啟動子核酸、表達盒和載體、宿主細胞和使用該細胞表達基因的方法

2023-12-10 06:20:47

專利名稱：啟動子核酸、表達盒和載體、宿主細胞和使用該細胞表達基因的方法
技術領域：
本發明涉及來自棒桿菌屬細菌的新的啟動子核酸、包含該啟動子的表達盒、包 含該表達盒的載體、包含該載體的宿主細胞和使用該宿主細胞表達基因的方法。
背景技術：
棒桿菌類細菌是用於產生用於許多應用的多種化學物質的微生物，所述化學物 質為如動物飼料、藥品，和食品，包括L-賴氨酸、L-蘇氨酸，和多種核酸。通過遺傳 工程和代謝工程可以開發顯示出高生產力的棒桿菌菌株。為了得到顯示出高生產力的棒 桿菌菌株，需要在棒桿菌中表達涉及多種代謝途徑的基因。為此，必須開發合適的啟動 子。通常，在棒桿菌中，基因在內在地包括在該基因中的啟動子的控制下表達(見 例如，Journal of Bacteriology，181(19)，6188-6191，1999)。同時，在棒桿菌細菌中表 達基因的啟動子序列的結構是未知的，而其他工業微生物，如大腸桿菌(E.coli)和枯草芽 孢桿菌(Bacillus subtilis)的結構是已知的。因此，已經提出了下面的方法用來產生能夠 使基因在棒桿菌細菌中表達的啟動子。首先，除去耐受抗生素，如氯黴素的基因的啟動 子區。使用合適的限制酶單獨地切割從棒桿菌細菌分離的染色體DNA，並將所得片段 導入除去該啟動子區的基因中。然後，所得基因用於轉化棒桿菌細菌以產生轉化的菌株 並測量所轉化的菌株的抗生素抗性(見Gene，102，93-98，1991 ； Microbiology, 142， 1297-1309，1996.)。具體地，已經開發了用於 Corynebacterium ammoniagenesis 中的非 常少數目的啟動子，Corynebacterium ammoniagenesis是一種已知的生產核酸的微生物。 例如，在大腸桿菌中使用比tac啟動子活性高約10%的啟動子(見BiotechnoLLett. 25， 1311-1316，2003.)。然而，當它用於基因的大量表達時，這種啟動子顯示出低效率。美 國專利號5,593,781公開了一種啟動子DNA，其從黃色短桿菌CBrevibacterium flavum)菌 株MJ-233 (FERM BP-1497)分離並且具有比tac啟動子更高的活性。然而，這種從短杆 菌屬分離的啟動子DNA在其他細菌中不能工作。因此，需要開發來自通過商業途徑可獲 得的產氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)並且在其他細菌中具有高活性的啟動子 序列。因此，本發明的發明人在產氨棒桿菌中尋找強啟動子序列並且發現根據本發明 的啟動子可以在產氨棒桿菌中以高活性表達基因。附圖描述


圖1顯示了從產氨棒桿菌細菌提取的樣品的二維電泳測定的結果，其中將測定 結果進行銀染並顯影用於鑑定；圖2圖解了根據本發明的實施方案產生pll7-gi^的篩選載體的方法；圖3圖解了根據本發明的實施方案從篩選載體pll7-gi^產生包括啟動子序列pcjl 到pcj7的重組載體的方法。發明詳述 技術問題本發明提供了在棒桿菌中具有高活性的啟動子。本發明還提供了包括所述啟動子的表達盒和包括該表達盒的載體。本發明還提供了包括所述載體的宿主細胞。本發明還提供了使用所述宿主細胞表達基因的方法。技術解決方案本發明提供了包含至少一種選自由SEQ ID NO 1到7組成的組的多核苷酸的啟動子。根據本發明的實施方案的啟動子是分離的核酸並且具有啟動子活性。這裡，術 語「啟動子」指DNA區，RNA聚合酶結合該DNA區以起始基因的轉錄。術語「tac啟 動子」指通過將從大腸桿菌的色氨酸操縱子啟動子的-35區得到的序列與從大腸桿菌的乳 糖操縱子啟動子的-10區得到的序列融合得到的啟動子。已知tac啟動子具有高啟動子 活性。具有選自SEQ IDNO : 1、4、5、6和7的至少一種核酸的啟動子在棒桿菌屬細菌 中具有比tac啟動子更高的活性。具體地，具有選自SEQ ID NO: 1和4的至少一種核酸 的啟動子在棒桿菌屬細菌中具有比tac啟動子高4到10倍的活性。根據本發明的實施方案的啟動子除了在棒桿菌屬細菌中，還在埃希氏菌 (Escherichia)屬細菌中具有啟動子活性。具體地，含有SEQ ID NO 1的啟動子甚至在 埃希氏菌屬細菌中也顯示出比tac啟動子高兩倍的啟動子活性。本發明的啟動子可以在其中起作用的細胞可以是任何棒桿菌屬細菌。棒桿菌 屬細菌的實例包括產氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)和ATCC6871、穀氨酸棒桿菌 (Corynebacteriumglutamicum) ATCC13032 和 ATCC13060，等等。然而，穀氨酸棒桿菌屬
