運動發酵單胞菌果聚糖蔗糖酶基因突變的工程菌及其構建和用途的製作方法

2023-12-10 04:01:21

專利名稱：運動發酵單胞菌果聚糖蔗糖酶基因突變的工程菌及其構建和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種運動發酵單胞菌果聚糖蔗糖酶基因突變的工程菌；本發明還涉及此工程菌的構建方法以及其在發酵生產乙醇中的用途。
背景技術：
運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)是迄今為止所發現的唯一一株通過脫氧酮糖酸(Entner-Doudoroff，E-D)途徑利用葡萄糖、果糖和蔗糖發酵生產乙醇的革蘭氏陰性的兼性厭氧細菌。
運動發酵單胞菌有三種蔗糖水解酶胞內蔗糖水解酶SacA(intracellularsucrose-hydrolyzing enzymes)和胞外蔗糖水解酶SacC(extracellularsucrose-hydrolyzing enzymes)及胞外果聚糖蔗糖酶SacB(extracellularlevansucrase)。由於運動發酵單胞菌的細胞膜上沒有蔗糖轉運酶系，所以胞內蔗糖水解酶SacA在蔗糖水解和發酵中實際上不發揮作用。SacC能夠水解蔗糖生成單糖(葡萄糖和果糖)，生成的單糖繼而通過E-D代謝途徑生成乙醇。
SacB不僅具有蔗糖水解活性，同時又具有果聚糖形成活性。即其水解蔗糖的產物是葡萄糖和果聚糖。只有葡萄糖可以進一步通過E-D代謝途徑生成乙醇。因此當需要採用蔗糖作為發酵碳源製備乙醇時，由於副產物果聚糖的生成，影響了乙醇的產量。
已知SacB的蔗糖水解活性是運動發酵單胞菌總的蔗糖水解活性的1/3，所以，如果在利用運動發酵單胞菌進行蔗糖水解的過程中控制果聚糖的形成，則可以提高乙醇的收率。這是一個待解決的問題。

發明內容
本發明的目的是製備一種新型運動發酵單胞菌工程菌，使其在用蔗糖作為底物發酵生產乙醇的過程中減少副產物果聚糖的形成，以提高乙醇的產率。
本發明的技術方案是1.SacB基因改造將四環素抗性基因插入到運動發酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因(SacB)中，這些基因包括GeneBank L33402、AF081588、AF313764等；2.構建含有經改造的SacB基因的重組質粒將上述插入四環素抗性基因的SacB基因連接到克隆載體上，用內切酶消化，然後插入到自殺性質粒中；3.構建將四環素抗性基因插入到果聚糖蔗糖酶基因的工程菌將得到的重組質粒導入運動發酵單胞菌後，篩選具有四環素抗性的突變菌株。該突變株即為將四環素抗性基因插入到果聚糖蔗糖酶基因中的目標菌株。
所述運動發酵單胞菌包括運動發酵單胞菌XW101，及其它與其親緣關係相近的運動發酵單胞菌菌株；所述克隆載體包括pGEM-T、pUC19、pBS、pACYC184等載體；所述自殺性質粒包括質粒pSUP202、pPHU281和pSZ21等。
本發明的優點是1.本發明得到的上述運動發酵單胞菌工程菌具有四環素抗性，使果聚糖蔗糖酶基因失活，不能將發酵底物蔗糖轉化為副產物果聚糖，從而提高了將底物轉化為乙醇的效率。
經測試，使用本發明得到工程菌，在以15％的蔗糖為發酵底物時，在30攝氏度靜置培養經過70小時的發酵，可以明顯提高蔗糖轉化為乙醇(從37.2g/l到44.3g/l)的效率，即乙醇的產量提高了19％。
2.本發明採取同源重組雙交換的方法使運動發酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因突變失活，同時插入標記基因-四環素抗性基因，為突變後目標基因的篩選提供了方便。
具體實施例方式
以下以運動發酵單胞菌XW101為例，詳細說明本發明的內容。但本發明的範圍並不局限於此。應該說，本領域的技術人員用本發明的思路和方法可在任何運動發酵單胞菌中實現本發明目的。
在以下的實施例中，製備的運動發酵單胞菌工程菌是在野生型菌株的果聚糖蔗糖酶SacB基因(GeneBank L33402)的955bp處插入1950bp四環素抗性基因的目標菌株。利用SacB-F和SacB-R作為引物進行PCR擴增，可獲得3.685kb的產物。上述運動發酵單胞菌XW101的果聚糖蔗糖酶基因是通過PCR克隆得到的，在進行擴增運動發酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因時所用引物序列如SacB-F及SacB-R所示。
