一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株及其應用的製作方法

2023-12-01 17:30:56 3

專利名稱：一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明的技術方案涉及以弓丨入外來基因材料修飾的病毒，具體地說是一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株及其應用。
背景技術：
愛滋病，艮口獲得個生免疫缺 Pg 症候群(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的，以全身免疫系統嚴重損害為特徵的傳染性疾病。2007年衛生部和聯合國愛滋病規劃署估計中國愛滋病感染者達到70萬。我國的主要流行毒株是HIV-I B』/C重組亞型，主要分布於吸毒者較多的雲南、貴州、四川、新疆和西北地區，並隨新疆流動人口傳至華東和華南。HIV-I病毒發現之後的20多年以來，各國研究者對HIV-I的基因組結構、生物功能、與宿主的相互關係、藥物治療和疫苗研製等方面進行了深入研究。目前AIDS治療藥物方面取得了很大進展，延長了感染者的生存時間，提高了生存質量，但是HIV-I感染者體內的病毒並沒有徹底清除。此外藥物治療的副作用及耐藥性問題也沒有得到解決。安全有效的疫苗是控制愛滋病流行最有效的手段。自從上世紀80年代發現愛滋病病毒以來，各國政府和企業投入了大量的資金開展了一百多次的愛滋病疫苗臨床試驗研究，但絕大部分都沒有顯示出一定的保護效果。與此同時，殺微生物製劑等預防性生物製品的研發也開始起步。人類已經研製成功的疫苗絕大多數有合適的動物模型可供進行攻毒和免疫保護測試，以迅速評價疫苗的有效性和安全性。能真正模擬HIV-I自然感染過程的動物模型的缺乏已經成為疫苗和藥物等生物製劑研發最大的瓶頸之一。猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)與HIV-I同屬反轉錄病毒科慢病毒屬，它可以從不同種的猴體內分離得到。猴被某些種類的SIV感染後，會產生類似於AIDS的症狀。研究者曾經認為SIV/恆河猴動物模型是研究HIV-I致病和預防機制的「黃金標準」。但是，由於SIV與 HIV-I之間存在抗原性差異，使用這個模型具有很大局限性。另外，HIV-I/黑猩猩動物模型在HIV-I致病性和疫苗研究中曾經使用，但黑猩猩作為瀕危物種且價格昂貴，不能大量使用。同時，HIV-I病毒在黑猩猩體內複製的載量水平很低且較難致病，顯然不能滿足對HIV 疫苗評價的要求。SHIV (Chimeric simian/human immunodeficency virus),艮口 SIV/HIV 嵌合病毒， 是一種通過基因重組技術置換SIV和HIV-I的相應基因而構建出來的人造病毒。大部分 SHIV病毒是以猴缺陷病毒SIV作為骨架，將其中env，tat和rev基因由人缺陷病毒I型 HIV-I的相應基因片斷所替換。SHIV病毒可以有效感染恆河猴等靈長類動物，並且傳代後得到的致病性SHIV可以在短時間內誘導感染的動物發生AIDS疾病。SHIV感染恆河猴的體內動物模型在研究HIV-I包膜蛋白的感染性和致病性以及針對含HIV-I包膜蛋白愛滋病疫苗免疫評價方面發揮重要作用。另外，在HIV-I抗病毒藥物和微生物殺菌劑藥效學評價等研究方面也是很好的工具。90年代初期，日本京都大學的Siibata R等人首次構建出以SIVmac239為親本的嵌合病毒SIVAeM/HIV_l，可以在人和猴外周血單核淋巴細胞中有效複製，並能誘導猴體的體液免疫反應。這一模型受到了全世界的廣泛關注。隨後各國科學工作者相繼構建出一系列攜帶HIV-I不同亞型和不同毒株包膜蛋白基因的SHIV。目前構建的SHIV主要利用的包膜蛋白基因來源於B亞型HIV-I毒株。其中，以SIVmac239基因為框架重組入流行於歐美B 亞型HIV-I的tat，rev, env等基因構建的B亞型SHIV感染性克隆以及在印度恆河猴體內傳代得到的致病性強毒株種類最多，已經被愛滋病疫苗研究機構廣泛應用。絕大部分表現為CXCR4/CCR5雙嗜性的晚期病毒特點。最具有代表性的是SHIV-89. 6P和SHIV-KUl這兩個毒株。然而，B亞型HIV-I毒株在世界上並不佔主導。而這種亞型在全球感染者中只佔不足10%。因此，目前廣泛利用的SHIV病毒不能反映HIV-I流行病學的遺傳差異，尤其是C亞型HIV-I病毒。C亞型是目前國際上流行的主要HIV-I病毒亞型，估計佔世界上全部感染人數的一半以上。主要流行於撒哈拉以南非洲和部分亞州地區，並呈現快速增長的趨勢。C亞型SHIV的構建起步較晚，目前構建成功的只有SHIV MJ4、SHIV-MCGP1. 3和 SHIV-1157ipd3N4等少數幾株。其中，SHIV-MJ4含有非洲株C亞型HIV-I包膜蛋白基因， 能夠持續性感染恆河猴。而攜帶來源於非洲尚比亞的一名愛滋病嬰兒體內分離的C亞型 HIV-I包膜蛋白基因的SHIV-1157i經過印度恆河猴體內快速傳代後得到了目前唯一一株C 亞型致病性強毒株SHIV-1157ipd3N4。