗體(或含有其的藥物組合 物)可以以有效抑制神經細胞死亡或促進神經突長出的量施用。在一些實施方式中，所述方法涉及腹膜內注射施用TrkB的抗體激動劑(或含有其 的藥物組合物)。根據本發明的方法可使用任何類型的TrkB激動劑抗體。通常，使用的抗體是單 克隆抗體。可通過本領域已知的任何方法來產生單克隆抗體(例如使用雜交瘤、重組表達 和/或噬菌體展示)。不加限制的情況下，本發明的方法中可使用來自任何下述專利和非 專利公開文獻的 TrkB 激動劑抗體Qian，M.，et al. (2006) Journal of Neurosci. 26(37)； 9394-9403 ；美國專利號5，910，574 (及其任何相關的同族專利)；PCT專利公開號 W006/133164(及其任何相關的同族專利)。定義在本文中使用時，術語「呼吸病症」包括但不限於肺不張、囊性纖維化、雷特症候群(RTT)、哮喘、呼吸暫停(例如睡眠呼吸暫停)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、慢性阻塞性 肺病(COPD)、肺氣腫、急性呼吸困難、呼吸急促、端坐呼吸、類風溼性肺病、肺充血或水腫、慢 性氣道阻塞性疾病(例如肺氣腫、慢性支氣管炎、支氣管哮喘和支氣管擴張)、換氣不足、匹 克威克症候群、肥胖換氣不足症候群、嬰兒猝死症候群(SIDS)和呼吸過度。此外，「呼吸病症」還包括人類中已知與遺傳缺陷有關的狀況，例如沙-馬-圖 病、Cheyne-Stokes呼吸病、Willi-Prader症候群、嬰兒猝死症候群、先天性中樞性肺換氣 不足、瀰漫性間質性疾病(例如結節病、塵肺病、過敏性肺炎、細支氣管炎、古德帕斯丘綜合 徵、特發性肺纖維化、特發性肺含鐵血黃素沉著症、肺泡蛋白沉著症、脫屑性間質肺炎、慢性 間質性肺炎、纖維化肺泡炎、哈_裡症候群、肺嗜酸性粒細胞增多症、瀰漫性間質性纖維化、 韋格納肉芽腫病、淋巴瘤樣肉芽腫和脂質性肺炎)或腫瘤(例如支氣管原癌、細支氣管肺泡 癌、支氣管類癌、錯構瘤和間質瘤)。在本文中使用時，「調節」表示直接或間接控制或影響的能力，作為非限制性實例， 或者可表示抑制或刺激、激動或拮抗、阻礙或促進以及加強或削弱。「預防有效劑量」和「治療有效劑量」的本發明的TrkB激動性抗體可分別預防疾病 症狀(例如，與異常低的TrkB水平或TrkB的突變拷貝相關的病症的症狀)的發作或者使得 這些症狀的嚴重性降低。所述術語還可分別促進或增加疾病無症狀期的頻率和持續時間。 「預防有效劑量」和「治療有效劑量」還可分別預防或改善由於患TrkB相關病症或呼吸病症 導致的受損或殘障。術語「受試者」意欲包括遭受或患有與異常TrkB信號途徑相關的疾病、病症或狀 況的生物，例如真核生物。受試者的例子包括哺乳動物，例如，人、狗、奶牛、馬、豬、綿羊、山 羊、貓、小鼠、兔、大鼠和轉基因非人動物。在某些實施方式中，受試者是人，例如，遭受本文 所述的呼吸病症或狀況(例如雷特症候群(RTT))、處於遭受本文所述的呼吸病症或狀況 (例如雷特症候群(RTT))的風險中或可能遭受本文所述的呼吸病症或狀況(例如雷特綜合 徵(RTT))的人。術語「抗體」在本文中使用時表示完整的抗體或抗原結合片段(即「抗原結合部 分」)或其單鏈(即輕鏈或重鏈)。完整抗體是包含通過二硫鍵相互連接的至少兩條重(H) 鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白。每條重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫SVh)和重鏈恆定區。 重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為 Vl)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域Q。V1^nt區域可進一步細分為被稱為 互補決定區(CDR)的高變區，其間散布有被稱為構架區(FR)的更保守的區域。每個Vh* Vl由從氨基末端到羧基末端以下述順序排列的三個⑶Rs和四個FRs構成冊1、⑶R1、FR2、 ⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合區。抗體的恆定區 可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的多種細胞(例如效應細胞)和經典 補體系統的第一組分(Clq))的結合。術語抗體的「抗原結合部分」在本文中使用時表示完整抗體中保留有與給定抗原 (例如TrkB)特異性結合的能力的一條或多條片段。抗體的抗原結合功能可通過完整抗體 的片段來實現。術語抗體的「抗原結合部分」所包括的結合片段的例子包括Fab片段—— 由\、VH、Cl和CHl結構域構成的單價片段；F(ab)2片段——包含通過二硫橋在鉸鏈區相 連的兩條Fab片段(通常一條來自重鏈，一條來自輕鏈)的二價片段；Fd片段——由％和CHl結構域構成；Fv片段——由抗體單臂的\和Vh結構域構成；單結構域抗體(dAb)片段 (Ward et al.，1989Nature 341 544-546)——其由Vh結構域構成；以及經分離的互補決定 區(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結構域——Vl和Vh是不同基因編碼的，但是可使用重 組方法通過人工肽接頭將其連接起來，使得它們被製造為單條蛋白鏈，其中，區域 配對形成單價分子(也被稱為單鏈Fv(scFv)；見，例如，Bird et al.，1988Science 242 423-426 ；and Huston et al.，1988Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :5879_5883)。此類單鏈抗體包 括抗體的一個或多個「抗原結合部分」。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得這些抗體 片段，以與完整抗體相同方式篩選這些片段的效用。抗原結合部分還可摻入單結構域抗體、大抗體(maxibodies)、微型抗體、胞內抗 體(intrabodies)、雙抗體、三抗體、四抗體、v—NAR禾口雙一scFv (見，例如Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology，23，9，1126-1136)。