包含水稻胚乳特異性啟動子的重組載體及其應用和植株的製作方法

2023-12-10 06:20:02 2

專利名稱：包含水稻胚乳特異性啟動子的重組載體及其應用和植株的製作方法
技術領域：
本發明涉及轉基因水稻技術領域，尤其涉及一種包含水稻胚乳特異性啟動子的重組載體及其應用和植株。
背景技術：
生長素是一類小分子化合物，在植物體內種類很多，如吲哚乙酸 (indole-3-acetic acid, IAA)，苯乙酸、吲哚丁酸、4_氯吲哚乙酸，但最主要的形式是吲哚乙酸IAA。生長素在植物生長和發育過程中起著極其重要的作用，幾乎參與調控所有的發育過程，包括根系的發育、側根與不定根的啟動與形成、莖和葉的發育、葉原基和花原基的形成、花器官的發育、維管束組織的形成和分化、果實的生長與成熟、植株的頂端優勢、器官衰老、離區的形成等。同時，生長素還參與調控植物的向性生長如向光性和向地性、逆境脅迫反應(如乾旱、鹽漬、低溫和酸鋁等)、病原體浸染反應等。在最近10年中，人們利用模式植物擬南芥，對植物生長素生物合成途徑的研究已經取得了一些可喜的成果。植物生長素IAA的生物合成途徑已較為清楚，有色氨酸和非色氨酸兩條途徑，其中在植物體內以色氨酸途徑為主，其生物合成前體為色氨酸，這條途徑的下遊又可分為4條支路吲哚丙酮酸(indole-3-pyruvicacid，IPA)途徑、色胺 (tryptamine, ΤΑΜ)途徑、吲哚乙醛肟(indole-3-acetaldoxime，IAOx)途徑及吲哚乙醯胺 (indole-3-acetamide, IAM) (Woodward and Bartel, Ann Bot. 95 :707_735· 2005)。 控制合成吲哚乙酸的一些關鍵酶基因已經被克隆和鑑定，其中研究得最清楚是黃素單氧化物酶基因 l(flavin monooxygenase-like enzyme 1)。YUCCAl 基因是在分離高 IAA 水平的突變體中被分離鑑定，該基因編碼一個黃素類似單加氧酶，此酶能催化色胺形成N-羥基色胺，進一步催化形成IAA的中間產物ΙΑΟχ，這是色胺途徑中的限速步驟(Zhao et al.，science. 291 =306-309,2001) 在擬南芥基因組中，YUCCA基因家族共有11個成員 (AtYUCCAl-Il)，大部分成員的基因表達特性及其生物學功能已被鑑定(Cheng Y et al., Genes Dev. 20 :1790-1799,2006 ；Plant Cell. 19 :2430-2439,2007)。有研究表明在擬南芥中2個或多個YUCCA基因同時失活時表現出明顯的生長缺陷從而影響花器官的發育、葉片的發育、維管組織的形成以及胚胎發育。在水稻基因組中，有14個YUCCA基因，分別命名為 OsYUCCAl-14(Fujino et al.，Mol Genet Genomic. 279 :449-507,2008) 在水稻中高表達OsYUCCAl表現為生長素水平增高和產生生長素過表達株系的表型，而沉默OsYUCCAl 時所產生的表型與水稻生長素不敏感突變體的表型相似(Yamamoto Y et al. , Plant Physiol. 143 :1362-1371. 2007)。這些結果都表明YUCCA基因對調控植物體內的IAA水平具有重要的意義。目前有研究表明，植物激素參與調控作物生長發育的每個過程，作物的株高、分櫱、光合生產力和衰老均與作物的產量有密切的關係。在這些植物激素中，生長素吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA ；植物體內最主要的生長素形式)的生物合成途徑相對較為清楚。人們對植物激素的化學特性與生理功能已經進行了廣泛深入的研究，在作物特定生長期內，合理使用植物生長調節劑可使農作物明顯增產。