針對不同亞型和地區流行的HIV-I毒株構建的SHIV 在功能和生物學特徵上存在明顯的差異。由於我國廣泛流行的HIV-I B』/C重組亞型病毒和歐美B亞型毒株以及非洲C亞型毒株在基因序列上，尤其是在抗原表位方面存在差異。因此，目前廣泛存在的B亞型和C亞型SHIV/恆河猴模型並不適合針對我國HIV-I主要流行株設計的愛滋病疫苗等生物製劑的應用。在感染早期，HIV-I感染者體內毒株均為CCR5嗜性。隨著疾病進程，部分感染者體內同時具有CCR5、CXCR4/CCR5以及CXCR4這3種不同嗜性的HIV-I毒株；到了晚期，有數量50%感染者體內CCR5嗜性的毒株會轉變為CXCR4嗜性的；也有部分感染者在整個疾病過程中，體內一直保持著CCR5嗜性，沒有出現從CCR5到CXCR4的轉換。但無論如何，從 HIV-I新發感染者體內檢測到的都是CCR5嗜性。目前世界上大多數具有致病性的SHIV均為CXCR4嗜性，或者CXCR4/CCR5雙嗜性。 這些病毒感染宿主細胞後所表現出的共同特徵，就是引起CD4+T淋巴細胞的持續下降，表現出更多的HIV-I晚期感染的特徵。但是這類SHIV感染動物之後的疾病進程不同於SIV或 HIV-I自然侵染所引起的宿主淋巴細胞缺失的動態變化，因此需要對SHIV模型改造進行更多的嘗試，使其有效性不具爭議。研究表明，CXCR4嗜性和CXCR4/CCR5雙嗜性的SHIV所誘導的病變具有更多HIV-I晚期感染的特徵，而CCR5嗜性的SHIV具有更多的早期感染的特徵。此外，幾乎所有的黏膜感染都是CCR5嗜性的HIV-I毒株。因而，構建具有CCR5嗜性的中國SHIV，不僅可以更好地模擬HIV-I早期感染的特徵，而且可以模擬黏膜感染的方式進行攻毒。同時，這些SHIV/恆河猴模型均是利用印度源恆河猴所建立。研究表明，SHIV病毒在印度源和中國源恆河猴體內表現出不同的感染和致病特點。相比而言，SHIV/中國恆河猴模型更加接近HIV-I在人體的感染特點，表現為感染早期典型的一過性急性病毒血症過程和潛伏期低水平的病毒載量特點。CN200610124967.6公開了一種雜交免疫缺陷病毒株及應用，成功構建了包含B，亞型HIV-I包膜蛋白基因的SHIV-B』■病毒，具有CCR5嗜性並可以模擬HIV-I早期感染的致病特點。但是，CN200610124967. 6公開的SHIV-B，mu病毒是直接以SIVmac239病毒作為骨架，因此這株雜交病毒的毒力上升需要經過在細胞和動物體內進行長期的適應和傳代過程。全國分子流行病學調查結果顯示，我國的主要流行毒株是Hiv-I B』 /C重組亞型。 與1996-1998年第一次全國範圍分子流行病學調查結果相比，我國HIV-I的流行趨勢已發生變化。從B』亞型佔優勢，至2004年已發展為HIV-I B』/C重組亞型上升至第一位。我國愛滋病疫情和HIV-I基因型流行趨勢的轉變，迫切需要構建包含我國HIV-I BVC亞型外膜蛋白基因的SHIV嵌合病毒，為我國主要HIV-I流行株的致病特點研究以及疫苗、抗病毒藥物等生物製劑的有效性評價提供更為理想的評價模型。HIV-I B』 /C重組亞型病毒是通過數年的全國性HIV-I分子流行病毒調查獲得的，一方面具有新發感染的典型特徵並可以最大限度的代表本亞型病毒的流行特點；另一方面，HIV-I B』 /C重組亞型病毒具有相對較弱的感染和致病能力，同時，新發感染者體內 HIV-I病毒包膜蛋白基因差異明顯，從大量不同序列中獲得活性克隆的難度更大。因此，構建B』 /C重組亞型的SHIV病毒將會面臨更為嚴峻的挑戰。另外，在已報導的C 亞型 SHIV 中，SHIV-MCGP1. 3 為 CXCR4/CCR5 嗜性；SHIV-MJ4 和SHIV-1157ipd3N4攜帶的HIV-I基因均來自於南非分離的病毒株。因此，建立攜帶中國 HIV-I B』 /C重組亞型流行株基因的CCR5嗜性SHIV/中國恆河猴愛滋病模型，可以非常理想的模擬HIV-I病毒通過性途徑和輸血途徑感染人體早期的病毒學和免疫學等一系列反應的變化特點。這對於我國HIV-I主要流行毒株的致病機理研究以及相應的愛滋病疫苗和抗病毒藥物、殺微生物劑等生物製品的研發意義重大。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株及其應用，該病毒株是以歐美B亞型人猴嵌合免疫缺陷病毒株SHIV-KB9為骨架，替換其包膜蛋白基因 N末端的50到750個胺基酸為中國主要流行亞型HIV-I B』 /C重組亞型毒株的相應基因， 具有CCR5嗜性，能夠感染人源和猴源細胞並能在恆河猴體內有效複製，用該病毒株構建的 SHIV-XJN0363B8/中國恆河猴愛滋病模型，可以有效模擬HIV-I感染早期的病毒複製特點， 並在研究HIV-I體內的致病機制以及在我國愛滋病疫苗和愛滋病抗病毒藥物等生物製劑的有效性評價中發揮作用。