一種分泌脂肪酶的畢赤酵母共表達伴侶蛋白基因工程菌及其應用的製作方法

2023-12-10 02:27:36 2

專利名稱：一種分泌脂肪酶的畢赤酵母共表達伴侶蛋白基因工程菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種高產脂肪酶的畢赤酵母基因工程菌，特別是一種通過提高分泌效率加速積累脂肪酶的基因工程菌。
背景技術：
脂肪酶又稱三醯基甘油水解酶(EC 3. I. I. 3)是一種廣泛應用的水解酶類，能夠在水不溶性的底物酯和水的界面催化反應水解底物酯鍵。微生物脂肪酶被廣泛應用於很多工業，如油脂工業、製藥工業、食品工業和飼料工業等。但是，所有這些工業化應用能否成功的關鍵因素之一就是脂肪酶的高水平表達。本研究前期從濃香型大曲中篩選得到一株華根黴(CCTCC M201021)，從中克隆得到了一段脂肪酶基因，並在畢赤酵母中成功表達。喻曉蔚等發明設計的中國專利(CN201010287790. 8)公開了一種高產華根黴脂肪酶的基因工程菌和 構建方法。主要通過螢光定量的技術，篩選並鑑定了含有不同拷貝數脂肪酶基因的重組菌，通過該技術華根黴脂肪酶獲得了高水平表達。為了進一步滿足工業化生產華根黴脂肪酶的需求和進一步挖掘畢赤酵母表達華根黴脂肪酶的潛力，本發明欲採用共表達伴侶蛋白的策略加強胞內內質網中外源蛋白的合成速率以進一步提高華根黴脂肪酶的表達水平。通過同源建模獲得了華根黴脂肪酶的立體結構，分析表明該脂肪酶的結構中存在三對二硫鍵。分子伴侶能夠幫助蛋白質的正確摺疊或糾正蛋白質的錯誤摺疊，降低酶蛋白因錯誤摺疊的降解率，伴侶分子不參與蛋白質的最終組成。在酵母中二硫鍵形成需要內質網氧化還原蛋白Ει·ο1ρ和蛋白質二硫鍵異構酶PDI協調作用，通過PDI來介導氧化平衡物從Erolp傳遞到摺疊底物，這種氧化平衡物動態穿梭能促進內質網內快速完成二硫鍵形成，減少或重排錯誤二硫鍵連結。通過共表達伴侶蛋白能夠促進某些蛋白的表達。針對華根黴脂肪酶富含二硫鍵這一特徵，本發明擬採用共表達兩種伴侶蛋白的策略，進一步加強胞內內質網中外源蛋白的摺疊速率，從而提高脂肪酶的表達量。分子伴侶的概念早在1978年已被Laskey等人提出，它以其能夠幫助蛋白質正確摺疊、降低蛋白錯誤摺疊和提高外源蛋白表達量的能力逐漸被人關注。國內外大多數研究主要集中於添加一種伴侶蛋白如PDI等提高外源蛋白的表達量及生物活性。有學者利用基因工程手段增加內質網內分子伴侶Kar2p (結合蛋白)和蛋白質二硫鍵異構酶(proteindisukfide isomerase,F1DI)的量,使得β -葡萄糖苷酶在釀酒酵母中的表達量提高了 60%;Damasceno等在畢赤酵母中表達Α33單鏈抗體(A33scFv)的同時，高效共表達免疫球重鏈結合蛋白質Bip，結果使得A33scFv表達分泌量提高了兩倍左右。但是上述研究均忽視了內質網中催化蛋白質氧化摺疊中蛋白質的相互聯繫，僅共表達其中一種伴侶蛋白，而本研究正是在對內質網中Erolp介導的氧化摺疊模型細緻分析的基礎上，提出了共表達Ει·ο1ρ和PDI兩種伴侶蛋白，從而顯著提高了脂肪酶的表達量
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種在巴斯德畢赤酵母(P. pastoris GS115)中能夠加速摺疊分泌表達華根黴脂肪酶的基因工程菌法，以期運用該高產工程菌大規模的發酵生產華根黴脂肪酶。本發明提供的巴斯德畢赤酵母基因工程菌(Pichia pastoris)基因工程菌，於2012年5月18日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC No. 6123。本發明要解決的另一個技術問題是，提供一種發酵生產脂肪酶的方法，包括如下步驟I)接種所述基因工程菌到YPD培養基中，搖床30°C培養18小時左右，當種子液OD600達2 5後,完成搖瓶種子液的製備；2)然後轉入7L發酵罐BSM基礎鹽培養基進行發酵，起始裝液量為2L，在30°C、pH5. 5、溶氧50% 80%條件下進行甘油生長相培養；·
