一種導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物製備和保存方法
2023-11-06 06:02:47
專利名稱：一種導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物製備和保存方法
技術領域：
本發明屬於微生物純化、保存技術領域，具體涉及一種導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物製備方法和兩種保存方法。
背景技術：
菸草青枯病(Tobacco bacterial wilt)是菸草生產中的主要細菌病害之一，在中國大部分產煙區都有發生，而且有逐年加重的趨勢。其病原菌是茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)，該菌的寄主廣泛，現有技術可實現對該菌的分離、培養和保存，見《中國菸草病害》(朱賢朝，王彥亭，王智發，中國農業出版社，2002，152 163頁)，其採取的培養方式為將分離的材料表面消毒後，取病組織加入滅菌水後剪碎或磨碎，再取剪碎或磨碎液在 TTC培養基上劃線或塗布，27 30°C培養3 4天後，檢查培養的菌落，選擇病菌菌落轉入斜面培養、保存。該方式存在的不足是病菌在人工培養基上轉接多次會導致病菌的變異、 一些固有的特性會喪失；而且有可能因為病菌數量少分離不到病菌。方中達編著的《植物病研究方法》(中國農業出版社，1998，187 189頁)記載，有關保存菸草青枯病菌菌株的方法有真空冷凍乾燥保存、冷凍甘油保存、礦物油保存、斜面保存和無菌水常溫保存等方式。 真空冷凍乾燥保存菸草青枯病菌雖然保存時間長、保存效果好，但需要配套的昂貴設備、操作煩瑣、技術難度大。冷凍甘油保存方式如果長期保存時會出現菸草青枯病菌菌株存活率低、致病力下降的問題。礦物油保存、斜面保存方式的保存時間短、保存效果不佳。無菌水常溫保存，菸草青枯病菌菌體會沉澱，外界溫度變化大，保存效果得不到保障。為了防止菸草青枯病菌在人工培養基上連續傳代，出現致病力迅速下降或其它遺傳性狀的改變的問題，以及現有技術保存培養物的效果不確定的缺陷，發展一種經濟有效的、並保持菸草青枯病致病菌固有特性的分離培養和保存方法，顯得尤為必要。
發明內容
本發明的第一目的在於提供一種導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物製備方法，第二、三目的在於提供兩種保存該高純培養物的方法。本發明的第一目的是這樣實現的，導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物製備方法，採取以下步驟A、原料的製備選具有菸草青枯病典型症狀的病株莖稈用自來水洗淨，經75%的酒精表面消毒2 3分鐘後，用無菌水衝洗2 3次，然後在無菌條件下將病株莖稈截成 3 5cm的小段；B、保溼培養在27 30°C下，將病株莖稈小段的截口暴露於滅菌蒸餾水外，無菌保溼培養12 M小時，有濃稠狀液體從截口處流出，濃稠狀液體為含茄科雷爾氏菌培養物；C、選擇高純培養物採用半選擇TTC法進行培養測定，用移菌環取B步驟所得的濃稠狀液體，以含有0. 吐溫_80、pH值為6. 8的滅菌磷酸緩衝液10倍系列稀釋後，塗布於直徑9 IOcm半選擇TTC平板培養基上，27 30°C無菌培養3 4天後，選擇含有80 120個菌落的培養基，且有環狀螺紋、邊緣白色中央粉紅色的較大菌落佔總菌落數80%以上的，即接種到該培養基上的濃稠狀液體為含菌量在80%以上的含茄科雷爾氏菌高純培養物。所述的無菌保溼培養是將病株莖稈小段置於滅菌的離心管或量筒中，用封口膜封口，病株莖稈小段的截口高出液面1 2cm。所述的離心管或量筒的內徑比病株莖稈粗2 3mm。本發明第二個目的是這樣實現的將高純培養物加入到裝有保存液A的保存容器中，保存時細菌濃度為1千萬 10億CFU/mL，將旋蓋或扣蓋蓋緊後，用封口膜封口， 在-20 _40°C恆溫保存；所述的保存液A是用100 200mL甘油和20 40g脫脂奶粉， 加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規滅菌後製得。本發明第三個目的是這樣實現的將高純培養物加入到裝有保存液B的保存容器中，保存時細菌濃度為1千萬 10億CFU/mL，將旋蓋或扣蓋蓋緊後，用封口膜封口，在20°C 恆溫保存；所述的保存液B是用1 2g瓊脂加入至IOOOmL蒸餾水中融化、搖勻，常規滅菌後製得。上述兩種保存方法中，所述的保存容器為1. 5mL的離心管或2. OmL的菌種保存管。本發明相對於現有技術具有以下技術效果1、獲得高純培養直接、快速、純度高、性狀穩定。