賦予過氧化氫耐性的基因及其利用的製作方法

2023-12-10 08:12:52

賦予過氧化氫耐性的基因及其利用的製作方法
【專利摘要】本發明提供用於對微生物賦予過氧化氫耐性的基因及其利用方法。該賦予過氧化氫耐性的基因編碼選自以下的（a）～（c）中的蛋白質。（a）由序列編號2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；（b）由在（a）的胺基酸序列中缺失、取代或添加了1個或多個胺基酸的胺基酸序列組成且具有能夠賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質；（c）由具有與（a）的胺基酸序列85%以上的同一性的胺基酸序列組成且具有能夠賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質。
【專利說明】賦予過氧化氫耐性的基因及其利用
【技術領域】
[0001]本發明涉及對微生物賦予過氧化氫耐性的基因及其利用方法。
【背景技術】
[0002]許多需氧型微生物具有負責氧代謝的呼吸鏈，在氧存在下能夠獲得能量，良好地繁殖。另外，一部分氧在其代謝過程中產生超氧陰離子或過氧化氫，而這樣的微生物具有利用清除這些物質的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶或過氧化物酶等將這些物質無毒化而避免其毒性的機制。
[0003]在厭氧型微生物中作為有用菌被已知的乳酸菌屬於兼性厭氧型菌，不具有呼吸鏈和過氧化氫酶，但是許多乳酸菌即使在氧存在下也能夠繁殖，具有耐氧性。以前，關於乳酸菌耐氧性機理進行了若干研究，其中，作為代謝氧的酶，已知有NADH氧化酶和丙酮酸氧化酶等。NADH氧化酶被報告有水生成型和過氧化氫生成型的2種類型，水生成型將氧進行4電子還原形成水而無毒化。另一方面，報告了過氧化氫生成型以2電子還原產生過氧化氫，但在變異鏈球菌等乳酸菌中，利用烷基過氧化氫還原酶將該過氧化氫轉化為水，發揮作為2成分性的過氧化物酶的功能。
[0004]另外，也報告了具有清除由氧產生的超氧陰離子或過氧化氫的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶或NADH過氧化物酶等的乳酸菌。
[0005]在乳酸菌 植物乳桿菌WCFSl中，通過強化硫氧還蛋白還原酶基因的表達，對過氧化氫等的氧化應力的抵抗力更強，由此提出了硫氧還蛋白還原酶在氧化應力抗性中起著重要作用(非專利文獻I)。
[0006]另外，在厭氧型革蘭氏陰性細菌脆弱擬桿菌中，硫氧還蛋白-硫氧還蛋白還原酶系統被認為是負責硫醇/ 二硫化物的氧化還原反應的唯一系統，報告了通過硫氧還蛋白還原酶的缺失，即使在厭氧環境下，不添加半胱氨酸、二硫蘇糖醇等還原劑，菌也不能繁殖(非專利文獻2)。
[0007]另外，報告了在大腸桿菌中，存在為了將細胞內保持為還原狀態所必須的穀胱甘肽-穀胱甘肽還原酶系統或硫氧還蛋白-硫氧還蛋白還原酶系統，與這些系統相關的基因破壞株對過氧化氫等的氧化應力具有敏感性。
[0008]另一方面，報告了在乳酸菌乳酸乳球菌中，通過破壞硫氧還蛋白還原酶，有氧條件下繁殖被抑制(非專利文獻3)，但有氧條件下的繁殖抑制，由於以二硫蘇糖醇的添加得到恢復，而且如果培養24小時就會成為與野生株同樣程度的菌體量，所以有氧條件下的繁殖抑制和耐氧性的關係沒有解明。
[0009]另外，報告了在變異鏈球菌中，由於將NADH氧化酶、烷基過氧化氫還原酶(ahpC)雙敲除的變異株具有耐氧性，所以作為另一個具有鐵結合性的蛋白質的基因是與耐氧性相關的基因(專利文獻I)。但是，這些基因不是所有微生物具有的基因，耐氧性機理尚未明確之處較多。另外，如這裡所舉出的那樣，與耐氧性相關的基因有多個，不是只有I個基因發揮耐氧性能力，因此難以簡便進行實際應用。[0010]另外，本發明的發明人等報告了乾酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌中存在的fnr基因是對於有氧條件下的菌繁殖特別必要的基因，是賦予耐氧性的基因(專利文獻2)。
