楊樹葉綠體定點轉化方法以及用於該方法的dna序列的製作方法
2023-09-19 02:54:00
專利名稱：楊樹葉綠體定點轉化方法以及用於該方法的dna序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的楊樹轉基因方法，即利用兩段來源於楊樹葉綠體DNA的序列作為同源重組片段，構建葉綠體定點轉化載體，這類載體可將外源基因定點插入楊樹葉綠體基因組的合適位置，並使之在楊樹葉綠體基因組中高效表達。本發明還提供了用於本發明的方法的DNA序列。
在高等植物的細胞中，細胞核、葉綠體和線粒體三種細胞器各含有DNA分子，構成了既獨立又相互聯繫的遺傳體系。自70年代初基因工程技術誕生以來，向細胞核導入外源基因的轉化技術已經普遍地應用於重要農作物遺傳改良與分子生物學機理研究中。幾十年來，外源基因向核基因組中導入一直是植物基因工程的主要研究和應用方向。然而，隨著研究的深入發展，人們逐漸認識到核基因組中的基因工程操作有著如下難以克服的困難1.細胞核基因組龐大，背景複雜；2.導入的外源基因隨機插入核基因組中；3.外源基因表達效率低，且表達不穩定；4.有時外源基因的插入會引起其它性狀的變異，從而影響其經濟價值；5.安全性不好，外源基因易隨花粉擴散等。這些問題嚴重製約著外源基因轉化技術的改進及其在實踐中的應用。
為了克服以上這些缺點，1988年Boynton等人以萊茵衣藻(Chlamydomonas reinbardii)為材料，用基因槍將外源基因導入突變體的葉綠體DNA中，將突變體成功轉化為能進行光合作用的正常萊茵衣藻，首次證實葉綠體轉化的可行性(Boynton等，Science，1988，2401534-1538)。其後，Svab等人(Proc Natl Acad Sci USA，1990，878526-8530)將此技術應用於菸草中，獲得了穩定的葉綠體轉化體，由此建立起高等植物葉綠體轉化新體系。外源基因向葉綠體基因組中轉化，在一定程度上克服了核基因轉化的不足，具有外源基因可定點插入、外源基因表達效率高、變異小、便於遺傳操作、安全性好(母系遺傳，外源基因不隨花粉擴散)等優越性。
但要進行葉綠體遺傳操作必須具備兩個條件一是構建植物葉綠體定點轉化載體；二是最好具有葉片再生的組培基礎。而前者是至關重要的技術環節。要構建合適的葉綠體定點轉化載體，首先須選好定位片段，即與葉綠體基因組的同源片段之間發生重組的片段，從而確定外源基因的插入位點。作為定位片段，一般要求具備下面兩個條件足夠的DNA長度，一般為1-2kb，以保證外源DNA的有效整合(Carrer等，Mol GenGene，1993，24149-56；Svab等，Proc Natl Acad Sci USA，1993，90913-917；Zoubenko等，Nucl Acid Res，1994，223819-3824；McBride等，BioTechnol，1995，13362-365)；合適的插入位點。外源基因的插入要求既不引起原有葉綠體基因組重要序列的丟失，又不至於幹擾臨近基因的正常功能。在菸草的葉綠體轉化研究中的插入位點在大單拷貝區的rbcL/accD(Carrer等，Mol Gen Gene，1993，24149-56；Svab等，ProcNatl Acad Sci USA，1993，90913-917；Kota等，Proc Natl Acad Sci USA，1999，961840-1845)和位於反向重複序列區的16S trnV/rps12(Zoubenko等，Nucl Acid Res，1994，223819-3824)。如果插入位點在反向重複序列區，整合到其中一個重複序列區上的外源基因會通過所謂的拷貝矯正作用使另一個重複序列區也含有外源基因(Maliga，TIBTECH，1993，11101-107)。為了使外源基因整合進葉綠體基因組後能夠高效表達，在構建轉化載體時，一般選用葉綠體來源的強啟動子和終止子。最常用的啟動子是光系統II作用蛋白基因psbA的啟動子和核糖體RNA基因rrn的啟動子，而常用的終止子是psbA基因的終止子，從而保證外源基因在受體植物DNA中的正常表達。此外，轉化載體還須包含適合的抗生素基因，以便對轉化體進行有效篩選。