3)當基礎培養基中甘油消耗完，溶氧值大幅度上升，然後進入過渡相，流加50%甘油(含12mL/L PTMl )，使菌體濃度長至35 39g/L，停止甘油補加，飢餓O. 5h，然後進入誘導相，進行甲醇，每Kg甲醇含30ml PTMl流加，溫度控制於26 28 V ;在甲醇誘導表達階段，採用溶氧兩段式控制策略，甲醇流加啟動後，控制溶氧為初始溶氧值40% 50%，當菌體濃度達到100 110g/L，適當限制溶氧於10% 20%，整個誘導表達過程中，甲醇濃度維持於 O. 08 O. 12%。共表達兩種伴侶蛋白與分別共表達Erolp或者PDI —種伴侶蛋白進行對比研究，共表達兩種伴侶蛋白分別提高了 2. 13倍或者2倍。脂肪酶的活性測定方法橄欖油指示劑滴定法參考國家標準GBT 23535-2009脂肪酶製劑酶活在40°C、pH8. O條件下，Imin水解底物產生I μ mo I可滴定脂肪酸所需要的酶量(U/mL)。麵包比容測定方法菜籽置換法測定麵包體積並稱重。麵包比容(mL/g)=體積(mL) / 質量(g)。油脂含量測定採用索氏抽提法，溶劑為二氯甲烷，抽提時間6h ；油脂含量(%) =萃取的油脂質量/皮的絕幹質量X 100% ；脫脂率(%)=(脫脂前皮的油脂含量-脫脂後皮的油脂含量)/脫脂前皮的油脂含量 X 100%O膠原含量測定採用Hyp法對膠原含量進行測定。用100目濾布過濾浸水廢液，然後用10倍於廢液量的6M HCl於110°C下水解廢液10h，將膠原蛋白完全轉化為胺基酸。再將鹽酸驅除，蒸餾水定容後進行Hyp含量測定。本發明是利用畢赤酵母真核表達系統來生產華根黴脂肪酶，其表達量極高並可分泌到胞外。本發明的脂肪酶高產菌株的產量達到32000U/mL，遠遠高於國內外報導的根黴菌屬脂肪酶的產量。並且國內外尚無報導利用伴侶蛋白EROlp和PDI兩者的協同作用提高外源蛋白在畢赤酵母GS115中的表達水平。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發明，下列實施例用於說明目的而非用於限制本發明範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊所述的條件進行操作。材料及試劑限制性內切酶、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、PCR試劑(TaKaRa寶生物公司)，引物(上海賽百盛基因技術有限公司)，DS 2000 DNA Ladder Maker、E5000 DNA LadderMaker, E15000 DNA Ladder Maker (廣州東盛生物科技有限公司)，瓊脂糖凝膠DNA回收試 劑盒、PCR產物純化試劑盒(Bioflux)，Plasmid Mini Kit I (OMEGABIO-TEK)，其餘試劑均為國產或進口分析純。酵母培養基MD-Zeocin: YNB O. 0134g/mL, Biotin 4 X lCT7g/mL, Dextrose O. 02g/mL, Agar 0. 02g/mL, Zeocin 100 μ g/mL。MM-Zeocin: YNB 0. 0134g/mL, Biotin 4 X lCT7g/mL, Methanol 0. 005g/mL, Agar0. 02g/mL, Zeocin lOOyg/mL。實施例I兩種伴侶蛋白基因EROl和PDI的克隆及表達載體的構建通過NCBI網站查詢，獲得了畢赤酵母基因組中的兩種伴侶蛋白基因EROl (GenBank:FN392319. I)和 PDI (GenBank:AJ302014. I)的基因序列，採用化學合成的方法構建首尾相連的表達盒，連接到表達載體pPICZ上，操作過程參照Multi-CopyPichia Expression Kit, Invitrogen, Version F」,得到共表達兩種伴侶蛋白的表達質粒pP ICZ-EROI-PD I ;此外，還將EROl和TOI基因分別連接到表達載體pPICZ上，得到表達伴侶蛋白Erolp的表達質粒pPICZ-EROl，以及表達伴侶蛋白PDI的表達質粒pPICZ-PDI。實施例2共表達Erolp和TOI的華根黴脂肪酶基因工程菌的構建將5-10 μ g質粒pP ICZ-EROI-PD I用限制性內切酶Sal I酶切，回收後濃縮。畢赤酵母感受態細胞製備參考Invitrogen公司操作手冊「Multi-Copy Pichia ExpressionKit, Invitrogen, Version F」進行。將線性化質粒與80 μ L畢赤酵母感受態(發明專利CN201010287790. 