利用目標菌的寄主植物——菸草， 其莖稈微管系統發達的特性，直接將具有菸草青枯病典型症狀的病株莖稈進行保溼培養， 從而獲得高純培養物。這種方法避免了人工培養基導致病株傳代中致病力下降或遺傳性狀改變的問題。配合半選擇 TTC培養基(Granada G A, Sequeira L. Survival of Pseudomonas solanacearum in soil, rhizosphere and plant roots. Can. J. Microbiol. ,1983,29 433 440.)進行稀釋分離、篩選高純培養物，可經濟、有效地獲得固有特性保持良好的菌株。2、保存方法簡便易行、保存效果好。保存目標菌的高純培養物，可根據需要選擇採用兩種方法，即利用保存液A在-20 _40°C冷凍保存和利用保存液B在20°C恆溫保存。冷凍保存將培養物作為菌種資源長期保存，如不反覆凍融，可有效保存病菌10年以上；採用恆溫保存，培養物中菌體存活率高，轉接方便，可以有效保存病菌至少5年。
具體實施例方式下面對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基於本發明教導所作的任何變換，均落入本發明的保護範圍。一種導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物製備方法，採取以下步驟A、原料的製備選具有菸草青枯病典型症狀的病株莖稈用自來水洗淨，經75%的酒精表面消毒2 3分鐘後，用無菌水衝洗2 3次，然後在無菌條件下將病株莖稈截成 3 5cm的小段；B、保溼培養在27 30°C下，將病株莖稈小段的截口暴露於滅菌蒸餾水外，無菌保溼培養12 M小時，有濃稠狀液體從截口處流出，濃稠狀液體為含茄科雷爾氏菌培養物；C、選擇高純培養物採用半選擇TTC法進行培養測定，用移菌環取B步驟所得的濃稠狀液體，以含有0. 吐溫-80、pH值為6. 8的滅菌磷酸緩衝液10倍系列稀釋後，塗布於直徑9 IOcm半選擇TTC平板培養基上，27 30°C無菌培養3 4天後，選擇含有80 120個菌落的培養基，且有環狀螺紋、邊緣白色中央粉紅色的較大菌落佔總菌落數80%以上的，即接種到該培養基上的濃稠狀液體為含菌量在80%以上的含茄科雷爾氏菌高純培養物。上述製備方法中，所述的無菌保溼培養是將病株莖稈小段置於滅菌的離心管或量筒中，用封口膜封口，病株莖稈小段的截口高出液面1 2cm。所述的離心管或量筒的內徑比病株莖稈粗2 3_。一種保存上述高純培養物的方法，將高純培養物加入到裝有保存液A的保存容器中，保存時細菌濃度為1千萬 10億CFU/mL，將旋蓋或扣蓋蓋緊後，用封口膜封口， 在-20 -40°C恆溫保存；所述的保存液A是用100 200mL甘油和20 40g脫脂奶粉， 加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規滅菌後製得。另一種保存上述高純培養物的方法，將高純培養物加入到裝有保存液B的保存容器中，保存時細菌濃度為1千萬 10億CFU/mL，將旋蓋或扣蓋蓋緊後，用封口膜封口，在 20°C恆溫保存；所述的保存液B是用1 2g瓊脂加入至IOOOmL蒸餾水中融化、搖勻，常規滅菌後製得。上述保存方法中，所述的保存容器為1. 5mL的離心管或2. OmL的菌種保存管，其保存效果更好。實施例1 製備高純培養物，採取以下步驟A、取具有菸草青枯病典型症狀的菸草病株莖稈自來水洗淨，經75%的酒精表面消毒3分鐘後，用無菌水衝洗2次，然後在無菌條件下將病株莖稈截成3cm的小段；B、在27°C下，將病株莖稈小段截口暴露於滅菌蒸餾水外1cm，無菌保溼培養12小時，直到有濃稠狀液體從病株莖稈小段的截口處流出；C、採用半選擇TTC培養測定，用移菌環取濃稠狀液體，以含有0. 吐溫-80的、 PH值為6. 8的滅菌磷酸緩衝液10倍系列稀釋後，塗布於直徑IOcm的半選擇TTC平板培養基上，27°C無菌培養3天後，培養基上包含有96個菌落，其中有環狀螺紋、邊緣白色中央粉紅色的較大菌落佔總菌落數的86.對％。配製保存液Al 用IOOOmL甘油和20g脫脂奶粉，加入蒸餾水溶解、定容至500mL，
搖勻，常規滅菌後製得。採用裝有保存液Al的1. 5mL離心管保存高純培養物，將高純培養物加入到其中， 保存時細菌濃度為1千萬 10億CFU/mL(採用常規稀釋平板菌落計數法測定)，在_20°C 恆溫保存；。實施例2 製備高純培養物，採取以下步驟A、取具有菸草青枯病典型症狀的菸草病株莖稈自來水洗淨，經75%的酒精表面消毒2分鐘後，在無菌條件下用無菌水衝洗3次，然後將病株莖稈截成5cm的小段；