由於定位片段的確立是以了解葉綠體基因組序列為基礎。目前僅有少數高等植物的葉綠體序列被全部或部分測定，因此高等植物的葉綠體轉化只在菸草(McBride等，BioTechnol，1995，13362-365)、擬南芥(Sikdar等，Plant Cell Rep，1998，1820-24)、水稻(Khan等，Nat Biotechnol，1999，17910-915)和馬鈴薯(Sidorov等，Plant J，1999，19209-216)中開展。
楊樹為楊柳科、楊柳屬木本植物，是重要的速生林樹種，由於其本身具有生長快速、易於繁殖的優點，因此不僅在木材工業生產上有重要用途，而且還廣泛用於防護林的建造及生態環境保護。目前的楊樹基因工程研究和應用均限於核基因組操作，還沒有關於楊樹葉綠體基因組序列及以葉綠體為對象進行遺傳轉化的報導。
本發明的目的是提供一種向楊樹葉綠體中定點轉化外源DNA的方法。
本發明的再一個目的是提供用於本發明的方法的DNA序列。
本發明提供了一種向楊樹葉綠體中定點轉化外源DNA的方法，包括(1)使用SEQ ID NO1所示的序列或其不小於1kb的片段、SEQ ID NO2所示的序列或其不小於1kb的片段和外源基因構建DNA重組片段，外源基因位於SEQ ID NO1或其片段和SEQ ID NO2或其片段的中間；(2)將得到的DNA片段插入一種克隆載體中；(3)使用得到的克隆載體轉化楊樹細胞；(4)將轉化後的楊樹細胞培育成植株。
在本發明的上述方法中，所述的SEQ ID NO1的不小於1kb的片段最好位於其3′端，即包括最3′端的核苷酸序列；SEQ ID NO2的不小於1kb的片段最好位於其5′端，即包括最5′端的核苷酸序列。
本發明所述的外源基因(也稱作目的DNA片段)可以是完整的一個或多個基因，也可以是基因的片段或任何DNA序列片段。
本發明所述的定點插入位置是由轉化載體上的定位片段的序列所決定的。為了保證轉化過程不引起原有葉綠體基因組重要序列的丟失或幹擾臨近基因的正常功能，整合位點應是在葉綠體基因組的非功能區或功能不重要區內。所謂基因組的非功能區是指植物基因組中不具編碼蛋白質、調控基因複製、轉錄、翻譯等一切生化反應功能的核苷酸序列，如基因之間的間隔區、假基因序列區、轉錄間隔區等。而功能不重要區是指植物基因組中的核苷酸序列，它所表達的產物在植物的正常生長發育和生理代謝中不起重要的作用，缺失後不影響植物的正常發育與代謝活動。
本發明中所謂的適合的整合位點是楊樹葉綠體基因組中的rps7基因和ndhB基因之間的間隔區，即SEQ ID NO1(
圖1)的3』端到SEQ ID NO2(圖2)的5』端區域。第一片段有1766個核苷酸，包含3』rps12基因、rps7基因及其邊界序列(圖1)；第二個片段共有1601個核苷酸，包含部分ndhB基因及基因間隔區(圖2)。以此為定位片段構建的楊樹葉綠體定點轉化載體，可將外源DNA插入到rps7基因和ndhB基因之間的間隔區，即楊樹葉綠體基因組中第一片段的3』端至第二片段的5』端之間。這兩個片段的獲得可利用已測序的菸草葉綠體DNA序列設計引物，用PCR的方法從楊樹葉綠體基因組中分離相應的DNA片段。
本發明所述的克隆載體可以是現有技術中已知的任何一種克隆載體，例如SK質粒，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119等。用於葉綠體定點轉化的外源基因是指任意的目的基因，包括用於葉綠體轉化的機理研究、對楊樹進行遺傳改良，乃至以楊樹作為生物反應器生產工業用酶或藥用蛋白等的基因。
用於本發明的本發明中楊樹葉綠體定點轉化載體可以是以綠色螢光蛋白(GFP)基因為外源基因，與抗生素篩選基因原核表達框一起構建為楊樹葉綠體的定點轉化載體。插入位點為rps7基因和ndhB基因之間的間隔區。構建圖如圖3所示。該載體應用的主要目的是建立楊樹高效的葉綠體表達體系，包括轉化方法、獲得同質化轉化體的步驟。