[0011]但是，在氧化應力中，對在代謝過程中產生的過氧化氫的耐性也很重要，在乳桿菌屬的微生物中，報告了 NADH過氧化物酶或過氧化氫酶等的與清除過氧化氫相關的基因，但至今沒有發現對過氧化氫直接顯示抗性的基因。
[0012]現有技術文獻
[0013]專利文獻
[0014]專利文獻1:日本特開2001-327292號公報
[0015]專利文獻2:國際公開第2009/150856號小冊子
[0016]非專利文獻
[0017]非專利文獻1:L.Mariela Serrano et al.Microbial Cell Factories6:29(2007)
[0018]非專利文獻2:Edson R.Rocha et al.J.Bacteriol.189:8015-8023 (2007)
[0019]非專利文獻3:Karin Vido et al.J.Bacteriol.187:601-610 (2005)

【發明內容】

[0020]發明所要解決的課題
`[0021]本發明涉及提供對微生物賦予對過氧化氫的耐性的基因及其利用方法。
[0022]用於解決課題的方法
[0023]本發明的發明人等對於乾酪乳桿菌?Τ9029 (FERM BP-1366)的基因組基因進行研究，發現存在即使暴露於過氧化氫下也抑制羥基自由基生成的基因，通過利用該基因，能夠對微生物賦予對過氧化氫的耐性或強化微生物本來具有的對過氧化氫的耐性。
[0024]即，本發明是涉及以下發明。
[0025]I) 一種賦予過氧化氫耐性的基因，其編碼選自以下的(a)~(C)中的蛋白質:
[0026](a):由序列編號2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；
[0027](b):由在(a)的胺基酸序列中缺失、取代或添加了 I個或多個胺基酸的胺基酸序列組成且具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質；
[0028](c):由具有與(a)的胺基酸序列85%以上的同一性的胺基酸序列組成且具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質。
[0029]2) 一種賦予過氧化氫耐性的基因，其包括選自以下的(d)~(f)中的多核苷酸:
[0030](d):由序列編號I所示的鹼基序列組成的多核苷酸；
[0031](e):與由與(d)的鹼基序列互補的鹼基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交、且編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質的多核苷酸；
[0032](f):由具有與(d)的喊基序列85%以上的同一性的喊基序列組成且編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質的多核苷酸。
[0033]3) 一種對微生物賦予或強化過氧化氫耐性的方法，其特徵在於，在該微生物中導入上述基因或改變該微生物具有的該基因。
[0034]4)導入或改變了上述基因得到的微生物。
[0035]5)含有上述微生物的飲料和/或食品。[0036]6)含有上述微生物的醫藥品。
[0037]7) 一種過氧化氫耐性微生物的篩選方法，其特徵在於，測定上述基因有無和/或
其表達量。
[0038]8)包含上述多核苷酸或其一部分的重組載體。
[0039]9)包含上述重組載體的宿主微生物。
[0040]10)與上述多核苷酸特異性雜交的核酸片段。
[0041]11)包含上述多核苷酸或其一部分的DNA陣列或DNA晶片。
[0042]發明的效果
[0043]通過利用本發明的基因或多核苷酸，能夠對微生物賦予過氧化氫耐性、強化微生物具有的過氧化氫耐性、篩選過氧化氫耐性的微生物。該過氧化氫耐性被賦予或強化後的微生物，即使暴露於過氧化氫下也能夠控制羥基自由基的生成，抑制核酸、蛋白質、脂質等細胞構成成分的障礙。
