一種錦鯉皰疹病毒核酸疫苗的製作方法

2023-12-07 05:08:06 1

專利名稱：一種錦鯉皰疹病毒核酸疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種錦鯉皰疹病毒核酸疫苗，屬生物技術領域。
背景技術：
錦趣抱疫病毒病(Kio herpesvirus disease, KHVD)是由錦趣抱疫病毒(Kioherpesvirus, KHV)引起錦鯉、鯉魚及其普通變種如框鏡鯉等發病的一種具有高度傳染性和致死性的疾病。 該病於1998年首次在以色列的Magan Michael地區和美國爆發，2000年該病傳至英國、德國和比利時；2002年4月，印尼發生本病，同時中國廣東省錦鯉疑似發生本病；同年12月我國臺灣省證實錦鯉感染本病；2003年10月日本證實該病已在本國存在。目前，該病在我國的鯉魚養殖中發病較多，造成鯉魚的大量死亡，給鯉魚養殖業帶來了幾乎毀滅般的打擊。儘管有多種傳統疫苗可用於疾病的免疫預防，但在生產實踐中以及我們的試驗研究結果均表明，利用滅活苗來免疫預防錦鯉皰疹病毒病不能起到完全免疫保護作用，同時在我國尚未見有分尚出或研究出KHV弱毒株病毒的報導,因此亟待有該病毒的新型疫苗問世。核酸疫苗(Nucleic acid vaccine)又稱基因疫苗、DNA疫苗，它是利用DNA重組技術將保護性抗原蛋白基因克隆到真核表達載體，並將其直接導入體內，使抗原蛋白內源性表達遞呈給免疫系統，誘發機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫反應。0RF81基因表達主要囊膜蛋白，是KHV囊膜的重要組成部分，可構成病毒主要抗原決定簇；其功能與誘導病毒與細胞融合、病毒對細胞的吸附和穿入以及在細胞核膜出放有關。本專利以0RF81基因為目的基因，pIRES-neo為真核表達載體，構建了 pIRES_0RF81真核表達重組質粒，並研究其免疫效力，研製出高效、新型KHV核酸疫苗。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有良好免疫原性的錦鯉皰疹病毒核酸疫苗。本發明所提供的錦鯉皰疹病毒核酸疫苗，是將0RF81基因克隆到真核表達載體pIRES-neo中得到pIRES_0RF81重組質粒。其中，所述0RF81基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；其對應的胺基酸序列如序列表SEQ ID No. 2所示。本發明利用將編碼錦鯉皰疹病毒的0RF81基因定向克隆到真核表達載體pIRES-neo中，轉化到大腸桿菌DH5 a感受態細胞，提取質粒DNA經限制性核酸內切酶鑑定證實含有正確的0RF81基因。用SDS鹼裂解法大量提取質粒，通過羅氏FuGENE HD轉染試劑將重組質粒導入框鏡鯉尾鰭細胞(MFC)內，收集轉染48小時後的MFC細胞，用ffestern-blot方法檢驗目的基因的蛋白表達情況,證明所構建的真核重組表達質粒成功在MFC細胞中得到了表達。重組表達質粒進行肌肉注射健康鯉魚，每14天免疫一次，共免疫3次，每周心臟採血，利用ELISA方法檢測鯉魚血清中的KHV特異性抗體。用0RF81重組質粒免疫的鯉魚血液中可檢測到KHV的特異性抗體，加強免疫後抗體水平隨免疫次數的增加而增高。採用固定病毒稀釋血清方法，測定0RF81重組質粒免疫後各試驗組鯉魚血清中抗KHV中和效價，0RF81重組質粒免疫組鯉魚血清均產生了明顯的中和抗體。第三次免疫後兩周用IOOTCID5ci的KHV對各組鯉魚胸腔攻毒，免疫後的鯉魚保護率顯著提高。對每組鯉魚進行病理切片，顯示免疫鯉魚大大提高了感染後腮、腎、脾、肝的病理狀況。