抗體的抗原結合部分可移植到基 於多肽(例如III型纖連蛋白(Fn3))的骨架中(見美國專利號6，703，199，其描述了纖連 蛋白多肽單抗體(monobodies))。抗原結合部分可摻入包含串聯Fv區段對(Vh-CHI-Vh-CHI)的單鏈分子，與互補輕 鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata et al.，1995Protein Eng. 8(10) 1057-1062 和 美國專利號5，641，870)。術語「駱駝抗體(camelid antibody) 」在本文中使用時表示從駱駝和單峰駝 (Camelus bactrianus禾口 Calelus dromaderius)家族的成員(包括新世界的成員，例如美 洲駝物種(Lama paccos、Lama glama ^P Lamavicugna))獲得的完整抗體的一個或多個片 段。駱駝抗體的小的單可變結構域(被鑑定為Vhh)區域可通過遺傳工程獲得，以產生具有 針對靶標的高度親和性的小蛋白，從而產生被稱為「駱駝納米抗體」的低分子量的、源於抗 體的蛋白。見美國專利號 5，759，808 ；還見 Stijlemans et al. ,2004 J.Biol. Chem. 279 1256-1261 ；Dumoulin et al.,2003Nature 424 783-788 ；Pleschberger et al. ,2003 Bioconjugate Chem. 14 440~448 ；Cortez-Retamozo et al. ,2002Int.J.Cancer 89: 456-62 和 Lauwereys. et al.，1998 EMBO J. 17 :3512_3520。「經分離的TrkB激動劑抗體」在本文中使用時指這樣的結合分子，其基本上沒有具 有針對非TrkB的抗原的抗原特異性的分子(例如，經分離的抗體，其特異性結合TrkB，但是 基本上沒有特異性結合非TrkB的抗原的抗體)。但是，經分離的特異性結合TrkB的結合分 子可具有對其它抗原(例如，來自其它物種的TrkB分子)的交叉反應性。如果結合分子基 本上不含細胞物質，那麼該結合分子是「經純化的」。在本文中使用時，術語「人工程化抗體」表示結合相同表位但是序列不同的抗體。 示例性技術包括通過Kalobios的人工程化技術生產的人工程化抗體，其中，抗原結合區域 的序列是通過例如突變獲得的，而非由於保守胺基酸置換獲得。在本文中使用時，「特異性結合TrkB」的TrkB激動劑抗體(例如抗體或其抗原結 合部分)意欲表示以1x10_7M或更低的Kd與TrkB結合的TrkB激動劑抗體。與「抗原交叉 反應」的TrkB激動劑抗體(例如，抗體或其抗原結合部分)意欲表示以IxlO-6M或更低的 Kd與抗原結合的TrkB激動劑抗體。「不與」給定抗原「交叉反應」的TrkB激動劑抗體(例 如，抗體或其抗原結合部分)意欲表示這樣的TrkB激動劑抗體，其與給定抗原的結合無法檢測到，或者其以IxlO-5M或更高的Kd與給定抗原結合。在某些實施方式中，不與抗原交叉 反應的此類結合分子在標準結合測定中展示出基本上檢測不到的針對這些蛋白的結合。術語「單克隆抗體組合物」在本文中使用時表示單種分子組成的抗體分子的製備 物。單克隆抗體組合物展示出針對特定表位的單結合特異性和親和性。術語「人抗體」在本文中使用時意欲包括具有可變區的抗體，其中，構架和CDR 區源於人源序列。此外，如果抗體含有恆定區，恆定區也源於此類人序列，例如，人種系 (germline)序列或人種系序列的突變形式。本發明的人抗體可包括不由人序列編碼的氨基 酸殘基(例如，通過隨機或位點特異性誘變體外引入或通過體細胞突變體內引入的突變)。 但是，術語「人抗體」在本文中使用時不包括下述抗體其中，源於另外的哺乳動物物種(例 如小鼠)的種系的CDR序列被移植到人構架序列上。術語「人單克隆抗體」指這樣的抗體，其展示出單結合特異性，具有可變區，其中， 構架區和CDR區域都源於人序列。在一種實施方式中，人單克隆抗體是通過雜交瘤產生的， 所述雜交瘤包括與永生化細胞融合的從轉基因非人動物(例如，轉基因小鼠，其具有包含 人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組)獲得的B細胞。術語「重組人抗體」在本文中使用時包括通過重組手段製備、表達、製造或分離 的任何人抗體，例如，從對於人免疫球蛋白基因為轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠) 或由其製備的雜交瘤分離的抗體；從經轉化以表達人抗體的宿主細胞(例如從轉染瘤 (transfeetoma))分離的抗體；從重組、組合人抗體文庫分離的抗體；以及通過涉及將人免 疫球蛋白基因序列的全部或部分與另外的DNA序列剪接的任何其它手段製備、表達、製造 或分離的抗體。此類重組人抗體具有下述可變區，其中，構架和CDR區源於人種系免疫球蛋 白序列。但是，在某些實施方式中，此類重組人抗體可經歷體外誘變(或者當使用對人Ig 序列轉基因的動物時，經歷體內體細胞誘變)，由此，重組抗體的Vh和\區域的胺基酸序列 是這樣的序列雖然源於人種系Vh和\序列及與其相關，但可不天然存在於人的人抗體種 系的全部組成部分(i^pertoire)中。在本文中使用時，「同種型」指重鏈恆定區基因編碼的抗體類(例如IgM、IgE、IgG， 例如 IgGl 或 IgG4)。短語「識別抗原的抗體」或「對抗原特異性的抗體」在本文中可與術語「特異性結 合抗原的抗體」互換使用。在提到蛋白或肽時，短語「特異性(或選擇性)結合」抗體或「特異性(或選擇性)
與......免疫反應」指這樣的結合反應，其能確定蛋白質在異源蛋白群或其它生物製劑中
