無血清動物細胞培養基幹粉、液體培養基及其製備方法

2023-12-10 06:17:32 3

專利名稱：無血清動物細胞培養基幹粉、液體培養基及其製備方法
技術領域：
本發明涉及培養基幹粉、液體培養基以及它們的製備方法，尤其涉及無血清動物 細胞培養基幹粉、液體無血清動物細胞培養基以及它們的製備方法。
背景技術：
現有技術通過增加大豆水解產物作為無血清動物細胞培養基的組分，來提高被培 養宿主細胞或重組細胞的培養穩定性和培養密度、增加被培養宿主細胞或重組細胞的產 量，並且增加寄生在宿主細胞中的病毒等的產量或者利用重組細胞作為表達載體後所產生 重組靶蛋白產物的產量。並且認為其它植物的水解產物，例如小麥水解產物不能得到與大 豆水解產物相當的有益效果。例如CN 1318577C(專利號00816020. 1)中公開了一種用於培養哺乳動物細胞的
無蛋白無血清培養基，所述培養基包含大豆水解產物，其中至少40%的所述大豆水解產物 的分子量< 500道爾頓。該培養基能夠起到提高被培養重組細胞培養穩定性、終細胞密度 以及重組細胞靶蛋白產率的作用。W002/29084也在說明書實施例中提及可以向培養動物細 胞的培養基中添加大豆蛋白的水解產物。但是大豆水解產物中除了含有大豆蛋白外還含有許多其他成分，比如，大豆油、大 豆多糖、大豆皂甙等，因此在向無血清動物細胞培養基中添加大豆水解產物的同時，極有可 能加入上述其他成分即加入雜質成分，從而不利於細胞的增殖和生長。此外，由於大豆蛋白 在不同水解條件下被水解程度不同，因而得到的大豆蛋白水解產物成分很難統一，會造成 培養基成分不確定，從而使被培養細胞的批次差異性大，且使被培養細胞的下遊產品分離 困難。綜上，雖然現有技術已經出現了添加大豆水解產物的無血清動物細胞培養基，但 目前這類動物細胞培養基仍然存在細胞培養密度低、分離細胞下遊產品成本高、被培養細 胞的批次差異性大、安全性差的缺陷。

發明內容
本發明的目的是克服現有動物細胞培養無血清動物細胞培養基存在細胞培養密 度低、分離細胞下遊產品成本高、被培養細胞的批次差異性大、安全差的缺點，提供一種新 的無血清動物細胞培養基幹粉，由無血清動物細胞培養基幹粉製成液體培養基所培養的細 胞培養密度高、利於分離細胞下遊產品、成本低、被培養細胞的批次差異性小、安全性好。本發明的第二個目的是提供上述無血清動物細胞培養基幹粉的製備方法。本發明的第三個目的是提供包括上述無血清動物細胞培養基幹粉的液體無血清 動物細胞培養基。本發明的第四個目的是提供包括上述無血清動物細胞培養基幹粉的液體無血清 動物細胞培養基的製備方法。現有技術中認為向無血清動物細胞培養基中加入除大豆水解蛋白外的其他蛋白效果不好，例如，在CN 1318577C的說明書第3-4頁明確記載，「與現有技術已知的其它水解 產物(例如小麥水解產物、水稻水解產物或酵母水解產物)相反，已經發現僅大豆水解產物 介導按照本發明的特性，並且導致例如顯著提高重組靶蛋白的得率。」在該文件的實施例7 中揭示出小麥水解產物不如大豆蛋白水解產物效果好。然而本發明的發明人意外地發現，向無血清基本培養基幹粉中以培養基溶劑的體 積為基準，加入100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的 蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0-200g/100L的小麥麩蛋白和50_100g/100L的水稻 蛋白得到的培養基幹粉，製成液體無血清培養基培養動物細胞，特別是中國倉鼠卵巢細胞 (CH0細胞)以及敘利亞地鼠腎細胞(BHK21細胞)時，能夠達到的細胞培養密度遠高於現有 技術添加大豆水解產物或大豆蛋白水解產物的液體無血清培養基所能達到的細胞培養密 度；由於添加的成分確定，一方面有利於分離細胞下遊產品，使成本降低，另一方面使被培 養細胞的批次差異性大大減小，安全性更好。