一種快速製備糖肽的方法
2023-11-06 12:37:57
專利名稱：一種快速製備糖肽的方法
技術領域：
本發明屬於食品領域，涉及蛋白改性以及製備糖肽的方法，特別涉及一種多肽糖基化接枝的方法。
背景技術：
大部分天然蛋白質都帶有共價鍵相連的多糖側鏈，糖蛋白以各種形式廣泛存在於動植物和某些微生物中，它在生物體中起著很關鍵的作用，諸如細胞信號識別、生長調控、 細胞間的信息傳達，及免疫調節等多種生理功能。因此，糖蛋白引起了人們的廣泛關注。但分離純化糖蛋白很困難，靠基因工程技術製備也很受限制，所以在生化，免疫細胞生物學及醫學研究中必須通過化學合成糖蛋白的部分結構——糖肽來作為模型分子，以供活性和構效關係研究，糖肽合成也就應運而生。除此之外，糖肽具有明顯的抗腫瘤、鎮痛、免疫調節、 抗缺氧、促進多種細胞因子、抗B肝病毒的產生和改善某些老年性疾病症狀等作用。由於肽鏈較短，糖肽比糖蛋白有更優越的乳化性質，乳化穩定性更好，可用作乳化劑、穩定劑等。另外，作為一種生理活性肽，糖肽引起了國內外研究者的廣泛關注。近幾年生命科學家強烈建議把「大分子擁擠」環境與pH、離子強度和溶液組成等因素一樣用於研究生物大分子，加入擁擠物質逐漸成為一種研究大分子的途徑，從而加深對分子間相互作用的了解。採用「大分子擁擠環境」作為溫和的反應體系，將生命科學領域的擁擠理論應用於糖基化接枝反應中，當體系中存在高濃度的生物大分子時，大分子之間的反應遵循分子排斥容積理論，反應向溶質總體積減小的方向移動，即朝結合方向移動。大分子擁擠環境能夠使蛋白分子在水溶液中同樣處於非聚集或者較少聚集的反應狀態，同時，促進蛋白質與多糖的反應向著共價結合的方向進行，所得產物具有優越的功能性，有良好的工業應用前景。作為一種新的有效的方法，解決了傳統方法的弊端(申請號 201010237456. 1)。比如乾熱法，乾熱處理前原料水分含量應較低，需要乾燥，而且在反應過程中需要保持恆定的溫度和溼度，通常是在60°C反應1 3周，實驗條件不容易控制，固相反應中反應物接觸不均勻，反應不充分，產物通常帶有淺黃或淺棕的顏色。
發明內容
本發明的目的是提供一種多肽糖基化接枝方法。本發明模擬生命科學領域的大分子擁擠體系，體系中的擁擠試劑可以是惰性高聚物或葡聚糖。該法具有操作方便、反應時間短、所得糖肽功能性優越等優點，克服了現有蛋白質糖基化接枝改性方法難以實現工業化的缺陷，產品在食品工業中具有規模化的應用前景。本發明的目的通過下述技術方案實現一種快速製備糖肽的方法，包括如下步驟(1)將蛋白酶解成多肽，反應結束後滅酶、離心、取上清液乾燥；(2)模擬生命科學領域的大分子擁擠體系，將擁擠試劑置於反應裝置中，加入緩衝溶液，使之充分溶解；
(3)將多糖和步驟(1)得到的多肽加入步驟O)的溶液中，充分攪拌池後，加入 0. 02% w/w的NaN3防腐，5°C靜置過夜後，50_70°C攪拌l_8h，反應結束後迅速冷卻至低於 25°C，若擁擠試劑為聚蔗糖70、聚乙二醇2000，則還要除去擁擠試劑；(4)最後離心、取上清液乾燥，得到糖肽產品。優選地，所述多肽與擁擠試劑的質量比為1 1 1 8，多肽與多糖的質量比為 1 0. 5 1 4。優選地，步驟(1)所述蛋白為大豆分離蛋白、脫脂大豆粉、大豆濃縮蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麥麵筋蛋白。優選地，步驟(1)所述酶為酸性蛋白酶、複合蛋白酶或中性蛋白酶，所述酸性蛋白酶優選胃蛋白酶，酶解程度控制在水解度DH < 2.0。優選地，所述酶解程度控制是將蛋白配製成質量分數為10%的溶液，加熱至37 55°C，加入酶，酶解30min，其中，酶與蛋白的質量比為1 100。所述擁擠試劑為高分子惰性聚合物，優選聚蔗糖70、聚乙二醇2000或葡聚糖。優選地，所述多糖為葡聚糖、半乳甘露聚糖、卡拉膠和可溶性澱粉中的一種或者一種以上。