的存在。因此，在指定的免疫測定條件下，指出的抗體以背景至少兩倍的水平與特定蛋白結 合，並且基本上不以顯著的量與樣品中存在的其它蛋白結合。在此類條件下與抗體的特異 性結合可能需要針對其與特定蛋白的特異性選擇出的抗體。這種選擇可通過扣除與例如 TrkA或TrkC或神經營養蛋白受體p75NR交叉反應的抗體來實現。多種免疫測定形式可用 於選擇能與特定蛋白特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定常規用於選擇能 與蛋白特異性免疫反應的抗體(關於可用於測定特異性免疫反應性的免疫測定形式和條 件的描述，見例如 Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual (1998))。典型地，特異 性或選擇性反應將是背景信號或噪聲的至少兩倍，更典型地，超過背景10-100倍以上。術語「抗體激動劑」指這樣的抗體，其能活化受體以誘導出完全或部分的受體介導的應答。例如，TrkB的激動劑與TrkB結合，並且誘導TrkB介導的信號傳導。在一些實施 方式中，可通過其接觸SH-SY5Y細胞時結合TrkB並誘導神經突長出的能力，或按照本文所 述，來鑑定針對激動劑的TrkB抗體。本發明的多肽的「活性」指多肽在其天然細胞或組織中的結構、調控或生物化學功 能。多肽的活性的例子包括直接活性和間接活性。示例性的直接活性是與多肽直接相互作 用的結果，包括配體結合，例如，BDNF與配體結合結構域(LBD)的結合。在本文中使用時，提到IgG抗體時，術語「高度親和性」表示抗體針對靶抗原具有 ICT9M或更低的Kd。如果核苷酸序列被改變，以使用在生產細胞或生物(通常是真核細胞，例如，酵 母(例如畢赤酵母(Pichia))的細胞，昆蟲細胞，哺乳動物細胞，例如，中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)或人細胞)中優選的密碼子來編碼胺基酸序列的話，該核苷酸序列就被稱為「經優化 的」。經優化的核苷酸序列被工程改造，以編碼與原始起始核苷酸序列編碼的胺基酸序列 (也被稱為「親本」序列)相同或幾乎相同的胺基酸序列。下文章節中更詳細地描述了本發明的多個方面。用於評估分子結合多個物種的TrkB(特別是TrkB的表位)的能力的標準測定法 是本領域已知的，其包括，例如ELISAs和western印跡。可利用肽表位競爭測定法，來測定 TrkB激動劑抗體是否結合TrkB的特異性表位。例如，將TrkB激動劑抗體與對應於感興趣 的TrkB表位的肽在肽的飽和濃度下一起孵育。針對與固定化的TrkB的結合，對經預孵育 的TrkB激動劑抗體進行測試，例如通過；Biaeore 分析來進行。與肽預孵育對TrkB結合的 抑制表明，TrkB激動劑抗體與肽表位結合(見，例如，美國專利公開20070072797)。還可通 過本領域已知的標準測定法來評估結合動力學，例如通過Biaeore 分析，或通過facs分 析來評估表觀結合。下文中詳細描述了評價TrkB激動性抗體對TrkB功能性質的影響的測 定法。因此，按照本領域已知的和本文描述的方法測定時，「抑制」這些TrkB功能性質 (例如，生物化學、細胞、生理或其它生物活性等等)中一種或多種的TrkB激動劑抗體將被 理解為相對於在不存在結合分子的情況下(例如，當存在無關特異性的對照分子時)觀察 到的而言，特定功能性質產生統計學上顯著減少。抑制TrkB活性的TrkB激動劑抗體能實 現將測定參數統計學上顯著減少至少5%。在某些實施方式中，拮抗抗體或其它TrkB激動 劑抗體可使得選擇的功能性質較之對照減少至少10%、20%、30%或50%。識別或促進TrkB活性的TrkB激動劑抗體實現將測量的參數統計學上顯著地增加 至少5%。在某些實施方式中，TrkB激動劑抗體或其部分可使得選擇的功能性質較之對照 增加至少10%、20%、30%或50%。jrf.^本文描述的抗TrkB抗體包括人單克隆抗體。在某些實施方式中，與TrkB結合的 抗體的抗原結合部分(例如Vh和\鏈)是「混合併匹配的」，以產生其它抗TrkB激動性抗 體。可使用前文所述的結合測定(例如ELISAs)來測試此類「混合併匹配的」抗體的結合。 當選擇Vh與特定\序列混合併匹配時，典型地，選擇的Vh與其在和該\的配對中置換的Vh 結構上相似。類似地，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對的全長重鏈序列通常被結構上相 似的全長重鏈序列置換。類似地，來自特定配對的\序列應當被結構上相似的\序列置換。類似地，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對的全長輕鏈序列應當被結構上相似的 全長輕鏈序列置換。本文上下文中，鑑定結構相似性是本領域公知的方法。在其它方面，本發明提供了以多種組合包含一種或多種TrkB結合抗體的重鏈和 輕鏈⑶Rls、⑶R2s和⑶R3s的抗體。鑑於這些抗體每條都可結合TrkB，並且抗原結合特 異性主要由CDRU2和3區域提供，VhCDRU2和3序列和Vl CDRU2和3序列可「混合併匹 配」(即，來自不同抗體的CDRs可混合併匹配)。可使用本文描述的結合測定(例如ELISAs) 來測試此類「混合併匹配的」抗體的TrkB結合。CDR序列結合併匹配時，來自特SVh 序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列應當被結構上相似的⑶R序列置換。類似地，當Vl⑶R 序列混合併匹配時，來自特定\序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列應當被結構上相似的 CDR序列置換。本文上下文中，鑑定結構相似性是本領域公知的方法。在本文中使用時，如果抗體的可變區或全長鏈是從使用人種系免疫球蛋白基因作 為序列來源的系統獲得的話，人抗體包含重或輕鏈可變區或全長重或輕鏈，其是特定種系 序列「的產物」或「源於」特定種系序列。在一種此類系統中，人抗體是在攜帶人免疫球蛋白 基因的轉基因小鼠中產生的。用感興趣的抗原(例如，TrkB的表位)免疫轉基因。或者， 通過提供在噬菌體上展示的人免疫球蛋白基因文庫並且用感興趣的抗原(例如TrkB的表 位)篩選該文庫，來鑑定人抗體。可通過將人抗體的胺基酸序列與人種系免疫球蛋白的胺基酸序列相比較，並選擇 序列上與人抗體的序列最接近(即，最高％同一性)的人種系免疫球蛋白序列，來鑑定是人 種系免疫球蛋白序列「的產物」的或「源於」其的人抗體。是特定人種系免疫球蛋白序列「的 產物」的或「源於」其的人抗體較之種系編碼的序列可含有胺基酸差異，所述差異例如由於 天然存在的體細胞突變或人工定點突變導致的。但是，選擇的人抗體典型地具有與人種系 免疫球蛋白基因編碼的胺基酸序列至少90%同一性的胺基酸序列，並且含有當與其它物種 的種系免疫球蛋白胺基酸序列(例如小鼠種系序列)比較時將人抗體鑑定為人的胺基酸殘 基。在某些情況下，人抗體在胺基酸序列上可與種系免疫球蛋白基因編碼的胺基酸序列有 至少60%、70%、80%、90%或至少95%同一性，或者甚至至少96%、97%、98%或99%同一 性。兩條序列間的百分比同一性是序列共享的相同位置的數量的函數(即，％同一性 =相同位置#/總位置#χ100)，其中要考慮到空位數量和每個空位的長度，需要引入這些空 位以對兩條序列進行最優比對。