一種食蟹猴酒精性肝病模型的構建方法與流程
2023-11-09 07:52:18
本發明屬於動物模型的構建方法，具體涉及到一種食蟹猴酒精性肝病模型的構建方法。
背景技術：
隨著我國經濟的高速發展，居民酒精的消費也不斷增加，與飲酒相關的問題也越來越突出。正常人在24小時體內可代謝120g乙醇，但長期、過量地飲酒會超過機體的代謝能力，可導致酒精性肝病。該病的發生主要是乙醇及其代謝物-乙醛的毒性作用造成的，尤其是乙醛對肝細胞的毒性作用最明顯，二者直接或間接導致肝臟的系列病變：肝細胞變性(酒精性脂肪肝)、壞死(肝炎)、纖維化(肝纖維化)，嚴重時可發展為肝硬化、肝癌。
臨床上，酒精性肝病的治療上缺乏有針對性的靶點治療方法，臨床上只能被動的以對症處理為主(用營養支持來防治營養不良和用糖皮質激素來控制炎症)。
因此，建立一種更接近人類酒精性肝病的動物模型，尤其是構建具有酒精性肝臟病變進程的動物模型，利用該動物模型研究其發生機制，進而發現新的治療靶點和藥物，是具有非常重要的醫學基礎理論和臨床應用價值。
公開於該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種酒精性肝病動物模型的構建方法，該方法的特點是在構建動物模型的過程，逐漸實現酒精性肝臟病變的過程(包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性纖維化等)。
本發明所提供的技術方案是：
一種酒精性肝病動物模型的構建方法，包括以下步驟：
(1)選取雄性8-10kg的食蟹猴作為研究對象，除正常餵養基礎飼料外，在第1周適應階段讓其自行飲用含有阿斯巴甜的飲用水，從第2周開始在飲用水中按每周增加10％的酒精讓其自由飲用，到第4周末篩選出每日飲用30％酒精超過50mL的食蟹猴作為試驗動物；
(2)從第5周開始用10％蔗糖代替酒精溶液中的阿斯巴甜，除繼續餵養30％酒精外，在基礎飼料中額外添加20％的豬板油；
(3)酒精性脂肪肝模型的建立：在使用高糖、高脂飼料餵養，30％酒精自由飲用條件下，飼養第12周末①，經B超誘導進行肝臟活檢，肝組織用HE染色，食蟹猴表現明顯的脂肪肝症狀；
(4)酒精性肝炎、肝纖維化模型的建立：在①的基礎上，繼續使用高糖、高脂飼料餵養，30％酒精自由飲用條件，並且腹腔注射四氯化碳溶液，每周2次，每次注射量為0.25mL/kg；第16周末，經B超誘導進行肝臟活檢，肝組織用HE染色，食蟹猴表現明顯的肝細胞膜破裂、浸潤的肝炎症狀；第24周末，經B超誘導進行肝臟活檢，肝組織用HE染色，食蟹猴表現明顯的肝纖維化症狀。
作為優選，步驟(1)中所述的含有阿斯巴甜的飲用水中阿斯巴甜的質量百分比為0.1-1％。
作為優選，所述的含有阿斯巴甜的飲用水中阿斯巴甜的質量百分比為0.5％。
作為優選，步驟(1)中所述的基礎飼料為蛋白質15-20％，碳水化合物50-60％，脂肪5％，粗纖維4-6％，其它9-26％。
作為優選，步驟(4)中所述的高糖、高脂飼料是在基礎飼料基礎上，糖分由3％升至8-10％，脂肪由5％升至20-25％。
作為優選，步驟(4)中所述的四氯化碳溶液為將四氯化碳分散在橄欖油中，其含量為10％v/v。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
(1)本發明的食蟹猴酒精性肝病模型的構建方法時間短，成功率高，可以用於研究酒精性肝病的發生機理，便於篩選治療酒精性肝病的藥物以及評價藥物對該酒精性肝病的藥效，具有良好的應用前景。