本發明提供了一種無血清動物細胞培養基幹粉，所述培養基幹粉分散在培養基溶 劑中形成液體培養基，所述培養基幹粉包括基本培養基幹粉，其中，以所述培養基溶劑的體 積為基準，所述培養基幹粉還包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋 白、100-200g/100L的蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0_200g/100L的小麥麩蛋白和 50-100g/100L的水稻蛋白。本發明還提供了上述無血清動物細胞培養基幹粉的製備方法，該方法包括將本發 明所述的無血清動物細胞培養基幹粉的組分分散在分散劑中，移除所得混合物中的分散 劑。本發明還提供了一種液體無血清動物細胞培養基，所述液體無血清動物細胞培養 基包括培養基溶劑和分散在該培養基溶劑中的無血清動物細胞培養基幹粉，其中，所述無 血清動物細胞培養基幹粉為本發明所述的無血清動物細胞培養基幹粉中的一種或幾種。本發明還提供了上述液體無血清動物細胞培養基的製備方法，該方法包括將無血 清動物細胞培養基幹粉分散在培養基溶劑中，過濾滅菌，其中，所述無血清動物細胞培養基 乾粉選自本發明所述的無血清動物細胞培養基幹粉中的一種或幾種。與現有的添加大豆水解產物或大豆蛋白水解產物的無血清動物細胞培養基幹粉 或液體無血清培養基相比，本發明的無血清動物細胞培養基幹粉或液體無血清培養基中 還包括以培養基溶劑的體積為基準，100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋 白、100-200g/100L的蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0_200g/100L的小麥麩蛋白和 50-100g/100L的水稻蛋白。當本發明的無血清動物細胞培養基幹粉或液體無血清培養基用 於培養動物細胞時，能夠達到的細胞培養密度大大提高；由於添加的成分確定，一方面有利 於分離細胞下遊產品，使成本降低，另一方面使被培養細胞的批次差異性大大減小，安全性 更好。


圖IA為使用本發明實施例1的無血清動物細胞培養基幹粉培養72小時的CHO細 胞的照片(放大420倍)；圖IB為使用本發明實施例5的無血清動物細胞培養基幹粉培養72小時的BHK21細胞的照片(放大300倍)；圖2A為使用對比例1 (CN 1318577C)的無血清動物細胞培養基(包括大豆水解產 物)培養72小時的CHO細胞的照片(放大300倍)；圖2B為使用對比例1 (CN 1318577C)的無血清動物細胞培養基(包括大豆水解產 物)培養72小時的BHK21細胞的照片(放大300倍)；圖3A為使用對比例2 (W0 02/29084)的無血清動物細胞培養基(包括大豆水解產 物)培養72小時的CHO細胞的照片(放大300倍)；圖;3B為使用對比例2 (W0 02/29084)的無血清動物細胞培養基(包括大豆水解產 物)培養72小時的BHK21細胞的照片(放大300倍)；圖4A為使用本發明實施例2的液體無血清動物細胞培養基培養72小時的CHO細 胞的照片(放大420倍)；圖4B為使用本發明實施例6的液體無血清動物細胞培養基培養72小時的BHK21 細胞的照片(放大300倍)；圖5A為使用實施例3的培養液體無血清動物細胞培養基培養48小時的CHO細胞 的照片(放大420倍)；圖5B為使用實施例7的培養液體無血清動物細胞培養基培養48小時的BHK21細 胞的照片(放大300倍)；圖6A為使用實施例4的培養液體無血清動物細胞培養基培養48小時的CHO細胞 的照片(放大420倍)；圖6B為使用實施例8的培養液體無血清動物細胞培養基培養48小時的BHK21細 胞的照片(放大200倍)；圖7A為對比例1-2和實施例1-4隨培養時間變化的CHO細胞密度對比圖；圖7B為對比例1-2和實施例5-8隨培養時間變化的BHK21細胞密度對比圖。