本發明解決該技術問題所採用的技術方案是一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株，是攜帶中國HIV-1B』 /C重組亞型包膜蛋白基因片斷的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8， 其分類命名免疫缺陷病毒，保藏日期2010年10月15日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號CGMCC No.似43。上述一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株的製備方法是，利用分子克隆的方法以高致病性B亞型SHIV-KB9為骨架，從一位新疆HIV-I新發感染者急性感染期的臨床樣本中PCR 擴增2. Ikb片段，該片段包括gpl20和從包膜蛋白N術端的50到750個胺基酸的gp41，通過相應片段替換，構建一系列包含包膜蛋白基因的SHIV cDNA全長克隆，將這些重組病毒cDNA轉染細胞，收集病毒上清病毒液，分別感染TZM細胞系、人和猴的外周血單核淋巴細胞，對所有克隆的生物學活性進行細胞水平鑑定，通過SIV ρ27衣殼蛋白滴定，篩選到一株具有感染活性的攜帶中國HIV-I B』 /C重組亞型包膜蛋白基因片斷的人猴免疫缺陷病毒 SHIV-XJN0363B8o透射電鏡觀察到SHIV-XJN036;3B8 cDNA克隆在轉染細胞系中包裝出病毒顆粒；利用表達不同輔助受體的細胞系確定SHIV-XJN0363B8具有CCR5嗜性；SIV ρ27衣殼蛋白滴定描繪出其在人和恆河猴外周血單核淋巴細胞中的複製動力學曲線，被感染過的恆河猴外周血單核淋巴細胞出現明顯的細胞病變；DNA PCR檢測到病毒已成功整合到人、恆河猴外周血單核淋巴細胞的基因組中；RT-PCR檢測到病毒在人、恆河猴外周血單核淋巴細胞培養上清中gag-pol RNA轉錄本和/或RNA基因組的形成，表明此株嵌合病毒可在人、恆河猴的外周血單核淋巴細胞中可以進行有效複製。上述一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株的應用，將上述人猴免疫缺陷病毒 SHIV-XJN0363B8用於構建SHIV_XJN036;3B8/中國恆河猴愛滋病模型。上述一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株的應用，將上述人猴免疫缺陷病毒 SHIV-XJN0363B8構建的SHIV_XJN036;3B8/中國恆河猴愛滋病模型用於評價愛滋病疫苗免疫保護效果。上述一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株的應用，將上述人猴免疫缺陷病毒 SHIV-XJN0363B8構建的SHIV_XJN036;3B8/中國恆河猴愛滋病模型用於評價檢測愛滋病抗病毒藥物。本發明的有益效果是用本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8構建的SHIV_XJN036;3B8/中國恆河猴愛滋病模型，可以有效模擬HIV-I感染早期的病毒複製特點並具備較強的感染能力， 對於研究HIV-I病毒體內的致病機制以及在我國愛滋病疫苗、抗病毒藥物等生物製劑的有效性評價中發揮作用。具體地說該SHIV-XJN036;3B8/中國恆河猴愛滋病模型具有下列特性和優點1.攜帶中國HIV-I主要流行亞型HIV-I B』 /C重組亞型毒株的包膜蛋白基因新疆作為靜脈吸毒和HIV-I感染人數眾多的省份，HIV-I B』/C重組亞型毒株的感染者比例最大。並且該亞型在第二次和第三次全國分子流調中也表現出感染優勢，成為中國目前最為流行的HIV-I亞型。從中選取一株由中國CDC性病愛滋病預防控制中心病免室經過常年積累獲得的新發感染病人樣本，從中獲取外源片斷，該親本生物學毒株來源於新疆新發感染隊列急性感染期樣本。這樣既可以最大程度地保證獲得代表中國近年來的毒株亞型，同時也獲取了急性期具有較強感染能力的病毒序列。本發明設計保守的引物，採用套式PCR及touchdown PCR反應條件，從HIV-1感染者血清樣品病毒基因組中擴增到2. 11Λ包膜蛋白基因片段。為了對本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8的亞型進行明確分類，結合流行病學資料，對其包膜蛋白基因片段進行了 PCR擴增、測序和序列分析。根據包膜蛋白基因的序列，利用Wisconsin GCG Package和網上BLAST等工具對本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8包膜蛋白基因的序列與其它HIV-I毒株進行分析和比對，繪製其與HIV-I各亞型毒株的親緣關係系統進化樹(見圖幻。從圖2中包膜蛋白基因序列上判斷可以看出，本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8是屬於HIV-I B，/C重組亞型的CRF07_BC重組模式毒株。2.採用3』 SHIV半長重組篩選的方法，提高篩選的效率在構建攜帶中國株HIV-I B』 /C重組亞型的包膜蛋白基因的本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8全長克隆時，選擇SHIV-KB9作為骨架。