一種查找與杆狀病毒pcna相互作用蛋白的方法

2023-11-05 19:08:02

一種查找與杆狀病毒pcna相互作用蛋白的方法
【專利摘要】本發明公開了一種查找與杆狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，應用分子克隆、DNA測序等手段克隆了苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）PCNA基因的全長DNA，並對其純化，耦連到親和層析柱，與質譜連用查找互作蛋白。本發明可應用於杆狀病毒PCNA互作蛋白的查找與功能研究。
【專利說明】—種查找與杆狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程和生物【技術領域】，具體涉及與苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)的增殖細胞核抗原(PCNA)相互作用的蛋白。
技術背景
[0002]杆狀病毒是一類專門寄生於節肢動物的病原微生物。在杆狀病毒眾多成員中，研究和利用最多的是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)。杆狀病毒宿主域很狹窄，僅限於少數幾種節肢動物，主要是昆蟲。杆狀病毒用於生物防治的突出優點是:對人畜安全，不傷害天敵，對宿主致病性強，殺蟲的後效作用較持久，不汙染環境，並有後效作用。但其過高的宿主特異性與緩慢的發病致死作用也在一定程度上影響了杆狀病毒的使用。通過基因工程構建重組病毒，不僅可以克服杆狀病毒的固有缺點，也為擴大病毒殺蟲功能提供了潛在可能。
[0003]增殖細胞核抗原(proliferatingcell nuclear antigen,PCNA)的相對分子質量為29KD的酸性蛋白，它是一種表達水平隨著細胞周期波動的高度保守的生長調控蛋白，可圍繞DNA鏈組裝成三聚體滑動夾。滑動夾PCNA能夠以一定的秩序與多種複製相關蛋白如SSB (single-stranded DNA binding protein)、RFC(複製因子 C)等結合，實現對DNA 的複製、損傷修復、細胞周期調控及凋亡等事件的協同。因此，PCNA作為一個平臺與DNA代謝中的多種蛋白因子相互作用，對於了解病毒的DNA修復機制非常有意義，為進一步研究和改造杆狀病毒奠定了重要的生物學基礎。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在於提供一種查找與杆狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，以實現對與PCNA起互作反應的蛋白的鑑定及功能分析。
[0005]為了解決以上技術問題，本發明應用分子克隆、DNA測序等手段克隆了苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)PCNA基因的全長DNA，並對其純化，耦連到親和層析柱，與質譜連用查找互作蛋白，具體技術方案如下:
一種查找與杆狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特徵在於查找與AcMNPV即苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的PCNA即增殖細胞核抗原相互作用蛋白的方法，具體包含以下幾個步驟:
步驟一，克隆所述AcMNPV的PCNA基因連接到表達載體中；所述PCNA基因為GenBankID=1403881 ；
步驟二,在大腸桿菌B121中表達PCNA蛋白，通過N1-NTA Agarose柱子和FPLC Mono Q離子交換層析柱純化，得到PCNA高純蛋白；
步驟三,利用所述PCNA高純蛋白與CNBr-Activated Sepharose 4B稱連,製備PCNA親和層析柱；
步驟四，在所述AcMNPV病毒感染SF9細胞後，收集感染後的總蛋白，經過PCNA親和層析柱洗脫，SDS-PAGE鑑定洗脫組分，質譜鑑定與PCNA相互作用的蛋白。
[0006]所述的PCNA基因是用以下引物擴增得到的:
正向為 5』 -CGCGGATCCATGTTCGAAGCGGAAITT-3』 ；
反向為 5』 -CCGCTCGAGGTGATGGTGATGGTGATG-3。
[0007]步驟二中所述的純化，具體過程為:收集的經超聲波裂解、高速離心後含表達了PCNA蛋白的上清,經過N1-NTA Agarose柱子和FPLC Mono Q離子交換層析柱分離純化出高純度的PCNA高純蛋白。
[0008]步驟三中所述親和層析柱的具體製備過程為:
過程一，如步驟二所述製備PCNA高純蛋白；
過程二，製備親和層析介質:耦連緩衝液，含有0.5M NaCl的pH8.3 0.1M NaC03 ;稱取CNBr-Activated Sepharose 4B凍乾粉放置在ImM HCl中懸浮溶脹，放置大約30分鐘後，棄濾液，用約15倍膠體積的I mM HCl溶液衝洗乾淨；加入PCNA的含量為2 mg/ml的耦連緩衝液，4°C，過夜；將反應完洗滌過的凝膠懸浮到水中，加入IM乙醇胺，在常溫最少攪拌反應2小時，以消除殘餘活性基團；用含有0.5M NaCl的0.1M PH為4.0的醋酸鹽緩衝液和含有
