選擇高水平表達蛋白質的宿主細胞的製作方法

2023-11-05 07:49:52 3

專利名稱：：選擇高水平表達蛋白質的宿主細胞的製作方法
技術領域：
：本發明涉及分子生物學和生物
技術領域：
。更具體的，本發明涉及用於對選擇高水平表達蛋白質的宿主細胞進行改進的手段(means)和方法。可以在多種宿主細胞中生產蛋白質用於廣泛的生物學和生物技術應用，例如作為生物藥物。對於該目的，例如在這些蛋白質具有某些翻譯後修飾例如糖基化時，優選真核宿主細胞特別是哺乳動物宿主細胞用於表達許多蛋白質。已經充分建立了這類生產的方法，通常包括在宿主細胞中表達編碼感興趣蛋白質的核酸(也被稱作"轉基因")。通常將轉基因連同可選擇標記基因引入到前體細胞中，對細胞進行可選擇標記基因表達的選擇，對一個或者多個高水平表達感興趣蛋白質的克隆進行鑑定並用於表達所感興趣的蛋白質。選擇表達相對高水平期望蛋白質的重組宿主細胞的方法是已知的(參見例如在WO2006/048459和US2006/0141577中的介紹)。國際申請PCT/EP2005/055794(公開為WO2006/048459)中公開了一種選擇表達高水平感興趣的多肽的宿主細胞的新理念，其中該國際申請是在本申請的優先權日之前提交，但在本申請的優先權日之後公開的。美國專利申請No.11/359,953(公開為US2006/0141577)和國際申請PCT/EP2007/051696公開了替換的方法，其中這兩份申請也是在本申請的優先權日之前提交，但在本申請的優先權日之後公開的。簡言之，這些申請教導使用具有非ATG起始密碼子如GTG或TTG的編碼可選擇標記多肽的序列。這達到了可以以高嚴格性選擇克隆，並用於獲得表達水平非常高的宿主細胞的克隆。本發明旨在提供進一步改進的途徑和方法用於選擇表達高水平感興趣蛋白質的宿主細胞。發明概述在本文中通過參照將申請PCT/EP2005/055794(WO2006/048459)，US11/359,953(US2006/0141577)和PCT/EP2007/051696的公開內容整體併入。簡言之，這些申請教導使用具有非ATG起始密碼子如GTG或TTG的編碼可選擇標記多肽的序列。這達到了可以以高嚴格性選擇克隆，並用於獲得表達水平非常高的宿主細胞的克隆。本發明公開了具有GTG或TTG起始密碼子的改進的可選擇標記基因。例如，這些改進的可選擇標記基因可以用於在WO2006/048459和US2006/0141577中所公開的轉錄單位及其所使用的方法中。這獲得了進一步改進的高表達水平宿主細胞(的選擇)。在一個方面中，本發明提供了一種DNA分子，其包含編碼可選擇標記多肽的開放閱讀框序列，其中所述編碼鏈中的所述DNA分子包含選自由a)GTG起始密碼子，和b)TTG起始密碼子所組成組的可選擇標記多肽的翻譯起始序列；其中與編碼可選擇標記蛋白質的原始開放閱讀框序列相比，編碼所述可選擇標記蛋白質的開放閱讀框序列已經被突變以替換其至少一半的CpG二核苷酸。在優選的實施方式中，可選擇標記蛋白質提供了針對選擇劑例如抗生素致死和/或生長抑制效果的抗性。在某些實施方式中，可選擇標記多肽提供了針對Zeocin或針對新黴素的抗性。本發明還提供了一種根據本發明的DNA分子，其中編碼所述可選擇標記多肽的開放閱讀框是多順反子轉錄單位的一部分，其中所述多順反子轉錄單位還包含編碼感興趣的多肽的開放閱讀框序列。本發明還提供了一種包含這類DNA分子的表達盒，所述表達盒包含在所述多順反子轉錄單位上遊的啟動子，以及優選在所述多順反子轉錄單位的下遊具有轉錄終止序列。本發明還提供了包含根據本發明的DNA分子或表達盒的宿主細胞。本發明還提供了一種表達感興趣的多肽的方法，其包括培養包含本發明表達盒的宿主細胞，以及從所述表達盒表達所感興趣的多肽。圖1.在CHO-K1細胞中利用CpG含量減少的Zeocin抗性標記物的結果。點表示單獨的數據點，線表示平均表達水平；垂直軸表示d2EGFP信號。詳細內容參見實施例1。圖2.除在CHO-DG44細胞中外，與圖1相同。詳細內容參見實施例1。圖3.使用具有不同突變的"貧CpG"的新黴素抗性標記的結果。點表示單獨的數據點，線表示平均表達水平；垂直軸表示d2EGFP信號。詳細內容參見實施例2。發明詳述術語"單順反子基因"被定義為能夠提供編碼一種多肽的RNA的基因。"多順反子轉錄單位"也被稱作多順反子基因，被定義為能提供編碼至少兩種多肽的RNA分子的基因。術語"雙順反子基因"被定義為能夠提供編碼兩種多肽的RNA分子的基因。因此，雙順反子基因包含在多順反子基因的定義內。本文中所使用的"多肽"包含通過肽鍵連接的至少五個胺基酸，例如可以是蛋白質或其一部分例如亞基。多肽可以包含翻譯後修飾例如糖基化。通常，術語多肽和蛋白質在本文中是可以互換使用的。在本發明中所使用的"基因"或"轉錄單位"可以包括染色體DNA、cDNA、人工DNA及其組合等。"可操作地連接"是指允許所描述組分以期望的方式發揮功能的位置關係。因此，例如"可操作地連接"到順反子的啟動子是以一種在與啟動子兼容的條件下達到表達順反子的模式進行連接。類似的，可操作地連接於順反子的IRES核苷酸序列，是以在與IRES兼容的條件下達到翻譯順反子的模式進行連接。本發明的DNA分子可以以雙鏈DNA的形式存在，關於可選擇標記多肽和感興趣的多肽，其具有編碼鏈和非編碼鏈，其中除了存在T替換U以外，所述編碼鏈具有與被翻譯的RNA相同的序列。因此，AUG起始密碼子是由編碼鏈中的ATG序列所編碼的，包含對應RNA中AUG起始密碼子的該ATG序列的鏈被稱作DNA的編碼鏈。對於本領域技術人員明顯的是，實際上起始密碼子或翻譯起始序列存在於RNA分子中，但是這些可以被等價地認為包含在編碼這類RNA分子的DNA分子中；因此，除非以其他方式明確說明，無論在本發明中何處提到起始密碼子或翻譯起始序列，是為了包括除了在所述DNA分子的編碼鏈中存在T替換U外具有與RNA序列相同序列的相應DNA分子，反之亦然。