雷公藤甲素在製備抗瘧疾藥物中的應用及其藥物組合物的製作方法

2023-12-10 06:16:27 2

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及化合物雷公藤甲素在製備治療瘧疾藥物中的應用，尤其涉及雷公藤甲素作為活性成分以及藥學上可接受的載體的藥物組合物。

背景技術：

瘧疾(malaria)瘧疾是嚴重危害人民健康和生命安全的重大傳染病之一，根據世界衛生組織報導目前全球有99個國家和地區流行瘧疾，約33億人受到瘧疾威脅，每年約有2億瘧疾病例，66萬人死於瘧疾感染。瘧疾由瘧原蟲引起，其瘧原蟲包括了惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲，其中以惡性瘧原蟲致死率最高。帶有成熟子孢子的雌按蚊叮咬人體後，將瘧原蟲注入人體，經10～20天會發生典型的瘧疾臨床症狀，可分為四期：前驅期、發冷(寒戰)期、發熱期、出汗期和間歇期。瘧疾的反覆發作後，病人會出現貧血、肝脾腫大，甚至出現腦型、超高熱型、厥冷型和胃腸型等兇險症狀，甚至危及生命。隨著氯喹、哌喹和青蒿素的應用，在近幾十年挽救了無數人的生命。20世紀50年代使用氯喹、哌喹等4-氨基喹啉類藥物進行抗瘧治療，但是隨著這些藥物的應用，在使用12年後隨之出現的是耐藥性。在20世紀60年代開始應用抗葉酸製劑，但是這些不管是單獨使用還是聯合氯喹使用都出現耐藥性，這些耐藥性的出現，致使瘧疾的發病率日益增加，促使我們儘快尋找高效、敏感、低毒的抗瘧藥物。

中國中藥博大精深，是瘧疾預防和治療的重要組成部分，具有良好的療效和提高生活質量的優勢，成為瘧疾治療的重要手段之一。在中國著名書籍《本草綱目》和《瘧疾論》記載了如常山、青蒿、鴉膽子、草果和砂仁等是在民間用來治療瘧疾的中草藥。我國工作者從中藥青蒿中發現的活性化合物青蒿素用於治療瘧疾取得了很好的效果，廣泛用於臨床，因此從中藥中尋找具有抗瘧活性的化合物意義重大。本發明人通過多年研究發現廣泛存在於雷公藤中的化學成分雷公藤甲素(triptolide)具有顯著抗瘧作用。

雷公藤甲素是從傳統中藥雷公藤中提取出來的環氧二萜內酯類化合物，是雷公藤的主要有效成分之一。具有免疫調節、抗炎、抗生育及抗腫瘤藥理作用。隨著對雷公藤甲素研究的不斷深入,人們對其藥理、藥代學、毒理及臨床應用等方面的認識也越來越深入而廣泛。雷公藤甲素有相當大的潛在應用價值和市場前景，但目前尚未見雷公藤甲素具有抗瘧作用的報導。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題在於研究設計雷公藤甲素在製備抗瘧疾藥物中的應用。

本發明的一個目的是提供一種雷公藤甲素的用途，即雷公藤甲素在製備抗瘧疾藥物中的應用。

雷公藤甲素的結構式如下：

通過體內外抗瘧活性的實驗測定結果顯示，雷公藤甲素有較好的體內外抗瘧原蟲活性。因此，可用於製備治療瘧疾的藥物。

本發明的另一目的是提供以雷公藤甲素為活性成分，用於製備治療瘧疾的藥物組合物，尤其用於製備治療由瘧原蟲引起的瘧疾的藥物組合物。

本發明所述藥物組合物含有治療有效量的雷公藤甲素為活性成分，以及含有一種或多種藥學上可接受的載體。其中活性成分在藥物組合物中的重量為5-95％。

所述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如：稀釋劑、賦形劑如水等；填充劑如澱粉、蔗糖等；粘合劑如明膠、聚乙烯吡咯烷酮；溼潤劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣、碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、聚乙二醇等、另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。

本發明化合物可以組合物的形式通過口服、注射、呼吸道、皮膚、鼻黏膜給和直腸的方式施用於需要這種治療的患者。用於口服時，可將其職稱常規的固體製劑如片劑、顆粒劑、膠囊等或製成液體製劑如水或油懸浮劑、糖漿等；用於注射時可將其製成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等；用於呼吸道給藥時，可製成噴霧劑；用於皮膚給藥時，可將其製成軟膏劑和經皮給藥的劑型等；用於直腸給藥時，可製成栓劑等劑型。

本發明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領域的常規生產方法製備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然後將其製成所需的劑型。

附圖說明

圖1是雷公藤甲素和陽性藥物(氯喹)對3d7蟲株生存率影響圖。

圖1中氯喹組(分別為：0、0.01、0.1、1μg/ml)，雷公藤甲素(分別為：0、1、3、10μm)，*p<0.05**p<0.01***p<0.001。

圖2是雷公藤甲素和陽性藥物(氯喹)在體內對伯氏瘧原蟲感染率影響圖。

圖2中空白模型組，10mg/kg氯喹組，100μg/kg雷公藤甲素組，200μg/kg雷公藤甲素組，400μg/kg雷公藤甲素組，*p<0.05**p<0.01***p<0.001。

具體實施方式

本發明公開了一種雷公藤甲素在製備抗瘧疾藥物中的應用，下文將以具體實施方式的形式闡述本發明。應理解，這些具體實施例僅僅是闡述性的，而非限制性的。在不偏離本發明精神和範圍的情況下，可對本發明做出適當的修改和變動。這些修改和變動都在本發明的範圍之內。實驗中使用的各種試劑都可從市場上購得，其用量除非另有說明否則按照常規的量使用。

