(e,e)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物的應用的製作方法

2023-12-02 02:21:01

專利名稱：(e,e)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一類化合物在製備Bcl-2家族蛋白抑制劑類抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
Bcl-2小分子抑制劑通過模擬BH3結構域發揮作用，是一類有效的抗腫瘤藥物。該類化合物通過模擬天然BH3-only肽，競爭結合在Bcl_2或者Mcl-I、Bcl_xL蛋白表面的BH3 結構域，促使天然的BH3-only肽釋放、激活，發揮促進凋亡的作用。所以，這一類小分子抑制劑適用於所有高表達Bcl-2，Mcl-l，和/或Bcl-xl蛋白的腫瘤，包括血液腫瘤和實體瘤。本申請人多年從事Bcl-2抑制劑的分子設計、合成和藥理學研究。曾經在PCT申請TO2010/0M575A1中，公開了具有專一靶向性的Bcl_2家族蛋白(包括Bcl-2、Bcl_xL和 Mcl-I蛋白)抑制劑——危並雜環類化合物。根據fragment-based原則，申請人在已經申請專利並獲得授權的小分子Bcl-2抑制劑-3-硫嗎啉基-8-氧-8H-苊並[l，2_b]吡咯_9_腈 (簡稱Si)的基礎上，通過分子拆分和分子生長，獲得了(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈。該化合物的結構曾經在CN100413845C中被公開(說明書第39頁，實施例 17)。但是在上述公開的專利說明書中，所保護的全部化合物被當做激酶調節劑的用途並且主要用於調節酪氨酸激酶的活性，優選用於抑制以高表達酪氨酸激酶為主要特徵之一的血液腫瘤的細胞增殖，以及用於鑑定表達酪氨酸激酶的細胞，研究酪氨酸激酶的定位。然而本發明人經過研究發現該化合物並非如現有技術所述的是作為激酶調節劑在抑制細胞增殖中發揮作用，而是作為Bcl-2家族蛋白抑制劑，通過直接結合Bcl-2和/或Mcl-I和/或 Bcl-xl蛋白，發揮了殺死腫瘤細胞的作用。基於上述研究的結果，發明人認為有必要給予該類化合物以更為準確的應用定位。

發明內容
發明人在最新的研究中發現，以(E，E)-2_(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈 (下文也簡稱為3g)為代表的一類化合物通過直接結合Bcl-2和/或Mcl-I和/或Bcl-xl 蛋白，發揮了殺死腫瘤細胞的作用，因此該化合物的應用不應當如現有技術所述的，局限於 /優選用於以血液腫瘤為代表的激酶高表達的腫瘤，而是可以用於所有高表達Bcl-2和/或 Mcl-I和/或Bcl-xl蛋白的惡性腫瘤。其次，這種殺傷腫瘤細胞的作用，可能間接導致酪氨酸激酶等激酶的下調，但是不依賴激酶的下調。再次，在沒有酪氨酸激酶高表達的腫瘤中， 只要符合該化合物的適應症，仍然可以用該類化合物進行治療。第四，激酶尤其是酪氨酸激酶並非腫瘤特異性表達，因此激酶抑制劑類藥物將具有相應的毒副作用和因此而來的禁忌症。因此，本發明的目的是針對以(E，E) -2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈為代表的一類化合物殺傷腫瘤細胞的作用機制進行研究，從而為該類化合物的使用提供更準確的指導。
首先，本發明提供一種篩選能夠被(E，E) -2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物誘導凋亡的腫瘤細胞的方法，該方法包括以下步驟(a)和/或(b)(a)檢測腫瘤細胞中位於染色體18q21. 3上Bcl-2基因拷貝數，以基因拷貝數大於對照2. 8倍為基準，確定能夠被(E，E) -2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物誘導凋亡的腫瘤細胞；(b)對腫瘤細胞進行免疫組化染色，檢測Mcl-I和/或Bcl-xL蛋白表達量，以免疫組化染色大於10%為基準，確定能夠被(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物誘導凋亡的腫瘤細胞。其中，所述的腫瘤細胞可以來自體外腫瘤細胞培養物，或是來自腫瘤患者，即離體的腫瘤細胞樣本。本發明還提供一種用於篩選能夠被(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物誘導凋亡的腫瘤細胞的試劑盒，該試劑盒包括用於檢測Bcl-2基因拷貝數的元件，和/或用於檢測Mcl-I和/或Bcl-xL蛋白表達量的元件。所述用於檢測Bcl-2基因拷貝數的元件優選包括識別染色體18q21. 3的探針和識別18號染色體著絲點的探針。 更優選地還包括Trizol，螢光染料STOR Green I，反轉錄酶，6鹼基隨機引物。