目前，人工合成了各類植物生長調節劑達100多個品種(如萘乙酸、2，4-D、防落素、青鮮素、6-苄基氨基嘌呤、乙烯利、增苷膦、比久、噻唑隆、助長素(Pix)、矮壯素、多效唑、烯效唑、增甜劑、復硝鹽、芸苔素內酯、石油助長劑、抑芽敏、吲熟酯、水楊酸、三碘苯甲酸、調節安、異戊氨基嘌呤和疏果安等)，已被廣泛應用到農業、林業和工業生產中，大大提高了糧食產量和人們的生活水平。有研究表明，生長素IAA與水稻光合產物分配過程密切相關，是光合產物分配過程中許多限速和限量因子的調節劑，水稻源(葉片)和庫(穗子)組織中都含有一定濃度的IAA，特別是發育中的籽粒，其IAA含量要比其它組織高得多。籽粒中的IAA含量動態變化與籽粒灌漿速率表現基本一致。在水稻灌漿期間，用外源IAA處理葉片能明顯促進葉片的光合作用能力及其光合產物分配，提高種子的結實率(楊建昌等，江蘇農學院學報.16 27-31. 1995)；而外源IAA處理籽粒，可促進籽粒獲取同化物的能力，增加粒重(段俊等，植物學報.41 :75-77. 1999)。外源IAA對水稻幼穗的處理能縮小強、弱勢粒間結實的差異，使整穗的結實率都有所提高(陶龍興等，中國水稻科學.17 :149-155. 2003)。這些結果表明， 作物籽粒中IAA含量的上升有利於提高作物產量，對於農業生產具有十分積極的意義。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種包含水稻胚乳特異性啟動子OsGtl、 OsGluB與OsYUCCAl-8基因的重組載體及其應用，和水稻轉基因植株。技術方案如下包含水稻胚乳特異性啟動子OsGtl、OsGluB與0sYUCCAl-8基因的重組載體。所述的重組載體在轉基因水稻中的應用。含有所述各個載體的水稻轉基因植株。YUCCA基因是生長素合成生物途徑中的限速步驟，該基因過表達後，植株體內IAA 含量顯著上升。由於水稻轉基因通過組培培養分化形成植株，組成型過表達YUCCA會造成高濃度IAA使植株再生困難，某些器官的分化異常。本發明採用胚乳特異性啟動子OsGtl 和OsGluB來表達YUCCA基因，改良水稻籽粒中內源生長素IAA的生物合成效率，提高水稻光合作用的效率，從而提高水稻的產量或品質，有效地減少環境汙染。因此，本發明將在作物產量、環境保護等綠色農業生產中具有重要應用價值。


圖1技術路線圖。圖 2. pCambia-OsGtl/GluB: :0sYUCCAl_8:GUS 載體構建示意圖。圖 3. A. 1，2 均為 GUSPCR 片段，大約為 1. 8kb 左右；B. pCambia2300_2X35S: :GUS 酶切鑑定，U為未酶切質粒(對照)，D為酶切質粒，都有1.81Λ左右的條帶切下，證明⑶S連接到載體上。圖 4. A. 0sYUCCA2 基因 RT-PCR 片段，1. 2kb ；B. pCambia2300_2X35S: :0sYUCCA2 :GUS酶切鑑定，U為未酶切質粒(對照)，D為酶切質粒，在1.21Λ處都有酶切片段，證明 0sYUCCA2 片段連接到 pCambia2300-2X;35S: :GUS 載體上。圖5. A. 1為OsGluB PCR產物片段，條帶大小約為1. 4kb ；2為載體pCambia2300-2X35S: :0sYUCCA:GUS 雙酶切 2X !35S 後得到的圖，2X !35S 條帶大小為 750bp 左右；3 為未酶切的載體 pCambia2300-2X35S: 0sYUCCA2 GUS (即)對照；B. pCambia2300 -OsGluB :0sYUCCA2:⑶S酶切結果D為酶切後質粒，在1. 4kb處有條帶，證明OsGluB連接到 pCambia2300-2X35S: 0sYUCCA2GUS 上，un 為對照。圖6農桿菌介導的水稻轉基因流程A.日本晴成熟胚在誘導培養基上誘導愈傷10 天；B.繼代後的愈傷；C.經農桿菌共培養後，抗性愈傷的篩選；D.抗性愈傷的分化；E.