一種以hif為靶點的抗腫瘤藥物篩選的方法及其應用的製作方法
2023-12-10 07:28:32 1
專利名稱：一種以hif為靶點的抗腫瘤藥物篩選的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種以HIF為靶點的抗腫瘤藥物篩選的方法及其應用，確切地說，涉及一種以低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)為靶點的抗腫瘤血管生成藥物篩選的方法及其應用，屬抗腫瘤藥物篩選的技術領域。
背景技術：
腫瘤血管(Angio)指圍繞著腫瘤而新生的血管。Angio使腫瘤獲得繼續生長的氧氣和養分供應，是腫瘤增殖和生存的重要條件。從某種意義上說，Angio使腫瘤能利用患者自身來摧毀患者。
Angio是一種受多因素、多機制調控的現象。HIF在其中起著極其重要的作用。當對腫瘤的供氧不足時，腫瘤便會產生HIF，而HIF進而促使正常血管長出幫助腫瘤生長的分支血管。見圖1。常見的發生Angio的腫瘤包括結腸癌、腎癌、肝癌和乳腺癌等實體瘤。研究發現，上述腫瘤細胞表現為HIF高表達。其它類型的腫瘤增殖中也常伴有HIF表達的上調。
HIF是一種轉錄蛋白，不具有可直接的檢測的活性。它只有與其結合位點(hypoxia responsive element，HRE)結合後，促使其它基因，例如磷光酶(Luciferase，Luc)的表達，從而來體現它的存在。見圖2。因此，Luc的活性高低也就反映了HIF表達的高低。
HIF發現於1992年。數年後，人們才發現HIF與腫瘤的密切關係。2001年以來，HIF的調控機制才被逐步搞清。目前國外剛剛開始致力於探尋臨床有效的HIF抑制劑，而且還沒有建立標準化的有效的篩選方法，至今也沒有發現特異的抑制劑。國內在這方面的工作則是空白。由於缺乏標準化的、有效的篩選方法，極大地限制了HIF抑制劑的篩選和應用。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種以HIF為靶點的抗腫瘤藥物篩選的方法。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案是構建穩定表達HRE和Luc的轉染細胞株，通過檢測Luc的活性，確定待篩選化合物對HIF的作用，實現對抗腫瘤藥物的篩選。
現詳細說明本發明的技術方案。一種以HIF為靶點的抗腫瘤藥物篩選方法，其特徵在於，包括以下步驟第一步 構建穩定表達HRE和Luc的轉染細胞株①構建含人HRE和Luc基因的重組質粒；②轉染人腫瘤細胞株，獲得穩定表達HRE和Luc的轉染細胞株；第二步 建立合適的磷光檢測系統；第三步 建立合適的低氧條件，在該條件時，轉染細胞株的Luc活性增強；第四步 進行以HIF為靶點的抗腫瘤藥物篩選用待篩選化合物作用轉染細胞，在合適的低氧條件下孵育一定時間，檢測Luc活性，如果待篩選化合物使細胞內的Luc活性減弱，說明該化合物可能是一種HIF的抑制劑，具有抗腫瘤血管生成的作用，因此是一種抗腫瘤藥物。
本發明的第二個目的是提供上述方法的一種應用，確切地說，推出一種以上述方法工作的快速篩選以HIF為靶點的抗腫瘤藥物的試劑盒。
為實現上述目的，本發明採用以下技術方案。
一種以上述方法工作的快速篩選以HIF為靶點的抗腫瘤藥物的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒內裝有轉染細胞株、Luc底物、磷光檢測試劑、陽性對照藥品，即經典的HIF抑制劑、陰性對照藥品、細胞裂解液等。
與
背景技術：
相比，本發明具有自動化程度高、快速、高效、簡便、直觀且省藥品等優點，適合應用於高通量快速篩選以HIF為靶點的抗腫瘤藥物，特別適用於可供篩選的物質種類多，但含量少時的情況。
圖1示出了腫瘤血管的發生。當腫瘤在氧氣供給發生短缺(Hyp)時便產生HIF。然後HIF促使血管朝向腫瘤生長，從而保證了對腫瘤的氧氣和養分供應，使腫瘤得以繼續發育和生長。
圖2是HIF表達的檢測原理。缺氧條件(Hyp)促使了細胞內HIF的高表達，與HRE結合的HIF的量隨之增加，從而使得產生的Luc的量也增加。
圖3是HRE的序列。HRE由PCR合成。深色標記的部分指示的分別是KpnI(51)和XhoI(31)的酶切位點。
圖4是HepGHRE細胞株的選擇。此克隆在缺氧條件(5％O2，16小時)下與正常氧(Nor)條件下相比，LucHyp∶LucNor比率達到了11.5。