[0044]另外，通過使用本發明的基因被導入或改變後的微生物，就能夠製造所希望的對氧化應力具有抗性的飲料和/或食品、醫藥品。另外，由於能夠在氧存在下維持較高的活菌數，所以不需要製品製造時的厭氧裝置、製品的厭氧保存容器，能夠實現降低成本的製造。另外，由於一般而言活菌數越高則微生物的生理效應越大，所以能夠使微生物具有的生理效應有效地發揮。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1是表示由氧化應力造成的⑶S2657基因表達量變化的圖表。
[0046]圖2是表示⑶S2657基因破壞株的過氧化氫耐性(存活率)的曲線圖。
[0047]圖3是表示⑶S2657基因破壞株的過氧化氫清除活性的圖表。
[0048]圖4表示⑶S2657蛋白質的SDS-PAGE圖譜。M:標記物(marker)、CL:細胞裂解液(cell lysate)、FT:流穿液(Flow through)、W:清洗液(wash)、E1&2:洗脫液(elution)
[0049]圖5是表示過氧化氫對⑶S2657基因高表達株的影響的圖表。
【具體實施方式】
[0050]在本說明書中，胺基酸序列和鹼基序列的同一性(相同性)，能夠使用通過利用基因信息處理軟體GENETYX (Genetyx公司生產)的Lipman-Person法(Lipman, D.J.and Pearson, ff.R.1985.Rapid and sensitive protein similarity searches.Science227:1435-1441)的同源性解析(Search homology)程序得到。具體而言,例如，同一性通過將乾酪乳桿菌YIT9029的基因與已知的基因進行相同性比較、解析來算出，作為參數，設為 Unit Size to compare=2、Pick up Location=5,將結果以 ％ 表不來進行。
[0051]另外，所謂基因，不僅包括雙鏈DNA，還包括構成雙鏈DNA的正義鏈和反義鏈的各個單鏈DNA，另外，其長度沒有任何限制。另外，作為多核苷酸，可以例示RNA、DNA，DNA包括cDNA、基因組DNA、合成DNA。
[0052]本發明的賦予過氧化氫耐性的基因是在乾酪乳桿菌?Τ9029中發現的⑶S2657基因以及從該基因得到的基因，編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質。
[0053]該CDS2657基因是由其編碼的蛋白質功能未被解明(假設蛋白hypotheticalprotein)的所謂功能未知的基因。
[0054]本發明的賦予過氧化氫耐性的基因，具體而言是編碼選自以下的(a)~(C)中的蛋白質的基因。
[0055](a):由序列編號2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；
[0056](b):由在(a)的胺基酸序列中缺失、取代或添加了 I個或多個胺基酸的胺基酸序列組成且具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質；
[0057](c):由具有與(a)的胺基酸序列85%以上的同一性的胺基酸序列組成且具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質
[0058]其中，由序列編號2所示的胺基酸序列組成的蛋白質是來自於乾酪乳桿菌YIT9029的蛋白質。
[0059]序列編號2所示的胺基酸序列中缺失、取代或添加了 I個或2個以上的胺基酸的胺基酸序列，包括缺失、取代或添加了 I個或數個、優選I~10個胺基酸的胺基酸序列，添加包括在兩末端添加I~數個胺基酸。
[0060]胺基酸的缺失、取代、添加包括例如通過由序列編號2所示的胺基酸序列組成的蛋白質發生I鹼基取代等天然產生的變異、或利用位點特異性變異導入法或突變處理等在基因中人工導入的變異等而產生的缺失、取代、添加。作為人工進行這樣的胺基酸缺失、取代或添加時的方法，例如，可以列舉對由編碼序列編號2所示的胺基酸序列的鹼基序列組成的多核苷酸，實施常用的位點特異性變異導入，然後由通常方法使該多核苷酸表達的方法。