使用E. Meyers和W. Miller的算法(1988 Comput. Appl. Biosci.，4 :11_17)，來比較序列並且測定兩條序列間的百分比同一性，該算法已被整合到 ALIGN程序(版本2. 0)，其中使用PAM120權重殘值表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。典型地，源於特定人種系序列的人抗體的￥11或\將展示出與人種系免疫球蛋白基 因編碼的胺基酸序列相比不超過10個胺基酸差異。在某些情況下，人抗體的Vh或\可展 示出與種系免疫球蛋白基因編碼的胺基酸序列相比不超過5個或者甚至不超過4、3、2或1 個胺基酸差異。駱駝抗體已在大小、結構複雜性和對人受試者的抗原性方面，對從駱駝和單峰駝(Camelus bactrianus和Calelus dromaderius)家族的成員(包括新世界的成員，例如美洲駝物種 (Lamapaccos、Lama gIama禾口 Lama vicugna))獲得的抗體蛋白進行了表徵。自然界中在該家族的哺乳動物中發現的某些IgG抗體缺少輕鏈，並且由此在結構上與來自其它動物的抗 體典型的具有兩條重鏈和兩條輕鏈的四鏈四級結構有所不同。見WO 94/04678。駱駝抗體的小的單可變結構域(被鑑定為Vhh)區域可通過遺傳工程獲得，以產 生具有針對靶標的高度親和性的小蛋白，從而產生被稱為「駱駝納米抗體」的低分子量的 源於抗體的蛋白質。見美國專利號5，759，808 ；還見Stijlemans et al. ,2004 J.Biol. Chem. 279 1256-1261 ；Dumoulin et al. ,2003 Nature 424 783-788 ；Pleschberger et al.,2003Bioconj ugate Chem. 14 440~448 ；Cortez-Retamozo et al.,2002Int. J. Cancer 89 456-62 和 Lauwereys. et al.，1998EMB0 J. 17 :3512_3520。路輪抗體和抗體片段的工 程化文庫可商業獲得，例如從Ablynx，Ghent, Belgium獲得。和非人來源的其它抗體一樣， 駱駝抗體的胺基酸序列可被重組改變，以獲得更接近於人序列的序列，即，納米抗體可以是 「人源化的」。因此，駱駝抗體對人的天然低抗原性可被進一步降低。駱駝納米抗體具有大約是人IgG分子十分之一的分子量，該蛋白具有僅數納米的 物理直徑。小尺寸的一種後果是駱駝納米抗體能結合對於較大抗體蛋白來說功能上不可見 的抗原位點，即，駱駝納米抗體可用作為試劑，以檢測使用經典免疫技術檢測不到的抗原， 以及可用作為可能的治療劑。因此，小尺寸的另一結果是，由於與靶蛋白的溝或窄縫中的特 異性位點結合，駱駝納米抗體可抑制靶蛋白，以及由此可以以比典型抗體更接近典型低分 子量藥物的功能的能力發揮作用。低分子量和緊湊的大小進一步導致駱駝納米抗體極其熱穩定、對極端pH和對蛋 白水解消化穩定，和更少的抗原性。另一結果是，駱駝納米抗體易於從循環系統移動進組 織，並且甚至穿過血腦屏障，因此可治療影響神經組織的病症。納米抗體可進一步協助藥物 運輸穿過血腦屏障。見2004年8月19日公開的美國專利公開號20040161738。這些特徵 與在人中的低抗原性組合表明了極大的治療潛力。此外，這些分子可在原核細胞，例如大腸 桿菌中完全表達。因此，本發明的特徵是具有針對TrkB的高度親和性的駱駝抗體或駱駝納米抗體。 在本文某些實施方式中，駱駝抗體或納米抗體是在駱駝動物中天然產生的，即，使用本文所 述針對其它抗體的技術，用TrkB或其肽片段進行免疫之後由駱駝產生的。或者抗TrkB的 駱駝納米抗體是工程化的，即，通過選擇，例如，使用淘選方法，用本文描述的TrkB或TrkB 表位作為靶標，從展示經合適誘變的駱駝納米抗體蛋白的噬菌體文庫進行選擇，來生產抗 TrkB的駱駝納米抗體。可通過遺傳工程對經工程化的納米抗體進行進一步定製，以將接受 的受試者中的半壽期從45分鐘增加至2周。雙抗體雙抗體是二價的、雙特異性的分子，其中，V1^Pt結構域在單條多肽鏈上表達，它 們通過短到不允許相同鏈上兩個結構域間配對的接頭相連。Vh和\結構域與另一條鏈的 互補結構域配對，由此產生兩個抗原結合位點(見例如，Holliger et al. , 1993Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :6444_6448 ；Poljak et al.，1994Structure 2 1121-1123)。可通過在相 同細胞中表達具有結構νΗΑ-νω和Vhb-Vla (Vh-Vl構型)或Vla-Vhb和\B_VHA (Vl-Vh構型)的兩 條多肽鏈，來產生雙抗體。它們中的大多數可以以可溶形式在細菌中表達。單鏈雙抗體(scDb)是通過用大約15個胺基酸殘基的接頭將兩條形成雙抗體的 多肽鏈連接起來而產生的(見 Holliger and Winter, 1997Cancer Immunol. Immunother.,45(3-4) 128-30 ；Wu et al. , 1996Immunotechnology, 2 (1) :21_36)。scDb 可以以可溶的活 性單體形式在細菌中表達(見 Holliger and Winter, 1997Cancer Immunol. Immunother.， 45(34) 128-30 ；Wu et al. ,1996Immunotechnology, 2(1) 21-36 ；Pluckthun and Pack, 1997Immunotechnology,3 (2) 83-105 ；Ridgway et al. , 1996Protein Eng. ,9 (7) 617-21)。雙抗體可與Fc 融合，產生「雙雙抗體」(見 Lu et al. , 2004J. Biol. Chem. ,279(4) 2856-65)。經工稈化和修飾的抗體可使用具有一條或多條Vh和/或\序列的抗體作為起始材料，對經修飾的抗體工 程化，來製備本發明的抗體，其中所述經修飾的抗體具有與起始抗體不同的性質。可通過修 飾一個或全部兩個可變區(即，\和/或VJ中(例如，一個或多個CDR區域中和/或一個 或多個構架區中)的一個或多個殘基，來對抗體工程化。此外或備選地，可通過修飾恆定區 內的殘基，來對抗體進行工程化，例如，以改變抗體的效應功能。可進行的一種類型的可變區工程化是⑶R移植。