換句話說例如起始密碼子是RNA中的AUG序列，但在本發明中DNA編碼鏈中相應的ATG序列也被稱作起始密碼子。同樣的還用於引用"符合閱讀框的"編碼序列，其意思是被翻譯成胺基酸的RNA分子中的三聯體(三個鹼基)，但也被解釋成DNA分子的編碼鏈中相應的三核苷酸序列。在本領域中翻譯起始序列通常被稱作"Kozak序列"，最佳的Kozak序列是RCCATGG，下劃線的是起始密碼子，R是嘌呤即A或G(參見KozakM，1986，1987,1989，1990，1997，2002)。因此，除了起始密碼子本身外，其背景特別是-31和+4位核苷酸是有關的，最佳的翻譯起始序列包括在最佳背景(即ATG之前即是RCC，之後即跟著G)中的最佳啟動密碼子(即ATG)。在存在Kozak序列時，核糖體翻譯最有效(參見KozakM，1986，1987，1989,19卯，1997，2002)。然而，在小比例事件中，核糖體識別並使用非最佳翻譯起始序列來起始翻譯。本發明利用該原理，能夠減少翻譯進而表達可選擇標記多肽的量，因此這被用於提高選擇系統的嚴格性。術語"選擇標記"或"可選擇標記"通常用於指可以直接或間接檢測其在細胞中存在的基因和/或蛋白質，例如使選擇劑失活並保護宿主細胞免於藥物致死或生長抑制作用的多肽(例如抗生素抗性基因和/或蛋白質)。可選擇標記多肽是本領域中公知的，並且在要獲得真核宿主細胞時被常規使用，WO2006/048459中提供了許多適當的可選擇標記蛋白質的某些例子。編碼這類可選擇標記多肽的DNA序列是己知的，WO2006/048459提供了編碼可選擇標記蛋白質的DNA野生型序列的某些例子(例如其中的圖15~21，通過參照併入本文中)。明顯的是也可以適當使用可選擇標記的突變體或衍生物，因此只要所述可選擇標記蛋白質仍然發揮功能，就包括在術語"可選擇標記多肽"的範圍內。例如還包括由於遺傳密碼冗餘性而不改變所編碼蛋白質的任何沉默突變。還包括其他導致保守胺基酸突變或其他突變的突變，只要所編碼的蛋白質仍具有活性，該活性可以比指定序列所編碼野生型蛋白質的活性低，或者可以不低於所指定序列所編碼野生型蛋白質的活性。特別的，優選所編碼的蛋白質與由分別指定序列所編碼蛋白質具有至少70%，優選至少80%，更優選至少卯％，更加優選至少95%的同一性。可以通過常規的方法完成對可選擇標記蛋白質活性的測試。根據本發明的可選擇標記多肽是由核酸編碼的蛋白質，其中所述多肽功能上被用於選擇，例如由於其提供了對選擇劑例如抗生素的抗性。因此，如果使用抗生素作為選擇劑，則DNA編碼提供對所述選擇劑抗性的多肽，該多肽是可選擇標記多肽。可選擇標記多肽是由本發明的DNA所編碼的。根據本發明的可選擇標記多肽必須在真核宿主細胞中有功能，因此能夠被選擇用於真核宿主細胞中。對於本發明適當的可選擇標記基因的例子是Zoecin和新黴素。其他適當的候選物包括例如殺稻瘟菌素、嘌呤黴素、博來黴素、潮黴素、DHFR、GS等(同樣參見WO2006/048459)。其他可以使用的可選擇標記基因以及它們的選擇劑被列舉在例如美國專利5，561，053的表1中；還可以參見Kaufinan,MethodsinEnzymology，185:537-566(1990)，或者這些的綜述。術語"選擇"通常被定義為使用選擇標記/可選擇標記以及選擇劑以鑑定具有具體遺傳特徵的宿主細胞(例如宿主細胞包含整合到其基因組上的轉基因)的過程。為了方便並且通常本領域技術人員能夠接受，在許多出版物以及本文中，經常講編碼對選擇劑抗性的基因和蛋白質分別稱作"可選擇劑(抗性)基因"或"選擇劑(抗性)蛋白質"，儘管正式名稱可能不同，例如編碼提供對新黴素(以及對G418和卡那黴素)抗性的蛋白質的基因經常被稱作新黴素(抗性)(或nec/)基因，而其正式名稱為氨基葡糖苷3，-磷酸轉移酶基因。WO2006/048459和US2006/0141577在優選的實施方式中編碼可選擇標記蛋白質的序列具有GTG起始密碼子，或者更優選TTG起始密碼子。這達到了非常嚴格的選擇以及在所獲得的克隆中蛋白質非常高水平的表達。在本發明中，通過降低其中CpG的含量對可選擇標記蛋白質的編碼序列進行進一步改進，這達到了更高的嚴格性以及進一步提高的表達水平。優選，可選擇標記多肽編碼鏈中的翻譯起始序列包含TTG起始密碼子。優選GTG或TTG起始密碼子的側面是提供對非ATG序列相對好地識別為起始密碼子的序列，以便至少某些核糖體從這些起始密碼子開始翻譯，即翻譯起始序列優選包含序列ACC[GTG或TTG起始密碼子]G或者GCC[GTG或TTG起始密碼子]G。在一個方面中，本發明提供了一種DNA分子，其包含編碼可選擇標記多肽的開放閱讀框序列，其中編碼鏈中的DNA分子包含選自由a)GTG起始密碼子和b)TTG起始密碼子所組成組的可選擇標記多肽的翻譯起始序列；其中與編碼可選擇標記蛋白質的原始開放閱讀框序列相比，編碼所述可選擇標記蛋白質的開放閱讀框序列已經被突變以替換至少10%的CpG二核苷酸(該序列中的所有"CG")。根據本發明，通過選擇可選擇標記多肽的表達，這類DNA分子可以用於獲得表達高水平感興趣的多肽的真核宿主細胞。接著，或者同時，可以鑑定一種或者多種表達感興趣的多肽的宿主細胞，並進一步用於表達高水平的感興趣的多肽。本文中顯示本發明可選擇標記基因(即具有TTG或GTG起始密碼子)中CpG含量的降低能夠引起感興趣的多肽提高的表達，其中所述感興趣的多肽是從同樣翻譯出可選擇標記多肽的多順反子轉錄單位中翻譯的。不希望受到理論的限制，相信，CpG含量的降低可以降低轉錄沉默的可能性，因為在真核細胞中CpG二核苷酸能夠被甲基化並沉默。具有相對高CpG含量的基因所編碼的可選擇標記多肽通常來自細菌序列，例如Zeocin和新黴素可以最大受益於CpG含量的降低，儘管已經發現具有相對低CpG含量的選擇基因的某些益處。