該SHIV克隆株攜帶的包膜蛋白基因主要為歐美B亞型，並在印度源恆河猴體內具有較強的致病性。該病毒通過分子克隆手段，分成3』 SHIV-KB9和5』 SHIV-KB9兩部分，而替換的HIV-XJN0363包膜蛋白基因區位於3』SHIV-KB9之中，並通過已有的酶切位點對包膜蛋白基因2. 11Λ左右的區域進行替換，之後將得到的3』 SHIV與5』 SHIV通過酶切位點進行連接，得到全長的本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8全長克隆(見圖3)。3.具有CCR5細胞嗜性為了確定本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8的細胞嗜性，選用(ihost 系列表達不同輔助受體的細胞系來進行檢測。通過流式細胞儀檢測表達不同輔助受體的 Ghost細胞中被激發表達綠色螢光蛋白的細胞數量，從而驗證病毒使用何種輔助受體，同時以B亞型SHIV-KB9病毒作為對照組。結果證明，攜帶B亞型HIV-I包膜蛋白基因片斷的 SHIV-KB9既可以在表達CXCR4的Ghost-⑶4-CXCR4細胞中進行複製，同時也可以在表達 CCR5輔助受體的(ihOSt-CD4-CCR5細胞中複製。而攜帶中國HIV-I B，/C重組亞型的包膜蛋白基因的本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8隻能在表達CCR5輔助受體的(ihost 細胞中進行複製，不能在表達CXCR4的(ihost細胞中複製。由此確定，本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8是以CCR5作為輔助受體，具有巨嗜細胞嗜性的特性(結果見圖 4)。對不同病毒感染的(ihost-CD4-CXCR4和(ihost-CD4-CCR5兩種嗜性細胞進行流式細胞計數。正常的兩種細胞均存在本底表達，數量百分比約佔總細胞數的0.16%。而被檢測的樣品細胞中，表達綠色螢光蛋白的細胞數量百分比高於本底值的即可認為這種SHIV病毒對該嗜性細胞具有感染能力。從結果可見，本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8在 CXCR4輔助受體的細胞中感染細胞數量百分比與本底值一致，說明不具有T細胞嗜性，均為使用CCR5輔助受體的巨噬細胞嗜性的病毒。4.具有在人外周血外周血單核淋巴細胞中複製的特點通過分子克隆手段，最終得到了一株外源插入片斷序列無誤的本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8全長SHIV cDNA克隆。在生物安全三級實驗室中，將該全長SHIV 克隆轉染細胞，40小時後收集部分培養物上清，進行SIV ρ27抗原蛋白的檢測為陽性。表明克隆可以通過細胞包裝出病毒顆粒或表達病毒蛋白。將病毒轉染的細胞製成超薄切片，在電鏡下可以觀察到本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8在轉染細胞系中成功組裝出病毒顆粒(見圖幻。本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8 顆粒呈球形，表面具有包膜結構。照片中箭頭所指示的即為本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8在細胞邊緣和細胞之間的間隙形成的病毒顆粒。將培養物上清通過 0. 45 μ m的濾膜過濾後，得到病毒濾液，將病毒濾液分別感染在M孔板中已經培養適當濃度的TZM-bl細胞。TZM-bl來源於Hela細胞，其表面表達⑶4受體，CXCR4和CCR5輔助受體並攜帶HIV-I LTR控制的螢火蟲螢光素酶。本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8 病毒感染TZM-bl細胞後檢測螢火蟲螢光素酶發光值為強陽性。初步證明本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8的包膜蛋白具有結合⑶4受體進入細胞的能力，而在細胞水平感染和複製能力還需在相應的外周血單核淋巴細胞中進行檢測。在人外周血單核淋巴細胞中對本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8 進行了細胞水平感染活性的檢測(見圖6)，進一步確認體外的感染效果，同時以B亞型 SHIV-KB9為實驗正對照。結果表明，以SHIV-KB9為主要骨架，嵌合了中國HIV-I B』/C重組亞型的包膜蛋白基因的SHIV-XJN0363B8可有效在人外周血單核淋巴細胞中進行複製。複製滴度最高是在感染後第11天，滴度可高達170ng/ml。5.具有在恆河猴外周血外周血單核淋巴細胞中複製的特點檢測本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8在恆河猴外周血單核淋巴細胞中的感染複製能力，可以在一定程度上可以反映體內的感染特徵。將SHIV-XJN0363B8轉染