其中，本發明所用錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)和框鏡鯉尾鰭原代細胞(MFC)均由吉林農業大學動物科技學院實驗室保存提供。本發明的有益效果本發明的錦鯉皰疹病毒核酸疫苗容易生產，在大腸桿菌中可高效克隆；穩定性強，可在大腸桿菌中長期嚴格複製克隆；在魚體內使用安全，由於是真核載體表達保護性抗原所以不會造成病毒擴散；免疫劑量小，所發明的核酸疫苗對鯉魚進行免疫後，載體高效表達，確保了抗原高效持續表達並分泌到胞外，所以免疫劑量極小。本發明的核酸疫苗目前已在鯉魚上進行試驗，取得了非常明顯保護效率。如果用 該疫苗免疫魚，必將大大減少魚患錦鯉皰疹患病機率，保證魚的產量和質量。本發明能使魚建立針對錦鯉皰疹病毒病有效的抗病機制，使養殖戶減少經濟損失。同時減少藥物使用量，從而保證水產品的質量，維護生態穩定性。使用本發明具有重要的經濟效益、社會效益和生態效益。


圖1 :錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)的0RF81基因PCR擴增電泳圖，其中M為DNA分子質量標準，2為0RF81基因PCR產物；圖2 :重組質粒pIRES-0RF81的PCR鑑定結果，其中M為DNA分子質量標準，4為重組質粒PIRES-0RF81的PCR結果，5為陽性對照，6為陰性對照；圖3 :重組質粒pIRES-0RF81的雙酶切分析電泳圖，其中M為DNA分子標準質量，I為pIRES-0RF81的酶切結果；圖4 :含pIRES-0RF81表達載體的MFC細胞表達蛋白的Western-blot分析結果，其中M為蛋白Marker，I為pIRES_0RF81轉染組，2為陰性對照；圖5 :用皰疹病毒KHV靜脈胸腔攻毒後每組鯉魚腮組織的顯微切片(X 100)，其中A為注射PBS組，B為注射pIRES組，C為空白組，D為注射pIRES_0RF81的免疫組；圖6 :用皰疹病毒KHV靜脈胸腔攻毒後每組鯉魚腎臟組織的顯微切片(X 100)，其中A為注射PBS組，B為注射pIRES組，C為空白組，D為注射pIRES_0RF81的免疫組；圖7 :用皰疹病毒KHV靜脈胸腔攻毒後每組鯉魚脾臟組織的顯微切片(X 100)，其中A為注射PBS組，B為注射pIRES組，C為空白組，D為注射pIRES_0RF81的免疫組；圖8 :用皰疹病毒KHV靜脈胸腔攻毒後每組鯉魚肝臟組織的顯微切片(X 100)，其中A為注射PBS組，B為注射pIRES組，C為空白組，D為注射pIRES_0RF81的免疫組；圖9 :真核表達載體pIRES-neo的物理圖譜
具體實施例方式實施例1:0RF81基因的克隆與鑑定1.設計0RF81基因擴增引物
根據GenBank上已登錄的KHV-1株0RF81基因序列，利用軟體Primer Premiers5. 0設計引物，上遊引物為F15 ' -CCCGGGATGGCAGTCACCAAAGCT-3 '，下遊引物為F25' -TCTAGATCACCACATCTTGCCGG-3'，分別引入Sma I和Xba I兩個限制性酶切位點(劃線部位)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。2. 0RF81基因的PCR擴增與鑑定以KHV核酸DNA為模板，對0RF81基因進行PCR擴增。反應體系為Fl，F2(20pmol/U L) 0. 5 u L>10XExBuffer 2. 5 u L> dNTP 2 u L> DNA I u L、ExTaq 酶 0. 25 u L、加滅菌水補足至25iiL。PCR反應條件為:預變性95°C，5min ;變性94°C，40s ;退火59. 