[0061]另外，作為胺基酸的取代，例如，可以列舉取代為與原胺基酸在疏水性、電荷、pK、立體結構上的特徵等具有類似性質的胺基酸。
[0062]另外，作為具有與(a)的胺基酸序列85%以上的同一性的胺基酸序列，是指在序列編號2所示的胺基酸序列中將相當的序列適當地比對(alignment)時，具有與該胺基酸序列85%以上、優選90%以上、更優選95%以上同一性的胺基酸序列。
[0063]在本發明中，所謂「賦予過氧化氫耐性」，是指使微生物對過氧化氫的敏感性下降，即，即使在過氧化氫存在下也能夠使微生物繁殖，和/或即使在過氧化氫存在下也不會使繁殖的微生物死亡。具體而言，是指即使微生物在內部或外部被暴露於過氧化氫時，也能夠控制羥基自由基的生成，抑制由該羥基自由基引起的核酸、蛋白質、脂質等細胞構成成分的障礙。
[0064]本發明的賦予過氧化氫耐性的基因，適合列舉由選自以下的(d)~(f)中的多核苷酸組成的基因。
[0065](d):由序列編號I所示的鹼基序列組成的多核苷酸；
[0066](e):與由與(d)的鹼基序列互補的鹼基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交、且編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質的多核苷酸；
[0067](f):由具有與(d)的喊基序列85%以上的同一性的喊基序列組成且編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質的多核苷酸。
[0068]其中，由序列編號I所示的鹼基序列組成的多核苷酸是來自於乾酪乳桿菌YIT9029的DNA (⑶S2657基因)，對該微生物賦予過氧化氫耐性，使其能夠在過氧化氫存在下繁殖。[0069]在本發明中，所謂「嚴格條件」，例如，可以列舉在Molecular cloning-aLaboratory manual 2nd edition (Sambrook 等、1989)中記載的條件等。例如，可以列舉如下條件:在包含6XSSC( IXSSC的組成:0.15M氯化鈉、0.015M檸檬酸鈉、pH7.0),0.5%SDS、5X Denhardt雜交溶液和100mg/mL鯡魚精子DNA的溶液中，與由與該鹼基序列互補的鹼基序列組成的多核苷酸一起，以65°C恆溫8~16小時使之雜交。
[0070]另外，作為具有與(d)的鹼基序列85%以上的同一性的鹼基序列，是指在序列編號I所示的鹼基序列中將相當的序列適當地比對時，具有與該鹼基序列85%以上、優選90%以上、更優選95%以上同一性的鹼基序列。
[0071]本發明的基因能夠以序列編號I的鹼基序列參考，製作引物，利用以乾酪乳桿菌YIT9029的DNA作為模板的通常方法的PCR法容易地得到。
[0072]即，例如，能夠通過化學合成由包含任意基因的N末端起始密碼子的序列組成的多核苷酸A、和由與包含該基因的終止密碼子的序列互補的序列組成的多核苷酸B，將這些多核苷酸A和B作為I組，將乾酪乳桿菌?Τ9029的DNA作為模板進行PCR反應而得到。另外，為了將這樣操作得到的基因片段在質粒載體等中高效地進行克隆，也可以在多核苷酸引物的5』末端側添加用於限制酶切斷的序列。在這裡，作為引物，一般可以使用基於與本發明基因的鹼基序列相關的信息而化學合成的核苷酸等，但也可以良好地利用已經獲得的本發明基因及其片段。作為該核苷酸，可以列舉作為對應於序列編號I的部分核苷酸序列的10~50個連續的鹼基、優選15~35個連續的鹼基等。
[0073]另外，PCR的條件，例如，在得到2000鹼基對長度的DNA片段時，可以列舉94°C 2分鐘、(95 0C 10秒鐘、52°C 10秒鐘、72°C 2分鐘)X 30循環、72°C 7分鐘。
[0074]另外，也可以利用DNA合成儀，按照該鹼基序列進行人工合成而得到。