抗體主要通過位於六個重鏈和輕 鏈CDRs中的胺基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，在各抗體間CDRs內的胺基酸序列要比 CDRs外的序列更具多樣性。因為CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，因此可通過構 建下述表達載體，來表達模擬特異性的天然存在的抗體的性質的重組抗體，所述表達載體 包括移植到來自具有不同性質的不同抗體的構架序列上的、來自特異性的天然存在的抗體 的 CDR(見，例如 Riechmann et al. , 1998Nature 332 :323_327 Jones et al. , 1986Nature 321 -.522-525 ；Queen et al. , 1989Proc. Natl. Acad. See. U. S. A. 86 :10029-10033 ；美國專 利號 5，225，539 和美國專利號 5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 和 6，180，370)。構架序列可從公開的DNA資料庫或公開的文獻(包括種系抗體基因序列) 中獲得。例如，針對人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可在「VBase」人種系 序歹Ij資料庫(可在Internet上於www. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase獲得)中找至Li， 以及在 Kabat et al. ,1991Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 ；Tomlinson et al.，1992 J. Mol. Biol. 227 :776_798 和 Cox et al. ,1994Eur. J. Immunol. 24 827-836中找到；它們每篇的內容都通過引用明確併入本文。Vh⑶Rl、2和3序列和\⑶Rl、2和3序列可被移植到下述構架區上，所述構架區 具有與構架序列來源的種系免疫球蛋白基因中所發現的相同的序列，或者CDR序列可被移 植到較之種系序列而言含有一處或多處突變的構架區上。例如，已經發現，在某些情況下， 在構架區內突變殘基以保持或增強抗體的抗原結合能力是有利的(見，例如，美國專利號 5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 和 6，180，370)。還可將CDRs移植進並非免疫球蛋白結構域的多肽的構架區中。合適的骨架形 成構象上穩定的構架，其展示移植的殘基，使得它們形成局部表面，並且結合感興趣的 靶標(例如TrkB)。例如，可將CDRs移植到骨架上，其中，構架區基於纖連蛋白、錨蛋白 (ankyrin)、脂質運載蛋白(Iipocalin)、neocarzinostain、細胞色素 b、CPl 鋅指、PSTU 捲曲螺旋、LACI-DU Z 結構域或 tendramisat(見例如 Nygren and Uhlen, 1997Current Opinion in Structural Biology,7,463—469)。
另一種類型的可變區修飾是對V1^P/或\⑶R1、⑶R2和/或⑶R3區域中的氨基 酸殘基加以突變，由此改善感興趣的抗體的一種或多種結合性質(例如親和性)，這被稱為 「親和性成熟」。可進行位點定向誘變或PCR介導的誘變，以引入突變，可在本文所述的體外 或體內測定中評價對抗體結合或其它感興趣的功能性質的影響。可引入保守修飾。突變可 以是胺基酸取代、添加或缺失。此外，典型地，在⑶R區域中改變不超過一個、兩個、三個、四 個或五個殘基。本發明的經工程化的抗體包括在V1^P/或&中的構架殘基中進行了修飾的那些， 例如，以改善抗體的性質。典型地，進行此類構架修飾，以減少抗體的免疫原性。例如，一種 方法是將一個或多個構架殘基「回復突變(backmutated)」成相應的種系序列。更具體地， 經歷體細胞突變的抗體可含有不同於抗體所源於的種系序列的構架殘基。可通過將抗體構 架序列與抗體所源於的種系序列加以比較，來鑑定此類殘基。為將構架區序列返回至其種 系構型，可通過，例如，位點定向誘變或PCR介導的誘變，將體細胞突變「回復突變」成種系 序列。此類「回復突變」的抗體也是本發明所包括的。另一類型的構架修飾包括對構架區內或者甚至一個或多個⑶R區域內的一個或 多個殘基加以突變，以除去T-細胞表位，由此降低抗體的潛在免疫原性。該方法還被稱為 「去免疫化」，在Carr et al.的美國專利公開號20030153043中對其有更詳細的描述。除了構架或CDR區域中進行的修飾之外，或備選地，可對本發明的抗體進行工程 化，以在Fc區域內包括修飾，典型地，用於改變抗體的一種或多種功能性質，例如，血清半 壽期、補體固定、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明的抗體可被化學修 飾(例如，可向抗體連接一個或多個化學部分)，或被修飾以改變其糖基化，再次改變抗體 的一種或多種功能性質。在一種實施方式中，對CHl的鉸鏈區加以修飾，使得鉸鏈區的半胱氨酸殘基的數 量被改變，例如，增加或減少。該方法由Bodmer et al.進一步描述於美國專利號5，677，425 中。CHl的鉸鏈區中半胱氨酸殘基的數量被改變，以例如促進輕鏈和重鏈的裝配，或者增加 或減少抗體的穩定性。在另一實施方式中，抗體的Fc鉸鏈區被突變，以減少抗體的生物半壽期。更具體 地，一個或多個胺基酸突變被引入Fc鉸鏈片段的CH2-CH3結構域界面區域，使得抗體較之 天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合而言具有受損的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合。該手段在Ward et al.的美國專利號6，165，745中被更詳細地描述。在另一實施方式中，抗體被修飾，以增加其生物半壽期。多種方法是可能的。例 如，美國專利號6，277，375描述了在IgG中增加其體內半壽期的如下突變T252L、T254S、 T256F。或者，為了增加生物半壽期，可在CHl或CL區域中對抗體加以改變，以含有取自IgG 的Fc區域的CH2結構域的兩個環的挽救受體結合表位，如Presta et al.的美國專利號 5，869，046 和 6，121，022 所述。在另外一些實施方式中，通過用不同的胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改 變Fc區域，以改變抗體的效應功能。例如，可用不同的胺基酸殘基置換一個或多個胺基酸， 使得抗體具有改變的針對效應配體的親和性，但是仍然保留親本抗體的抗原結合能力。針 對其的親和性被改變的效應配體可以是，例如，Fc受體或補體的Cl組分。該方法在Winter et al.的美國專利號5，624，821和5，648，260中被更詳細地描述。