3°C，30s ;延伸72°C, Imin0擴增循環數均為35次；最後，反應體系於72°C總延伸lOmin，反應結束後4°C保存。取5 ii L PCR產物，在I X TAE緩衝液中以DL 2000Marker作分子量對照，1%瓊脂 糖凝膠電泳，檢測擴增片段的大小，記錄凝膠成像結果。如圖1所示，經PCR擴增出預期的DNA片段，為771bp，說明成功擴增出0RF81基因。所述0RF81基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所不；其對應的氣基酸序列如序列表SEQ ID No. 2所不。實施例2 pIRES-0RF81重組真核表達質粒的構建與鑑定1. pIRES-neo 質粒的製備取5 ill含pIRES-neo質粒(購自金維克(中國)生物技術中心)DH5 a菌液，加入到5mL含氨苄青黴素的LB液體培養基中，37°C 180r/min震蕩培養過夜。按照分子克隆操作指南(第三版)SDS鹼裂解法小量製備質粒。2. pIRES-neo 質粒的酶切對pIRES-neo質粒進行Sma I和Xba I雙酶切，1. 0%瓊脂糖電泳,參照天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書回收酶切大片。3. 0RF81基因在pIRES-neo質粒中的克隆利用天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒將0RF81的PCR產物進行回收純化，取純化後的基因片段5iil，pIRES-neo質粒雙酶切回收的大片段liil，10倍T4 bufferlu I,T4DNA連接酶I U 1，ddH202 U 1，混均置16°C過夜。將連接產物轉至DH5 a感受態細胞中，獲得陽性克隆菌落，隨機挑取部分陽性菌落，接種在LB液體培基中培養過夜，按照分子克隆操作指南(第三版)SDS鹼裂解法小量製備質粒。5.重組質粒pIRES-0RF81的PCR和酶切鑑定參照上述0RF81的PCR條件，取適量小量製備的重組質粒pIRES_0RF81為模板進行PCR擴增。結果如圖2所示，獲得了長為771bp的片段，與目的基因大小一致。對pIRES-0RF81質粒進行Sma I和Xba I雙酶切，酶切體系如下Sma I和Xba I各 0.5ii 1，10 倍H bufferl u 1，質粒 l,ddH20 6 u I,總體積為 IOu 1，37°0水浴111。1%瓊脂糖凝膠電泳後，凝膠成像系統採集酶切結果。結果如圖3所示，pIRES-0RF81應用Sma I和Xba I雙酶切後出現兩條帶，一條約4419bp，與pIRES用Sma1、Xba I雙酶切後的大片段大小一致，另一條約771bp，與0RF81大小一致，表明0RF81已經成功插入到PIRES載體中。實施例3 :重組質粒pIRES-0RF81在MFC細胞中的表達1.重組質粒的大量提取及純化
將鑑定為陽性的pIRES-0RF81質粒轉化至大腸桿菌DH5 a感受態細胞中，挑取單菌落；接種於5mL含Amp+的LB液體培養液，37°C震蕩培養至對數生長期(0D600 ^ 0. 6);取ImL接種於500mL含Amp的LB液體培養液擴大培養。將上述培養物5000r/min離心lOmin，棄上清，低溫冰櫃放置數小時後，用200ml冰預冷的STE (0. lmol/L NaCl, IOm mo I/LTris-HCl pH8. 0,1m mol/L EDTA)將細菌沉澱重懸，按上述方法離心收集細菌。參照分子克隆操作指南(第三版)SDS鹼裂解法大量製備質粒方法提取質粒，大提與純化方法如下(I)用18ml鹼裂解液I，重懸細菌沉澱(置於漩渦振蕩器上振蕩)；(2)加入新配置的2ml溶菌酶(10mg/ml)；(3)加入40ml新配置的鹼裂解液II，蓋上離心管蓋後輕輕顛倒數次，以徹底混勻，室溫下放置5-10min ；