實施例1：雷公藤甲素提取分離方法

提取：稱取雷公藤全草25kg加入15l的75％乙醇，攪拌均勻。原料浸泡設定的時間後裝入萃取柱，萃取柱兩端鋪墊醫用紗布，防止萃取柱口過濾網堵塞和物料的細小顆粒進入管道。然後將萃取柱吊入萃取釜，密封。打開設備管路，使co2進入萃取釜中，將壓力和溫度調節至設定值，關閉萃取釜管路，靜態保持設定的時間後，再開啟管路，調節分離釜壓力和溫度至設定值，進行動態循環萃取。動態循環萃取開始後，從分離釜接收產品。萃取到達設定時間後即停止實驗。卸壓後清洗萃取柱和管路。

分離：稱取約500mg雷公藤超臨界提取物，用10ml無水乙醇溶解，加入100ml的設定濃度的鹽酸，充分攪拌。靜置10min後，抽濾，濾餅經真空乾燥後即為雷公藤紅素產品。往抽濾所得濾液加入naoh溶液，充分攪拌，調節其ph至設定值。靜置10min後，抽濾，不溶物經真空乾燥後得雷公藤總生物鹼產品。前一步抽濾所得濾液用乙酸乙酯按體積比1:1萃取三次，合併乙酸乙酯萃取液，旋轉蒸發回收乙酸乙酯，並經真空乾燥後得到雷公藤甲素產品。

雷公藤甲素鑑定：根據hplc方法進行鑑定，結果顯示分離出的雷公藤甲素的與標準品(來源於中國食品藥品檢定研究院)完全一致。

實施例2：雷公藤甲素體外抗瘧活性測定

抗瘧活性可以通過測量瘧原蟲dsdna含量來確定(corey,v.c.,etal.,abroadanalysisofresistancedevelopmentinthemalariaparasite.natcommun,2016.7:p.11901.)。在含20μl連續稀釋測試樣本和氯喹陽性藥物(購自中國食品藥品檢定研究所)的96孔板的每個孔中加入感染了3d7蟲株p.falciparum的紅細胞混懸液(100μl，在rpmi1640培養基(gibco)中加入5g/lalbumax(gibco)和50mg/l慶大黴素(sigma)，使瘧原蟲血症達到0.5％，紅細胞壓積達到2％)，然後置於37℃，5％co2培養箱培養48小時。細胞用裂解液(tris2.4g/l,edta1.86g/l,saponin0.08g/l,tritonx-1000.8ml/l)進行裂解，來源於sigma，dsdna含量用10000xsybrgreeni試劑(invitrogen)測定，測定程序參照文獻(plouffe,d.,etal.,insilicoactivityprofilingrevealsthemechanismofactionofantimalarialsdiscoveredinahigh-throughputscreen.procnatlacadsciusa,2008.105(26):p.9059-64.)。簡要說來，就是將100μl培育的混合物和按文獻說明配製好100μlsybrgreeni試劑混合，在室溫下避光培育30-60分鐘.然後100μl轉移至黑色酶標板中。將酶標板放入enspire螢光酶標儀(perkinelmer)中，在485nm和535nm的吸光值下讀取酵標板中每孔的螢光信號值。從劑量-效應曲線中計算出ic50。雷公藤甲素的對3d7的ic50值如下表：

結果顯示，雷公藤甲素具有較好的體外抗瘧原蟲活性。

實施例3：體外對哺乳動物細胞的毒性測試

在96孔組織培養板中進行(j.mustafa,s.i.khan,g.ma,l.a.walkerandi.a.khan,synthesisandanticanceractivitiesoffattyacidanalogsofpodophyllotoxin.lipids.2004,39(2):167-172.)。在96孔板中以25x103個/孔的密度種植非洲綠猴腎異倍體細胞(vero)並培育24小時。加入不同濃度的樣品，即雷公藤甲素化合物溶液，濃度為1μm、3μm、10μm，繼續培育48小時。利用neutralredassay方法測定存活細胞數，從劑量-效應曲線中計算出ic50。用阿黴素作為陽性對照藥物。雷公藤甲素的對vero的ic50值如下表：

結果顯示，雷公藤甲素在體外1-10μm無明顯細胞毒性。

實施例4：雷公藤甲素體內抗瘧活性測定

伯氏瘧原蟲伯氏株培養，其所用紅細胞為昆明小鼠紅細胞，其他培養條件與瘧原蟲3d7培養方法一致。本發明用的動物是來自中山大學實驗動物中心，品係為昆明種小鼠，所有的動物實驗過程中對實驗動物保護和使用根據nih標準進行。對小鼠進行輸血感染，抽取雄性小鼠心臟血液，用5％葡萄糖鹽水將血液稀釋成每0.2ml內含1×106個受感染紅細胞的懸液，腹腔接種小鼠。接種伯氏瘧原蟲3小時後，進行分組給藥，每組8隻，組別為：1、空白對照組(灌胃給予生理鹽水)，2、氯喹陽性對照組(灌胃給予10mg/kg)，3、雷公藤甲素(灌胃給予100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg)。每天測量體重無明顯差異，在接種感染後第0、2、4、6天尾靜脈取血塗膜檢查減蟲率，結果顯示(如圖2所示)，雷公藤甲素有較好的體內抗瘧原蟲活性。

由上可知，通過實施例1-4的實驗結果表明，雷公藤甲素有較好的體內外抗瘧原蟲活性。因此可以證實，雷公藤甲素可用於製備治療瘧疾的藥物。