不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法

2023-11-06 11:55:07

不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法
【專利摘要】本發明屬於分子生物學領域，具體涉及一種不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法。該不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法包括以下步驟：a、引物設計和合成；分別設計和合成兩對引物，第一對為目的基因正向引物IF和目的基因反向引物IR，第二對為載體正向引物VF和載體反向引物VR;b、進行PCR，分別獲得線性目的基因和線性目的載體DNA;c、將兩次PCR產物混合放置，使線性目的基因和線性目的載體DNA自發連接成環狀，得到含有目的基因的載體。本發明不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法與傳統的分子克隆技術相比較，具有1?速、1?效、低成本，隨機誤差低等-優點。具有廣闊的應用前景。
【專利說明】不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於分子生物學領域，具體涉及一種不依賴生物工程酶的快速分子克隆方 法。

【背景技術】
[0002] 繼人類全基因組測序圖譜完成後，多個物種的全基因組序列圖譜亦被相繼完成。 基因序列的一級結構彳目息，為人類探索單個基因及相關蛋白結構、功能提供了彳目息基礎。由 此，人類進入了後基因組研究時代。然而，面對海量的基因序列信息，傳統分子克隆技術效 率低下，成本耗費過高，隨機誤差較大，已經不能滿足科研需求，分子克隆技術的瓶頸限制 了對各物種基因的全面深入的分析和研究。隨著更多物種的全基因組測序工作的完成，以 及更多新物種的發現，後基因組研究迫切需要出現一種全新的高通量分子克隆技術。
[0003] 在傳統的分子克隆方法的基礎之上，出現了很多新的基因克隆方法，其中包括使 用同源重組序列、特異性連接頭、快速連接酶等新技術。但所有這些新方法的建立，都需要 使用相應的生物工程酶，如各類重組酶、T4連接酶、限制性內切酶等。這些生物工程酶的使 用，增加了實驗流程的複雜性性，同時也加大了實驗成本。為了解決分子克隆實驗流程復 雜，費用高，質量控制難度大等瓶頸問題，本領域需要在分子克隆的方法學上有新的突破。