[0075]本發明的基因是與`賦予過氧化氫耐性相關的基因，所以通過將其導入微生物或改變微生物具有的該基因，能夠賦予該微生物對過氧化氫的耐性或強化微生物本來具有的對過氧化氫的耐性。
[0076]本發明的基因的導入，能夠通過將該基因導入原來沒有該基因的微生物中進行。作為導入基因的方法，使用利用DNA的攝取能力的感受態法、利用原生質體的原生質體PEG法和利用高電壓脈衝的電穿孔法等即可，特別優選電穿孔法。另外，在微生物染色體中整合基因時，可以使用基於同源重組的方法、位點特異性整合的方法。
[0077]在本發明的基因改變中，可以列舉表達增強。
[0078]在增強基因的表達中，可以通過如下方法等進行即可:將載有本發明的基因的重組質粒導入作為對象的微生物中，由位點特異性重組在染色體的其他部位整合該基因使微生物內的該基因的拷貝數增加，通過改變控制該基因表達的控制區域或改變控制基因使表達增加，特別優選使該基因的拷貝數增加的方法。具體而言，在每I個微生物細胞具有多個拷貝數的質粒中，克隆入作為對象的基因以及該基因本來的引物序列和核糖體結合位點，或者在從其他基因中分離得到或由化學合成得到的引物和核糖體結合位點的下遊只連接編碼該基因的多肽的區域，克隆入在每I個微生物細胞具有多個拷貝數的質粒中，製成重組質粒，由電穿孔法等將其導入微生物細胞內，由此，能夠提高該基因在微生物細胞內的拷貝數。
[0079]另外，對原本具有該基因的微生物，通過對該基因進行表達阻止或表達抑制，也能夠使該微生物的過氧化氫耐性下降。
[0080]在阻止基因的表達中，使本發明的基因破壞、缺失即可，作為該方法，可以使用將完全無關的DNA片段插入基因內部的插入失活法、或者通過階段性同源重組使一部分或全部靶基因缺失的階段性雙重交叉法，特別優選階段性雙重交叉法。
[0081]具體而言，在使一部分或全部靶基因缺失時，從染色體DNA中分離出夾著缺失區域的兩側的區域、或者由PCR法擴增來分離，例如，在pYSSE3那樣的在大腸桿菌中增殖但在作為對象的微生物中不能複製的質粒載體中，以與本來方向相同的方向排列的狀態克隆入這兩條DNA片段。接著，使用電穿孔法等在要發生缺失的微生物中導入所得到的重組質粒DNA，從產生的抗生物質耐性的克隆中，利用PCR法等篩選出在與目的缺失區域的上遊或下遊的克隆區域相同的區域發生重組而質粒插入染色體上的克隆。將這樣操作得到的克隆，用不含抗生物質的培養基反覆傳代培養，由此，篩選出如下失去抗生物質耐性的克隆，其中，質粒再次因接近存在的相同區域之間的重組而從染色體上脫離，伴隨菌增殖消失，從而失去抗生物質耐性。能夠利用PCR法等從這樣操作得到的克隆中分離出缺失靶基因區域的克隆。
[0082]在抑制基因的表達中，可以使用基於合成與本發明基因的mRNA的5』末端區域互補的短的RNA的所謂RNA幹涉的方法、或者將控制該基因表達的區域或控制基因破壞或者缺失等使其改變的方法，特別優選改變控制該基因表達的區域。具體地，通過改變控制基因轉錄的引物序列，能夠增多或減少向該基因向mRNA的轉錄量。
[0083]其中，作為基因導入或改變的對象的微生物沒有特別限定，能夠使用革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、酵母等，可以適合利用革蘭氏陽性細菌，特別優選利用對機體的安全性得到確認的乳桿菌屬細菌、雙歧桿菌屬細菌等。在乳桿菌屬細菌中，優選利用乾酪乳桿菌、類乾酪乳桿菌、玉米乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等屬於乾酪乳桿菌群的細菌，可以特別適合利用乾酪乳桿菌。
[0084]雙歧桿菌屬細菌是偏性厭氧型菌，對氧、低pH和高酸度弱，在製造時的增殖和保存時的存活性等操作中困難多。由於雙歧桿菌屬細菌對人顯示有用的生理效應，所以耗費精力利用育種改良獲得對過氧化氫具有耐性的變異株或使用不透氧性容器等，其在飲料和/或食品、醫藥品中的應用得到發展，但存在培養困難、或在保存中活菌數下降的各種問題。雙歧桿菌屬細菌因為已知不具有本申請發明的賦予過氧化氫耐性的基因，所以，能夠適合作為本申請發明的基因導入或改變的對象微生物利用。