所述用於檢測Mcl-I和/或Bcl-xL蛋白表達量的元件優選包括動物源抗人Mcl-I和Bcl-xL抗體，生物素標記二抗，例如兔源抗人Mcl-1，兔源抗人Bcl-xl抗體，生物素標記抗兔二抗。更優選地，所述用於檢測Mcl-I和/或Bcl-xL表達的元件還包括兔血清，染色液和顯色液。其中， 所述染色液包含抗生物素過氧化物酶，效價5 ；所述顯色液包含IOmM 二氨基聯苯胺。 另一方面，本發明提供一種篩查適用(E，E) -2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物治療的腫瘤患者的方法，該方法包括以下步驟(a)獲取腫瘤患者的腫瘤細胞，製備成為離體的腫瘤細胞樣品；(b)檢測腫瘤細胞中Bcl-2基因拷貝數，和/或對腫瘤細胞進行免疫組化染色，檢測Mcl-I和/或Bcl-xL蛋白表達量；(c)以基因拷貝數大於對照2. 8倍，和/或免疫組化染色大於10%為基準，篩選適用(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物治療的腫瘤患者。本發明還提供一種篩查適用(E，E)-2_(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物治療的腫瘤患者的試劑盒，該試劑盒包括用於檢測Bcl-2基因拷貝數的元件，和/ 或用於檢測Mcl-I和/或Bcl-xL表達的元件，和/或用於檢測促凋亡因子Bax和Bak表達的元件。優選技術方案中，所述用於檢測Bcl-2基因拷貝數的元件包括識別染色體 18q21. 3的探針和識別18號染色體著絲點的探針。更優選地，該元件還包括Trizol，螢光染料STOR Green I，反轉錄酶，6鹼基隨機引物。另一優選的技術方案中，所述用於檢測Mcl-I和/或Bcl-XL表達的元件包括動物源抗人Mcl-I和Bcl-xL抗體，生物素標記二抗，例如兔源抗人Mcl-I，兔源抗人Bcl-χ 抗體，生物素標記抗兔二抗。更優選地，該元件還包括兔血清，染色液和顯色液。其中，所述染色液包含抗生物素過氧化物酶，效價5 ；所述顯色液包含IOmM 二氨基聯苯胺。在另一技術方案中，上述用於篩查適用(E，E)-2_(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物治療的腫瘤患者的試劑盒還包括用於檢測促凋亡因子Bax和Bak表達的元件包括動物源抗人Bax和Bak抗體，動物源抗人actin抗體，例如兔源抗人Bax和Bak 抗體，鼠源抗人actin抗體，兔源抗人actin抗體，HPR標記的抗兔二抗，FITC標記的抗兔二抗，Cy3標記的抗鼠二抗。優選地，所述用於檢測促凋亡因子Bak表達的元件還包括裂解液、封閉液、洗滌液、轉膜緩衝液、顯色液和固定液。其中，所述封閉液為5% BSA ；所述洗滌液包含 IOmM Tris-HCl, ρΗ8· 0，150mM NaCl 和 0· Tween-20 ；所述裂解液包含 62. 5mM Tris-HCl,pH 6. 8,2% w/ν SDS，10% glycerol，50mMDTT和 ImM PMSF ；所述轉膜緩衝液包含 39mM 甘氨酸，48mM Tris, 0. 0375% (w/v) SDS 禾口 20% (ν/ν)甲醇；所述固定液為 10% (ν/ν) 甲醛。再一方面，本發明提供一種誘導腫瘤細胞凋亡的方法，包括給予腫瘤細胞有效劑量的(Ε，Ε)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈或其衍生物的步驟。其中所述的腫瘤細胞指高表達Bcl-2和/或Bcl-xL和/或Mcl-I蛋白的腫瘤細胞，尤其是肝癌、乳腺癌、 肺癌、前列腺癌等實體瘤細胞，也包括高表達Bcl-2和/或Bcl-xL和/或Mcl-I蛋白的各型白血病。由此可以引申出一種腫瘤的治療方法，包括給予來自腫瘤患者的腫瘤細胞治療有效劑量的(E，E) -2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈或者其衍生物，檢測Bcl-2/Bax， Mcl-1/Bak,和Bcl-xl-Bak的含量，對比未經E，E) -2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈或者其衍生物處理的腫瘤細胞，以Bax/Bak的釋放作為治療有效的標準。本發明也提供了一種採用(E，E)-2_(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈或者其衍生物治療腫瘤患者的試劑盒，該試劑盒包括有效量的(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈或者其衍生物，用於檢測Bcl-2/Bax和/或Mcl-1/Bak和/或 Bcl-xl/Bak 二聚體的元件。優選地，所述用於檢測元件包括動物源抗人Bcl-2，Bax, Mcl-I 和Bak，和Bcl-xl抗體，例如兔源抗人Bcl-2和Bax抗體，兔源抗人Mcl-I，Bcl-xl和Bak抗體，!PR標記的抗兔二抗。