從小牛血中提取刺激細胞呼吸活性物質的方法
2023-11-06 06:06:52
專利名稱：從小牛血中提取刺激細胞呼吸活性物質的方法
技術領域：
本發明涉及一種從血液中提取具有促進細胞對氧和葡萄糖的攝取和利用作用的血液提取物的方法，尤其涉及採用超濾等生物技術從小牛血中提取刺激細胞呼吸活性物質的方法。
背景技術：
小牛血去蛋白提取物是以小牛血液為原料，製備的小分子(分子量＜6000)肽、核苷酸和寡糖類物質。其主要藥理作用是促進細胞對氧和葡萄糖的攝取和利用，使葡萄糖的無氧代謝轉向有氧代謝，促使能量物質生成增多，延長細胞生存時間，促進組織細胞代謝及功能恢復和組織修復。
我國衛生部1992年批准進口奧地利HAFSLUND NYCOMED藥廠的Actovegin注射劑及片劑在臨床上使用，臨床療效肯定，國產該品種的注射劑型已獲得生產批文。
中國專利(專利號為96120777.9)公開了一種提取小牛血去蛋白提取物的方法，此方法採用乙醇為溶媒去蛋白，然後去除溶媒，這種方法使提取的物質的活性損失，並且還存在處理量低、生產周期長、產量和收率低等問題。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種從小牛血中提取刺激細胞呼吸活性物質的方法，該方法解決了目前技術存在的處理量低、生產周期長、產量和收率低，並且活性損失較高的問題。
為了解決上述技術問題本發明是這樣實現的
一種從小牛血中提取刺激細胞呼吸活性物質的方法，它包括下述步驟1).取非傳染區的、經檢驗合格的健康小牛，採用無菌動脈方法採血，在採集過程中，不斷用表面消毒過的棒狀器具進行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的棒狀器具上，除去纖維蛋白，以避免出現凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-30℃～40℃下反覆凍融，於低溫(0～8℃)條件下膠體磨中反覆勻漿，顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液；3).將勻漿液經過濾、不同截留分子量超濾膜分級超濾，超濾後最終截留分子量＜6000D，得小牛血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經低溫減壓濃縮並病毒滅活後得小牛血去蛋白提取物。
所述的一種從小牛血中提取刺激細胞呼吸活性物質的方法，其特徵在於它包括下述步驟1).取非傳染區的、經檢驗合格的、出生6個月以內的健康小牛，採用無菌動脈方法採血，在採集過程中，不斷用表面消毒過的器具，器具為木棒進行攪拌，使纖維蛋白吸附在木棒上，除去纖維蛋白以避免出現凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-30℃～40℃下反覆凍融二-四次，於0--8℃下膠體磨中勻漿2分鐘，重複三次，在顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液；3).取勻漿液離心後，棄沉澱；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；取濾液A，用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量8000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，經低溫減壓濃縮5-8倍得濃縮液；將濃縮液病毒在55-65℃下滅活10小時；滅活後的濃縮液用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾後的濃縮液；將檢驗合格的超濾後的濃縮液分裝於一次性使用塑料輸液袋中，低溫(-18℃±2℃)貯存，即得小牛血去蛋白提取物。
本發明的優點和效果如下採用生物技術及分級超濾手段，在本產品的製造工藝中，首次採用分級超濾手段。超濾膜分離技術作為二十一世紀六大高新技術之一，以其常溫低壓下操作、無相變、能耗低等顯著特點已成為一種分離過程的標準，在歐美等發達國家和地區得到了廣泛的使用，超濾膜的分離過程具有以下幾個顯著特點1)在常溫和低壓下進行分離，因而能耗低，從而使設備的運行費用低；2)設備體積小、結構簡單，故投資費用低；3)超濾分離過程只是簡單的加壓輸送液體，工藝流程簡單，易於操作管理；4)超濾膜是由高分子材料製成的均勻連續體，純物理方法過濾，物質在分離過程中不發生質的變化，並且在使用過程中不會有任何雜質脫落，保證超濾液的純淨。
採用分級超濾技術手段，使本品活性物質活性狀態保持好，不經過除溶媒過程，提高質量，提高收率；可進行工業規模化生產，生產周期短、成本降低。
傳統技術提取工藝 本發明提取工藝處 理 量 25萬ml 50萬ml生產周期 7天 4天產量 2.5萬ml 10萬ml活性 QO2＝4.0～4.4μlO2/mg·h QO2＝4.2～4.8μlO2/mg·hSI＝2.5～2.8 SI＝2.7～3.0收率 10％ 20％
具體實施例方式