具體實施例方式本發明提供的無血清動物細胞培養基幹粉，所述培養基幹粉分散在培養基溶劑 中形成液體培養基，所述培養基幹粉包括基本培養基幹粉，其中，以所述培養基溶劑的體 積為基準，所述培養基幹粉還包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋 白、100-200g/100L的蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0_200g/100L的小麥麩蛋白和 50-100g/100L的水稻蛋白。本發明的無血清動物細胞培養基幹粉優選其中以所述培養基溶劑的體積為基 準，所述培養基幹粉還包括150-180g/100L的大豆蛋白、150-180g/100L的豌豆蛋白、 150-180g/100L的蠶豆蛋白、50-80g/100L的馬鈴薯蛋白、150_180g/100L的小麥麩蛋白和 50-80g/100L的水稻蛋白。本發明的無血清動物細胞培養基幹粉更優選其中以所述培養基 溶劑的體積為基準，所述培養基幹粉還包括170-180g/100L的大豆蛋白、170-180g/100L的 豌豆蛋白、170-180g/100L的蠶豆蛋白、50-60g/100L的馬鈴薯蛋白、150_160g/100L的小麥 麩蛋白、50-60g/100L的水稻蛋白。本發明的無血清動物細胞培養基幹粉中，所述大豆蛋白、豌豆蛋白、蠶豆蛋白、馬 鈴薯蛋白、小麥麩蛋白和水稻蛋白可以是商業上可供的商品，也可以是按照常規實驗手段從相應植物種子或果實中分離出來的蛋白。蛋白質的分離提純方法以及定性定量的檢測 方法為本領域技術人員公知，比如TCA-丙酮法(Mechin V，Damerval C，Zivy M. Total protein extraction with TCA-acetone. Methods MolBiol 2007 ;355 :1-8)、酸水解以及 酶水解法，優選酶水解法。優選本發明所述的大豆蛋白、豌豆蛋白、蠶豆蛋白、馬鈴薯蛋白、小麥麩蛋白和水 稻蛋白通過以下方法製備a)粉碎大豆、豌豆、蠶豆、馬鈴薯、小麥麩或水稻植物原料至直徑為0. l-3mm3的顆 粒；b)在酶解時間為0. 5-10h、酶解PH值為5_9、酶解溫度為45°C -60°C、酶量為2_5 重量％的條件下酶解步驟a)所得的顆粒；其中，所述酶選自胰蛋白酶、中性蛋白酶、鹼性蛋 白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶中的一種或幾種，所述酶的酶活> IXlO5單位/克；c)在80_100°C保持5-20min以終止步驟b)所述的酶解；d)將步驟c)所得的酶解產物在3000-8000rpm下離心5-20min，收集上清液；e)將步驟d)所得上清液用中空纖維過濾器超濾，所述過濾器所用膜的透過分子 量為10000-20000道爾頓；f)收集步驟e)所得超濾液，真空冷凍乾燥，獲得相應植物蛋白。更優選所述大豆蛋白、豌豆蛋白、蠶豆蛋白、馬鈴薯蛋白、小麥麩蛋白和水稻蛋白 通過以下方法製備a)粉碎大豆、豌豆、蠶豆、馬鈴薯、小麥麩或水稻植物原料至直徑為0. I-Imm3的顆 粒；b)在酶解時間為2-10h、酶解PH值為5-8、酶解溫度為45°C _60°C、酶量為2_5重 量％的條件下酶解步驟a)所得的顆粒；其中，所述酶選自胰蛋白酶、中性蛋白酶、鹼性蛋白 酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶中的一種或幾種，所述酶的酶活> IX IO5單位/克；c)在80_90°C保持5-lOmin以終止步驟b)所述的酶解；d)將步驟c)所得的酶解產物在3000-5000rpm下離心15-20min，收集上清液；e)將步驟d)所得上清液用中空纖維過濾器超濾，所述過濾器所用膜的透過分子 量為10000-20000道爾頓；f)收集步驟e)所得超濾液，真空冷凍乾燥，獲得相應植物蛋白。更優選地，根據不同的植物原料進行不同的前處理，例如，對於豆類原料(大豆、 豌豆和蠶豆)可以先脫脂前處理。不同的植物原料也可以採用不同的酶解條件，例如，在 溫度為52. 9°C、鹼性蛋白酶(IO5單位/克)加酶量為5. 2%、pH為8. 7、底物濃度為8. 06 重量％以及提取時間為2小時的條件下製備小麥麩蛋白；或者在溫度為50°C、中性蛋白酶 (IO5單位/克)加酶量為4%、pH為6. 8、底物濃度為6. 5重量％以及提取時間為2. 5小時 的條件下製備小麥麩蛋白。馬鈴薯蛋白可以通過以下方法製得清洗去皮馬鈴薯原料與等 體積亞硫酸鈉溶液勻漿，固液分離(離心、靜置或榨汁)，收集所得馬鈴薯汁在pH為3. 0 下靜置證，離心收集沉澱，噴霧乾燥得粉末。