在某些實施方式中，從編碼可選擇標記多肽的序列中除去CpG二核苷酸而不改變所編碼的胺基酸序列。可以通過利用遺傳密碼子的冗餘性完成這一點，並且對於分子生物學領域普通技術人員而言是公知並且常規的。期望在可選擇標記基因的編碼序列中至少10%的CpG二核苷酸已經被替換時，除去CpG二核苷酸的積極效果是明顯的。期望除去更多的CpG二核苷酸會提高效果，因此在某些實施方式中，與編碼可選擇標記蛋白質的原始幵放閱讀框序列相比，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的CpG二核苷酸被突變。在某些有利的實施方式中，與編碼可選擇標記多肽的原始開放閱讀框序列相比，編碼可選擇標記多肽的開放閱讀框序列中至少一半CpG二核苷酸被替換。SEQ.ID.NO.l(包含內部ATG)給出了編碼提供對Zeocin抗性的可選擇標記多肽的原始開放閱讀框序列，在該序列中第280位的A突變成T提供了缺少內部ATG的序列，其中在第94位內部編碼的甲硫氨酸被替換成為亮氨酸。對於本發明的DNA序列，起始密碼子(DNA序列的開始三個核苷酸)被突變成GTG起始密碼子或突變成TTG起始密碼子。在某些有利的實施方式中，可選擇標記多肽提供了針對Zeodn的抗性。在其某些實施方式中，DNA分子包含SEQ，ID.NO.1，其中至少一半CpG二核苷酸已經被替換而沒有突變所編碼的胺基酸序列，前提是起始密碼子(DNA序列的開始三個核苷酸)被替換為選自GTG或TTG的起始密碼子。在替換的實施方式中，DNA分子包含SEQ.ID.NO.1，其中第280位的核苷酸A被替換為T，以便第94位胺基酸(甲硫氨酸)被替換為亮氨酸，其中至少一半CpG二核苷酸已經被替換而沒有突變所編碼的胺基酸序列，前提是起始密碼子(DNA序列的開始三個核苷酸)被替換為選自GTG或TTG的起始密碼子。該實施方式在Zeodn抗性基因的編碼序列中缺少ATG序列，因此其適合本發明的多順反子轉錄單位，其中可選擇標記多肽的編碼序列在感興趣的多肽編碼序列的上遊。在本發明的一個優選實施方式中，DNA分子包含SEQ.ID.NO.3。SEQ.ID.NO.5(包含內部ATG)和SEQ.ID.NO.7(缺少內部ATG)中給出了編碼提供對新黴素抗性的可選擇標記多肽的原始開放閱讀框。在有利的實施方式中，這些序列可以包含一個或者更多個其他的突變，以便所編碼的多肽在第201位纈氨酸突變成甘氨酸(201V〉G)，第185位的穀氨酸突變成天冬氨酸(185E〉D)，或者都突變(185E〉D，201V>G)。在其他有利的實施方式中，可選擇標記多肽提供了針對新黴素的抗性。在本發明的某些實施方式中，DNA分子包含選自由a)SEQ.ID.N0.5，前提是至少一半CpG二核苷酸已經被替換而沒有突變所編碼的胺基酸序列，進一步的前提是起始密碼子(開始的ATG序列)被替換為GTG或TTG;b)SEQ.ID.NO.7，前提是至少一半CpG二核苷酸已經被替換而沒有突變所編碼的胺基酸序列，進一步的前提是起始密碼子(開始的ATG序列)被替換為GTG或TTG;和c)SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.7中任意一種所組成的組，與所指定序列編碼的序列相比，其包含突變以編碼新黴素抗性蛋白質變體，所述變體在所編碼蛋白質的第201位具有甘氨酸(201G變體)，或者在第185位具有天冬氨酸(185D變體)或者同時在第201位具有甘氨酸在第185位具有天冬氨酸(185D，201G變體)，前提是給定DNA序列中至少一半CpG二核苷酸已經被替換而沒有進一步突變所編碼的胺基酸序列，進一步的前提是起始密碼子(開始的ATG序列)被替換為GTG或TTG。例如185D變體是通過將所提供核酸序列中第553555位的密碼子替換為GAC而獲得的，例如201G變體是通過將給定核酸序列中第601~603位的密碼子替換為GGT而獲得的。在一個優選的實施方式中，DNA分子包含SEQ.ID.NO.9，前提是第555位的核苷酸A被替換為C(以編碼185E>D變體)，第602位的核苷酸T替換為G並且第603位的核苷酸G被替換為T(以編碼201V>G變體)，進一步的前體是啟動密碼子(第1~3位的ATG)被替換為GTG或TTG。對於本領域技術人員明顯的是本領域技術人員可以製備其他的變體而不離開本發明的教導，因此只要啟動密碼子不是ATG並且所編碼的蛋白質提供針對新黴素(或G418)的抗性則這些其他的變體也包含在本發明中。185D和201G變體進一步提高了本發明的選擇嚴格性。在某些實施方式中，可選擇標記多肽還包含與野生型對應物相比降低可選擇標記多肽活性的突變。這可以用於進一步提高選擇的嚴格性。作為非限制性實施例，可以對Zeocin抗性多肽中第9位的脯氨酸進行突變，例如突變成Thr或Phe，對於新黴素抗性多肽，則第182位或第261位的胺基酸或者兩個胺基酸都可以被進一步突變(參見例如WO01/32901)。原則上，本發明編碼可選擇標記多肽的DNA分子可以用於任何表達載體中，例如作為單順反子基因。他們提供了嚴格的選擇標準。然而在優選的實施方式中，編碼可選擇標記多肽的ORF是還包含編碼感興趣的多肽的ORF的多順反子轉錄單位的一部分。本發明的多順反子轉錄單位可以是例如包含編碼5'到3'為可選擇標記多肽和感興趣的多肽的序列的多順反子轉錄單位，或者例如包含編碼5'到3，為感興趣多肽和可選擇標記多肽的序列的多順反子轉錄單位。在前一種情況中，優選可選擇標記多肽的編碼序列在編碼鏈中不含ATG序列(參見WO2006/048459)。在後一種情況中，從可選擇標記多肽編碼序列的上遊編碼感興趣的多肽，並且內部核糖體進入位點(IRES)可操作地連接於編碼可選擇標記多肽的序列，因此可選擇標記多肽依賴IRES進行其翻譯(參見US2006/0141577)。