實施例1運動發酵單胞菌工程菌的製備A、運動發酵單胞菌的培養及DNA的提取運動發酵單胞菌在培養基RM(葡萄糖20g/l、酵母浸膏10g/l、磷酸二氫鉀2g/l、pH6.0)中30攝氏度培養48小時後，採用CTAB法提取總DNA用於以後的遺傳操作。
CTAB法提取細菌總DNA1)取單菌落接種於5ml相應的培養基中，在合適的溫度下培養。根據細菌的生長率不同培養時間可由幾小時到幾天不等。
2)取1.0ml菌液於1.5ml離心管中，13,000rpm離心2min，棄上清。
3)沉澱重懸於1.0ml 0.85％NaCl中。
4)室溫13,000rpm離心2min，棄上清。
5)沉澱重懸於550μl 1×TE中。
6)加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃溫育30min。
7)加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37℃溫育30min。
8)加30μl 10％SDS，37℃溫育30min。
9)加100μl 5M NaCl充分混勻。
10)加80μl CTAB/NaCl溶液，混勻，65℃水浴10min。
11)加等體積(0.7～0.8ml)氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕振蕩混勻。
12)室溫，13,000rpm離心10min。
13)將上清液轉移到一新1.5ml離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)輕輕振蕩混勻。
14)重複第12)步。
15)將上清液轉移到一新1.5ml離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)輕輕振蕩混勻。
16)重複第12)步。
17)將上清液轉移到一新1.5ml離心管中，加入0.6體積異丙醇，混勻後室溫靜置60min。
18)20℃13,000rpm離心20min。
19)棄上清，加500μl 70％乙醇，輕輕顛倒數次(洗鹽)。
20)4℃15,000rpm離心20min。
21)重複洗鹽兩次。
22)倒置離心管，乾燥DNA沉澱10～15min。
DNA沉澱溶於20μl無菌水，-20℃保存備用。
B、運動發酵單胞菌XW101果聚糖蔗糖酶基因的克隆以SacB-F5』-GCATGCGAGATTTATATGGTTGC-3』和SacB-R5』-GTCGACGGAATAGGAAGGGTGTC-3』為引物，擴增運動發酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因。得到XW101果聚糖蔗糖酶基因的PCR產物，其大小為1735bp，並重組到pGEM-T載體上，該重組質粒命名為pGS，經測序分析後，與已報導的運動發酵單胞菌果聚糖蔗糖酶基因的同源性為98％。
PCR反應體系10×PCR buffer 2μl2.5mMdNTP 2μl50μM SacB-F 0.5μl50M SacB-R 0.5μl模板DNA2μl5U/μlTaq酶0.5μl加無菌水至20μlPCR反應條件1、94℃預變性 5min2、94℃30s53℃ 1min72℃ 2min(25個循環)3、72℃10min連接體系與連接反應2×buffer 5μlpGEM-T 0.5μlPCR產物3.5μlT4連接酶(3U/μl) 1μl4℃過夜連接。
c、將四環素抗性基因插入到所克隆的果聚糖蔗糖酶基因中。
通過分析，發現重組質粒pGS的插入片段中在955bp處有唯一的Nde I酶切位點，經酶切後，將四環素抗性基因插入到該位點，構建成果聚糖蔗糖酶基因中插入有四環素抗性基因的重組質粒pGST限制性內切酶的酶切反應體系與酶切反應10×buffer5μlDNA樣品 3μl限制性內切酶 0.5μl加無菌水至20μl37℃過夜酶切D、果聚糖蔗糖酶基因突變菌株的構建用SalI和SphI完全酶切重組質粒pGST後，將得到的含有四環素抗性基因插入片斷的果聚糖蔗糖酶基因與經SalI和SphI完全酶切的pSUP202自殺性質粒重組，得重組質粒pSST，在pRK2013幫助下通過三親接合導入到野生型運動發酵單胞菌XW101中，在含有四環素(20μg/ml)和氨苄青黴素(100μg/ml)的RM培養基上篩選突變菌株。得到工程菌株XW101(pSST)。