得到的培養物上清，過濾膜後感染恆河猴外周血單核淋巴細胞。檢測不同時間點的培養物上清中SIV ρ27抗原滴度，以確定SHIV-XJN0363B8在恆河猴外周血單核淋巴細胞中的複製能力。本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8在猴外周血單核淋巴細胞中表現出SIV ρ27滴度的上升(見圖7)。在恆河猴外周血單核淋巴細胞感染的第4、7和11天SIV Ρ27滴度逐漸上升，第11天達到高峰，然後又逐漸回落。從結果可見，本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8在恆河猴細胞中也檢測到感染活性，但由於包膜蛋白基因為人源， SHIV在恆河猴細胞中感染活性略有降低。在本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8感染猴外周血單核淋巴細胞第11天，收集被感染的細胞，提取基因組總DNA為模板，應用針對SHIV衣殼基因的引物進行擴增，可以擴增到衣殼基因477bp的特異性片段。表明本發明的人猴免疫缺陷病毒 SHIV-XJN0363B8可以整合到宿主染色體DNA中成為原病毒。本發明的人猴免疫缺陷病毒 SHIV-XJN0363B8感染恆河猴外周血單核淋巴細胞11天後，與沒有被感染的外周血單核淋巴細胞對照進行比較。在倒置顯微鏡下觀察兩種細胞的狀態，見圖8。從照片中可以看出， 本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8可以導致恆河猴外周血單核淋巴細胞產生明顯的細胞病變。與生長狀態良好的正常細胞相比，被病毒感染的外周血單核淋巴細胞變得膨大，內含物增多，許多細胞出現崩解現象。綜上所述，本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8具備在人或恆河猴外周血單核淋巴細胞中的感染複製能力，但由於沒經過猴體內適應性實驗和猴體傳代實驗，因而體外在猴外周血單核淋巴細胞中的複製能力較弱。6.具有感染中國源恆河猴並且可在猴體內傳代的的特點。在本發明的應用試驗中選用了 3隻健康的幼年中國源恆河猴，經過相關慢病毒篩選(SIV，simian retrovirus type D，simian T-cell leukemia virus禾口Herpes B virus) 均為陰性。第一代試驗感染動物為兩隻中國源恆河猴0504號和0505號。將本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8從液氮中取出於4°C下緩慢解凍，然後在麻醉狀態下採用後肢靜脈注射途徑感染兩隻中國源恆河猴，攻毒劑量為IO3 TCID500定期觀察並記錄兩隻中國源恆河猴的體溫、淋巴結大小以及精神狀態等臨床表現。本發明的人猴免疫缺陷病毒 SHIV-XJN0363B8注射兩隻中國源恆河猴後定期採集:3ml EDTA抗凝靜脈血，檢測血漿中病毒RNA載量變化趨勢(見圖9)。數據表明兩隻中國源恆河猴的感染特徵基本一致，感染後20天出現病毒載量，載量檢測高峰在30天至35天，載量值分別達到5. 14X IO5Copies/ml和2.23X 105COpieS/ml ；隨後，病毒載量逐步降低。通過病毒載量結果分析，本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8/中國恆河猴愛滋病模型表現出病毒在猴體內的低水平複製。因此，本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8是一種非致病性的弱毒株，建立病毒感染的動物進入潛伏期後，病毒血症水平均低於病毒RNA載量檢測範圍，與多數人類感染HIV-I症狀相似。這一結果與之前國內外大量SHIV/恆河猴愛滋病模型攻毒實驗結果一致。即在未經傳代的情況下，人工構建的SHIV毒株不能在猴體內進行高效率的感染複製，因此無法表現出高感染性或致病性。本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8 病毒感染兩隻中國源恆河猴後進行了血常規和CD3，CD4，CD8流式檢測(見圖10)。感染後，兩隻中國源恆河猴體內CD4+T與CD8+T細胞比值在初期略有下降，但是隨後細胞比值回升，始終未見明顯的倒置現象。CD4+T細胞數量一直保持穩定水平，感染後稍許下降，但是很快恢復正常水平。因此，血液淋巴細胞分類流式方法分析本發明的人猴免疫缺陷病毒 SHIV-XJN0363B8感染後並不能導致CD4+T細胞的大量降低，表明本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8對於中國源恆河猴是非致病性弱毒株。