細菌不限於此。本發明的啟動子可以在其中起作用的埃希氏菌屬細菌的實例包括大腸杆 菌。根據本發明實施方案的啟動子的序列可以由本領域普通技術人員通過已知的誘 變方法如定向進化和位點定向誘變而容易地改變。因此，本發明的範圍內包括與分離的 啟動子序列具有例如70%或者更高同源性，優選80%或者更高同源性，更優選90%或者 更高同源性並且可以在棒桿菌屬細菌中作為啟動子的核酸，所述分離的啟動子序列包括 至少一種選自SEQ IDNO. 1到7的核酸。本發明還提供了表達盒，其包括可操縱連接編碼序列的啟動子。編碼序列可 以是例如完整基因或者編碼基因的預定區域的編碼序列。這裡，術語「可操縱連接 (operably linked)"指出編碼序列功能地連接啟動子，使得啟動子序列可以起始或者介導 編碼序列的轉錄。根據本發明的實施方案的表達盒可以還包括可操縱連接啟動子序列的 5』和3』控制序列。編碼序列可以是結合代謝產物，如IMP、GMP, L-賴氨酸和L-蘇氨酸的基因。本發明還提供了包括根據本發明的實施方案的表達盒的載體。這裡，載體是不 受限制的，並且可以是本領域中已知的任何載體。根據本發明的實施方案的載體的實 例包括 pCR2.1-TOPO 載體(Invitrogen Inc, USA 生產)禾Π pECCG117 (KFCC-10673)。 然而，載體不限於此。包括根據本發明的實施方案的表達盒的載體的實例包括 pll7-cjl-gip> pll7-cj2-gip> pll7_cj3_gfp、pll7-cj4-gip> pll7-cj5-gip> pll7-cj6-gip 禾口 pll7_cj7-gfp0本發明還提供了包括按照本發明的實施方案的載體的宿主細胞。宿主細胞可以 是棒桿菌屬細菌或者埃希氏菌屬細菌，但不限於此。例如，宿主細胞可以是產氨棒桿菌 CJHB100(KCCM-10330)或者大腸桿菌。本發明還提供了通過培養宿主細胞表達異源基因的方法。根據所選的宿主細 胞，可以在多種已知的培養基和多種已知的培養條件之一下培養宿主細胞。有益效果 可操縱連接根據本發明的啟動子的基因在大腸桿菌和產氨棒桿菌中有效表達。 啟動子適於用棒桿菌屬細菌開發菌株。包括根據本發明的啟動子的表達盒和包括根據本發明的表達盒的載體適於在大 腸桿菌和產氨棒桿菌中有效表達外源基因。根據本發明的宿主細胞可以有效表達外源基因。通過使用根據本發明的表達基因的方法，可以有效表達外源基因。最佳方式將參考下面的實施例進一步詳細描述本發明。這些實施例僅用於闡明目的，並 且不意在限制本發明的範圍。
實施例從不同培養階段的產氨棒桿菌CJHB100(KCCM_10330)製備細菌提取物。對細 菌提取物進行二維電泳以發現其中過表達的蛋白質，然後將其切割以分析肽序列。所得 的肽序列用於鑑定過表達蛋白質的基因。然而，分離啟動子區，並使用啟動子區產生載 體。接著，測量啟動子在產氨棒桿菌CJHB100(KCCM_10330)和大腸桿菌中的活性。實施例1 :培養產氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)並根據培養階段選擇過表 達蛋白質(1)細菌的培養在具有糖蜜的粗糖(含有50%葡萄糖和50%果糖的混合物)的培養基中培養產 氨棒桿菌CJHB100(KCCM-10330)。此時，測量細胞濃度。在早穩定期和穩定期收穫 培養的產氨棒桿菌CJHB100(KCCM_10330)的樣品。將樣品離心並除去所得的上清液。 得到的細胞沉澱在崩解緩衝液中裂解以產生約100 μ m細菌提取物。(2) 二維電泳測定從第⑴部分得到的細菌提取物用6M尿素、2M硫脲、4% CHAPS和0.4% DTT 稀釋以得到總體積350 μ 1的混合物。然後，向其中加入7μ1的IPT緩衝液和3μ1的 溴酚藍(BPB)。使用immobiline pH梯度drystrip將所得溶液裝載到再水化盤。再水化盤上的樣品用2ml覆蓋液覆蓋以防止樣品的蒸發和尿素的結晶，然後在室溫下再水化約24 小時。使用等電聚焦裝置(MultiphorII Amersham Bioscience, USA.生產)將再 水化的條帶凝膠(strip gel)進行等電聚焦在20°C 0-100V進行1小時，300V進行1 小時，600V進行1小時，和在8000V下進行預定的時間，該時間經調節以進行聚焦 43-97kVhr(pH 4-7 43.4kVhr，pH 4.5-5.5，pH5.5-6.7 97kVhr)。