因此，在一個實施方式中，本發明的多順反子轉錄單位按照下列順序包含a)啟動子；b)編碼可選擇標記蛋白質的序列；以及C)編碼感興趣蛋白質的序列。在另一個實施方式中，本發明的多順反子轉錄單位按照下列順序包含a)啟動子；b)編碼感興趣蛋白質的序列；以及C)內部核糖體進入位點(IRES)，其可操作地連接於d)編碼可選擇標記蛋白質的序列。在某些實施方式中，多順反子轉錄單位在第二順反子的下遊包含第三順反子，所述第三順反子優選可操作地連接於IRES,例如第三順反子是編碼第二可選擇標記多肽。在某些實施方式中這種第二可選擇標記多肽是DHFR，優選具有GTG或TTG起始密碼子以能夠在dhfr缺陷型細胞中進行連續選擇(參見例如PCT/EP2007/0516%，在本文中通過參照併入)。在某些實施方式中，本發明提供了包含本發明DNA分子的表達盒，其中所述表達盒在本發明多順反子轉錄單位的上遊包含啟動子，以及在本發明多順反子轉錄單位的下遊包含轉錄終止序列。在真核宿主細胞中，所述表達盒是有功能的，用於驅動多順反子轉錄單位的轉錄。在本文中所使用的"表達盒"是至少包含功能上連接於期望表達序列的啟動子的核酸序列。優選，表達盒還包含轉錄終止和聚腺苷酸化序列。適當的啟動子和轉錄終止/聚腺苷酸化序列的例子是公知的，並易於被本領域技術人員獲得，例如在WO2006/048459，第28~29頁中所討論的，在本文中通過參照併入。還可以包含其他調控序列例如增強子。啟動子必須能夠在真核宿主細胞中發揮作用，即其必須能夠驅動轉錄單位的轉錄。因此，啟動子可操作地連接於轉錄單位。表達盒可以可選擇地還包含本領域中己知的其他元件例如剪切位點以包含內含子等。在可選擇標記多肽是在感興趣的多肽的下遊被編碼的實施方式中，IRES被可操作地連接於包含編碼可選擇標記多肽序列的順反子。在可選擇標記多肽是在感興趣的多肽的上遊被編碼的實施方式中，編碼可選擇標記多肽的序列在編碼鏈中不包含ATG序列。本文中所使用的"內部核糖體進入位點"或"IRES"是指促進內部核糖體直接進入起始密碼子的元件，例如通常為順反子(編碼蛋白質的區域)的ATG，但在本發明中優選為GTG或TTG，使得基因不依賴於帽進行翻譯。IRES序列和其應用對於本領域技術人員是公知的，如在US2006/0141577和PCT/EP2007/051696中所教導的，在本文中通過參照併入US2006/0141577和PCT/EP2007/051696。還參見例如JacksonRJ，HowellMT，KaminskiA(1990)TrendsBiochemSci15(12):477-83)，JacksonRJandKaminski,A.(1995)RNA1(10):985-1000，Martinez-Salas，1999，Venkatesan&Dasgupta，2001，Rees等人，1996和Mizuguchi等人，2000。在US2006/0141577(其中的SEQIDNO.127)的實施例19中提供了適當的IRES序列的例子，在本文中通過參照併入。可以通過本領域技術人員能夠利用的標準分子生物學方法產生本發明的DNA分子。例如，可以通過常規的方法對原始序列例如來自商業上可以獲得的質粒進行突變。此外，目前還可以任意合成(如果需要，使用亞克隆步驟)具有可選擇標記多肽ORF的充分長度的DNA序列，目前這類合成的DNA序列可以從各種公司商業訂購。因此，根據本發明的教導，本領域技術人員可以設計本發明編碼可選擇標記多肽的適當序列(具有GTG或TTG起始密碼子，CpG含量降低，在某些實施方式中不包含內部ATG)，合成該序列，並且通過將該DNA分子引入到真核宿主細胞中對DNA分子測試所編碼可選擇標記的功能，以及測試發揮功能的可選擇標記多肽的表達。這些序列的商業可獲得性使得便於提供缺少內部的ATG編碼選擇標記的序列而沒有過分的壓力，其中選擇標記多肽的野生型序列包含某些這類的內部ATG(參見WO2006/048459)。在某些實施方式中，本發明的DNA分子是載體如質粒的一部分。通過本領域技術人員公知的方法，容易對這些載體進行處理，例如可以被設計成能夠在原核細胞和/或真核細胞中複製。另外，許多載體可以直接或者以從其分離的期望片段的形式用於轉化真核細胞，並能夠全部或部分整合到這些細胞的基因組中，得到在它們的基因組中包含期望核酸的穩定宿主細胞。所使用的載體可以是任何適合克隆DNA的載體，並能夠用於感興趣核酸的轉錄。在使用宿主細胞吋，優選所述載體是整合型載體。可替換的，所述載體可以是游離複製型載體。廣泛接受的是染色質結構和其它外遺傳調控機制可以影響轉基因在真核細胞中的表達(例如Whitelaw等人，2001)。本發明的多順反子表達單位形成了選擇體系的一部分，其具有相當嚴格的選擇方案。通常，這需要在所選擇宿主細胞中的高轉錄水平。為了提高發現在嚴格選擇方案中存活的宿主細胞克隆的機會，並可能提高在所獲得克隆中表達的穩定性，通常優選提高轉錄的可預測性。因此，在優選的實施方式中，本發明的表達盒還包含至少一個染色質調控元件。本文中所使用的"染色質調控元件"是能夠以某種方式影響染色質結構，進而在真核細胞中影響鄰近轉基因的表達水平和/或穩定性(它們順式發揮作用，因此優選置於距離轉基因5kb以內，更優選在2kb以內，更加優選在lkb以內)的DNA序列的總稱。優選這類染色質調控元件選自由絕緣子序列、遍在染色質開放元件(UCOE)、基質或支架附著區(MAR/SAR)和抗阻抑物(STAR)序列所組成的組。在WO2006/048459第32~37頁提供了染色質調控元件的例子以及獲得和使用它們以及功能上進行測試的方法，通過參照併入本文中。在某些實施方式中，所述至少一個染色質調控元件是抗阻抑物元件，其選自由WO2006/048459中SEQ.ID.NO.1~SEQ.ID.NO.66的任何一種及其片段所組成的組。