實施例一1).取非傳染區的、經檢驗合格的出生5個月的健康小牛，採用無菌動脈方法採血，在採集過程中，不斷用表面消毒過的木棒進行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的木棒上，除去纖維蛋白，以避免出現凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-20℃冷凍，30℃下融化，反覆三次，於低溫0--5℃條件下膠體磨中反覆勻漿，顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液；3).將勻漿液經過濾、不同截留分子量的超濾膜分級超濾，超濾後最終截留分子量＜6000D，得小牛血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經低溫減壓濃縮並病毒滅活後得小牛血去蛋白提取物。
實施例二1).取非傳染區的、經檢驗合格的出生6個月的健康小牛，採用無菌動脈方法採血，在採集過程中，不斷用表面消毒過的木棒進行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的木棒上，除去纖維蛋白，以避免出現凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-20℃冷凍，20℃下融化，反覆三次，於低溫5--8℃條件下膠體磨中反覆勻漿，顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液；3).將勻漿液經過濾、不同截留分子量的超濾膜分級超濾，超濾後最終截留分子量＜6000D，得小牛血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經低溫減壓濃縮並病毒滅活後得小牛血去蛋白提取物。
實施例三1).取非傳染區的、經檢驗合格的出生3個月的健康小牛，採用無菌動脈方法採血，在採集過程中，不斷用表面消毒過的木棒進行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的玻璃棒，除去纖維蛋白，以避免出現凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-20℃冷凍，40℃下融化，反覆三次，於低溫0--5℃條件下膠體磨中反覆勻漿，顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液；3).將勻漿液經過濾、不同截留分子量的超濾膜分級超濾，超濾後最終截留分子量＜6000D，得小牛血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經低溫減壓濃縮並病毒滅活後得小牛血去蛋白提取物。
實施例四1).取非傳染區的、經檢驗合格的、出生4個月的健康小牛，採用無菌動脈方法採血，在採集過程中，不斷用表面消毒過的器具，器具為木棒或玻璃棒進行攪拌，使纖維蛋白吸附在木棒上，除去纖維蛋白以避免出現凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-30℃凍，40℃下融化，反覆四次，於0--5℃下膠體磨中勻漿2分鐘，重複三次，在顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液；3).取勻漿液於4000轉/分鐘離心20分鐘，棄沉澱；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量8000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，經低溫減壓濃縮8倍得濃縮液；將濃縮液病毒在60℃下滅活，滅活10小時左右；滅活後的濃縮液用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾後的濃縮液；將檢驗合格的超濾後的濃縮液分裝於一次性使用塑料輸液袋中，低溫-20℃貯存，即得小牛血去蛋白提取物。
實施例五1).取非傳染區的、經檢驗合格的、出生2個月的健康小牛，採用無菌動脈方法採血，在採集過程中，不斷用表面消毒過的器具，器具為木棒進行攪拌，使纖維蛋白吸附在木棒上，除去纖維蛋白以避免出現凝血，得到去纖維蛋白小牛血；
2).將去纖維蛋白小牛血在-30℃凍，20℃下融化，反覆凍融二次，於0--5℃下膠體磨中勻漿2分鐘，重複三次，在顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液；3).取勻漿液離心後，棄沉澱；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量8000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，經低溫減壓濃縮6倍得濃縮液；將濃縮液病毒在65℃下滅活，滅活15小時左右；滅活後的濃縮液用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾後的濃縮液；將檢驗合格的超濾後的濃縮液分裝於一次性使用塑料輸液袋中，低溫(-18℃±2℃)貯存，即得小牛血去蛋白提取物。