8中公開的華根黴脂肪酶基因工程菌)混勻，轉至O. 2cm電擊杯中；電壓1500V,電容25 μ F，電阻200 Ω，進行電擊；電擊完畢後，立即加入ImL冰預冷的lmol/L的山梨醇溶液，混勻；30°C靜置Ih。實施例3表達Erolp的華根黴脂肪酶基因工程菌的構建將5_1(^8質粒？？10241 01用限制性內切酶5&1 I酶切，回收後濃縮。畢赤酵母感受態細胞製備參考Invitrogen公司操作手冊「Multi-Copy Pichia ExpressionKit, Invitrogen, Version F」進行。將線性化質粒與80 μ L畢赤酵母感受態(發明專利CN201010287790. 8中公開的華根黴脂肪酶基因工程菌)混勻，轉至O. 2cm電擊杯中；電壓1500V,電容25 μ F，電阻200 Ω，進行電擊；電擊完畢後，立即加入ImL冰預冷的lmol/L的山梨醇溶液，混勻；30°C靜置Ih。實施例4表達roi的華根黴脂肪酶基因工程菌的構建將5-1(^8質粒？？102- 01用限制性內切酶5&1 I酶切，回收後濃縮。畢赤酵母感受態細胞製備參考Invitrogen公司操作手冊「Multi-Copy Pichia ExpressionKit, Invitrogen, Version F」進行。將線性化質粒與80 μ L畢赤酵母感受態(發明專利CN201010287790. 8中公開的華根黴脂肪酶基因工程菌)混勻，轉至O. 2cm電擊杯中；電壓1500V,電容25 μ F，電阻200 Ω，進行電擊；電擊完畢後，立即加入ImL冰預冷的lmol/L的山梨醇溶液，混勻；30°C靜置Ih。實施例5 Fast-blue頂層瓊脂顯色法篩選基因工程菌。將電轉液塗布在MD-Zeocin平板上，30°C培養3天，將平板上長出的轉化子複製影印到MM-Zeocin平板上,30°C培養3-4天,然後進行fast-blue頂層瓊脂顯色法顯色。具體操作如下，將Fast-blue RR染色液A液與B液混合後傾倒於MM-Zeocin平板上,於2min內觀察菌落變色情況，在MD-Zeocin平板上挑取MM-Zeocin板上變色最深的克隆子。Fast-blue RR 染色液配方20mg/mL乙酸萘酯溶液0. 02g乙酸萘酯溶於ImL N, N- 二甲基甲醯胺；
80mg/mL fast-blue RR 溶液0. 08g 固藍 RR 鹽溶於 ImL 二甲基亞諷。A液取360 μ L乙酸萘酯溶液和160 μ L fast-blue RR溶液溶於IOmL去離子水；B液取5mL去離子水(含O. 3g瓊脂)，煮沸。實施例6基因工程菌的發酵法表達分別挑取數個顯色最深的單克隆菌種進行7L發酵罐發酵，發酵方法如下接種單克隆到YPD培養基中，搖床30°C培養18小時左右，當種子液0D600達2 5後，完成搖瓶種子液的製備。然後轉入7L發酵罐BSM基礎鹽培養基進行發酵，起始裝液量為2L，在30°C、pH5. 5、溶氧50% 80%條件下進行甘油生長相培養。當基礎培養基中甘油消耗完，溶氧值大幅度上升，然後進入過渡相，流加50%甘油(含12mL/L PTMl )，使菌體濃度長至35 39g/L，停止甘油補加，飢餓O. 5h，然後進入誘導相，進行甲醇(每Kg甲醇含30mlPTMl)流加，溫度控制於26 28°C。在甲醇誘導表達階段，採用溶氧兩段式控制策略，甲醇流加啟動後，控制溶氧為初始溶氧值40 % 50 %，當菌體濃度達到100 110g/L，適當限制溶氧於10% 20%，整個誘導表達過程中，甲醇濃度維持於O. 08 O. 12%。涉及的培養基YPD :蛋白粉20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/LBSM CaS04(cp) I. lg/L, K2S04(AR) 18. 2g/L,無水硫酸鎂(AR) 7. 27g/L，KOH (AR) 4. 128g/L，甘油 40g/L, 85%H3P04 26. 7ml/LPTMl :五水硫酸銅6g/L，碘化鉀0. 089g/L, 一水硫酸猛3. 0g/L,鑰酸鈉0. 2g/L，硼酸0. 02g/L,七水硫酸鋅42. 2g/L，七水硫酸亞鐵65g/L，生物素0. 2g/L，六水氯化鈷0. 5g/L，硫酸5ml/L。