圖5是缺氧持續時間對HIF表達的影響。HepGHRE細胞在含氧量為5％的缺氧條件下處理0-32小時，然後測定Luc的活性。
圖6是缺氧持續時間對HIF表達的影響。HepGHRE細胞在21％-0％含氧量的缺氧條件下處理16小時，然後測定Luc的活性。
圖7是陽性藥物LY294002對HIF表達的影響。HepGHRE細胞在21％或1％含氧量的條件下分別孵育16小時，其中1％的缺氧實驗分為加藥組(1％+LY294002)和不加藥組。然後測定Luc活性。
圖8示出對真菌提取物的篩選結果。真菌提取物的濃度為10μg/ml。空白對照(Control)是正常氧氣條件而且不加入真菌提取物的樣品。陽性對照(Hyp)是缺氧條件(1％，16小時)但不加入真菌提取物的樣品。Y軸上表明的是真菌提取物的編號。
具體實施例方式
本發明方法的工作原理。①HIF是抗腫瘤藥物特別是抗腫瘤血管生成藥物的重要靶點，HIF抑制劑具有抗腫瘤生長作用；②HIF是一種轉錄蛋白，不具有可直接的檢測的活性，它只有與HRE結合後，促使其它基因如Luc的表達，從而來體現它的存在，因此，Luc的活性的高低也反映了HIF表達的高低；③HIF只有在低氧時才表現為轉錄蛋白的活性，通常指環境中的氧含量為0.5-3％時認為是低氧條件，這時HIF本身的表達增加，其下遊基因如Luc表達也增加、活性增強；④LY294002是一種3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide-3kinase，PI3K)的抑制劑，由於HIF的蛋白合成需要PI3K的參與，所以LY294002可以抑制HIF的表達，可作為HIF抑制劑的陽性對照藥品；所有的實施例完全按上述的步驟操作。
實施例1第一步①中，HRE的cDNA由聚合酶鏈式反應(polymerase chainreaction，PCR)合成，其序列如圖3所示，全長的HRE用限制性內切酶KpnI和XhoI切割，連接到用KpnI和XhoI預處理的帶有Luc基因的質粒pGL3promotor上，重組的新質粒被命名為pHRELuc，並對插入序列測序檢驗是否正確；第一步②中，用Superfect轉染試劑盒(Qiagen)，讓重組質粒pHRELuc和帶有新黴素(neomycin，neo)抗性的質粒pSV2neo共同轉染人肝臟細胞HepG2，轉染48小時後，用濃度為800μg/ml的neo類似物G418進行第一輪篩選，10天後，挑出具有neo抗性的穩定克隆，轉染的細胞培養在含濃度為500ug/ml的G418的培養液中，然後利用有限稀釋法在缺氧條件下進行第二輪篩選；第二步中，把缺氧條件處理後的細胞中的Luc活性用Luc檢測試劑進行檢測，比較同一克隆在缺氧(Hyp)和正常供氧(Nor)條件下的Luc活性，得到LucHyp∶LucNor比率，挑出LucHyp∶LucNor＞10的克隆(見圖4)，即為轉染成功的HepGHRE細胞株；第三步中，把HepGHRE細胞接種於96孔板，細胞貼壁後移入5％氧氣濃度的缺氧條件中，缺氧條件持續0h-32小時，之後進行Luc活性的檢測(見圖5)，由於Luc的活性反映了HIF的表達，結果表明HIF在缺氧4小時後開始表達，在16小時後達到峰值，因此16小時的缺氧處理時間最適宜；確定缺氧時間後，用21％-0％，16小時的氧含量作用於HepGHRE細胞並測定Luc的活性(見圖6)，結果表明HepGHRE細胞在氧氣濃度8％時便開始顯現出了Luc活性增強，即HIF的高表達，在1％氧含量時達到峰值，比正常給氧條件(21％)下的細胞具有30倍以上的HIF高表達，因此，1％的缺氧條件是引發HIF高表達的最佳缺氧程度；第四步中，加待篩選的化合物是LY294002。把10μM的LY294002加HepGHRE細胞中，之後細胞被移入1％缺氧環境中孵育16小時，加入裂解溶液，室溫下搖震10分鐘，然後放置於-20℃凍凝30分鐘，最後回到室溫融化並搖震蕩10分鐘，取出5μl裂解液，加入50μl反應液，反應時間為10秒，讀取磷光值，比較空白孔和其它孔磷光強度差別，結果顯示LY294002完全抑制了HIF的高表達(見圖7)，也就是說，所得結果與已知情況完全相符。
實施例2第一、二、三步與實施例1同；第四步中，加待篩選的抑制劑為隨機抽出的1000種真菌提取物。基於HepGHRE細胞，使用100μg/ml的真菌提取物，僅花費2周的時間就完成了第一輪篩選，篩選出38個有效的真菌提取物。為避免過高濃度的真菌提取物的毒性和假陽性，把真菌提取物的使用濃度降低為10μg/ml，對這38個樣品進行了第二輪篩選，從中發現了030-02KF、036-02KF、036-02M三個樣品仍具有明顯效果(見圖8)。