在另一個實施方式中，可用不同的胺基酸殘基置換選自胺基酸殘基的一個或多個 胺基酸，使得抗體具有改變的Clq結合和/或降低或消失的補體依賴性細胞毒性(CDC)。該 方法在Idusogie et al.的美國專利號6，194，551中更詳細地描述。在另一實施方式中，對一個或多個胺基酸殘基加以改變，從而改變抗體的補體固 定能力。該方法在Bodmer et al.的WO 94/29351中被更詳細地描述。在另一實施方式中，通過修飾一個或多個胺基酸，對Fc區域加以修飾，以增加抗 體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力，和/或增加抗體對Fc γ受體的親和性。該方 法在Presta的WO 00/42072中被更進一步地描述。此外，人IgGl上針對Fc γ Rl、Fe γ RII、 FcyRIII和FeRn的結合位點已被作圖，並且已經描述了具有改善的結合的變體(見 Shields, R. L. et al.，2001 J. Biol. Chem. 276 :6591_6604)。在再一種實施方式中，對抗體的糖基化加以修飾。例如，可產生非糖基化的抗體 (即，所述抗體缺乏糖基化)。可對糖基化加以改變，例如以增加抗體對抗原的親和性。可 例如通過改變抗體序列內一個或多個糖基化位點，來完成此類碳水化合物修飾。例如，可進 行一個或多個胺基酸取代，導致消除一個或多個可變區構架糖基化位點，由此消除該位點 的糖基化。此類無糖基化可增加抗體對抗原的親和性。此類方法在Co et al.的美國專利 號5，714，350和6，350，861中被更詳細地描述。此外或備選地，產生具有改變的糖基化類型的抗體，例如，具有降低量的巖藻糖基 殘基的巖藻糖基化不足的抗體，或者具有增加的二分GlcNac結構的抗體。此類改變的糖 基化模式已被證實能增加抗體的ADCC能力。此類碳水化合物修飾可通過，例如，在具有改 變的糖基化機制的宿主細胞中表達抗體來完成。具有改變的糖基化機制的細胞在本領域中 被描述過，其可用作為宿主細胞，其中，表達本發明的重組抗體，由此產生具有改變的糖基 化的抗體。例如，Hang et al.的EP 1，176，195描述了具有功能破壞的FUT8基因(其編 碼巖藻糖基轉移酶)的細胞系，使得在此類細胞系中表達的抗體展示出巖藻糖基化不足。 Presta的PCT Pub. WO 03/035835描述了變體CHO細胞系Lecl3細胞，其將巖藻糖連接到 Asn(297)相連的碳水化合物上的能力降低，還導致該宿主細胞中表達的抗體巖藻糖基化不 足(還見 Shields，R. L. et al. ,2002 J. Biol. Chem. 277 :26733_26740)。Umana et al.的 WO 99/54342描述了經工程化以表達修飾糖蛋白的糖基轉移酶(例如，β (1，4)_Ν乙醯葡糖 胺基轉移酶III(GnTni))的細胞系，使得經工程化的細胞系中表達的抗體展示出增加的 二分GlcNac結構，這導致抗體增加的ADCC活性(還見Umana et al. , 1999Nat. Biotech. 17 176-180)。本發明包括的對本文中抗體的另一修飾是聚乙二醇化。可對抗體聚乙二醇化，以 例如增加抗體的生物(例如血清)半壽期。為對抗體進行聚乙二醇化，典型地，用聚乙二醇 (PEG)，例如PEG的反應性酯或醛衍生物，與抗體或其片段反應，該反應在一個或多個PEG部 分與抗體或抗體片段連接的條件下進行。可使用反應性PEG分子(或類似的反應性水溶性 聚合物)，通過醯化反應或烷基化反應來進行聚乙二醇化。在本文中使用時，術語「聚乙二 醇」意欲包括已被用於衍生化其它蛋白的任何形式的PEG，例如，單(Cl-ClO)烷氧基或芳氧 基-聚乙二醇或聚乙二醇馬來亞醯胺。在某些實施方式中，將被聚乙二醇化的抗體是非糖 基化的抗體。用於對蛋白進行聚乙二醇化的方法是本領域已知的，其可應用於本發明的抗 體。見，例如，Nishimura et al.的 EP 0 154 316 和 Ishikawa et al.的 EP 0 401 384。
此外，可通過引入非天然胺基酸，在本發明的TrkB結合多肽的任何部分實現聚 乙二醇化。可通過 Deiters et al.，J Am Chem Socl25 11782-11783,2003 ；Wang and Schultz, Science 301 :964_967，2003 ；Wang et al.，Science 292 :498_500，2001 ；Zhang et al. ,Science 303 :371_373，2004或美國專利號7，083，970描述的技術引入某些非天然 胺基酸。簡言之，這些表達系統中的一些涉及位點定向誘變，以向編碼本發明的多肽的可讀 框中引入無義密碼子，例如，琥珀TAG。然後再將此類表達載體引入可利用對引入的無義密 碼子來說具有特異性的tRNA的宿主，並裝載選擇的非天然胺基酸。對將部分與本發明的多 肽綴合的目的有益的特定的非天然胺基酸包括具有乙炔和疊氮化物側鏈的那些。然後可在 蛋白中這些選擇的位點上對含有這些新的胺基酸的多肽進行聚乙二醇化。對抗體講行工稈化的方法如上文所討論的，可使用抗TrkB抗體，通過修飾全長重鏈和/或輕鏈序列、Vh和/ 或\序列或與其連接的恆定區來產生新的抗TrkB抗體。例如，可將抗體的一個或多個CDR 區域與已知的構架區和/或其它⑶Rs重組組合，以產生新的、經重組工程化的抗TrkB抗 體。其它類型的修飾包括前文章節中描述的那些。用於工程化方法的起始材料是\和/或 八序列中的一條或多條或者其一個或多個CDR區域。為製造經工程化的抗體，並不一定要 實際製備出具有Vh和/或\序列中的一條或多條或者其一個或多個CDR區域的抗體(即， 作為蛋白質表達)。而是，用序列中含有的信息作為起始材料，以製造源於原始序列的「第 二代」序列，然後製備「第二代」序列，並將其表達為蛋白質。