轉基因幼苗生根；F.煉苗。圖7. pCambia2300-GluB::0sYUCCA2:GUS轉基因植株不同株系間的GUS染色以及 RT-PCR 結果。圖8. PCambia2300-GluB: :0sYUCCA2:⑶S轉基因植株不同株系與對照的結實率情況。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。水稻穀蛋白啟動子GluBl (Wu et al.，Plant J. 23(3) :415-421. 2000)和 Gtl (張憲銀等.作物學報.28(1) :110-114.2002)都在胚乳中特異性表達，從水稻日本晴DNA中克隆得到胚乳特異性啟動子OsGIuBI和OsGtl。利用RT-PCR分別克隆了 0sYUCCAl-8cDNA，然後在其C端與⑶S (編碼β-葡萄糖苷酸酶，能與X-Gluc發生反應生成藍色產物，肉眼可見， 便於實驗操作)融合，構成OsYUCCAl-8:⑶S，然後分別與OsGIuBI和OsGtl融合，即為水稻胚乳特異性表達載體OsGluBlOsYUCCAlGUS，OsGtl:OsYUCCAlGUS，
OsGluBl0sYUCCA2GUS，OsGtl:0sYUCCA2GUS，
OsGluBl0sYUCCA3GUS，OsGtl:0sYUCCA3GUS，
OsGluBl:0sYUCCA4GUS，OsGtl:0sYUCCA4GUS，
OsGluBl:0sYUCCA5GUS，OsGtl:0sYUCCA5GUS，
OsGluBl:0sYUCCA6GUS，OsGtl:0sYUCCA6GUS，
OsGluBl:0sYUCCA7GUS，OsGtl:0sYUCCA7GUS，
OsGluBl:0sYUCCA8GUS，OsGtl:0sYUCCA8GUS，OsYUCCA1-8 ID number (RAP-DB)OsYUCCAl, 0s01g0645400 ；0sYUCCA2, 0s05g0528600 ；0sYUCCA3, 0s01g0732700 ； 0sYUCCA4, 0s01g0224700 ；0sYUCCA5, 0sl2g0512000 ；0sYUCCA6, 0s07g0437000 ；0sYUCCA7, 0s01g0732700 ；0sYUCCA8,0s03g0162000 ；本發明利用農桿菌介導的轉化方法已分別獲得了上述16個載體的轉基因苗。本發明所採用的技術路線如圖1所示。(1)在水稻灌漿期對日本晴幼穗噴施不同濃度的外源生長IAA，統計結果顯示適量的外源生長素處理能提高水稻的結實率。結果如表1所示。表1.不同濃度外源IAA處理抽穗後兩天的穗子各30個，統計結實和百粒重
權利要求
1.包含水稻胚乳特異性啟動子OsGtl、OsGluB與0sYUCCAl_8基因的重組載體。
2.根據權利要求1所述的重組載體在轉基因水稻中的應用。
3.含有權利要求1所述任一載體的水稻轉基因植株。
全文摘要
本發明公開了包含水稻胚乳特異性啟動子OsGt1、OsGluB與OsYUCCA1-8基因的重組載體。還公開了所述的重組載體在轉基因水稻中的應用。還公開了含有所述各個載體的水稻轉基因植株。YUCCA基因是生長素合成生物途徑中的限速步驟，該基因過表達後，植株體內IAA含量顯著上升。本發明採用胚乳特異性啟動子OsGt1和OsGluB來表達YUCCA基因，改良水稻籽粒中內源生長素IAA的生物合成效率，提高水稻光合作用的效率，從而提高水稻的產量或品質，有效地減少環境汙染。因此，本發明將在作物產量、環境保護等綠色農業生產中具有重要應用價值。
文檔編號C12N15/82GK102154363SQ20101060623
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月27日 優先權日2010年12月27日
發明者葉曉帆, 潘偉槐, 潘建偉, 王超 申請人:浙江師範大學