在其某些實施方式中，所述表達盒包含WO2006/048459的SEQ.ID.NO.66或其片段，其位於驅動多順反子轉錄單位轉錄的啟動子的上遊。在其它一些實施方式中，多順反子轉錄單位的兩側連接至少一個抗阻抑物序列，所述抗阻抑物序列選自由WO2006/048459中SEQ.ID.NO.1~SEQ.ID.NO.65的任何一種或其片段所組成的組。優選，所述染色質調控元件選自由STAR67、STAR7、STAR9、STAR17、STAR27、STAR29、STAR43、STAR44、STAR45、STAR47、STAR61或所述STAR序列的功能片段或衍生物所組成的組(參見例如WO2006/048459獲得這些STAR元件的序列和優選應用，通過參照併入本文中)。本發明的感興趣的多肽可以是任何蛋白質，並且可以是單體蛋白質或者多聚體蛋白質(的一部分)。多聚體蛋白質包含至少兩條多肽鏈。本發明感興趣蛋白質的非限制性例子是酶、激素、免疫球蛋白鏈、諸如抗癌蛋白質的治療性蛋白質、諸如VIII因子的血液凝集蛋白質、諸如紅細胞生成素的多功能蛋白質、診斷性蛋白質，或者可以用於免疫目的的蛋白質或其片段，所有都是本領域技術人員已知的。感興趣的多肽可以來自任何來源，在某些實施方式中是哺乳動物蛋白質、人工蛋白質(例如融合蛋白或突變的蛋白質)，並優選是人蛋白質。包含本發明的多順反子轉錄單位和/或表達盒的DNA分子可以用於提高核酸的表達，優選在宿主細胞中。術語"細胞"/"宿主細胞"和"細胞系"/"宿主細胞系"通常分別被定義為通過本領域中已知的方法可以維持在細胞培養中並且具有表達異源或同源蛋白質能力的細胞和其均一的群體。本發明還提供了包含本發明DNA分子或表達盒的宿主細胞。原核宿主細胞可以用於繁殖和/或使用本發明的DNA分子進行遺傳工程。本發明的DNA分子，特別是出現在質粒上時能夠在原核宿主細胞例如細菌中複製。根據本發明的宿主細胞優選是真核細胞，更優選哺乳動物細胞，例如嚙齒類動物(例如小鼠、倉鼠)細胞或人細胞或者不同細胞的融合。在某些非限制性實施方式中，所述細胞是U-20S骨肉瘤、HEK293、HuNS-l骨髓瘤、WERI-Rb陽l眼癌、BHK、COS、Vero、非分泌性小鼠骨髓瘤Sp2/0-Ag14、非分泌性小鼠骨髓瘤NSO、NCI-H295R腎上腺癌或PEILC6②細胞。對於本發明的目的，PER.C6細胞的意思是在ECACCno.96022940保藏的細胞(參見例如美國專利5,994,128)傳代的上遊或下遊，或者其上遊或下遊的派生物即具有這些細胞特徵。之前已經顯示這些細胞能夠以高水平表達蛋白質(例如WO00/63403和Jones等人，2003)。在某些優選的實施方式中，宿主細胞是CHO(中國倉鼠卵巢)細胞，例如CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44、CHO-DUKXB11等。在某些實施方式中，所述CHO細胞具有dhfr—表型。這些真核宿主細胞能夠表達期望的多肽，並且通常用於該目的。能夠通過將本發明的DNA分子優選以表達盒的形式引入到細胞中，獲得這些真核宿主細胞。優選，表達盒被整合到宿主細胞的基因組中，在各種宿主細胞中可以整合在基因組的不同位置中，選擇將提供轉基因被整合到適當位置的克隆，這得到了在表達水平、穩定性、生長特徵等方面具有期望性能的宿主細胞克隆。可替換的，可以靶向或隨即選擇轉錄單位用於整合到轉錄活躍的染色體區域例如在基因組中所存在啟動子的後面。優選，宿主細胞來自根據本領域技術人員己知的標準程序可以選擇並增殖的穩定克隆。如果細胞包含編碼感興趣的多肽的轉錄單位，則這類克隆的培養物能夠產生感興趣的多肽。本發明還提供了一種產生能夠表達感興趣多肽的宿主細胞的方法，所述方法包括步驟a)將本發明的DNA分子或表達盒引入到多個前體細胞中，b)在適合表達可選擇標記多肽的條件下培養這些前體細胞，以及c)選擇至少一個表達所述可選擇標記多肽的宿主細胞。完成對可選擇標記多肽表達的選擇，例如通過施加選擇壓力(例如在存在選擇劑時培養)，並將保證在本發明的多順反子轉錄單位和表達盒中感興趣的多肽的表達。在所獲得克隆與期望多肽高表達的克隆的比例方面，該新型方法提供了非常好的結果使用相同濃度的選擇劑獲得了比使用已知的選擇系統少得多的集落，以及相對高比例的所獲得克隆以高水平產生感興趣的多肽。本發明還提供了一種生產感興趣的多肽的方法，其包括培養包含本發明表達盒的宿主細胞，以在所述細胞中表達編碼感興趣蛋白質的核酸。在優選的實施方式中，從所述細胞或這從培養基中或者同時從兩者中收穫感興趣的蛋白質。在優選的實施方式中，所述細胞是哺乳動物細胞，例如CHO細胞。可以通過多種方法之一完成在細胞中引入待表達的核酸，同樣這也是本領域技術人員所已知的，也依賴於所要引入核酸的模式。所述方法包括但不限於轉染、感染、注射、轉化等。在某些實施方式中至少在培養過程中的部分時間內，在培養基中存在選擇劑，其濃度足以選擇表達可選擇標記多肽的細胞，或者以較低的濃度。在其他實施方式中，如果表達多肽，則在生產階段，在培養基中不再出現選擇劑。進行培養細胞，以使其能夠代謝和/或生長和/或分裂和/或生產感興趣的重組蛋白。這可以通過本領域技術人員熟知的方法完成，其包括但不限於為細胞提供營養物。這些方法包括附著到表面的生長，在懸浮液中的生長，或其組合。例如可以在盤、滾瓶或者在生物反應器中使用分批系統、補料分批系統、連續系統例如灌注系統等進行培養。為了達到通過細胞培養大規模(連續)生產重組蛋白質，本領域中優選使用能夠在懸浮液中生長的細胞，並且優選使用在無血清甚至無蛋白質的培養基中能夠生長的細胞。細胞生長和繁殖的條件(參見例如TissueCulture,AcademicPress,Kruse和Paterson，編輯(1973))以及表達重組蛋白的條件是本領域技術人員已知的。