(2)動物有厭惡酒精的天性，故在第1周通過甜味劑的引誘，促使食蟹猴能主動攝食乙醇。為了避免部分甜味劑對肝損的保護作用(如蔗糖、葡萄糖等能提供肝線粒體能量，羅漢果甜苷、甜菊苷等能避免肝細胞的損傷)，造模初期優選阿斯巴甜為甜味劑，這樣既能引誘食蟹猴主動攝食酒精，又可避免對肝細胞的保護作用。
(3)酒精性肝病的發生主要是乙醇及其代謝物-乙醛的毒性作用所致，尤其是乙醛對肝細胞的影響是多方面的：影響線粒體對三磷酸腺苷(ATP)的產生、蛋白質的生物合成和排洩受阻、微管損傷，使蛋白、脂肪排洩障礙而在肝細胞內蓄積。而在影響肝細胞的初期，蔗糖、葡萄糖、脂肪、蛋白質等能對抗肝細胞的損失。酒精性脂肪肝模型是在前期通過酒精引起輕度肝損的前提下，加大飼料中糖份、脂肪的比例，從而加重肝臟的負擔，促使脂肪在肝細胞內快速蓄積，形成脂肪肝。
(4)單純酒精+高糖、高脂肪餵養大多數情況下只能誘發脂肪變性，要想達到更嚴重的肝損傷(如肝炎、肝纖維化等)，往往需要第二波打擊，即二次損傷。第二波打擊的方式有很多，包括藥物因素、激素、肝藥酶誘導劑、基因操作和病毒感染等。本發明優選四氯化碳為第二波打擊的手段，因為四氯化碳在肝臟代謝後能快速增強脂質過氧化，引起肝細胞內質網、線粒體、高爾基體甚至細胞膜的變性和壞死，形成肝炎，後期更容易引起肝纖維化。
附圖說明
附圖1為食蟹猴表現明顯的脂肪肝症狀；
附圖2為食蟹猴表現明顯的肝炎症狀；
附圖3為食蟹猴表現明顯的肝纖維化症狀。
具體實施方式
下面結合具體例對本發明作進一步詳細的說明。
一種酒精性肝病動物模型的構建方法，包括以下步驟：
(1)選取雄性8-10kg的食蟹猴作為研究對象，除正常餵養基礎飼料外，在第1周適應階段讓其自行飲用含有阿斯巴甜的飲用水，從第2周開始在飲用水中按每周增加10％的食用乙醇任其自由飲用，到第4周末篩選出每日飲用30％酒精超過50ml的食蟹猴作為試驗動物；所述的含有阿斯巴甜的飲用水中阿斯巴甜的質量百分比為0.1-1％；所述的基礎飼料為蛋白質15-20％，碳水化合物50-60％，脂肪5％，粗纖維4-6％，其它9-26％；
(2)從第5周開始用10％蔗糖代替酒精溶液中的阿斯巴甜，除繼續餵養30％酒精外，在基礎飼料中額外添加20％的豬板油；
(3)酒精性脂肪肝模型的建立：在使用高糖、高脂飼料餵養，30％酒精自由飲用條件下，飼養第12周末①，經B超誘導進行肝臟活檢，肝組織用HE染色，食蟹猴表現明顯的脂肪肝症狀，參見圖1；所述的高糖、高脂飼料是在基礎飼料基礎上，糖分由3％升至8-10％，脂肪由5％升至20-25％；
(4)酒精性肝炎、肝纖維化模型的建立：在①的基礎上，繼續使用高糖、高脂飼料餵養，30％酒精自由飲用條件，並且腹腔注射四氯化碳溶液，每周2次，每次注射量為0.25mL/kg；第16周末，經B超誘導進行肝臟活檢，肝組織用HE染色，食蟹猴表現明顯的肝細胞膜破裂、浸潤的肝炎症狀，參見圖2；第24周末，經B超誘導進行肝臟活檢，肝組織用HE染色，食蟹猴表現明顯的肝纖維化症狀，參見圖3；所述的四氯化碳溶液為將四氯化碳分散在橄欖油中，其含量為10％v/v。
前述對本發明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述並非想將本發明限定為所公開的精確形式，並且很顯然，根據上述教導，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在於解釋本發明的特定原理及其實際應用，從而使得本領域的技術人員能夠實現並利用本發明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發明的範圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。