0.5M NaCl的0.1M PH為8的Tris-HCl緩衝液交替洗滌，重複洗滌3次即得親和層析柱。
[0009]步驟 四中所述的質譜鑑定是指:將細胞總蛋白過PCNA親和層析柱後，跑SDS-PAGE凝膠電泳，複合物中的各個蛋白被分開，切膠、胰酶消化後，通過ABI 4800 MALDITOF/ TOF質譜儀上進行分析，鑑定各片段的分子質量，利用Mascot軟體搜索比對最新的NCBI蛋白資料庫以鑑定目的蛋白，查找出與PCNA互相作用的蛋白。
[0010]本發明具有有益效果。本發明應用分子克隆、DNA測序等手段克隆了苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒PCNA基因的全長DNA，並對其純化，耦連到親和層析柱，與質譜連用查找互作蛋白，能實現方便、快速、廉價的查找與杆狀病毒PCNA起互作反應的蛋白。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發明的PCNA蛋白表達的Western blot鑑定結果圖。
[0012]圖2為本發明洗脫組分的SDS-PAGE圖譜。
[0013]圖3為本發明洗脫的蛋白條帶胰酶水解肽指紋圖譜。
【具體實施方式】
[0014]下面結合附圖和實施例對本發明的技術方案作進一步詳細闡述。
[0015]實驗材料:
SDS、TEMED,丙烯醯胺及甲叉丙烯醯胺購自上海捷瑞生物有限公司JransStartFastPfu DNA Polymerase和pEASY-Blunt Zero載體購自北京全式金生物技術有限公司；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；昆蟲細胞培養基、胎牛血清等化學試劑購自 GIBCO BRL 公司；N1-NTA Agarose 購自 QIAGEN ;CNBr_Activated Sepharose 4B 購自GE Healthcare Life Sciences ;其它試劑均為國產,分析純。限制性內切酶、大腸桿菌DH5a和BL21從Takara公司購買；AcMNPV病毒、Sf9細胞由江蘇大學生命科學研究院保存。
[0016]實施例一:苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒PCNA基因的克隆
根據AcMNPV的PCNA基因序列(GenBank ID:1403881)設計引物。PCR引物為: 正向:5』-CGCGGATCCATGTTCGAAGCGGAATTT-3』(下劃線為 BamH I 酶切位點)
反向:5』-CCGCTCGAGGTGATGGTGATGGTGATG-3』(下劃線為 Xho I 酶切位點)
用全式金的TransStart FastPfu DNA Polymerase特異擴增PCNA片段，PCR擴增條件為94°C預變性5 min，94°C變性30 S，58°C退火30 s，72°C延伸40 S，共25個循環，之後72°C再延伸8 min。將PCR產物進行瓊脂糖電泳，切下800bp大小的片段，用上海捷瑞的凝膠回收試劑盒純化回收的擴增片段。將目的片段連接到pEASY-Blunt zero載體上,並轉化到大腸桿菌中，獲得陽性克隆後進行測序。
[0017]用Takara的BamH I和Xho I酶切測序正確的克隆，回收約800bp大小的片段，連接到BamH I和Xho I酶切的原核表達載體pET_30a中，得到PCNA_30a融合蛋白表達載體。該蛋白載體可在大腸杆囷中表達His融合蛋白。
[0018]實施例二:PCNA蛋白的表達和純化
將PCNA-30a重組質粒轉入大腸桿菌BL21感受態細胞中。挑取鑑定正確的目的克隆接種於LB培養基中，37°C在搖床中振蕩培養過夜，次日轉接於新鮮的LB培養基中，至菌液0D600為0.6時，直接向菌液中加入IPTG進行誘導。8小時後，收集誘導後的菌體並進行處理，對處理後的菌體蛋白進行12%的SDS-PAGE電泳，將膠分離後的蛋白轉移到PVDF膜上，用鼠源抗His的單克隆抗體進行免疫反應，帶6 X His標籤的His-PCNA的Western blot檢測結果如圖1所示。
[0019]用IL含PCNA_30a融合蛋白表達載體的大腸桿菌進行大規模誘導，誘導後4000g離心15分鐘，按照試劑盒說明書，用N1-NTA柱純化帶組氨酸標籤的PCNA，洗脫的蛋白如圖
2。收集洗脫下的各蛋白餾分，再經過一次FPLC Mono Q離子交換層析柱純化。平衡液含25mM Tris-HCl，PH 8.0, 5 mM DTT , I mM PMSF 和 0.2 mM EDTA。上樣後用 0-1 M Nacl 線性梯度洗脫，流速為5mL/min。SDS-PAGE鑑定純化效果。
[0020]實施例三:PCNAf禹連 CNBr-Activated Sepharose 4B 柱子的製備