優選地，所述反應裝置為帶恆溫加熱攪拌裝置的密閉容器。優選地，所述緩衝溶液是pH5. 5 7. 5的磷酸鹽緩衝液。上述方法製備的糖肽應用於營養品、抗氧化劑、乳化劑或穩定劑等食品添加劑行業。在食品工業中，高效率是一個重要的因素，縮短反應時間可以更好的促進反應的進行，提高生產效率。蛋白質分子中加入酶製劑可以打開肽鏈促進接枝反應的進行，從而大大縮短反應時間。採用蛋白酶水解蛋白，能夠有效地打開蛋白大分子的三級空間結構，同時將蛋白的長肽鏈切斷成中長鏈，使更多的氨基基團暴露出來，通過酶解蛋白再進行糖基化接枝，此時的產物是糖肽。相對於球蛋白來說，更多的肽鏈上氨基基團與多糖的還原性羰基末端結合，使蛋白與多糖的Maillard反應共價結合更為有效的進行，縮短了反應時間，所得糖肽比糖蛋白複合物的功能性更加優越。糖肽同時具有促進能量代謝，減肥，抗疲勞，增強肌肉爆發力、促進雙歧桿菌繁殖、降膽固醇、抗過氧化、降血壓、免疫調節等生理活性功效。本發明利用蛋白適度酶解成多肽，再利用生命科學領域中大分子擁擠環境作為反應介質，添加擁擠試劑，使多肽和多糖發生Maillard反應，得到具有優越的功能性的糖肽共價結合物，該發明反應時間短，操作方便。通過接枝改性，共價鍵合的蛋白質-多糖複合物既保留了蛋白質的表面活性又具有多糖的親水性能，與以次級力結合的蛋白質-多糖體系相比，對於環境條件具有較高的適應性，其結合不受熱或PH值的影響。就乳化性能而言，這種複合物具有優越的乳化性質，因此在反應過程中選用乳化活性作為檢測指標。乳狀液中粒度分布是影響乳狀液穩定性的關鍵因素，也是評價樣品乳化性的重要指標，乳狀液粒子越大，乳析的速率越快，乳化活性越差。乳化活性採用D[4』來表徵，D[4』越小，粒徑越小，乳化活性越強，反之亦然。本發明利用蛋白適度酶解成多肽，後採用「大分子擁擠環境」作為生成糖基化蛋白的反應體系，使多肽與多糖的反應向著共價結合的方向進行，得到功能性糖肽結合物。作為功能性糖肽的新的有效的製備方法，具有如下的優點
(1)在本發明中，先將蛋白進行適度酶解，自由氨基暴露，特別是芳香族胺基酸暴露，加快了與多糖接枝反應的進程，提高了效率；(2)該發明在水溶液中攪拌加熱，克服了乾熱反應中反應不均勻的缺點，不可控制的現象，最大程度地讓多糖和多肽充分接觸；(3)與其他接枝改性方法相比，本發明具有規模化的應用前景，工業可操作性強。
具體實施例方式實施例1將大豆蛋白配製成質量分數為10%的溶液，加熱至37°C，加入胃蛋白酶(酶蛋白質量=1 100)，酶解30min後，加熱到100°C保溫:3min滅酶，離心(5000rpm, 20min), 取上清液凍幹，此為大豆多肽。將1. Og葡聚糖作為擁擠試劑置於密閉容器中，加入IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸鈉緩衝溶液，攪拌2h，使之充分溶解，將0. 5g大豆多肽和1. Og葡聚糖加入該含有擁擠試劑的溶液中，充分攪拌池後，加入2滴NaN3 (0. 02% w/w)防腐，5°C 靜置過夜後，60°C攪拌4h，反應結束後迅速冷卻至25°C終止反應，離心(8000rpm，20min)， 上清液冷凍乾燥，得到糖肽產品。取上述糖肽產品製備乳液，分別靜置Id和30d後，採用Mastersizer 2000粒度分布儀測定體積平均粒徑D[4』的大小，結果見表1。對比實施例1將大豆蛋白配製成質量分數為10%的溶液，加熱到37°C，加入胃蛋白酶(酶蛋白質量=1 100)，酶解30min,後加熱到100°C保溫3min滅酶，離心(5000rpm, 20min)，取上清液凍幹，此為大豆多肽。準確稱取0. 5g多肽，溶解於IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸鈉緩衝溶液，容器密閉，室溫攪拌後，加入2滴NaN3 (0. 02% w/w)防腐，置於5°C過夜後， 恆溫60°C攪拌4h。反應結束後，迅速冷卻至25°C終止反應，離心(8000rpm，20min)，上清液冷凍乾燥。取上述糖肽產品製備乳液，分別靜置Id和30d後，採用Mastersizer 2000粒度分布儀測定體積平均粒徑d[4』的大小，結果見表1。表1實施例1和對比實施例1結合物的性能對比