在第一代中國源恆河猴0505號被本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8 感染後47天，從動物體內抽取5mL全血靜脈接種到第二代中國源恆河猴0506號中。 在接種中國源恆河猴0506號後的第9天，檢測到中國源恆河猴0506號病毒載量為 5. MX104COpieS/ml，並且至第二代中國源恆河猴0506號感染後第20天，病毒載量已經達到5. 98 X 105copies/ml (如圖11所示)。與第一代中國源恆河猴載量結果相比，第二代中國源恆河猴載量出現時間更早，峰值更高，證明本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8 已經在第二代中國源恆河猴體內建立起感染效果高於第一代中國源恆河猴的持續性感染。同時，在本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8第二代中國源恆河猴0506 號中分離到傳代病毒株，並在TZM-bl中檢測其細胞水平感染活性達到3. IexiO4TCID500本發明與現有技術相比具有如下優點本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8攜帶了來源於中國新發感染病人急性感染期樣本HIV-I的包膜蛋白基因，主要流行株CRF07_BC亞型，具有CCR5單嗜性。 能夠感染人和恆河猴外周血單核淋巴細胞，並能在中國源恆河猴體內有效複製。中國源恆河猴體內傳代過程中表現出感染能力增強的趨勢。通過本發明的人猴免疫缺陷病毒 SHIV-XJN0363B8感染中國源恆河猴表現出典型的新發感染特點，可以很好的模擬HIV-I多種途徑感染人體早期的病毒血症特點。另外，本發明利用成熟的B亞型SHIV-KB9致病性強毒株作為基因框架，因此本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8的本身具有一定水平的致病能力，對於人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8/中國恆河猴愛滋病模型在疫苗和抗病毒藥物評價中應用是非常關鍵的。因此，本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8/ 中國恆河猴愛滋病模型可以在我國愛滋病疫苗、抗病毒藥物生物製品的研發和有效性評價中發揮關鍵作用。歸納起來，本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8具有下述特性和優點(1)攜帶屬於中國HIV-IBVC重組亞型的CRF07_BC重組模式毒株包膜蛋白基因。(2)攜帶的HIV-I包膜蛋白基因來源於中國新發感染病人急性感染期樣本。(3)具有CCR5細胞嗜性。(4)具有在人外周血單核淋巴細胞中複製的特點。
(5)具有在恆河猴外周血單核淋巴細胞中複製的特點。(6)具有感染中國源恆河猴體並在傳代過程中表現出感染能力增強的的特點。


下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。圖1是本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8基因結構示意圖。圖2是HIV-I XJN0363包膜蛋白基因系統進化樹分析。圖3是SHIV cDNA克隆構建流程圖。圖4是本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8輔助受體的檢測圖。圖5是本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8轉染細胞系的電鏡照片。圖6是SHIV病毒在人外周血單核淋巴細胞中的複製曲線圖。圖7是SHIV病毒在猴外周血單核淋巴細胞中的複製曲線圖。圖8是在倒置顯微鏡下觀察被病毒感染的恆河猴外周血單核淋巴細胞的狀態。圖9是本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8在中國源恆河猴體內病毒載量分析。圖10是本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8病毒感染中國源恆河猴血液流式分析。圖11是本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8病毒在第二代中國源恆河猴體內病毒載量分析。