E、四環素抗性基因插入位點的驗證採用B中的引物，以工程菌株XW101(pSST)的總DNA為模板(反應條件和反應體系如B中所述)，可擴增到大小約為3.685kb的條帶，說明四環素抗性基因經過同源重組雙交換，已成功的插入到目標基因果聚糖蔗糖酶基因中間。
實施例2工程菌株XW101(pSST)利用蔗糖發酵乙醇1.培養條件1.1培養基成分蔗糖15％、酵母浸膏1％、磷酸二氫鉀0.2％、pH6.01.2培養條件30攝氏度靜置培養70小時2.乙醇的測定2.1色譜條件2.1.1色譜柱長2m，內徑4mm。
2.1.2固定相GDX-102，60-80目2.1.3溫度氣化室190度，檢測器190度，柱溫170度。
2.1.4氣體流速載氣(N2)40ml/min。
2.2進樣量5.0ul。
2.3定性以乙醇標準出峰時間定性。乙醇標準應用液和樣品測定液各進樣5.0ul，分別測定保留時間，樣品與標準出峰時間對照而定性。
2.4定量2.4.1樣品測定液中乙醇含量測定取樣品測定液5.0ul進樣，測出乙醇峰高或峰面積，依據工作曲線或回歸方程計算測定液中乙醇含量(％)。
3.4.2工作曲線製作取20±0.5度的乙醇標準應用液適量用20±0.5度純水稀釋成乙醇含量(V/V)分別為0.20％、0.40％、0.60％、0.80％、1.00％的標準系列濃度。分別取上述乙醇標準系列濃度5.0ul進樣，測得乙醇的峰高或峰面積。以乙醇的含量百分濃度為橫坐標、相應的峰高或峰面積為縱坐標，製作工作曲線，或用最小二乘法計算其回歸方程。
2.4.3計算樣品中乙醇含量乙醇含量(C2H5OH，％，V/V)＝樣品測定液中乙醇含量×ff一稀釋倍數(1，50或100)。
6.試驗結果以15％的蔗糖為發酵底物，在30攝氏度的發酵條件下，經過70小時測定發酵液中乙醇的量，發現突變菌株(44.3g/l)與野生菌XW101(37.2g/l)相比乙醇的產量得到明顯提高。
權利要求
1.一種重組質粒，特徵是含有插入了四環素抗性基因的運動發酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因。
2.權利要求2所述的重組質粒，是權利要求1所述的果聚糖蔗糖酶基因與克隆載體連接、被內切酶消化後插入在自殺性質粒中的。
3.權利要求1或2所述的重組質粒，其中運動發酵單胞菌是運動發酵單胞菌XW101。
4.權利要求1或2所述的重組質粒的製備方法，是將權利要求1所述的果聚糖蔗糖酶基因連接到克隆載體上，用內切酶消化，並將其插入到自殺性質粒中。
5.權利要求4所述的重組質粒的製備方法，所述克隆載體包括pGEM-T、pUC19、pBS、pACYC184。
6.權利要求4所述的重組質粒的製備方法、所述自殺性質粒包括質粒pSUP202、pPHU281和pSZ21。
7.一種用於發酵生產乙醇的工程菌，特徵是含有權利要求1或2所述的重組質粒。
8.權利要求7所述的工程菌，特徵是含有權利要求3所述的重組質粒。
9.權利要求7或8所述的工程菌的構建方法，特徵是將權利要求1或2所述的重組質粒導入運動發酵單胞菌後，篩選具有四環素抗性的突變菌株。
10.權利要求7或8所述的工程菌的用途，是用於發酵生產乙醇。
全文摘要
本發明涉及運動發酵單胞菌果聚糖蔗糖酶基因突變的工程菌及其構建和用途。本發明將四環素抗性基因插入到運動發酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶基因中，並將得到的重組質粒導入運動發酵單胞菌後，篩選具有四環素抗性的突變菌株即為目標工程菌。本發明得到的上述工程菌具有四環素抗性，使果聚糖蔗糖酶基因失活，不能將發酵底物蔗糖轉化為副產物果聚糖，從而提高了將底物轉化為乙醇的效率。
文檔編號C12N9/24GK1746311SQ20041000954
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月10日 優先權日2004年9月10日
發明者徐玉泉, 李淑英, 林敏 , 陳明 申請人:中國農業科學院生物技術研究所