本發明提供的定點轉化載體也可以是以殺蟲蛋白基因Bt cryIA(a)(專利申請號99119236.2)為外源基因而構建的楊樹葉綠體定點轉化載體。插入位點為rps7基因和ndhB基因之間的間隔區。該載體的構建圖如圖4所示。在已建立的楊樹高效葉綠體表達體系的基礎上，應用該載體可獲得抗蟲轉基因楊樹植株。
在載體構建方面，除前述的適合的定位片段、目的基因外，須具備抗生素篩選標記基因，以便於轉化個體的篩選。本發明所使用的抗生素標記基因為壯觀黴素基因。此外，目的基因和抗生素標記基因均須在原核啟動子和終止子驅動的原核表達框內才能在葉綠體中高效表達。因此，本發明所使用的啟動子為來自菸草的核糖體RNA基因rrn的啟動子；終止子為菸草psbA基因的終止子。另外，目的基因編碼序列最好使用原核表達所喜好的翻譯密碼子。在載體的導入方面，常用的基因槍法、微束雷射穿刺法、原生質體融合法均適合於本發明所述的楊樹葉綠體轉化。在葉綠體轉化個體的篩選方面，本發明使用了壯觀黴素篩選標記基因，只要在培養基中加入適當濃度的壯觀黴素便可得到轉化個體。本發明所謂適當的抗生素濃度是指在轉化篩選初期用2.5mg/L，然後逐漸提高為5mg/L、7.5mg/L、10mg/L。在10mg/L條件下獲得轉化個體之後，繼續在該濃度下培養直至轉化苗具4-6片葉片。再逐步降低壯觀黴素濃度至2.5mg/L以獲得健康(具健康的根系和綠色健壯的葉片)的轉化個體。所獲得的T0代轉化個體通過常規的分子生物學手段檢測沒達到純合，即轉化個體中不是所有的葉綠體基因組均具外源基因。本發明中獲得同質化轉化個體的方式為取T0代轉化個體的葉片進行再生培養，使用的培養基仍為抗生素篩選培養基，壯觀黴素濃度同T0代轉化株的篩選。可獲得再生苗，即T1代轉化苗。這樣篩選四代後，便可得到同質化的轉化個體，即轉化個體中所有的葉綠體基因組均具外源目的基因。
本發明還提供了一種用於向楊樹葉綠體中定點轉化外源DNA的DNA序列，它具有SEQ ID NO1所示的序列或其不小於1kb的片斷。
本發明還提供了與上述序列配合使用的用於向楊樹葉綠體中定點轉化外源DNA的DNA序列，它具有SEQ ID NO2所示的序列或其不小於1kb的片斷。
本發明提供了一種全新的楊樹轉化方法，即楊樹葉綠體定點轉化方法。與目前使用的楊樹核基因轉化方法相比，它具有如下的優點外源基因表達效率高，可比核基因轉化的表達效率提高至少10倍，甚至高出40-50倍；外源基因可定點整合，減小了轉化個體及其後代的變異與畸形化機率；安全性好，外源基因不隨花粉隨意擴散等。因此，本發明為楊樹的基因工程遺傳改良提供了全新的機遇。對其它樹種的改良，也具有普遍的參考意義。
4.葉綠體轉化體的獲得在篩選培養基上的葉片組織塊經過約一個月的培養，有的組織塊發黃、萎蔫；有的組織塊從葉緣分化出綠色的芽點。再經過約一個月的培養，綠色的分化芽逐漸長大。這樣的綠苗可用於檢測，首先用紫外燈照射所得到的綠苗，能發出綠色螢光的為轉基因個體，在檢測的25株苗中有17株發出了明顯的螢光。提取這17株發螢光苗的葉綠體DNA進行PCR檢測，證實確為轉基因植株。為了證明GFP基因表達的部位，我們應用雷射共聚焦掃描顯微鏡，對轉基因植株中GFP的表達部位進行亞細胞定位，證明發螢光的主要部位位於葉綠體細胞器中。同時用螢光光度計對轉基因植株中GFP基因的表達蛋白進行定量測定。對經上述檢測的陽性植株的葉綠體DNA進行適當的酶切、轉膜，然後進行Southern雜交，證明外源基因已經整合進楊樹的葉綠體DNA，但均未同質化，即為雜合子。
5.同質化轉化體的獲得取用分子生物學方法證實的轉基因植株的葉片進行再分化，在含壯觀黴素的篩選培養上篩選培養約3個月，獲得再生的綠苗，用上述分子生物學的方法進行各方面的檢測，證明仍未達到同質化。接著再取第二次篩選獲得的轉基因植株(T1代)的葉片進行葉片再生，在篩選培養基上篩選約3個月，獲得再生的綠苗。共篩選了四代，並用上述分子生物學的方法對轉基因植株中的GFP蛋白進行了定性、定位、定量的測定，證明所獲得的T4代轉化體已同質化。