通常，可以在哺乳動物細胞生物技術實用方法(MammalianCellBiotechnology:aPracticalApproach)(M.Butler，ed.，IRLPress,1991)中發現用於使哺乳動物培養物產量最大化的原理、方案和實用技術。在優選的實施方式中，從細胞或者從培養基或者從二者收集(分離)表達的蛋白質。接著可以使用己知的方法進行進一步純化，例如通過本領域技術人員公知的方法進行過濾、柱層析等。顯然，在最終目的不是生產感興趣的多肽，而是RNA本身時，也可以使用該結構的表達盒，例如用於從表達盒來生產量提高的RNA，其可以用於調節其他基因的目的(例如RNAi，反義RNA)、基因治療、體外蛋白質生產等。除非以其他方式明確說明，本發明的實踐將採用在本領域技術範圍內的免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA的傳統技術。參見，例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆實驗室手冊第2版(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedition),1989;分子生物學當前方案(CmrentProtocolsinMolecularBiology),AusubelFM，etal，eds，1987;酶學系列手冊(theseriesMethodsinEnzymology)(AcademicPress,Inc.);PCR2:實用方法(PCR2:APracticalApproach),MacPhersonMJ，HamsBD，TaylorGR,編輯，1995;抗體實驗室手冊(Antibodies:ALaboratoryManual),Harlow和Lane，編輯，1988。在下面的實施例中對本發明進行進一步解釋。這些實施例不以任何方式限制本發明。它們僅僅是為了闡明本發明。實施例實施例1:從編碼可選擇標記的序列除去CpG二核苷酸提高了使用本發明選擇方法的表達使用可選擇標記的不同翻譯起始密碼子如GTG或TTG的選擇方法可以達到非常嚴格的選擇，並且感興趣的多肽非常高水平地產生感興趣的多肽(參見WO2006/048459和US2006/0141577，例如後者中的實施例119)。在該實施例中，通過除去CpG二核苷酸對可選擇標記多肽基因本身的編碼區進行修飾。基本原理是CpG核苷酸中的C核苷酸可以傾向於甲基化，這可能導致可選擇標記的基因沉默，因此除去CpG二核苷酸可能改進結果。採用具有TTG起始密碼子的Zeocin抗性基因作為標記，儘可能除去CpG二核苷酸，而不改變Zeocin抗性蛋白質的胺基酸序列，進一步不在編碼鏈中引入ATG序列以防止在Zeocin抗性蛋白質的編碼區中不期望的翻譯起始(例如在WO2006/048459中所解釋的)。因此，某些CG未被除去。原始序列的CpG含量(此處:包含TTG起始密碼子，突變以除去內部ATG序列)為13.3%，而在CpG突變之後，CpG含量降低到1.8%[稱作"TTGZeo(貧CpG)"]。在d2EGFP編碼區的上遊克隆CpG含量降低的Zeocin抗性基因以得到多順反子表達構建體。檢測d2EGFP的表達水平。製備構建體，其在CMV啟動子的上遊包含STAR7和67，接著是TTGZeo(貧CpG)選擇標記(GeneArtGmbH，Regensburg，Germany合成，參見SEQ.ID.NO3;參見SEQ.ID.NO.l，具有天然CpG含量的Zeocin抗性編碼序列)，d2EGFP基因和STAR7(圖1)。將這些構建體轉染到CHO-K1細胞。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)轉染DNA，在補加10%FBS(Invitrogen)的HAM-F12培養基(Invitrogen)中存在150pg/mlZeocin時培養細胞。在以對照"富CpG"TTGZeo構建體轉染後出現了8個集落(圖1中的A)，而在轉染包含"貧CpG"TTGZeo的構建體後則沒有出現集落(圖1中的C)。相反，如果構建體中包含STAR7/67-7，則使用"富CpG"TTGZeo(圖1中的B)選擇標記和使用"貧CpG"TTGZeo(圖1中的D)選擇標記都會出現超過24個集落。使用"富CpG"TTGZeo選擇標記(圖1中的A)，禾U用STAR-少的對照構建體，d2EGFP的平均表達為140，而利用包含STAR的構建體，d2EGFP的平均表達為1332(圖1中的B)。這是由於存在STAR元件的提高。使用包含STAR的構建體以及"貧CpG"TTGZeo，d2EGFP的平均表達為2453(圖1中的D)，與使用"富CpG"TTGZeo(圖1中的B)相比，幾乎提高了兩倍。此外，使用"富CpG"TTGZeo(B)達到的最高d2EGFP值是2481，使用"貧CpG"TTGZeo(D)達到的最高值是4308。我們得出結論降低Zeocin標記基因的CpG含量提高了選擇系統的嚴格性。這達到了如果構建體中包含STAR元件則d2EGFP表達值較高，而使用對照構建體則沒有集落。還將相同的構建體轉染CHO-DG44細胞。這是使用Lipofectamine2000(Invitrogen)進行的，並使用在培養基中的150pg/mlZeocin進行選擇。該培養基由HAMF12:DMEM-1:1，加上10°/。胎牛血清構成。利用"富CpG"TTGZeocin選擇標記，通過STAR-少的對照構建體，d2EGFP的平均表達為43(圖2中的A)，通過包含STAR的構建體，d2EGFP的平均表達為586(圖2中的B)。這是由於存在STAR元件的提高。利用STAR構建體和"貧CpG"Zeo，平均d2EGFP表達為1152(圖2中的D)，與"富CpG"TTGZeo(圖2中的D)相比，提高了幾乎兩倍。