配置 5 mg/mL PCNA 溶於耦連緩衝液(含 0.5M NaCl 的 0.1M Na⑶3，PH 8.3)。ImM的HCl溶脹CNBr-Activated Sepharose 4B凍乾粉。將含PCNA的耦連溶液和溶脹的CNBr-Activated Sepharose 4B混合2小時；加入pH8.0、1M的乙醇胺以消除殘餘活性基團，裝柱。用含有0.5M NaCl的0.1M醋酸鹽緩衝液(PH 4.5)和耦連緩衝液交替洗滌耦連介質3次。
[0021]實施例四:質譜鑑定與PCNA互相作用的蛋白
野生型的AcMNPV感染SF9細胞96小時後，收集細胞總蛋白。經過超聲裂解、4°C下IOOOOg高速離心後，取上清，用細胞裂解液(20 mM Tris-Cl，ρΗ7.8，0.5 mM EGTA，I mMEDTA, I mM MgC12, 50 mM NaCl, 10%甘油，蛋白酶抑制劑)裂解。
[0022]將製備的細胞裂解物上柱。以含0.1%的Triton X-100的提取液洗脫，吸收峰迴到基線後，用I M NaCl的提取液洗脫；吸收值回到基線後，改為PH5.0、50 mM的醋酸鈉洗脫。
[0023]將洗脫組分進行SDS-PAGE電泳，12%分離膠分離結合蛋白。用手術刀將膠均勻切割成多個條帶，每個條帶經酶切消化後，通過ABI 4800 MALDI TOF/ TOF質譜儀上進行分析，鑑定各片段的分子質量，利用Mascot軟體搜索比對最新的NCBI蛋白資料庫以鑑定目的蛋白，查找出與PCNA互相作用的蛋白，比對到多個蛋白，其中的肽指紋圖譜如圖3所示。
【權利要求】
1.一種查找與杆狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特徵在於查找與AcMNPV即苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的PCNA即增殖細胞核抗原相互作用蛋白的方法，具體包含以下幾個步驟: 步驟一，克隆所述AcMNPV的PCNA基因連接到表達載體中；所述PCNA基因為GenBankID =1403881 ； 步驟二,在大腸桿菌B121中表達PCNA蛋白，通過N1-NTA Agarose柱子和FPLC Mono Q離子交換層析柱純化，得到PCNA高純蛋白； 步驟三,利用所述PCNA高純蛋白與CNBr-Activated Sepharose 4B稱連,製備PCNA親和層析柱； 步驟四，在所述AcMNPV病毒感染SF9細胞後，收集感染後的總蛋白，經過PCNA親和層析柱洗脫，SDS-PAGE鑑定洗脫組分，質譜鑑定與PCNA相互作用的蛋白。
2.如權利要求1所述的一種查找與杆狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特徵在於所述的PCNA基因是用以下引物擴增得到的:
正向為 5』 -CGCGGATCCATGTTCGAAGCGGAAITT-3』 ；
反向為 5』 -CCGCTCGAGGTGATGGTGATGGTGATG-3。
3.如權利要求1所述的一種查找與杆狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特徵在於步驟二中所述的純化，具體過程為:收集的經超聲波裂解、高速離心後含表達了 PCNA蛋白的上清，經過N1-NTA Agarose柱子和FPLC Mono Q離子交換層析柱分離純化出高純度的PCNA聞純蛋白。·
4.如權利要求1所述的一種查找與杆狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特徵在於步驟三中所述親和層析柱的具體製備過程為: 過程一，如步驟二所述製備PCNA高純蛋白； 過程二，製備親和層析介質:耦連緩衝液，含有0.5M NaCl的pH8.3 0.1M NaC03 ;稱取CNBr-Activated Sepharose 4B凍乾粉放置在ImM HCl中懸浮溶脹，放置大約30分鐘後，棄濾液，用約15倍膠體積的I mM HCl溶液衝洗乾淨；加入PCNA的含量為2 mg/ml的耦連緩衝液，4°C，過夜；將反應完洗滌過的凝膠懸浮到水中，加入IM乙醇胺，在常溫最少攪拌反應2小時，以消除殘餘活性基團；用含有0.5M NaCl的0.1M PH為4.0的醋酸鹽緩衝液和含有0.5M NaCl的0.1M PH為8的Tris-HCl緩衝液交替洗滌，重複洗滌3次即得親和層析柱。
5.如權利要求1所述的一種查找與杆狀病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特徵在於步驟四中所述的質譜鑑定是指:將細胞總蛋白過PCNA親和層析柱後，跑SDS-PAGE凝膠電泳，複合物中的各個蛋白被分開，切膠、胰酶消化後，通過ABI 4800 MALDI TOF/ TOF質譜儀上進行分析，鑑定各片段的分子質量，利用Mascot軟體搜索比對最新的NCBI蛋白資料庫以鑑定目的蛋白，查找出與PCNA互相作用的蛋白。
【文檔編號】C12N15/34GK103713037SQ201310696294
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】陳慧卿, 周亞竟, 唐琦, 李梅, 黃國平, 李國輝, 麥維軍, 張春霞 申請人:江蘇大學