權利要求
1.一種快速製備糖肽的方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)將蛋白酶解成多肽，反應結束後滅酶、離心、取上清液乾燥；(2)將擁擠試劑置於反應裝置中，加入緩衝溶液，使之充分溶解；(3)將多糖和步驟(1)得到的多肽加入步驟( 的溶液中，充分攪拌池後，加入0.02% w/w的NaN3防腐，5°C靜置過夜後，50-70°C攪拌l_8h，反應結束後迅速冷卻至低於25°C，若擁擠試劑為聚蔗糖70、聚乙二醇2000，則還要除去擁擠試劑；(4)最後離心、取上清液乾燥，得到糖肽產品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述多肽與擁擠試劑的質量比為1 1 1 8，多肽與多糖的質量比為1 0. 5 1 4。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述擁擠試劑為聚蔗糖70、聚乙二醇 2000或葡聚糖。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟(1)所述蛋白為大豆分離蛋白、脫脂大豆粉、大豆濃縮蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麥麵筋蛋白；所述酶為酸性蛋白酶、複合蛋白酶或中性蛋白酶，酶解程度控制在水解度DH ^ 2. 0。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述酶解程度控制是將蛋白配製成質量分數為10 %的溶液，加熱至37 55°C，加入酶，酶解30min，其中，酶與蛋白的質量比為 1 100。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述多糖為葡聚糖、半乳甘露聚糖、卡拉膠和可溶性澱粉中的一種或者一種以上。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述反應裝置為帶恆溫加熱攪拌裝置的密閉容器。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述緩衝溶液是pH5.5 7. 5的磷酸鹽緩衝液。
9.一種快速製備的糖肽，其特徵在於，該糖肽是由權利要求1 8任一項所述方法製備的。
10.權利要求9所述的糖肽應用於營養品、抗氧化劑、乳化劑或穩定劑中。
全文摘要
本發明公開了一種快速製備糖肽的方法，包括如下步驟(1)將蛋白酶解成多肽，反應結束後滅酶、離心、取上清液乾燥；(2)將擁擠試劑置於反應裝置中，加入緩衝溶液，使之充分溶解；(3)將多糖和步驟(1)得到的多肽加入步驟(2)的溶液中，充分攪拌2h後，加入0.02％w/w的NaN3防腐，5℃靜置過夜後，50-70℃攪拌1-8h，反應結束後迅速冷卻至低於25℃，若擁擠試劑為聚蔗糖70、聚乙二醇2000，則還要除去擁擠試劑；(4)最後離心、取上清液乾燥，得到糖肽產品。本發明操作方便，反應時間短，反應效率高，所得產物——糖肽具有優越的功能性，產品在食品工業中有廣泛的應用前景。
文檔編號C08B37/00GK102308904SQ20111020343
公開日2012年1月11日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者卓秀英, 楊曉泉, 齊軍茹 申請人:華南理工大學