【發明內容】

[0004] 本發明要解決的技術問題是本領域分子克隆需採用多種生物工程酶，導致實驗流 程複雜，費用高的問題。
[0005] 本發明解決上述技術問題的技術方案是提供一種不依賴生物工程酶的快速分子 克隆方法。
[0006] 該不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法包括以下步驟：
[0007] a、引物設計和合成；分別設計和合成兩對引物，第一對為目的基因正向引物IF和 目的基因反向引物IR，第二對為載體正向引物VF和載體反向引物VR ;
[0008] b、進行PCR，分別獲得線性目的基因和線性目的載體DNA ;
[0009] C、將兩次PCR產物混合放置，使線性目的基因和線性目的載體DNA自發連接成環 狀，得到含有目的基因的載體。
[0010] 進一步的，上述方法還包括步驟d :以步驟C所得產物轉化細菌。
[0011] 更進一步的，上述方法還包括步驟e :挑選單克隆菌落提取質粒，進行PCR驗證及 測序鑑定，得到含有目的基因的重組載體。
[0012] 其中，上述方法步驟a所述目的基因正向引物IF和目的基因反向引物IR中，目 的基因正向引物IF含有Overlap Il引物和12引物兩部分，Overlap Il引物部分的序列 與目的載體插入位置的5'端的12-21個鹼基的序列相同，12引物部分的序列與目的基因 5'端10-30個鹼基的序列相同；IR同樣含有兩個部分，分別為Overlap 13引物和14引物， Overlap 13引物的序列與載體插入位置3'端序列12-21個鹼基序列反向互補，14與目的 基因3'端10-30個鹼基的序列反向互補，其中Il與13鹼基數量相等，鹼基數量12-21個 均可。
[0013] 優選的，上述方法步驟a所述目的基因正向引物IF的12引物部分的序列與目的 基因5'端的如20個喊基的序列相同；目的基因反向引物IR 14與目的基因3'端的最後20 個鹼基的序列反向互補。
[0014] 其中，上述方法步驟a所述載體正向引物VF和載體反向引物VR是以載體的5 '至 3'方向為參考，VF與載體待插入位置3'端的24-30個鹼基序列相同，VR與載體待插入位 置5'端24-30個鹼基序列反向互補。
[0015] 本發明的兩對引物設計的方法可參見示意圖10。
[0016] 其中，上述方法中的細菌為大腸桿菌。優選為DMT感受態大腸桿菌。
[0017] 其中，上述方法步驟C所述的混合放置為在室溫下進行，時間為30?90分鐘。進 一步的，所述的混合放置的時間30?60分鐘。
[0018] 其中，上述方法中所述的載體為質粒。
[0019] 本發明不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法與傳統的分子克隆技術相比較，具 有高速、高效、低成本，隨機誤差低等優點。與目前已有的快速克隆方法相比具有更明顯的 優勢，即在整個實驗流程中，無需使用任何限制性內切酶，連接酶、重組酶體系等工程酶，僅 需使用DNA聚合酶。尤為可貴的是該技術連接頭設計方法獨特，不受商業載體中限制性酶 切位點的限制，可以將基因插入到質粒任何位置，可以大大擴展分子克隆使用的載體的種 類，可對載體進行任何改造
[0020] 此外本發明方法的過程極為簡便，將過去一個熟練技術人員需要三到四天的工 作，縮短到2天內完成，工作時間縮短了 30%?50%。實驗成本耗費降低可達50%，成功效 率達到90%。具有廣闊的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1、反應序號A =EcoI-C domain，兩次PCR，獲得線性目的基因和線性目的載體。
[0022] 圖2、挑取反應序號A所得的載體轉化大腸桿菌DMT得到的單克隆菌落提取質粒， PCR鑑定；plasimidl為質粒提取結果，PCR of plasimidl為該質粒PCR驗證結果。
[0023] 圖3、反應序號B :Pcl09,分別兩次PCR得到的線性目的基因和線性目的載體
[0024] 圖4、挑取反應序號B所得的載體轉化單克隆菌落提取質粒，PCR鑑定；plasimidl 為質粒提取結果，PCR of plasimidl為該質粒PCR驗證結果。
[0025] 圖5、反應序號C :BCRP1，兩次PCR分別獲得的目的基因和線性目的載體。
[0026] 圖6、挑取反應序號C中連接頭為18bp和21bp所得的載體轉化大腸桿菌DMT得到 的單克隆菌落提取質粒，PCR鑑定，BCRP118和BCRP121PCR驗證結果分別為連接頭為18bp 和21bp時的驗證結果，可以看到連接頭為18bp時陽性克隆率達75%，連接頭為21bp時陽 性克隆率可達100%。
[0027] 圖7、挑取反應序號C中連接頭為12bp所得的載體轉化大腸桿菌DMT得到的單克 隆菌落提取質粒，PCR鑑定，plasimidl為質粒提取結果，PCR of plasimidl為該質粒PCR 驗證結果。
[0028] 圖8、挑取反應序號C中連接頭為15bp所得的載體轉化大腸桿菌DMT得到的單克 隆菌落提取質粒，PCR鑑定，plasimidl為質粒提取結果，PCR of plasimidl為該質粒PCR 驗證結果。
[0029] 圖9、DMT感受態細胞與DH5 α感受態細胞的比較實驗結果，DH5 α感受態細胞必 須和DpnI配合使用。
[0030] 圖10、引物設計原理示意圖。
[0031] 圖11、孵育連接原理示意圖。