實施例六1).取非傳染區的、經檢驗合格的、出生6個月以內的健康小牛，採用無菌動脈方法採血，在採集過程中，不斷用表面消毒過的器具，器具為木棒進行攪拌，使纖維蛋白吸附在木棒上，除去纖維蛋白以避免出現凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-20℃凍，10℃下融化，反覆凍融四次，於0～8℃下膠體磨中勻漿2分鐘，重複三次，在顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液；3).取勻漿液離心後，棄沉澱；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量6000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，經低溫減壓濃縮5倍得濃縮液；將濃縮液病毒在60℃下滅活；滅活後的濃縮液用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾後的濃縮液；將檢驗合格的超濾後的濃縮液分裝於一次性使用塑料輸液袋中，低溫(-18℃±2℃)貯存，即得小牛血去蛋白提取物。使用上述本發明提供的方法取得的小牛血去蛋白提取物性狀為淡黃色澄明液體，其檢測情況如下[檢查]pH值為6.5-7.5(中國藥典2000年版二部附錄VIH)吸收度420nm波長處的吸收度小於0.25(中國藥典2000年版二部附錄IVA)蛋白質陰性細菌內毒素每1ml中含細菌內毒素量小於1EU(中國藥典2000年版二部附錄XIE)照高效液相色譜法(中國藥典2000年版二部附錄VD)測定大分子量物質。用凝膠色譜柱(如Pharmarcia Superdex Peptide或TSKG2000SW柱)，乙腈-三氟醋酸-水(40∶0.1∶60)為流動相，檢測波長為214nm，按面積歸一化法計算，含高分子量物質(分子量＞5800D)的量不得過2.0％。
採用瓦氏呼吸檢壓儀測定豚鼠肝勻漿的呼吸活力，從測得的耗氧量計算出計算出呼吸活力QO2為4.0～6.0μlO2/mg·h；刺激指數(SI)為2.5～4.0。
(1)總固體量，精密量取2ml，置稱量瓶中，在55℃下真空乾燥至恆重，計算出，每1ml中含固型物為38～60mg。
(2)採用中國生物製品規程附錄蛋白質含量測定法測定本發明多肽含量，每1ml為0.90～1.5mg。
(3)游離胺基酸含量，用高效液相進行胺基酸分析，游離胺基酸含量每1ml不少於0.80～1.2mg。
權利要求
1.一種從小牛血中提取刺激細胞呼吸活性物質的方法，它包括下述步驟1).取非傳染區的、經檢驗合格的健康小牛，採用無菌動脈方法採血，在採集過程中，不斷用表面消毒過的器具進行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的器具上，除去纖維蛋白，以避免出現凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-30℃～40℃下反覆凍融，於低溫(0～8℃)條件下膠體磨中反覆勻漿，顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液；3).將勻漿液經過濾、不同截留分子量的超濾膜分級超濾，超濾後最終截留分子量＜6000D，得小牛血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經低溫減壓濃縮並病毒滅活後得小牛血去蛋白提取物。
2.根據權利要求1所述的一種從小牛血中提取刺激細胞呼吸活性物質的方法，其特徵在於它包括下述步驟1).取非傳染區的、經檢驗合格的、出生6個月以內的健康小牛，採用無菌動脈方法採血，在採集過程中，不斷用表面消毒過的器具，器具為木棒或玻璃棒進行攪拌，使纖維蛋白吸附在木棒上，除去纖維蛋白以避免出現凝血，得到去纖維蛋白小牛血；2).將去纖維蛋白小牛血在-30℃～40℃下反覆凍融二～四次，於0～8℃下膠體磨中勻漿2分鐘，重複三次，在顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液；3).取勻漿液離心後，棄沉澱；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；取濾液A，用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量8000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，經低溫減壓濃縮5-8倍得濃縮液；將濃縮液病毒在55～65℃下滅活10小時；滅活後的濃縮液用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾後的濃縮液；將檢驗合格的超濾後的濃縮液分裝於一次性使用塑料輸液袋中，低溫(-18℃±2℃)貯存，即得小牛血去蛋白提取物。
全文摘要
本發明公開了一種從小牛血中提取刺激細胞呼吸活性物質的方法，它包括下述步驟取健康小牛，採用無菌動脈方法採血，不斷用表面消毒過的器具進行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的器具上，除去纖維蛋白得到去纖維蛋白小牛血；將其在－30℃～40℃下反覆凍融，於低溫(0～8℃)條件下膠體磨中反覆勻漿，得勻漿液；將勻漿液經過濾、不同截留分子量的超濾膜分級超濾，超濾後最終截留分子量＜6000D，得小牛血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經低溫減壓濃縮並病毒滅活後得小牛血去蛋白提取物。所用設備體積小、結構簡單，投資費用低；製備的活性物質活性狀態保持好，不經過除溶媒過程，提高質量，提高收率；可進行工業規模化生產，生產周期短、成本降低。
文檔編號A61K35/14GK1634137SQ200410087620
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月19日 優先權日2004年11月19日
發明者王光, 李莉, 史曉丹, 馬驫 申請人:瀋陽斯佳科技發展有限公司