此外，使用"富CpG"TTGZeo構建體達到的最高d2EGFP值是1296(圖2中的B)，使用"貧CpG"TTGZeo構建體則到達的最高值時2416(圖2中的D)。與使用"貧CpG"TTGZeo構建體沒有出現對照集落(圖1中的C)的CHO-K1相反，使用CHO-DG44出現了對照集落，但平均d2EGFP值是52，集落中最高值是15(圖2中的C)。我們得出結論，同樣在CHO-DG44中，向構建體加入"貧CpG"TTGZeo選擇標記達到了在採用STAR元件時的高蛋白質表達。實施例2:在本發明的選擇系統中新黴素抗性編碼序列的修飾在該實施例中，除了起始密碼子外，還修飾了新黴素抗性基因的編碼區，其通過儘可能多地除去新黴素抗性基因的CpG二核苷酸(ATG-少，因此已經排除了編碼鏈中的ATG序列)，而沒有改變新黴素抗性蛋白質的胺基酸序列(與野生型序列相比，除了Me^Leu突變夕卜，在該突變處內部ATG序列符合閱讀框並且被替換為CTG:顯然這是由於從編碼鏈中除去ATG序列並且獨立於降低CpG含量的努力，參見WO2006/04845的實施例17)，在編碼鏈中沒有引入新的ATG序列，這與在實施例1種對Zeocin抗性基因所進行的一樣。野生型新黴素選擇標記基因的CpG含量為10.4%(SEQ.ID.NO.5)，而改變後，CpG含量降低到2.3。/。(SEQ.ID.N0.9)。在該實施例中包含新黴素抗性基因的構建體是從GeneArtGmbH，Regensburg，德國訂購的。作為起始密碼子，在該實施例中使用TTG。因此，所使用的序列由SEQ.ID.NO.9構成，前提是起始密碼子(開始三個核苷酸，ATG)被替換為TTG起始密碼子，進一步在某些情況中包含下面所提到突變之一。在"貧CpG"新黴素抗性基因中，進行某些突變以改變新黴素抗性蛋白質中的胺基酸，以測試在本發明的多順反子轉錄單位中使用時，是否這些突變對所感興趣多肽的表達水平有影響。這些突變(Sautter等人，2005;注意與(Sautter等人，2005)所使用的序列相比，在本發明中所使用的neo序列編碼在緊接著起始密碼子後的三個額外胺基酸，因此本申請中的胺基酸編號比在(Sautter等人，2005)中的編號高三個數)由下列構成第201位胺基酸纈氨酸(Sautter等人，2005中的第198位)改變成第201位甘氨酸(TTGNeo201V>G)，第185位穀氨酸(Sautter等人，2005中的第182位)改變成第185位天冬氨酸(TTGNeo185E>D)，以及第201位纈氨酸和第185位穀氨酸分別改變成第201位甘氨酸和第185位天冬氨酸的雙突變(TTGNeo185E>D/201V〉G)(圖3)。將這些修飾與對照新黴素(貧CpG的TTGNeo185E/201V)進行比較。在所有情況中，製備具有或沒有STAR元件的構建體(圖3)。將修飾的TTGNeo選擇標記併入到構建體中，所述構建體在CMV啟動子的上遊包含STAR7和67，接著是所述TTGNeo選擇標記、d2EGFP基因和STAR7(圖3)。將構建體轉染到CHO-Kl細胞。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)轉染DNA，在補加10%FBS(Invitrogen)的HAM-F12培養基(Invitrogen)中存在500ng/mlG418遺傳黴素時培養細胞。使用對照Neo構建體(185E/201V)，僅觀察到STAR元件非常有限的影響。這可能至少部分是由於在500pg/mlG418遺傳黴素下所產生的許多集落，這說明TTG新黴素修飾的嚴格性低。然而，具有本發明修飾的新黴素是可以運行的在TTGNeol85E201V構建體中，從新黴素抗性基因的編碼鏈中除去所有ATG，儘管d2EGFP值低，但明顯ATG的除去仍能夠在遺傳黴素選擇壓力下進行正常的選擇。在進一步修飾新黴素抗性基因時，觀察到了加入STAR元件的顯著影響。21個TTGNeo201V>G對照集落的平均值是65(圖3中的A2)，而24個具有STAR元件的TTGNeo201V>G集落的平均d2EGFP信號是150(圖3中的B2)。使用TTGNeo185E>D突變，進一步提高了選擇嚴格性，因為沒有STAR元件的話，沒有對照集落存活(圖3中的A3)，而17個存活的TTGNeo185E>DSTAR集落的平均d2EGFP信號是204(圖3中的B3)。這意味著GFP螢光比TTGNeo201V>G集落的螢光高(圖3中的B2)。與TTGNeo201V>G集落中最高值433相比，TTGNeo185E〉D201V〉G集落中d2EGFP的最高值是715，(比較圖3中的B3禾HB2)。沒有對照集落存活(圖3中的A4)而7個存活的STARTTGNeo185E>D201V>G集落的平均d2EGFP值是513，最高d2EGFP值是923(圖3中的B4)。結論是引入特定的突變提高了根據本發明在使用新黴素抗性基因時的選擇嚴格性。這些修飾中的某些將該選擇嚴格性轉移到了新黴素抗性基因，其僅在併入STAR元件之後才能由於高表達值而存活。這伴隨著達到了更高的d2EGFP表達值。顯然，本文所描述的新黴素抗性基因的有利實施方式進一步提高了該基因用於根據本發明應用的適當性。明顯的是在將新黴素抗性蛋白質置於IRES調控下時(參見，例如US2006/0141577的實施例19)，CpG含量降低並具有GTG或TTG起始密碼子並具有指定突變(185E〉D和/或201V〉G)的新黴素抗性基因的構造也能夠被置於所感興趣的多肽(這裡使用d2EGFP作為模型)編碼序列的下遊。對於Zeocin抗性基因也一樣(實施例1)。在這種情況中，不需要關注CpG而據核苷酸的突變會引入ATG序列。在這些實施方式中，也期望能夠得到良好的結果，即CpG含量的降低以及在可選擇標記蛋白質編碼序列中指定位點的突變會提高表達水平。