[0085]這樣操作得到的基因被導入或改變的微生物，因為過氧化氫耐性被賦予或增強，所以能夠作為有效地發揮該微生物原來具有的各種生理效應的飲料和/或食品、醫藥品利用。
[0086]在將基因被導入或改變後的本發明的微生物製成飲料和/或食品、醫藥品時，菌體既可以是活菌或加熱菌體(死菌體)的任意一種，也可以是冷凍乾燥的菌體，或者還可以作為包含這些微生物的培養物、菌體處理物利用，但優選以活菌狀態利用。
[0087]在作為醫藥品使用時，能夠將本發明的微生物與固體或液體的醫藥用無毒性載體混合，以常用的醫藥品製劑的形態給藥。作為這樣的製劑，例如，可以列舉片劑、顆粒劑、散齊?、膠囊劑等固體製劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑等液體製劑、冷凍乾燥製劑等。這些製劑能夠由製劑上常用手段製備。作為上述醫藥用無毒性載體，例如，可以列舉葡萄糖、乳糖、蔗糖、澱粉、甘露糖醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羥乙基澱粉、乙二醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、胺基酸、明膠、白蛋白、水、生理食鹽水等。另外，根據需要，也可以適當添加穩定劑、溼潤劑、乳化劑、粘合劑、等滲劑、賦形劑等常用的添加劑。
[0088]另外，基因被導入或改變後的本發明的微生物，不僅可以製成為上述那樣的製劑，也可以在飲料和/或食品中配合使用。在飲料和/或食品中配合時，可以直接或使之與各種營養成分共同含有。因為該飲料和/或食品包含過氧化氫耐性被賦予或增強的微生物，所以能夠作為有效地發揮該微生物原來具有的各種生理作用的保健用食品或食品材料利用。具體而言，在飲料和/或食品中配合由本發明的方法得到的微生物時，既可以適當使用能夠作為飲料和/或食品使用的添加劑，使用常用手段成形為適於食用的形態，即，顆粒狀、粒狀、片劑、膠囊、糊狀等，另外，也可以在各種食品中添加使用，例如，在火腿、香腸等食肉加工食品，魚糕、竹輪等水產加工食品，麵包、甜點、黃油、奶粉中添加使用，或在水、果汁、牛奶、軟飲料、茶飲料等飲料中添加使用。另外，飲料和/或食品也包括動物飼料。
[0089]作為飲料和/或食品，還可以列舉利用本發明微生物的發酵乳、乳酸菌飲料、發酵豆乳、發酵果汁、發酵植物液等發酵飲料和/或食品的例子。這些發酵飲料和/或食品的製造按照通常方法進行即可。例如，製造發酵乳時，首先在滅菌後的乳培養基中將本發明的微生物單獨或與其它微生物同時接種培養，將其進行勻漿化處理，得到發酵乳基料(base)。接著，添加混合另外製備的糖漿溶液，用勻漿器等勻漿化，再添加香味調料，加工為最終製品即可。這樣操作得到的發酵乳也可以製成為不含糖漿(甜味劑)的原味類型、軟質類型、水果風味類型、固體狀態、液體狀態等任意形態的製品。
[0090]由本發明方法得到的微生物，由於具有高的過氧化氫耐性，所以飲料和/或食品中的菌的存活性高，因此，能夠抑制保存中的活菌數下降和死亡速度的增加，製品規格的維持變得容易，能夠使乳桿菌屬細菌等微生物具有的調節腸道作用等一般的生理效應有效地發揮。另外，對於原來具有抗癌作用、幽門螺桿菌的除菌作用等特異的生理效應的乳桿菌屬細菌和雙歧桿菌屬細菌，通過用本發明的方法賦予或增強過氧化氫耐性，就能夠在各種飲料和/或食品中利用該菌株，並且由於該菌株的存活性改善，就能夠使該菌株具有的生理效應增強。`
[0091]另外，在利用雙歧桿菌屬細菌的飲料和/或食品中，以提高保存時的存活性為目的，一直以來主要使用以玻璃和鋁塗布紙等不透氧性包裝材料構成的容器，但由本發明的方法得到的賦予或強化了過氧化氫耐性的雙歧桿菌屬細菌，因為具有高的存活性、不需要嚴格的無氧狀態，所以也可以使用透氧性高的樹脂(聚苯乙烯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯)作為容器材料。使用這些樹脂的容器，相比於以不透氧性包裝材料構成的容器，具有成本低、成型自由度高的優點。