當等電聚焦完成時，各自的條帶凝膠在含有20mMTris-HCl、6M尿素、2% SDS、20%甘油、2.5%丙烯醯胺和5mMTBP的pH8.8溶液中平衡15分鐘。將各自平衡的 條帶裝載到二維凝膠(9-16%濃度梯度)中然後用含有0.5%具有低沸點的瓊脂和0.001% BPB的SDS溶液密封。在100V下電泳約19小時。電泳完成後，將凝膠在45%甲醇溶液和5%乙酸溶液中固定。用蒸餾水洗滌乙 酸1小時。將凝膠用0.02%硫代硫酸鈉敏化2分鐘並用蒸餾水洗滌。然後，將凝膠與 0.1%硝酸銀反應20分鐘並用蒸餾水洗滌。反應產物用含有2% (w/v)碳酸鈉和0.04% (v/v)甲醛的溶液顯影。當斑點具有出現的希望的強度時，用乙酸中止反應。凝膠 用蒸餾水洗滌並在4°C下保存在密封的塑膠袋中。當使用考馬斯染色時，當電泳完成後，用30%甲醇溶液和10%乙酸溶液固定凝 膠1小時，用蒸餾水洗滌，用膠體考馬斯亮藍G-250染色24小時，然後用10%甲醇溶液 和7%乙酸溶液漂白4小時。(3)基於斑點，製備用於質譜的肽樣品使用已知方法(Shevchenkoetal.Anal.Chem.，68(5)，850-8，1996.)的改進版從
斑點分離肽。首先，從第(2)部分製備的凝膠切除蛋白質斑點，用30mM鐵氰化鉀和lOOmM 硫代硫酸鈉的1 1比例的120iU混合溶液漂白，並用蒸餾水洗滌，然後用120iU50% 乙腈/25mM碳酸氫銨(pH7.8)洗滌10分鐘。所得產物與50 y 1 100%乙腈反應直到白色 出現約5分鐘，然後真空乾燥。向乾燥的斑點加入10ii 1 二維電泳級的胰蛋白酶(0.02 ii g/ii 1)然後在冰水反應 45分鐘。然後，向反應產物加入50mM碳酸氫銨緩衝液(pH7.8)並在37。C反應12-14小 時。所得產物在10 y 10.5% TFA和50%乙腈中用超聲波處理3次10分鐘以提取肽。(4)質譜法通過HPLC-MS/MS分析如上述提取肽。用1100系列HPLC系統(Agilient Inc， USA生產)和Finnigan LCQ DECA離子阱質譜裝置(ThermoQuest，USA生產)進行 HPLC-MS/MS,在該裝置上安裝納噴霧離子化源。用C18顯微探針反相柱進行HPLC， 並以線性梯度(流速=lyl/分鐘)提供0.1%甲酸(溶劑A)和90% (v/v)乙腈和0.1% 甲酸的溶液(溶劑B)以分離肽。使用納噴霧電離(NSI)(噴霧電壓1.8kV ；毛細管溫度200°C;毛細管電壓 34V；管透鏡偏移40V;和電子倍增器-60V)進行肽檢測3次。以圖心模式(centroid mode)得到測量。得到400-2000Da的完整MS掃描後，將閾值設置為1 X 105計數並通 過高解析度局部放大掃描分離最強的離子。然後，進行碰撞誘導解離(CID)MS/MS。使 用TurboQuest軟體(Thermo Finnigan Inc, USA生產)鑑定不編碼的CID光譜的序列。SEQUEST搜索的結果通過互相關和ΔΟι(Δ歸一化相關)鑑定。使用Q-star Pulsar LC MS/MS (Applied Biosystems Inc, USA 生產)證實和鑑定
肽的胺基酸序列。結果，發現了 50種蛋白質，並選擇了 50種蛋白質的7種過表達的蛋白質。圖1 顯示了從產氨棒桿菌提取的樣品的二維電泳分析的結果，其中將測定結果銀染並顯影用 於鑑定。在圖1中，鑑定了通過CJl到CJ7表示的7種過表達的斑點。這些7種過表達 的蛋白質的功能在表1中指出。通過將肽的序列與NCBI gene bank資料庫中所含的氨基 酸序列比較，鑑定了這些蛋白質的功能。表 1
權利要求
1.啟動子，其由SEQIDNO 7的多核苷酸組成。
2.表達盒，其包含權利要求1的啟動子並且可操縱連接編碼序列。
3.載體，其包含權利要求2的表達盒。
4.宿主細胞，其包含權利要求3的載體。
5.權利要求4的宿主細胞，其是屬於棒桿菌屬(Corynebacterium)或埃希氏菌屬 (Escherichia)的細菌細胞。
6.表達異源基因的方法，其包括培養權利要求4或者權利要求5的宿主細胞。
全文摘要
提供了包括至少一種選自由SEQ ID NO1到7組成的組的多核苷酸的啟動子、包括該啟動子的表達盒、包括該表達盒的載體、包括該載體的宿主細胞，和使用該宿主細胞表達基因的方法。
文檔編號C12N15/113GK102010862SQ20091026608
公開日2011年4月13日 申請日期2005年12月16日 優先權日2004年12月16日
發明者崔惠真, 強泰善, 樸英薰, 李源植, 李真浩, 沈栽益, 金顯洙, 黃水淵 申請人:Cj第一製糖株式會社