更優選地，所述用於檢測元件還包括蛋白A/G瓊脂珠、封閉液、洗滌液、裂解液、轉膜緩衝液、顯色液和固定液。其中，所述封閉液為5% BSA ；所述洗滌液包含 IOmM Tris-HCl，ρΗ8· 0，150mM NaCl 禾Π 0· Tween-20 ；所述裂解液包含 150mM NaCl，IOmM HEPES pH 7. 4,2% CHAPS, 50mM DTT 和 ImM PMSF ；所述轉膜緩衝液包含 39mM 甘氨酸，48mM Tris,0. 0375% (w/v)SDS 和 20% (ν/ν)甲醇；所述固定液為 10% (ν/ν)甲醛。本發明還提供一種調節、優選抑制細胞中Bcl-2/Bax和/或Bcl-xL/Bak和/ 或Mcl-1/Bak蛋白二聚體的方法，包括給予細胞有效劑量的(E，E)_2_(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈或其衍生物的步驟。再一方面，本發明提供了對需要該類化合物治療的腫瘤患者給予有效量的(E， E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈或者其衍生物來幹擾Bcl-2/Bax和/或 Mcl-1/Bak和/或Bcl-xl/Bak 二聚體的方法，該方法包括以下步驟(a)給予腫瘤患者治療有效量的該類化合物，所述腫瘤患者為根據上述的方法確定的適用該類化合物治療的腫瘤患者；優選地，上述方法還包括以下步驟(a)檢測取自腫瘤患者的腫瘤細胞中Bcl-2/Bax，Mcl-l/Bak，Bcl-xk-Bak 二聚體的含量變化；(b)根據Bcl-2/Bax和/或Mcl-1/Bak和/或Bcl-xl/Bak 二聚體的解離，確定該類化合物治療腫瘤患者有效。除此以外，本發明化合物可用於研究工具，用於研究Bcl-2家族蛋白之間的相互作用。再者，本發明還公開了(E，E) -2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物在製備Bcl-2家族蛋白抑制劑類抗腫瘤藥物或蛋白二聚體調節劑中的應用，所述的蛋白二聚體包括Bcl-2/Bax和/或Bcl_xL/Bak和/或Mcl-1/Bak的二聚體。所述的抗腫瘤藥物或蛋白二聚體調節劑是所述的(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈或其衍生物與常規的藥用可接受輔劑混合，製備成常規的藥用劑型。常用輔劑例如藥學可用的賦形劑、崩解劑、粘合劑、包衣劑等。本發明的技術人員可使用常規製劑技術獲得上述產品。以上各技術方案中，來自腫瘤患者的腫瘤細胞，即離體的組織樣本，包括病人外周血樣品，腫瘤組織樣品，針刺樣品，骨髓樣品，淋巴結樣品，尿液樣品，腹水樣品，洗胃樣品， 食管衝洗樣品，膀胱或肺部衝洗樣品，腦脊液樣品，導管吸取樣品，乳導管造影樣品，胸腔積液樣品，組織凍存樣品，石蠟包埋組織樣品。組織樣本經一定處理後，用於檢測。例如，從病人的外周血樣本中分離出特定表皮細胞群，用於檢測。顯微分離腫瘤組織獲得富含腫瘤細胞的樣品，用於檢測。優選的組織樣本包括外周血樣品，腫瘤組織樣品，針刺樣品，石蠟包埋樣品和骨髓樣品。蛋白質二維核磁試驗、螢光偏振試驗、酶聯免疫吸附試驗、在多個細胞系(包括人肝癌細胞SMMC-7721，鼠肝癌細胞H22，人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞H1688、H520，人前列腺癌細胞DU145、和人急性淋巴細胞性白血病Nalm-6)中的細胞生物學實驗、以及皮下荷肝癌H22實體瘤小鼠的實驗均證明(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈是一個BH3類似物，結合在Bcl-2，Mcl-UP Bcl_xl的BH3結構域，並因此在培養細胞內和在體細胞內解離Bcl-2/Bax、Mcl-l/Bak的二聚體，釋放和激活Bax和Bak，從而以誘導腫瘤細胞凋亡的方式殺死腫瘤細胞。例如在高表達Bcl-2，Mcl-UP Bcl-xl的來自肝癌切除組織的細胞中，3g能夠誘導Bcl-2/Bax，Mcl-l/Bak，和Bcl-xl/Bak 二聚體的下調，並因此導致細胞凋亡，卻不能在不高表達Bcl-2，Mcl-1，和Bcl-xl的來自人肝囊腫切除組織的細胞中誘導凋亡。尤其是，這一凋亡誘導作用不依賴激酶的下調。在急性淋巴細胞性白血病細胞株中， 3g誘導的Mcl-1/Bak的下調和凋亡都發生在Brc-ABL激酶下調之前，證明3g誘導的是不依賴激酶下調的細胞凋亡，它的直接靶點是Bcl-2家族蛋白。最後，在肝癌模型小鼠體內， 0. lmg/kg體重3g腹腔注射10天就導致Bcl-2/Bax，Mcl-1/Bak，和Bcl-xl/Bak 二聚體的下調，相應的劑量下腫瘤抑制率在30%左右。以上各方法中，進行共培養的腫瘤細胞密度為IO5 107mL，本發明化合物的濃度為5 10 μ M，共培養時間為M小時。