發酵水平如下非共表達伴侶蛋白的基因工程菌原始酶活為12000U/mL ;表達伴侶蛋白Erolp的基因工程菌酶活為15000U/mL ;表達伴侶蛋白PDI的基因工程菌酶活為16000U/mL;共表達兩種伴侶蛋白PDI和Erolp的基因工程菌酶活為32000U/mL。可見共表達兩種伴侶蛋白顯著提高了華根黴脂肪酶的活性，兩個伴侶蛋白的綜合使用獲得了意想不到的技術效果。實施例7華根黴脂肪酶的麵包烘焙中的應用小麥粉100%，食鹽1%，白砂糖8%，黃油8%，酵母L 5%，水62%(以小麥粉質量計)，脂肪酶的添加量為1000U/kg。將上述原料於攪拌機中攪拌lOmin，後靜置lOmin，分割成IOOg/塊，搓圓，靜置20min，裝盤，於38°C、相對溼度85%的條件下醒發90min，烘焙15min (上火170°C、下火210°C)，添加脂肪酶後麵包的比容增加了 122. 68%。實施例8脂肪酶處理造紙白水去除膠粘物質模擬抄紙循環白水系統在實驗室製備機械漿白水試樣。分別取一定量楊木機械漿(鹼性過氧化氫機械漿，APMP)，加水浸泡，漿濃3%，攪拌一定時間後收集濾液製得一段白水；然後，另稱取新漿樣放入上述一段白水中浸泡，漿濃3%，攪拌一定時間後，收集得到二段白水；如此重複一次，獲得三段白水，即做為實驗用造紙白水試樣。加入華根黴脂肪酶處理楊木白水，酶的添加量為20U/100mL白水，反應時間為I. 5h。楊木APMP白水空白樣的陽離子需求量(CD)很大，為4. 445meq/L，經華根黴脂肪酶處理後⑶降低了 9. 88%。相同條件下，經諾維信脂肪酶處理後⑶降低了 9. 85%，二者效果相近。陽離子需求量造紙系統中陰離子垃圾含量一般可用陽離子需求量(cationicdemand,⑶)來表示,用顆粒電荷測定儀測定。標準陽離子滴定液為PDADMAC(polydimet hyldiallyl ammonium chloride)。實施例9脂肪酶應用於皮革脫脂脂肪酶浸水工序的工藝液比I. 5，加Na2CO3和食鹽(調波美度=5，pH=9)，重組脂肪酶 O. 02%,轉 30/30minX 2，殺菌劑 O. 1%，JFC O. 2%,轉 30/30min,轉 5/55min 至過夜，總浸水 24h。對比工藝液比I. 5，脫脂劑O. 2%，殺菌劑O. 2%，滲透劑JFC O. 3%，加Na2CO3和食鹽(調波美度=5，pH=9. 5)，轉30/30minX2，轉5/55min至過夜，總浸水24h。由表I可見，華根黴脂肪酶的脫脂效果較脫脂劑的好，脫脂率為37. 9%，而且用脂肪酶脫脂的浸水廢液Hyp濃度較小，說明廢液中膠原含量低，脂肪酶對皮中膠原的損傷不大，具有良好的工業化使用前景。表I華根黴脂肪酶與脫脂劑的效果比較
WM脫脂率(％)~Hyp濃度(mg/L)
~脂肪酶浸水工藝3T9IOJ
對比工藝(脫脂劑)32.711.1 雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。
權利要求
1.一種分泌脂肪酶的畢赤酵母共表達伴侶蛋白基因工程菌，於2012年5月18日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC No. 6123，所述基因工程菌為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。
2.權利要求I所述基因工程菌，其特徵在於共表達伴侶蛋白EROl和PDI基因。
3.權利要求I所述基因工程菌，其特徵在於高水平表達華根黴脂肪酶，表達量達到32000U/mL。
4.權利要求I所述基因工程菌應用於麵包烘焙、造紙工業中樹脂障礙控制、皮革脫脂。
全文摘要
本發明公開了一種分泌脂肪酶的畢赤酵母共表達伴侶蛋白基因工程菌及其應用，本發明運用了分子生物學技術在表達華根黴脂肪酶的畢赤酵母基因工程菌中插入兩種伴侶蛋白ERO1和PDI基因。通過在兩種伴侶蛋白的協同作用下，加速了外源蛋白的合成速度，從而增加了外源蛋白脂肪酶的分泌速率，其胞外酶活力達到32000U/mL；該酶在麵包烘焙、造紙工業中樹脂障礙控制、皮革脫脂中具有很好的應用前景。
文檔編號C12N1/19GK102911888SQ201210232950
公開日2013年2月6日 申請日期2012年7月6日 優先權日2012年7月6日
發明者喻曉蔚, 徐巖, 沙衝 申請人:江南大學