具體實施例方式圖1表示本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8感染性全長克隆是以 CRF07_BC亞型HIV-I XJN0363的包膜蛋白基因替換致病性強毒株SHIV-KB9的相應基因片段構建而成。本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B的分類命名免疫缺陷病毒，拉丁文學名？，保藏日期2010年10月15日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號CGMCC No.4243,圖2表明根據包膜蛋白基因的序列，利用Wisconsin GCG Package和網上BLAST 等工具對HIV-I XJN0363的序列與其它HIV-I毒株進行比對。分析表明HIV-I XJN0363的包膜蛋白基因序列屬於CRF_07BC亞型。圖3說明在構建本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8全長克隆時，選擇 SHIV-KB9作為骨架。通過分子克隆手段，替換的包膜蛋白基因區位於3』 SHIV-KB9半長克隆中，通過已有的酶切位點對包膜蛋白基因2. Ikb的片段進行替換。將替換了包膜蛋白基因的3，SHIV-KB9與5，SHIV-KB9通過酶切位點進行連接，得到全長的SHIV-XJN0363B8克隆質粒。圖4顯示通過流式細胞儀檢測表達不同輔助受體的(ihost細胞中被激發表達綠色螢光蛋白的細胞數量，從而驗證病毒使用何種輔助受體。以B亞型SHIV-KB9作為對照組， SHIV-XJN0363B8感染表達CCR5輔助受體的(ihost細胞，不能感染表達CXCR4的(ihost細
10胞。由此確定，SHIV-XJN0363B8是以CCR5作為輔助受體，具有巨噬細胞嗜性。圖5顯示本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8轉染細胞後，收集細胞製成超薄切片，在電鏡下可以觀察到SHIV-XJN0363B8在轉染細胞系中成功組裝出病毒顆粒。SHIV-XJN0363B8顆粒呈球形，表面具有包膜結構。照片中箭頭所指示的即為 SHIV-XJN0363B8在細胞邊緣和細胞之間的間隙形成的病毒顆粒。圖6表明本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8感染人外周血單核淋巴細胞後定期收集培養物上清，測定SIV Ρ27的滴度。同時，以B亞型SHIV-KB9為陽性對照，進一步確認SHIV毒株在體外的感染效果。圖7表明本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8病毒在恆河猴外周血單核淋巴細胞中也檢測到感染活性，SIV Ρ27滴度逐漸上升，第11天達到高峰，然後又逐漸回落。與人外周血單核淋巴細胞相比，SHIV在恆河猴外周血單核淋巴細胞中感染活性略有降低。圖8顯示本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8感染恆河猴外周血單核淋巴細胞11天後，與沒有被感染的外周血單核淋巴細胞對照進行比較。從照片中可以看出， SHIV-KB9 (C)和SHIV-XJN036;3B8 (D)均可以導致恆河猴外周血單核淋巴細胞產生明顯的細胞病變。與生長狀態良好的正常細胞相比(A和B)，被病毒感染的外周血單核淋巴細胞變得膨大，內含物增多，許多細胞出現崩解現象。圖9表明本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8病毒感染兩隻中國源恆河猴後定期採集3ml EDTA抗凝靜脈血，檢測兩隻中國源恆河猴0504號和0505號體內的血漿中病毒RNA載量變化趨勢。數據表明這兩隻恆河猴感染特徵基本一致，感染後20 天前後時間點出現病毒載量陽性結果，載量檢測高峰在30天至35天，載量值分別達到 5. 14X105copies/ml 和 2. 23X 105copies/ml ；隨後，病毒載量逐步降低。圖10表明本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8病毒感染兩隻中國源恆河猴後定期採集:3ml EDTA抗凝靜脈血，進行血常規和⑶3，⑶4，⑶8流式檢測。結果顯示感染後動物體內CD4+與CD8+T細胞比值在初期略有下降，但是隨後細胞比值回升，始終未見明顯的倒置現象。CD4+T細胞一直保持比較穩定的水平，感染後出現稍許下降，但是很快恢復正常水平，表明本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8對於中國恆河猴是一株非致病性弱毒株。圖11表明在第一代中國源恆河猴0505號感染後第47天，從動物體內抽取5mL全血靜脈接種到第二代中國源恆河猴0506號中。在本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8病毒傳代中國源恆河猴0506號後第9天，檢測到病毒載量為 5. MX104copies/ml，感染後第20天，病毒載量已經達到5. 98 X 105copies/ml的峰值水平。 與第一代中國源恆河猴感染後載量結果相比，第二代中國源恆河猴載量出現時間更早，峰值更高，證明傳代本發明的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8已經在第二代中國源恆河猴體內建立起感染效果高於第一代中國源恆河猴的持續性感染。實施例1中國HIV-I B』 /C重組亞型包膜蛋白基因的獲取。目的是為使用PCR方法從HIV-I陽性血樣中擴增得到用於SHIV-XJN0363B8克隆構建的包膜蛋白基因。