可使用標準分子生物學技術來製備和表達改變的抗體序列。改變的抗體序列編碼 的抗體是保留了其所源於的抗TrkB抗體的一種、一些或全部功能性質的抗體，所述功能性 質包括但不限於與TrkB特異性結合、幹擾TrkB結合神經營養蛋白(例如BDNF)的能力以 及調節TrkB 二聚化和在其細胞內結構域上酪氨酸殘基自身磷酸化的能力，如本文所述。可 使用本領域可獲得的和/或本文描述的標準測定法(例如ELISAs)來評估改變的抗體的功 能性質。在本發明的對抗體進行工程化的方法的某些實施方式中，在抗TrkB抗體編碼序 列的全部或部分上隨機或選擇性引入突變，可針對結合活性和/或其它功能性質(與TrkB 特異性結合、幹擾TrkB結合神經營養蛋白(例如BDNF)的能力以及調節TrkB 二聚化和在其 細胞內結構域上酪氨酸殘基自身磷酸化的能力，如本文所述)，對得到的經修飾的抗TrkB 抗體加以篩選。突變方法在本領域中已有描述。例如，Short的PCT公開W002/092780描 述了使用飽和誘變、合成連接裝配或其組合來產生和篩選抗體突變的方法。或者，Lazar et al.的WO 03/074679描述了使用計算機篩選方法來優化抗體的物理化學性質的方法。非抗體TrkB激動性抗體本發明還提供了展示出抗體的功能性質但是其構架和抗原結合部分源於其它多 肽(例如並非是抗體基因編碼的那些，也不是抗體基因體內重組產生的那些的多肽)的 TrkB激動性抗體。這些結合分子的抗原結合結構域(例如TrkB結合結構域)是通過定向 進化方法產生的。見，美國專利號7，115，396。具有與抗體的可變結構域類似的總體摺疊 (「免疫球蛋白樣」摺疊)的分子是合適的骨架蛋白。適合得到抗原結合分子的骨架蛋白包 括纖連蛋白或纖連蛋白二聚體、生腱蛋白、N-鈣黏著蛋白、E-鈣黏著蛋白、ICAM、肌聯蛋白、 GCSF-受體、細胞因子受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、
26⑶2、1類1^(、11-細胞抗原受體、^1丄2和VCAM-I的I-組結構域、肌球蛋白結合蛋白C的 I-組免疫球蛋白結構域、肌球蛋白結合蛋白H的I-組免疫球蛋白結構域、端蛋白的I-組 免疫球蛋白結構域、NCAM、顫搐蛋白、神經膠質蛋白、生長激素受體、促紅細胞生成素受體、 促乳素受體、幹擾素_ Y受體、「半乳糖苷酶/葡糖苷酸酶、「葡糖苷酸酶、轉穀氨醯胺酶、 T-細胞抗原受體、超氧化物歧化酶、組織因子結構域、細胞色素F、綠色螢光蛋白、GroEL或 奇甜蛋白。非抗體結合分子的抗原結合結構域(例如免疫球蛋白樣摺疊)可具有小於IOkD 或大於7.5kD的分子量(例如，7.5-lOkDa之間的分子量)。用於獲得抗原結合結構域的蛋 白是天然存在的哺乳動物蛋白(例如人蛋白)，較之其源於的蛋白的免疫球蛋白樣摺疊而 言，抗原結合結構域包括多達50% (例如，多達34%、25%、20%或15%)的經突變的氨基 酸。具有免疫球蛋白樣摺疊的結構域通常由50-150個胺基酸(例如，40-60個胺基酸)構 成。為產生非抗體結合分子，產生克隆文庫，其中，對骨架蛋白中形成抗原結合表面的 區域(例如，在位置和結構上與抗體可變結構域免疫球蛋白摺疊的CDRs類似的區域)中的 序列進行隨機化。針對與感興趣的抗原(例如TrkB)的特異性結合以及針對其它功能(例 如抑制TrkB的生物功能)，對文庫克隆加以測試。選擇的克隆可用作為基礎，用於進一步的 隨機化和選擇，以產生對抗原有更高親和力的衍生物。選擇方案的一個例子被描述於美國 專利號6，207，446中。產生高度親和性結合分子，例如，使用纖連蛋白III的第10個模塊C°Fn3)作為骨 架。針對WFN3的三個⑶R樣環中的每一個，在殘基23-29、52-55和78-87處構建文庫。為 構建每種文庫，通過寡核苷酸合成對編碼與每個⑶R樣區域重疊的序列的DNA區段隨機化。 用於產生可選擇uiFr^的文庫的技術被描述於美國專利號6，818，418和7，115,396 ；Roberts and Szostak, 1997Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 12297 ；美國專利號 6，261，804 ；美國專利 號 6，258，558 和 Szostak et al. W098/31700 中。非抗體結合分子可作為二聚體或多聚體產生，以增加對靶抗原的親合力。例如，抗 原結合結構域作為與抗體的恆定區(Fe)的融合物表達，其形成Fc-Fc 二聚體。見例如美國 專利號 7, 115，396。編碼本發明的抗體的核酸分子本發明的另一方面涉及編碼本發明的TrkB激動性抗體的核酸分子。核酸可存在 全細胞中、細胞裂解物中，或可以是經部分純化的或基本上純的形式的核酸。當通過標準技 術(包括鹼/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領域公知的其它技術)純化 去除其它細胞組分或其它汙染物，例如，其它細胞核酸或蛋白質時，核酸就是「經分離的」或 「使得為基本上純的」。見 F. Ausubel，et al.，ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本發明的核酸可以是， 例如，DNA或RNA，並且可以含有或可以不含內含子序列。在一種實施方式中，核酸是cDNA 分子。核酸可以存在於載體中，例如噬菌體展示載體或重組質粒載體中。可使用標準分子生物學技術來獲得本發明的核酸。對於通過雜交瘤(按照下文 進一步描述的，從攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠製備的雜交瘤)表達的抗體而言， 可通過標準PCR擴增或eDNA克隆技術，獲得編碼通過雜交瘤產生的抗體的輕鏈和重鏈的eDNA。對於從免疫球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體展示技術)獲得的抗體而言，可從是 文庫成員的多個噬菌體克隆回收編碼抗體的核酸。一旦獲得了編碼Vh和\區段的DNA片段，可通過標準重組DNA技術，對這些DNA 片段進行進一步操作，例如以將可變區基因轉化為全長抗體鏈基因，轉化為Fab片段基因 或scFv基因。在這些操作中，將編碼\或Vh的DNA片段與另外的DNA分子或編碼另外的 蛋白質的片段(例如抗體恆定區或柔性接頭)有效連接。術語「有效連接」在本文上下文 中使用時意欲表示兩條DNA片段以功能性方式相連，例如，使得兩條DNA片段編碼的胺基酸 序列保持符合讀碼框，或者使得蛋白在想要的啟動子的控制下表達。