[0092]本發明的基因也可以用於過氧化氫耐性微生物的篩選。
[0093]即，通過測定本發明的基因有無和/或其表達量，能夠篩選出過氧化氫耐性的微生物。
[0094]其中，基因的有無和/或其表達量的測定，使用能夠檢測出本發明的基因和來自基因的mRNA的探針和引物，能夠通過Southern雜交(DNA雜交)法、DNA微陣列或RT-PCR法測定微生物中作為靶標的基因的有無、拷貝數和表達量。然後，通過靶基因或其表達的有無，選擇目的微生物即可。[0095]包含(d)~(f)所示的多核苷酸或其一部分(片段)的本發明的重組載體，能夠使用具有能夠選擇該載體在大腸桿菌和作為對象的微生物中導入那樣的基因標記的任意載體(例如，pHY400、pSAl、pYSSE3等)，通過體外連接法等公知的方法得到。
[0096]另外，包含上述重組載體的宿主微生物能夠通過使用如下等方法得到:通過公知的方法、即在宿主微生物中導入該重組載體時用電穿孔法等的方法，在整合入微生物染色體中時，將具有與該微生物相同的DNA區域的重組載體用電穿孔法等導入後，由PCR法等確認由同源重組整合入染色體中的重組載體。
[0097]另外，包含(d)~(f)所示的多核苷酸或其一部分(片段)的本發明的DNA陣列或DNA晶片，能夠由光版印刷法等公知的方法製作。通過使用該DNA陣列或DNA晶片，能夠篩選表達本發明的基因的微生物。
[0098]另外，為了更有效地進行上述微生物的基因導入或改變和微生物的篩選，優選使用包含本發明的多核苷酸或其一部分的重組載體、由本發明的一部分多核苷酸片段組成的PCR和RT-PCR用引物、能夠將本發明的多核苷酸或其一部分擴增的PCR和RT-PCR用引物、由與本發明的多核苷酸特異性雜交的多核苷酸或其一部分組成的雜交用核酸片段。
[0099]其中，作為所使用的引物等的核酸片段，一般能夠使用基於與本發明基因的鹼基序列相關的信息化學合成的核苷酸等，作為該核苷酸，優選為對應於序列編號I所示的鹼基序列的部分核苷酸序列，為10~50個連續的鹼基，更優選為15~35個連續的鹼基。
[0100]以下，利用實施例更詳細地說明本發明的內容。
[0101]實施例
[0102]實施例1由氧、過氧化氫應力引起的CDS2657基因表達量的變化
[0103]關於⑶S2657基因，使用實時PCR解析施加氧或過氧化氫應力時的表達量。
[0104](I)氧化應力的施加
[0105]氧應力如下施加:在100ml的厭氧MRS培養基中培養7小時後，分為2份，將1份加入300ml容量的三角燒瓶，使用TAITEC公司生產的恆溫振蕩槽，以160rpm振蕩30分鐘。過氧化氫應力如下施加:將100ml的MRS培養基在有氧靜置培養7小時後，分為2份，在I份中，添加過氧化氫達到0.5mM，繼續30分鐘培養。
[0106](2) RNA 的製備
[0107]將2ml用MRS培養基培養得到的培養液添加在2倍量的RNAprotect BacteriaReagent (QIAGEN)中,攪拌後,在室溫孵育(incubate) 5分鐘，使RNA穩定化。以5000 Xg離心10分鐘集菌後，懸浮在200 μ I包含15mg/ml溶菌酶的TE緩衝液中，加入10 μ I的Img/ml的N-乙醯胞壁酸酶SG (生化學工業)，邊時常以旋渦混合器攪拌，邊以室溫孵育10分鐘。添加 700 μ I 的 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)的 Buffer RLT 進行懸浮，以 5000X g 離心 5 分鐘，採集上清液。然後，按照在 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)、RNAprotect BacteriaReagent (QIAGEN)中附帶的實驗程序(protocol)純化。在純化過程中，使用RNase-FreeDNase Set (QIAGEN)進行DNase處理，將混入的DNA分解。
[0108]製備的RNA 使用 2100Bioanalyzer (Agilent)確認品質。