進一步的二維核磁和結構模擬表明，具有與(Ε，Ε) -2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈相似結構域的一些列化合物均有類似的活性，這類化合物都含有α氰基結構， 結構中的氰基和與氰基相隔一個或兩個重原子的R1中的N，0原子一起與Mcl-I/蛋白中的 R263和Ν260形成氫鍵網絡，從而佔據Mcl-I蛋白ΒΗ3結合溝槽。Bcl_2和Bcl-xl蛋白在相應的位置同樣有R和N胺基酸殘基，它們與這兩個蛋白的結合也是同樣的分子基礎。因此，本發明上述任何一個技術方案所述及的(E，E) -2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物還包括與該化合物具有相同結構域的一系列化合物，包括通式I、通式II和通式III的化合物，其中所述通式I的化合物具有如下結構通式
權利要求
1.一種篩選能夠被(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物誘導凋亡的腫瘤細胞的方法，該方法包括以下步驟(a)和/或(b)(a)檢測腫瘤細胞中位於染色體18q21.3上Bcl-2基因拷貝數，以基因拷貝數大於對照 2. 8倍為基準，確定能夠被(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物誘導凋亡的腫瘤細胞；(b)對腫瘤細胞進行免疫組化染色，檢測Mcl-I和/或Bcl-xL蛋白表達量，以免疫組化染色大於10%為基準，確定能夠被(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物誘導凋亡的腫瘤細胞。
2.權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述腫瘤細胞來自體外腫瘤細胞培養物或腫患 ο
3.權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈的衍生物包括通式I、通式II和通式III的化合物，其中所述通式I的化合物具有如下結構通式
4.一種用於篩選能夠被(Ε，Ε)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物誘導凋亡的腫瘤細胞的試劑盒，該試劑盒包括用於檢測Bcl-2基因拷貝數的元件，和/或用於檢測Mcl-I和/或Bcl-xL蛋白表達量的元件。
5.一種篩查適用(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物治療的腫瘤患者的方法，該方法包括以下步驟(a)製備離體的腫瘤細胞樣品；(b)檢測腫瘤細胞中Bcl-2基因拷貝數，和/或對腫瘤細胞進行免疫組化染色，檢測 Mcl-I和/或Bcl-xL蛋白表達量；(c)以基因拷貝數大於對照2.8倍，和/或免疫組化染色大於10%為基準，篩選適用 (E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物治療的腫瘤患者。
6.一種篩查適用(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物治療的腫瘤患者的試劑盒，該試劑盒包括用於檢測Bcl-2基因拷貝數的元件，和/或用於檢測 Mcl-I和/或Bcl-xL表達的元件，和/或用於檢測促凋亡因子Bax和Bak表達的元件。
7.誘導腫瘤細胞凋亡的方法，包括給予腫瘤細胞有效劑量的(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈或其衍生物的步驟。
8.(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物在製備Bcl-2家族蛋白抑制劑類抗腫瘤藥物中的應用。
9.調節細胞中Bcl-2/Bax和/或Bcl_xL/Bak和/或Mcl-1/Bak蛋白二聚體的方法，包括給予細胞有效劑量的(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈或其衍生物的步馬聚ο
10.(E，E) -2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物在製備Bcl-2/Bax和 /或Bcl-xL/Bak和/或Mcl-1/Bak蛋白二聚體調節劑中的應用。
全文摘要
(E，E)-2-(苯甲基氨基羰基)-3-苯乙烯基丙烯腈及其衍生物的應用，該類化合物作為Bcl-2家族蛋白抑制劑，通過直接結合Bcl-2和/或Mcl-1和/或Bcl-xl蛋白，發揮了殺死腫瘤細胞的作用。這類化合物可以用於篩選能夠被其誘導凋亡的腫瘤細胞、以及製備Bcl-2家族蛋白抑制劑類抗腫瘤藥物，或製備Bcl-2/Bax和/或Bcl-xL/Bak和/或Mcl-1/Bak蛋白二聚體調節劑。
文檔編號A61K31/277GK102212613SQ201110077548
公開日2011年10月12日 申請日期2011年3月29日 優先權日2011年3月29日
發明者張志超, 謝飛博 申請人:大連理工大學