操作方案包括HIV-I陽性血樣中基因組總DNA的提取和包膜蛋白基因的PCR擴增。具體如下第一，HIV-I陽性血樣中基因組總DNA的提取方案將HIV-I陽性血樣室溫解凍後，使用QIAGEN全血核酸提取試劑盒進行基因組總 DNA的提取。提取產物於_80°C保存，儘量避免核酸樣品的反覆凍融。第二，包膜蛋白基因的PCR擴增方案以提取出的HIV-I陽性血樣中基因組總DNA為模板，使用套式PCR擴增得到整合進宿主基因組的HIV-I包膜蛋白基因2. Ikb片段，該片段包含了 gpl20和部分gp41基因。 擴增所使用的外套引物，根據C亞型HIV-I毒株包膜蛋白基因的保守區域設計。在內套引物中，帶有用於克隆的酶切位點(見表1)，PCR擴增體系及反應條件(見表2和表3)。由於HIV-I的全長基因組只有91Λ左右，僅為人類基因組的十萬分之一。因此，想將整合到宿主基因組中的HIV-I前病毒基因片段擴增出來比較困難，尤其當感染者體內的病毒載量較低時，相應整合到宿主基因組中的HIV-I拷貝數也低。採用保守引物和套式PCR 及touchdown PCR的反應條件，可有效地從感染者基因組中擴增到包膜蛋白基因片段。表1擴增HIV-I包膜蛋白基因片段的引物
？(S
External forward 5' -CGA GAA GAA GCG GAG ACA GCG ACG AA -3' External reverse 5， -AGC CAG GCA CAA GCA GCA TTG GTA GC -3， Internal forward 5 』 -CAC AGT CTA TTA TGG GGT ACC TGT ATG G {Kpnl) -3' Internal reverse 5' -ggc egg ate cgt tea cta ate g-3， {BaiiiM) -3表2HIV-1 env基因片段的PCR擴增體系(基於 TAKARA Pyrobest DNA Polymerase 試劑)
PCR第一輪PCR第二輪
體積(μ )體積(μ )
Pyrobest DNA Polymerase 025Pyrobest IM DNA Polymerase025
\OxPyrobest buffer51 O^Pyrobest buffer5
dNTP mixture4dNTP mixture權利要求
1.一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株，其特徵在於它是攜帶中國HIV-I B』/C重組亞型包膜蛋白基因片斷的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN036;3B8，其分類命名免疫缺陷病毒，保藏日期2010年10月15日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號CGMCC No. 4243。
2.權利要求1所述一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株的應用，其特徵在於將上述人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8用於構建SHIV_XJN036;3B8/中國恆河猴愛滋病模型。
3 根據權利要求2所述的權利要求1所述一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株的應用，其特徵在於將SHIV-XJN036;3B8/中國恆河猴愛滋病模型用於評價愛滋病疫苗免疫保護效果。
4.根據權利要求2所述的權利要求1所述一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株的應用，其特徵在於將SHIV-XJN036;3B8/中國恆河猴愛滋病模型用於評價檢測愛滋病抗病毒藥物。
全文摘要
本發明一種人猴嵌合免疫缺陷病毒株及其應用，涉及以引入外來基因材料修飾的病毒，它是攜帶中國HIV-1 B』/C重組亞型包膜蛋白基因片斷的人猴免疫缺陷病毒SHIV-XJN0363B8，其分類命名免疫缺陷病毒，拉丁文學名Lentivirus，保藏日期2010年10月15日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號CGMCC No.4243。用該病毒株構建的SHIV-XJN0363B8/中國恆河猴愛滋病模型，可以有效模擬HIV-1感染早期的病毒複製特點，並在研究HIV-1體內的致病機制以及在我國愛滋病疫苗和愛滋病抗病毒藥物等生物製劑的有效性評價中發揮作用。
文檔編號C12R1/93GK102465117SQ20101054680
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月17日 優先權日2010年11月17日
發明者喬文濤, 李悅, 楊貴波, 王金忠, 邵一鳴, 陳啟民 申請人:中國疾病預防控制中心性病愛滋病預防控制中心, 南開大學