收集所述粉末加緩衝液，在溫度為50°C、胰蛋 白酶加酶量(IO5單位/克)為4%、pH為8.0、底物濃度為20重量％ (IO5單位/克)以及 提取時間為1. 5小時的條件下製備馬鈴薯蛋白。本發明的無血清動物細胞培養基幹粉可以包括本領域常用的各種基本培養基，例如，選自BME細胞培養基、DMEM細胞培養基、DMEM/F12細胞培養基、Fischer' s細胞培養 基、IMDM細胞培養基、199細胞培養基、MEM細胞培養基、FlO細胞培養基、F12細胞培養基和 1640細胞培養基中的一種或幾種。優選包括的所述基本培養基為重量比1 1的F12細胞 培養基和DMEM細胞培養基。所述基本培養基的成分為本領域公知，上述列舉的基本培養基 名稱為它們的商品名，商業上可供。更優選本發明的無血清動物細胞培養基幹粉，其中，以所述培養基溶劑的體積為 基準，所述無血清動物細胞培養基幹粉包括下表1所示的組分表 權利要求
1.一種無血清動物細胞培養基幹粉，所述培養基幹粉分散在培養基溶劑中形成液體 培養基，所述培養基幹粉包括基本培養基幹粉，其特徵在於，以所述培養基溶劑的體積為 基準，所述培養基幹粉還包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、 100-200g/100L的蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0_200g/100L的小麥麩蛋白和 50-100g/100L的水稻蛋白。
2.根據權利要求1所述的無血清動物細胞培養基幹粉，其中，以所述培養基溶劑的體 積為基準，所述培養基幹粉還包括150-180g/100L的大豆蛋白、150-180g/100L的豌豆蛋 白、150-180g/100L的蠶豆蛋白、50-80g/100L的馬鈴薯蛋白、150_180g/100L的小麥麩蛋白 和50-80g/100L的水稻蛋白。
3.根據權利要求2所述的無血清動物細胞培養基幹粉，其中，以所述培養基溶劑的體 積為基準，所述培養基幹粉還包括170-180g/100L的大豆蛋白、170-180g/100L的豌豆蛋 白、170-180g/100L的蠶豆蛋白、50-60g/100L的馬鈴薯蛋白、150_160g/100L的小麥麩蛋 白、50-60g/100L的水稻蛋白。
4.根據權利要求1-3中任意一項所述的無血清動物細胞培養基幹粉，其中，所述大豆 蛋白、豌豆蛋白、蠶豆蛋白、馬鈴薯蛋白、小麥麩蛋白和水稻蛋白通過以下方法製備a)粉碎大豆、豌豆、蠶豆、馬鈴薯、小麥麩或水稻植物原料至直徑為0.l-3mm3的顆粒；b)在酶解時間為0.5-10h、酶解PH值為5-9、酶解溫度為45°C -60°C、酶量為2_5重 量％的條件下酶解步驟a)所得的顆粒；其中，所述酶選自胰蛋白酶、中性蛋白酶、鹼性蛋白 酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶中的一種或幾種，所述酶的酶活> IX IO5單位/克；c)在80-100°C保持5-20min以終止步驟b)所述的酶解；d)將步驟c)所得的酶解產物在3000-8000rpm下離心5-20min，收集上清液；e)將步驟d)所得上清液用中空纖維過濾器超濾，所述過濾器所用膜的透過分子量為 10000-20000 道爾頓；f)收集步驟e)所得超濾液，真空冷凍乾燥，獲得相應植物蛋白。
5.根據權利要求4所述的無血清動物細胞培養基幹粉，其中，所述大豆蛋白、豌豆蛋 白、蠶豆蛋白、馬鈴薯蛋白、小麥麩蛋白和水稻蛋白通過以下方法製備a)粉碎大豆、豌豆、蠶豆、馬鈴薯、小麥麩或水稻植物原料至直徑為0.I-Imm3的顆粒；b)在酶解時間為2-10h、酶解PH值為5-8、酶解溫度為45°C_60°C、酶量為2_5重量％ 的條件下酶解步驟a)所得的顆粒；其中，所述酶選自胰蛋白酶、中性蛋白酶、鹼性蛋白酶、 木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶中的一種或幾種，所述酶的酶活> IXlO5單位/克；c)在80-90°C保持5-lOmin以終止步驟b)所述的酶解；d)將步驟c)所得的酶解產物在3000-5000rpm下離心15-20min，收集上清液；e)將步驟d)所得上清液用中空纖維過濾器超濾，所述過濾器所用膜的透過分子量為 10000-20000 道爾頓；f)收集步驟e)所得超濾液，真空冷凍乾燥，獲得相應植物蛋白。