B、在30°C下，將病株莖稈小段截口暴露於滅菌蒸餾水外2cm，無菌保溼培養M小時，直到有濃稠狀液體從病株莖稈小段的截口處流出；C、採用半選擇TTC培養測定，用移菌環取濃稠狀液體，含有0. 1 %吐溫-80的、pH 值為6. 8的滅菌磷酸緩衝液10倍系列稀釋後，塗布於直徑9cm的半選擇TTC平板培養基上， 30°C無菌培養4天後，培養基上包含有87個菌落，其中有環狀螺紋、邊緣白色中央粉紅色的較大菌落佔總菌落數的83. 15%。配製保存液A2 用200mL甘油和40g脫脂奶粉，加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規滅菌後製得。採用裝有保存液A2的2. OmL菌種保存管保存高純培養物，將高純培養物加入到其中，保存時細菌濃度為ι千萬 10億CFU/mL(採用常規稀釋平板菌落計數法測定)， 在-40°C恆溫保存。實施例3製備高純培養物採取的方法中病株莖稈小段截口暴露於滅菌蒸餾水外1. 5cm, 無菌保溼培養18小時，其他均與實施例1相同。半選擇TTC培養測定後，培養基上包含有 116個菌落，其中有環狀螺紋、邊緣白色中央粉紅色的較大菌落佔總菌落數的82. 32%。配製保存液A3 用150mL甘油和30g脫脂奶粉，加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規滅菌後製得。裝有保存液A3的1. 5mL離心管保存高純培養物，將高純培養物加入到其中，保存時細菌濃度為1千萬 10億CFU/mL(採用常規稀釋平板菌落計數法測定)，在_30°C恆溫保存。實施例4製備高純培養物，採取的方法與實施例2相同。配製保存液A4 用ISOmL甘油和25g脫脂奶粉，加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規滅菌後製得。採用裝有保存液A4的2. OmL菌種保存管保存高純培養物，將高純培養物加入到其中，保存時細菌濃度為ι千萬 10億CFU/mL(採用常規稀釋平板菌落計數法測定)， 在-30°C恆溫保存。實施例5製備高純培養物採取的方法與實施例1相同。配製保存液Bl 用1. 5g的瓊脂加入至IOOOmL蒸餾水中融化、搖勻，常規滅菌後製得。採用裝有保存液Bl的1.5mL離心管保存高純培養物，將高純培養物加入到其中， 保存時細菌濃度為1千萬 10億CFU/mL (採用常規稀釋平板菌落計數法測定)，在20°C恆
溫保存。實施例6製備高純培養物採取的方法與實施例3相同。配製保存液B2 用Ig的瓊脂加入至IOOOmL蒸餾水中融化、搖勻，常規滅菌後製得採用裝有保存液B2的2. OmL菌種保存管保存高純培養物，將高純培養物加入到其中，保存時細菌濃度為1千萬 10億CFU/mL (採用常規稀釋平板菌落計數法測定)，在20°C恆溫保存。實施例7製備高純培養物採取的方法與實施例2相同。配製保存液B3 用2g的瓊脂加入至IOOOmL蒸餾水中融化、搖勻，常規滅菌後製得。採用裝有保存液B3的2. OmL菌種保存管保存高純培養物，將高純培養物加入到其中，保存時細菌濃度為1千萬 10億CFU/mL (採用常規稀釋平板菌落計數法測定)，在20°C 恆溫保存。本發明技術效果的驗證試驗1、採用現有技術的半選擇TTC培養測定法選擇高純培養物，屬於現有技術。觀察培養了 3 4天後的培養基，如果直徑為9 IOcm的培養基上包含有80 120個菌落，並且有環狀螺紋、邊緣白色、中央粉紅色的較大菌落佔總菌落數的80%以上，說明該培養基所接種的濃稠狀液體的含菌量在80%以上。選擇含菌量大於80%的培養物保存，保證了培養物的高純度。2、用第一種方法所保存菌株的活力和致病力試驗結果1)隨機抽取採用保存液A、以-20 _40°C恆溫保存了 10年的M株病菌菌株，用半選擇TTC培養測定，發現所有供試菌株的存活率均在40%以上，純度在70%以上。2)從M株病菌菌株中任意抽取12株菌株，採用公知技術的注射法接種苗齡45 55天的K326( —種主栽的菸草品種)煙苗的第3、4片真葉，在M小時內觀察過敏性反應， 結果表明所有的菌株致病力保持不變。3)採用Hicks菸草品種(一種測定茄科雷爾氏菌菌株致病力常用的菸草品種)， 用公知技術的溼潤育苗灌根法接種另外12株病菌菌株，結果發現病情指數與10年前的相比變化範圍為1 3，致病力變化不顯著。由此說明，第一種方法保存10年後的菌株活力保持良好，致病力變化不大。3、用第二種方法所保存菌株的活力和致病力試驗結果1)隨機抽取採用保存液B、以20°C恆溫保存了 5年的20株病菌菌株，用半選擇TTC 培養測定，發現所有的供試菌株存活率均在35 %以上，純度在60%以上。2)從20株病菌菌株中任意取10株菌株，採用公知技術的注射法接種苗齡45 55天的1(3 煙苗的第3、4片真葉，在M小時內觀察過敏性反應，結果表明所有的菌株致病力保持不變。3)採用Hicks菸草品種溼潤育苗灌根法接種另外10株病菌菌株，結果發現病情指數與5年前的相比變化範圍為1 3，致病力變化不顯著。由此說明，第二種方法保存5年後的菌株活力保持良好，致病力變化不大。本發明特點1、直接進行保溼培養，簡便快速，培養物的純度高，有效保持了菌株的固有特性；2、保存方式易於實施，操作簡便，保存時間長，效果好。