6.楊樹葉綠體轉化體系的建立*轉化方法的建立葉綠體定點轉化載體的導入通常用基因槍的方法，這裡我們建立了適合於楊樹葉綠體基因槍轉化的方法，包括高質量質粒DNA的提取、適合的質粒濃度與微粒子彈的製備、受體材料取材的部位與時期、材料高滲處理的時間與濃度、微粒子彈轟擊時的各技術參數等。
*篩選轉化植株方法的建立從楊樹葉片分化獲得再生苗的組培技術已成熟，我們在此基礎上對其進行了進一步的優化，在較短的時間內可獲得大量健康的分化再生苗。此外，我們對轉基因楊樹的篩選培養，尤其是壯觀黴素的濃度梯度進行了大量的比較研究，建立了有效篩選轉化體的方法。
*獲得同質化個體方法的建立建立了在較短的時間內從T0代轉化個體獲得同質化個體的技術方法，包括組織培養方法和分子生物學的檢測手段。
*外源基因在葉綠體轉化體系中的表達效率的確立首次將GFP基因在不同同質化程度的轉基因個體中的表達位置、表達量進行了定性、定量的測定與比較，揭示了同質化程度與基因表達量之間的關係，確立了楊樹葉綠體轉化體系中外源基因的表達效率。
*葉綠體轉化與核基因轉化的比較我們在進行葉綠體定點轉化的同時，也構建了一套核基因轉化的載體，即其他元件均一樣，只去掉了兩個定位片段。將這兩套載體用同樣的材料、同樣的轉化方法與條件進行轉化，篩選獲得各自的轉化個體，再從分子生物學各方面進行比較，發現用這兩種載體獲得的轉化個體中，GFP基因在拷貝數、整合位點、GFP蛋白在表達位置、表達量方面均有區別，尤其是在表達量上，葉綠體轉化體的表達量是核基因轉化體的10到15倍。揭示外源基因在楊樹核基因組及葉綠體基因組中表達效率和規律。
5.葉綠體轉化體的抗蟲實驗利用不同同質化程度的轉基因楊樹個體(T0，T1，T2，T3，T4，)的葉片飼餵小菜蛾幼蟲，四天後統計幼蟲死亡率，並計算出校正死亡率。[校正死亡率＝(處理的平均死亡率-對照的平均死亡率)/對照的平均存活率×100％]。每個處理重複三次。在轉基因楊樹葉片上飼餵的幼蟲除了死亡外，存活的幼蟲生長很慢、個體較小、體重減輕(見表1)。
表1葉綠體轉化楊樹的抗蟲性分析
此實驗結果表明，楊樹葉綠體轉化植株具有殺蟲和抑制幼蟲生長的特性。且同質化程度越高，抗蟲性越強。
權利要求
1.一種向楊樹葉綠體中定點轉化外源DNA的方法，包括(1)使用SEQ ID NO1所示的序列或其不小於1kb的片段、SEQ IDNO2所示的序列或其不小於1kb的片段和一種外源基因構建重組DNA片段，外源基因位於SEQ ID NO1或其片段和SEQ ID NO2或其片段的中間；(2)將得到的重組DNA片段插入一種克隆載體中獲得楊樹葉綠體基因組定點重組轉化載體；(3)使用得到的轉化載體轉化楊樹細胞；(4)將轉化後的楊樹細胞培育成植株。
2.按照權利要求1所述的方法，其中，所述的SEQ ID NO1的不小於1kb的片段包括其3′端序列。
3.按照權利要求1或2所述的方法，其中，所述的SEQ ID NO2的不小於1kb的片段包括其5′端序列。
4.按照權利要求1所述的方法，其中，所述的外源基因是編碼殺蟲蛋白的基因。
5.一種用於向楊樹葉綠體中定點轉化外源DNA的DNA序列，它具有SEQ ID NO1所示的序列或其不小於1kb的片段。
6.一種用於向楊樹葉綠體中定點轉化外源DNA的DNA序列，它具有SEQ ID NO2所示的序列或其不小於1kb的片段。
全文摘要
本發明提供了一種向楊樹葉綠體中定點轉化外源DNA的方法,包括:使用SEQ ID NO:1所示的序列或其不小於1kb的片段、SEQ ID NO:2所示的序列或其不小於1kb的片段和一種外源基因構建的DNA重組片段,外源基因位於SEQ IDNO:1或其片段和SEQ ID NO:2或其片段的中間;將得到的DNA重組片段插入一種克隆載體中,獲得楊樹葉綠體基因組定點重組轉化載體;使用得到的載體轉化楊樹細胞;將轉化後的楊樹細胞培育成植株。本發明還提供了用於該方法的DNA序列。
文檔編號C12N15/11GK1380417SQ01110539
公開日2002年11月20日 申請日期2001年4月10日 優先權日2001年4月10日
發明者周奕華, 張麗華, 陳正華, 石東喬, 侯丙凱, 胡贊民 申請人:中國科學院遺傳研究所