6.根據權利要求1-3中任意一項所述的無血清動物細胞培養基幹粉，其中，所述基本 培養基選自BME細胞培養基、DMEM細胞培養基、DMEM/F12細胞培養基、Fischer' s細胞培 養基、IMDM細胞培養基、199細胞培養基、MEM細胞培養基、FlO細胞培養基、F12細胞培養基 和1640細胞培養基中的一種或幾種。
7.根據權利要求1所述的無血清動物細胞培養基幹粉，其中，以所述培養基溶劑的體 積為基準，所述無血清動物細胞培養基幹粉包括下表1所示的組分
8.根據權利要求7所述的無血清動物細胞培養基幹粉，其中，以所述培養基溶劑的 體積為基準，所述無血清動物細胞培養基幹粉還包括0. l-lg/100L的次黃嘌呤和/或 0. l-2g/100L 的酚紅。
9.根據權利要求7所述的無血清動物細胞培養基幹粉，其中，以所述培養基溶劑的體 積為基準，所述無血清動物細胞培養基幹粉包括下表2所示的組分
10.根據權利要求7所述的無血清動物細胞培養基幹粉，其中，以所述培養基溶劑的體 積為基準，所述無血清動物細胞培養基幹粉包括下表3所示的組分表3
11.根據權利要求7所述的無血清動物細胞培養基幹粉，其中，以所述培養基溶劑的體積為基準，所述無血清動物細胞培養基於粉包括下表4所示的組分 表4
12.—種無血清動物細胞培養基幹粉的製備方法，該方法包括將選自權利要求1-11中 任意一項所述的無血清動物細胞培養基幹粉的組分分散在分散劑中，移除所得混合物中的 分散劑。
13.根據權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述分散劑選自蒸餾水、去離子水、注 射用水、重蒸水、超純水、能與水以任意比互溶的醇、鹼性水溶液和酸性水溶液中的一種或 幾種。
14.根據權利要求13所述的方法，其中，所述鹼性水溶液為氫氧化鈉溶液或者權利要 求1-11中所述的無血清動物細胞培養基幹粉中出現的陽離子的鹼的水溶液，所述酸性水 溶液為權利要求1-11中所述的無血清動物細胞培養基幹粉出現的酸根離子的酸的水溶 液。
15.一種液體無血清動物細胞培養基，所述液體無血清動物細胞培養基包括培養基溶 劑和分散在該培養基溶劑中的無血清動物細胞培養基幹粉，其特徵在於，所述無血清動物 細胞培養基幹粉為權利要求1-11中任意一項所述的無血清動物細胞培養基幹粉中的一種或幾種。
16.根據權利要求15所述的液體動物細胞培養基，其中，所述培養基溶劑選自蒸餾水、 去離子水、注射用水、重蒸水和超純水中的一種或幾種。
17.一種液體無血清動物細胞培養基的製備方法，該方法包括將無血清動物細胞培養 基幹粉分散在培養基溶劑中，過濾滅菌，其特徵在於，所述無血清動物細胞培養基幹粉選自 權利要求1-11中所述的無血清動物細胞培養基幹粉中的一種或幾種。
全文摘要
本發明提供了一種無血清動物細胞培養基幹粉及其製備方法，所述培養基幹粉包括基本培養基幹粉，其中，以所述培養基溶劑的體積為基準，所述培養基幹粉還包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蠶豆蛋白、0-100g/100L的馬鈴薯蛋白、0-200g/100L的小麥麩蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白。本發明還提供了包括上述無血清動物細胞培養基幹粉的液體無血清動物細胞培養基及其製備方法。由上述含有植物蛋白的本發明的培養基培養的細胞培養密度高、利於分離細胞下遊產品、成本低、被培養細胞的批次差異性小、安全性好，適於用作生產疫苗等生物製品的病毒宿主、表達載體等。
文檔編號C12N5/07GK102115728SQ20091026597
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月31日 優先權日2009年12月31日
發明者王建超, 羅海春, 陳文慶 申請人:北京清大天一科技有限公司