權利要求
1.一種導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物的製備方法，其特徵是採取以下步驟A、原料的製備選具有菸草青枯病典型症狀的病株莖稈用自來水洗淨，經75%的酒精表面消毒2 3分鐘後，用無菌水衝洗2 3次，然後在無菌條件下將病株莖稈截成3 5cm的小段；B、保溼培養在27 30°C下，將病株莖稈小段的截口暴露於滅菌蒸餾水外，無菌保溼培養12 M小時，有濃稠狀液體從截口處流出，濃稠狀液體為含茄科雷爾氏菌培養物；C、選擇高純培養物採用半選擇TTC法進行培養測定，用移菌環取B步驟所得的濃稠狀液體，以含有0. 吐溫_80、pH值為6. 8的滅菌磷酸緩衝液10倍系列稀釋後，塗布於直徑 9 IOcm半選擇TTC平板培養基上，27 30°C無菌培養3 4天後，選擇含有80 120個菌落的培養基，且有環狀螺紋、邊緣白色中央粉紅色的較大菌落佔總菌落數80%以上的，即接種到該培養基上的濃稠狀液體為含菌量在80%以上的含茄科雷爾氏菌高純培養物。
2.根據權利要求1所述的導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物的製備方法，其特徵是所述的無菌保溼培養是將病株莖稈小段置於滅菌的離心管或量筒中，用封口膜封口，病株莖稈小段的截口高出液面1 2cm。
3.根據權利要求2所述的導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物的製備方法，其特徵是所述的離心管或量筒的內徑比病株莖稈粗2 3mm。
4.一種保存權利要求1所述的導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物的方法，其特徵是將高純培養物加入到裝有保存液A的保存容器中，保存時細菌濃度為1千萬 10 億CFU/mL，將旋蓋或扣蓋蓋緊後，用封口膜封口，在-20 _40°C恆溫保存；所述的保存液A 是用100 200mL甘油和20 40g脫脂奶粉，加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規滅菌後製得。
5.一種保存權利要求1所述的導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物的方法， 其特徵是將高純培養物加入到裝有保存液B的保存容器中，保存時細菌濃度為1千萬 10億CFU/mL，將旋蓋或扣蓋蓋緊後，用封口膜封口，在20°C恆溫保存；所述的保存液B是用 1 2g瓊脂加入至IOOOmL蒸餾水中融化、搖勻，常規滅菌後製得。
6.根據權利要求4或5所述的保存導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物的方法，其特徵是所述的保存容器為1. 5mL的離心管或2. OmL的菌種保存管。
全文摘要
本發明公開了一種導致菸草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養物製備和保存方法，將菸草青枯病典型症狀的病株莖稈處置後，27～30℃無菌保溼培養12～24小時，獲得含茄科雷爾氏菌培養物；經過TTC法鑑定、篩選含菌量在80％以上的高純培養物；所獲得的高純培養物可採用保存液A在-20～-40℃恆溫保存，或採用保存液B在20℃恆溫保存；保存液A為100～200mL甘油和20～40g脫脂奶粉，加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規滅菌後製得；保存液B是將1～2g的瓊脂加入至1000mL蒸餾水中融化、搖勻，常規滅菌後製得。本發明的製備和保存方法簡便、易行，目標菌純度高、性狀穩定，保存效果好。
文檔編號C12N1/04GK102229897SQ201110112228
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月3日 優先權日2011年5月3日
發明者餘清, 宋春滿, 方敦煌, 晉豔, 秦西雲, 胡堅 申請人:雲南省菸草農業科學研究院