[0109](3)通過實時PCR的基因表達定量解析
[0110]為了對靶基因(⑶S2657基因)的表達量定量，進行了實時PCR。WlygSRNA(total RNA)為模板，使用 PrimeScriptlst strand cDNA Synthesis Kit (TAKARA ΒΙΟINC.)進行逆轉錄反應(30°C 10分鐘、42°C 50分鐘、95°C 5分鐘)，製備cDNA。以稀釋的cDNA溶液為模板，添加SYBR Premix Ex Taq (TAKARA BIO INC.)和引物，使用7500實時PCR系統(Real Time PCR System, Applied Biosystems),在 95°C維持 30 秒鐘後，以 95°C 5 秒鐘、60°C 34秒鐘反應40個循環。另外，基因表達量以16SrRNA為內部標準，進行樣品間的校正。結果用應力樣品表達量相對於非應力樣品表達量的相對值表示。在表1中表示使用的引物。
[0111][表1]
[0112]
【權利要求】
1.一種賦予過氧化氫耐性的基因，其特徵在於: 編碼選自以下的(a)~(C)中的蛋白質， (a):由序列編號2所不的氣基酸序列組成的蛋白質； (b):由在(a)的胺基酸序列中缺失、取代或添加了I個或多個胺基酸的胺基酸序列組成且具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質； (c):由具有與(a)的胺基酸序列85%以上的同一性的胺基酸序列組成且具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質。
2.一種賦予過氧化氫耐性的基因，其特徵在於: 包括選自以下的(d)~(f)中的多核苷酸， (d):由序列編號I所示的鹼基序列組成的多核苷酸； Ce):與由與(d)的鹼基序列互補的鹼基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交、且編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質的多核苷酸； (f):由具有與(d)的鹼基序列85%以上的同一性的鹼基序列組成且編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質的多核苷酸。
3.一種對微生物賦予或強化過氧化氫耐性的方法，其特徵在於: 在該微生物中導入權利要求1或2所述的基因或改變該微生物具有的該基因。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於: 基因的改變為權利要求1或2所述的基因的表達增強。
5.一種微生物，其特徵在於: 導入或改變了權利要求1或2所述的基因。
6.如權利要求5所述的微生物，其特徵在於: 微生物為革蘭氏陽性細菌。
7.如權利要求6所述的微生物，其特徵在於: 革蘭氏陽性細菌為乳桿菌屬細菌。
8.如權利要求7所述的微生物，其特徵在於: 乳桿菌屬細菌為乾酪乳桿菌。
9.一種飲料和/或食品，其特徵在於: 含有權利要求5~8中任一項所述的微生物。
10.一種醫藥品，其特徵在於: 含有權利要求5~8中任一項所述的微生物。
11.一種過氧化氫耐性微生物的篩選方法,其特徵在於: 測定權利要求1或2所述的基因的有無和/或其表達量。
12.—種重組載體，其特徵在於: 包含權利要求2所述的多核苷酸或其一部分。
13.—種宿主微生物,其特徵在於: 包含權利要求12所述的重組載體。
14.一種核酸片段，其特徵在於: 與權利要求2所述的多核苷酸特異性雜交。
15.一種DNA陣列或DNA晶片，其特徵在於:包含權利要求2所述的多核苷酸`或其一部分。
【文檔編號】C12N15/09GK103732742SQ201280011277
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年3月2日 優先權日:2011年3月4日
【發明者】世良田雅紀, 木脅真祐美, 飯野透 申請人:株式會社益力多本社