(4)加入20ml預冷的溶液III，蓋上離心管輕輕混勻後，冰浴IOmin ；(5)在4°C條件下11000r/min離心30min，將上清液移至量筒中，棄去離心管中的沉澱；(6)量取上清液的體積，加入0. 6倍體積的異丙醇後轉移至新的離心管中，充分混勻後，室溫作用IOmin ；(7)室溫下8000r/min離心15min回收核酸沉澱；(8)小心棄上清，將離心管敞開蓋，倒置於潔淨濾紙上除去殘餘的上清，室溫條件下70%乙醇涮洗管底及管壁，倒掉乙醇後將離心管倒置潔淨濾紙上使剩餘的乙醇揮發掉；(9)用3ml TE溶解溼潤的核酸沉澱，然後轉移到15ml離心管中，冰浴冷卻至0°C；(10)加入 3ml 預冰冷的 5mol/L LiCL,混勻後 4°C 10000r/min 離心 IOmin ；(11)將上清轉移至30ml離心管中，加入等量體積異丙醇，混勻後室溫10000r/min離心IOmin ；(12)小心倒掉上清，倒置使液體流幹，70%乙醇洗滌沉澱和管壁，小心倒掉乙醇後在潔淨濾紙上倒置數分鐘使沒有乙醇殘留，但應使沉澱保持溼潤；(13)用500 ill含RNaseA的TE溶解沉澱，轉移至微量離心管，室溫放置30min ；(14)將質粒-RNase混合物用酚氯仿抽提一次後，再用氯仿抽提一次，然後用標準的乙醇沉澱法回收核酸；(15)加入Iml滅菌水將質粒溶解，再加入0. 5ml PEG-MgCl2溶液，室溫放置超過IOmin後，室溫條件下12000r/min離心20min,回收沉澱；(16)用70%乙醇重懸沉澱以除去微量的PEG，12000r/min離心5min，回收沉澱；(17)吸去乙醇,重複上一步操作,然後將離心管置於管架上放置20min,使乙醇完全揮發；(18)用500 ii ITE溶解沉澱質粒，以1:100用TE稀釋後測OD26tl並計算質粒的濃度。按10D26(I=50 ii g質粒/ml計算。(19)分裝後-20°C保存。2.重組質粒的轉染將實驗室保存的框鏡鯉尾鰭細胞(MFC)復甦後培養至對數生長期後接種於6孔板，置於27° C 5%C02細胞培養箱中進行培養，待細胞覆蓋率達80%左右時進行轉染。
使用羅氏FuGENE HD轉染試劑進行轉染，按試劑盒使用說明進行，具體步驟如下先將轉染試劑、質粒和優化培養基溫浴至15_25°C ;將質粒用不含血清M199培養液稀釋至2 u g/100 u L ;然後向混合液中加入轉染試劑5 u L，將轉染試劑直接加入到稀釋後的質粒中，操作時應避免和EP管壁接觸；將轉染體系置於室溫作用20min ;將細胞培養板用無血清的M199培養液洗滌兩次，加入1. 9mL無血清的培養液；將100 U L轉染液滴入細胞中，輕搖細胞板混勻，置於27°C 5%C02細胞培養箱培養5h後倒掉培養液，六孔細胞培養板中每孔加入2mL含10%胎牛血清的M199培養液，27°C 5%C02細胞培養箱培養。收集孵育48h後的細胞備用，同時設PIRES-neo空質粒對照和正常細胞對照。3. ffestern-blot鑑定蛋白的表達收集轉染48小時後的MFC細胞,用Western-blot方法檢驗目的基因的蛋白表達情況。結果如圖4所示，可觀察到約28KD的蛋白條帶，與預期獲得的目的蛋白大小一致；陰性對照均沒有蛋白條帶出現。表明所構建的真核表達重組質粒PIRES-0RF81成功在MFC細 胞中得到了表達。