【具體實施方式】
[0032] 本發明方法具體而言可按以下方式實現：
[0033] a、引物設計和合成；分別設計和合成兩對引物，第一對為目的基因正向引物IF和 目的基因反向引物IR，第二對為載體正向引物VF和載體反向引物VR ;
[0034] b、進行PCR，分別獲得線性目的基因和線性目的載體DNA ;
[0035] c、將兩次PCR產物混合放置，使線性目的基因和線性目的載體DNA自發連接成環 狀，得到含有目的基因的載體。
[0036] 進一步的，根據克隆工作的要求，本發明方法可以包括步驟d或e。d :以步驟c所 得產物轉化細菌。e :挑選單克隆菌落提取質粒，進行PCR驗證及測序鑑定，得到含有目的基 因的重組載體。
[0037] 本發明方法的關鍵之處在於步驟a。本發明的兩對引物設計的方法和工作原理可 參見圖10和圖11。
[0038] 具體而言，步驟a所述目的基因正向引物IF和目的基因反向引物IR中，目的基因 正向引物IF含有Overlap Il引物和12引物兩部分，Overlap Il引物部分的序列與目的載 體插入位置的5'端的12-21個鹼基的序列相同，12引物部分的序列與目的基因5'端10-30 個鹼基的序列相同；IR同樣含有兩個部分，分別為Overlap 13引物和14引物，Overlap 13 引物的序列與載體插入位置3'端序列12-21個鹼基序列反向互補，14與目的基因3'端 10-30個鹼基的序列反向互補，其中Il與13鹼基數量相等，鹼基數量12-21個均可。
[0039] 優選的，上述方法步驟a所述目的基因正向引物IF的12引物部分的序列與目的 基因5'端的如20個喊基的序列相同；目的基因反向引物IR 14與目的基因3'端的最後20 個鹼基的序列反向互補。
[0040] 具體而言，上述方法步驟a所述載體正向引物VF和載體反向引物VR是以載體的 5'至3'方向為參考，VF與載體待插入位置3'端的24-30個鹼基序列相同，VR與載體待插 入位置5'端24-30個鹼基序列反向互補。
[0041] 其中，上述方法步驟b是分別進行兩次PCR。分別是將目的基因正向引物IF和目 的基因反向引物IR與目的基因的模板進行PCR擴增得到線性的目的基因；載體正向引物 VF和載體反向引物VR和線性化的載體模板進行PCR擴增得到線性化的目的載體DNA。顯 然，線性化的載體模板是和載體正向引物VF和載體反向引物VR相匹配的。
[0042] 其中，上述方法中的細菌為大腸桿菌。優選為DMT感受態大腸桿菌。
[0043] 其中，上述方法步驟C所述的混合放置為在室溫下進行，時間為30?90分鐘。進 一步的，所述的混合放置的時間30?60分鐘。
[0044] 其中，上述方法中所述的載體為質粒。
[0045] 使用本發明涉及的引物對進行PCR反應，Overlap Il和Overlap 13分別會與目的 載體形成自發的連接，組裝成為環狀。這就避免了傳統克隆方法中連接酶的使用。Overlap 均由PCR反應中引物設計產生，這也就避免了傳統克隆方法中限制性內切酶的使用，同時 也避免了酶切反應後的凝膠中線性載體的回收。這樣，也不會商業載體中限制性酶切位點 的限制，可以將基因插入到質粒任何位置。
[0046] 為了驗證本發明方法適用於各種長度和鹼基組成情況不同的目的基因，以及適用 不同類型載體，進行了一系列的驗證試驗。
[0047] 實施例一使用本發明方法進行分子克隆
[0048] 本實施例中使用的引物序列見表1，各目的基因信息見表2。使用的載體分別有質 粒載體：PET28a，pTEV。各種試劑和載體均為常規市售。PrimeSTAR? 1 HS DNA Polymerase和 DpnI限制性內切酶均來自寶生物工程（大連）有限公司，DMT感受態細胞為Transgen DMT Chemically Competent Cell。
[0049] 表1.實施例一使用的各種引物序列
[0050]

【權利要求】
1. 不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法，其特徵在於包括以下步驟： a、 引物設計和合成；分別設計和合成兩對引物，第一對為目的基因正向引物IF和目的 基因反向引物IR，第二對為載體正向引物VF和載體反向引物VR ; b、 進行PCR，分別獲得線性目的基因和線性目的載體DNA ; c、 將兩次PCR產物混合放置，使線性目的基因和線性目的載體DNA自發連接成環狀，得 到含有目的基因的載體。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於還包括步驟d :以步驟c所得產物轉化細 菌。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於還包括步驟e :挑選單克隆菌落提取質粒， 進行PCR驗證及測序鑑定，得到含有目的基因的載體的轉化細菌。
4. 根據權利要求1?3任一項所述的方法，其特徵在於步驟a所述目的基因正向引物 IF和目的基因反向引物IR中，目的基因正向引物IF含有Overlap Il引物和12引物兩部 分，Overlap Il引物部分的序列與目的載體插入位置的5'端的12-21個鹼基的序列相同， 12引物部分的序列與目的基因5'端10-30個鹼基的序列相同；IR同樣含有兩個部分，分別 為Overlap 13引物和14引物，Overlap 13引物的序列與載體插入位置3'端序列12-21個 鹼基序列反向互補，14與目的基因3'端10-30個鹼基的序列反向互補。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於：步驟a所述目的基因正向引物IF的12引 物部分的序列與目的基因5'端20個鹼基的序列相同；目的基因反向引物IR 14與目的基 因3'端20個鹼基的序列反向互補。
6. 根據權利要求1?5任一項所述的方法，其特徵在於所述載體正向引物VF和載體反 向引物VR是以載體的5'至3'方向為參考，VF與載體待插入位置3'端24-30個鹼基序列 相同，VR與載體待插入位置5'端24-30個鹼基序列反向互補。
7. 根據權利要求1?6任一項所述的方法，其特徵在於所述細菌為大腸桿菌。
8. 根據權利要求1?7任一項所述的方法，其特徵在於所述大腸桿菌為DMT感受態大 腸桿菌。
9. 根據權利要求1?8任一項所述的方法，其特徵在於所述的步驟C的混合放置為在 室溫下進行，時間為30?90分鐘。
10. 根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述的混合放置的時間30?60分鐘。
11. 根據權利要求1?10任一項所述的方法，其特徵在於所述的目的載體為質粒。
【文檔編號】C12N15/66GK104212827SQ201410475782
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年2月18日
【發明者】蘇丹, 陳義平, 周明, 曹磊, 李輝豔, 蘇小茗 申請人:四川大學