可通過將編碼Vh的DNA與編碼重鏈恆定區(CH1、CH2和CH3)的另外的DNA分子有 效連接，將編碼Vh區域的經分離的DNA轉化為全長重鏈基因。人重鏈恆定區基因的序列是 本領域己知的(見，例如 Kabat et al. , 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，包含這些區域的DNA片段可通過標準PCR擴增獲得。重鏈恆定 區可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。對於Fab片段重鏈基因而 言，可將編碼Vh的DNA與僅編碼重鏈CHl恆定區的另外的DNA分子有效連接。可通過將編碼Vl的DNA與編碼輕鏈恆定區CL的另外的DNA分子有效連接，將 編碼\區域的經分離的DNA轉化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恆定 區基因的序列是本領域已知的(見，例如Kabat et al.，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，包含這些區域的DNA片段可通過標準PCR擴增 獲得。輕鏈恆定區可以是κ或λ恆定區。為產生scFv基因，將編碼Vh和\的DNA片段與編碼柔性接頭(例如，編碼胺基酸 序列(Gly4-Ser)3)的另外的片段有效連接，使得Vh和\序列可作為連續的單鏈蛋白表達， 其中Vl和Vh區域通過柔性接頭相連(見，例如，Bird et al.，1988Science 242 :423_426 ； Huston et al.,1988Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5879-5883 ；McCafferty et al., 1990Nature348 :552_554)。單克隆抗體產生可通過多種技術，包括傳統單克隆抗體方法，例如Kohler和 Milstein (1975Nature, 256 495)的標準體細胞雜交技術，或使用文庫展示方法，例如噬菌 體展示，來產生單克隆抗體(mAbs)。用於製備雜交瘤的動物系統是鼠系統。小鼠中的雜交瘤產生是已良好建立的方 法。免疫方案和用於分離經免疫的脾細胞用於融合的技術是本領域已知的。融合伴侶(例 如鼠骨髓瘤細胞)和融合步驟也是已知的。可基於按照上文所述製備的鼠單克隆抗體的序列，來製備本發明的嵌合或人源化 抗體。可從感興趣的鼠雜交瘤獲得編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA，並使用標準分子生物 學技術對其加以人工改造，使其含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，為產生嵌合抗 體，可使用本領域已知的方法將鼠可變區與人恆定區相連(見例如Cabilly et al.的美國 專利號4，816，567)。為產生人源化抗體，可使用本領域已知的方法，將鼠⑶R區域插入人 構架。見，例如，美國專利號5，225，539和美國專利號5，530，101,5, 585，089,5, 693，762和6，180，370。在某實施方式中，本發明的抗體是人單克隆抗體。可使用攜帶人免疫系統而非小 鼠系統的部分的轉基因或轉染色體小鼠，來產生針對TrkB的此類人單克隆抗體。這些轉基 因和轉染色體小鼠包括在本文中分別被稱為HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，它們被合稱為 「人Ig小鼠」。HuMAb小鼠 (Medarex, Inc.)含有人免疫球蛋白基因微基因座，其編碼未經重排 的人重(μ和Y)鏈和K輕鏈免疫球蛋白序列，以及使得內源μ和K鏈基因座失活的靶 向突變(見,例如 Lonberg et al.，1994Nature368 (6474) :856_859)。因此，小鼠展示出小 鼠IgM或K的降低的表達，並且應答於免疫，引入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體 細胞突變，產生高親和性的人IgGK單克隆(Lonberg，N. et al.，1994supra ；reviewed in Lonberg, N. ,1994Handbook of Experimental Pharmacologyl13 :49_101 ；Lonberg, N. and Huszar,D. ,1995Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93 禾口 Harding,F. and Lonberg,N. ,1995Ann. N. Y. AcacL Sci. 764 :536_546) 。 Taylor， L. et al. , 1992 Nucleic Acids Research 20 6287-6295 ；Chen, J. et at. ,1993 International Immunology 5 647-656 ；Tuaillon et al.,1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 3720-3724 ；Choi et al. ,1993Nature Genetics 4117-123 ；Chen, J. et al. ,1993 EMBO J. 12 821-830 ；Tuaillon et al. , 1994J. Immunol. 152 :2912_2920 ；Taylor, L. et al.，1994International Immunology 579-591 禾口 Fishwild, D. et al.，1996Nature Biotechnology 14 :845_851 中進一步描述了 HuMAb 小 鼠的製備和使用以及此類小鼠攜帶的基因組修飾，這些文獻的所有內容都通過引用整體 明確併入本文。還見，Lonberg和Kay的美國專利號5, 545,806,5, 569,825,5,625, 126、 5，633，425,5, 789，650,5, 877，397,5, 661,016,5, 814，318,5, 874，299 和 5，770，429 ； Surani et al.的美國專利號 5，545，807 ;Lonberg and Kay 的 PCT
發明者C·布勞斯坦 申請人:諾瓦提斯公司