實驗例4 :重組質粒pIRES-0RF81誘導免疫鯉魚及效果檢測實驗前10天，在248尾同一批次健康鯉魚(體長20-30cm，體重200_300g)中隨機選取8尾應用PCR方法檢測沒有感染KHV後，剩餘480尾平均分成6組，每組40尾，在實驗室水族箱中正常條件下餵養。實驗時用丁香油將鯉魚麻醉，待魚停止遊動後迅速對肌肉部位進行核酸疫苗接種，並馬上放回清水中。實驗共分為6個處理組1.未注射組；2.注射生理鹽水(高壓滅菌)；3.注射pIRES-neo空載體組(劑量為IOu g) ；4.注射重組質粒pIRES_0RF81 (劑量為I U g) ；5.注射重組質粒pIRES-0RF81 (劑量為10 u g) ；6.注射重組質粒pIRES_0RF81 (劑量為50 u g)。以上6組鯉魚肌肉注射劑量均為200 iiL，每14天免疫一次，共免疫3次。免疫前採血,第一次免疫至三次免疫後兩周，每周心臟採血。血液於37°C放置lh,4°C放置2h後4500r/min離心15min,收集上層血清。採用鹽析法粗提，重組蛋白A(HiTrap rProteinASepharose)親和層析法精提鯉魚血清中的IgM，將純化的蛋白免疫實驗兔後製得高效價的兔抗魚IgM血清。1. ELISA檢測鯉魚血清中抗體水平包被用包被液將純化的0RF81蛋白按照600ng/mL稀釋，ELISA板每孔包被100iiL，37°C溫箱中作用lh，4°C過夜;洗滌每孔加300 u L PBST洗滌ELISA板，共洗滌3次，每次5min，濾紙上拍打後晾乾；封閉每孔加100 U L 5%脫脂牛奶，37°C溫箱中作用1. 5h ；洗滌同上；加入待測血清每孔加入10 ii L待測血清，37° C溫箱作用1. 5 2h ;洗滌同上；加入酶標二抗將酶標二抗按工作濃度稀釋後，每孔加入100 U L，37°C溫育1. 5 2h ；洗滌同上；
顯色每孔加入底物顯色液100 U I,室溫條件下避光顯色15min,觀察顯色反應；終止每孔加終止液50 ii L，立即用酶標儀測定0D450nm吸光光度值。結果判定當待測血清0D450nm值/陰性對照0D450nm值彡2. 0時，判定為陽性。各實驗組免疫後，每周心臟採血，利用ELISA方法檢測鯉魚血清中的KHV特異性抗體。結果由表I所示,對鯉魚進行免疫後,注射重組質粒的鯉魚血液中均可檢測到KHV的特異性抗體，加強免疫後抗體水平隨免疫次數的增加而增高；對照組沒有檢測到KHV的特異性抗體，與免疫重組質粒組相比抗體水平差異顯著(P 0. 05)；表I鯉魚血清ELISA抗體水平檢測(0D450)
權利要求
1.一種錦鯉皰疹病毒核酸疫苗，其特徵在於，是將0RF81基因克隆到真核表達載體pIRES-neo中得到pIRES_0RF81重組質粒。
2.根據權利要求1所述的錦鯉皰疹病毒核酸疫苗，其特徵在於，所述0RF81基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
3.根據權利要求1所述的錦鯉皰疹病毒核酸疫苗，其特徵在於，所述0RF81基因對應的氣基酸序列如序列表SEQ ID No. 2所不。
全文摘要
本發明公開了一種錦鯉皰疹病毒核酸疫苗，該疫苗具有較好的免疫原性。本發明所提供的錦鯉皰疹病毒病核酸疫苗，是將ORF81基因克隆到真核表達載體pIRES-neo中得到的重組質粒。本發明所提供的錦鯉皰疹病毒核酸疫苗對於鯉魚皰疹具有有效的預防作用。
文檔編號A61K48/00GK102988973SQ201210418808
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月29日 優先權日2012年10月29日
發明者周井祥, 王好, 李新偉, 張東鳴, 朱霞, 祖岫傑 申請人:吉林農業大學