上述以HepGHRE細胞株為模型，檢測Luc的活性來反映HIF的表達狀況及其受抑制情況的方法是有效且簡便的。此方法特別適用於可供篩選的物質種類多，但含量少時的情況。此方法自動化程度高，直觀快速且省藥品。
權利要求
1.一種以HIF為靶點的抗腫瘤藥物篩選方法，其特徵在於，包括以下步驟第一步構建穩定表達HRE和Luc的轉染細胞株①構建含人HRE和Luc基因的重組質粒；②轉染人實體瘤或血癌細胞，獲得穩定表達HRE和Luc的轉染細胞株；第二步建立合適的磷光檢測系統；第三步建立合適的低氧條件，在該條件時，轉染細胞株的Luc活性增強；第四步進行以HIF為靶點的抗腫瘤藥物篩選用待篩選化合物作用於轉染細胞，在合適的低氧條件下孵育一定時間，檢測Luc活性，如果待篩選化合物使細胞內的Luc活性減弱，說明該化合物可能是一種HIF的抑制劑，具有抗腫瘤血管生成的作用，因此是一種抗腫瘤藥物。
2.根據權利要求1所述的以HIF為靶點的抗腫瘤藥物篩選方法，其特徵在於，第一步①中，HRE的cDNA由PCR合成，其序列如圖所示，全長的HRE用限制性內切酶KpnI和XhoI切割，連接到用KpnI和XhoI預處理的帶有Luc基因的質粒pGL3promotor上，重組的新質粒被命名為pHRELuc，並對插入序列測序檢驗是否正確；第一步②中，用Superfect轉染試劑盒(Qiagen)讓重組質粒pHRELuc和帶有neo抗性的質粒pSV2neo共同轉染人肝臟細胞HepG2，轉染48小時後，用800μg/ml G418進行第一輪篩選，10天後，挑出具有neo抗性的穩定克隆；轉染的細胞培養在含500ug/ml G418的培養液中，然後利用有限稀釋法在缺氧條件下進行第二輪篩選；第二步中，把缺氧條件處理後的細胞中的Luc活性用Luc檢測試劑進行檢測，比較同一克隆在缺氧(Hyp)和正常供氧(Nor)條件下的Luc活性，得到LucHyp∶LucNor比率，挑出LucHyp∶LucNor＞10的克隆，即為轉染成功的HepGHRE細胞株；第三步中，把HepGHRE細胞接種於96孔板，細胞貼壁後移入5％氧氣濃度的缺氧條件中，缺氧條件持續0-32小時，之後進行Luc活性的檢測，由於Luc的活性反映了HIF的表達，結果表明HIF在缺氧4小時後開始表達，在16小時後達到峰值，因此16小時的缺氧處理時間最適宜；確定缺氧時間後，用21％-0％，16小時的氧含量作用於HepGHRE細胞並測定Luc的活性，結果表明HepGHRE細胞在氧氣濃度8％時便開始顯現出了Luc活性增強，即HIF的高表達，在1％氧含量時達到峰值，比正常給氧條件(21％)下的細胞具有30倍以上的HIF高表達，因此，1％的缺氧條件是引發HIF高表達的最佳缺氧程度；第四步中，加待篩選的化合物是LY294002，把10uM的LY294002加入HepGHRE細胞中，之後細胞被移入1％缺氧環境中孵育16小時，加入裂解溶液，室溫下搖震10分鐘，然後放置於-20℃凍凝30分鐘，最後回到室溫融化並搖震蕩10分鐘，取出5μl裂解液，加入50μl反應液，反應時間為10秒，讀取磷光值，比較空白孔和其它孔磷光強度差別，結果顯示LY294002完全抑制了HIF的高表達，也就是說，所得結果與已知情況完全相符。
3.一種以權利要求1或2的方法工作的快速篩選以HIF為靶點的抗腫瘤藥物的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒內裝有轉染細胞株、磷光檢測試劑、陽性對照藥品即經典的HIF抑制劑、陰性對照藥品、細胞裂解液。
全文摘要
一種以HIF為靶點的抗腫瘤藥物篩選方法及應用，屬抗腫瘤藥物篩選的技術領域。本發明的技術方案是構建穩定表達HRE和Luc的轉染細胞株，通過檢測Luc的活性，確定待篩選化合物對HIF的作用，實現對抗腫瘤藥物的篩選。用上述方法的工作原理，可製成快速篩選以HIF為靶點的抗腫瘤藥物的試劑盒。本發明具有自動化程度高、快速、高效、簡便、直觀且省藥品等優點，適合應用於高通量快速篩選以HIF為靶點的抗腫瘤藥物，特別適用於可供篩選的物質種類多，但含量少時的情況。
文檔編號G01N33/68GK1661042SQ200410099288
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月29日 優先權日2004年12月29日
發明者周捷, 陳菲, 王弢 申請人:華東師範大學