參考文獻JonesD，KroosN，AnemaR，VanMontfortB,VooysA，VanDerKraatsS，VanDerHelmE，SmitsS，SchoutenJ，BrouwerK,LagerwerfF，VanBerkelP，OpsteltenD-J，LogtenbergT，BoutA(2003)High-levelexpressionofrecombinantIgGinthehumancelllinePER.C6.萬/o/ec/zwo/.19:163-168.KozakM.(1986)PointmutationsdefineasequenceflankingtheAUGinitiatorcodonthatmodulatestranslationbyeukaryoticribosomes.Ce〃44:283-292.KozakM.(1987)Ananalysisof5'-noncodingsequencesfrom699vertebratemessengerRNAs.TVwc/e/d^Was.15:8125-8148.KozakM.(1989)Contexteffectsandinefficientinitiationatnon-AUGcodonsineucaryoticcell-freetranslationsystems.M/Ce//傷o/.9:5073-5080.KozakM.(1990)Downstreamsecondarystructurefacilitatesrecognitionofinitiatorcodonsbyeukaryoticribosomes,屍racTV""/87:8301-8305.KozakM.(1997)RecognitionofAUGandalternativeinitiatorcodonsisaugmentedbyGinposition+4butisnotgenerallyaffectedbythenucleotidesinpositions+5and+6.￡細0J.16:2482-2492.KozakM.(2002)加大掃描機制的限制用於起始翻譯(Pushingthelimitsofthescanningmechanismforinitiationoftranslation),Gewe299:1-34.Martinez-Salas，E.(1999)InternalribosomeentrysitebiologyanditsuseinexpressionvectorsCm/tO//"萬/0/ec/7w0//0，458-64.Mizuguchi，H，Xu，Z，Ishii-Watabe，A，Uchida，E，andHayakawa，T.(2000)IRES-dependentsecondgeneexpressionissignificantlylowerthancap-dependentfirstgeneexpressioninabicistronicvectorMo/7Tzer/，376-82.Rees，S，Coote，J，Stables,J，Goodson，S，Harris,S，andLee，MG.(1996)Bicistronicvectorforthecreationofstablemammaliancelllinesthatpredisposesallantibiotic-resistantcellstoexpressrecombinantprotein所她c—i/es20，102-104，106，108-110.Sautter,K，Enenkel，B.2005.Selectionofhigh-producingCHOcellsusingNPTselectionmarkerwithreducedenzymeactivity.歷ofec/z"o/89，530-538.Venkatesan，A，andDasgupta,A.(2001)Novelfluorescence-basedscreentoidentifysmallsyntheticinternalribosomeentrysiteelementsM/Ce//說o/2/，2826-37.Whitelaw，E，Sutherland,H，Kearns，M，Morgan,H，Weaving,L，andGarrick，D.(2001)EpigeneticeffectsontransgeneexpressionAfeAo^feAfo/5/o〃5S，351-68.權利要求1、一種DNA分子，其包含編碼可選擇標記多肽的開放閱讀框序列，其特徵在於所述DNA分子在所述可選擇標記多肽的編碼鏈中具有GTG起始密碼子或TTG起始密碼子，並且，與編碼所述可選擇標記蛋白質的原始開放閱讀框序列相比，編碼所述可選擇標記蛋白質的開放閱讀框序列已經被突變，以替換其至少一半的CpG二核苷酸。2、根據權利要求1所述的DNA分子，其中所述起始密碼子是TTG。3、根據權利要求1或2所述的DNA分子，其中所述可選擇標記多肽提供針對Zeodn或針對新黴素的抗性。4、根據權利要求3所述的DNA分子，其包含編碼提供針對Zeocin抗性的多肽的開放閱讀框序列，其中所述DNA分子包含以下序列中的一種a)SEQ.ID.NO.1，前提是至少一半的CpG二核苷酸已經被替換，而沒有突變其所編碼的胺基酸序列，進一步的前提是所述起始密碼子是GTG或TTG;禾口b)SEQ.ID.NO.1，其中第280位的核苷酸A被替換為T，前提是至少一半的CpG二核苷酸已經被替換，而沒有突變其所編碼的胺基酸序列，進一步的前提是所述起始密碼子是GTG或TTG。5、根據權利要求4所述的DNA分子，其包含SEQ.ID.N0.3。6、根據權利要求3所述的DNA分子，其包含編碼提供針對新黴素抗性的多肽的開放閱讀框序列，其中所述DNA分子包含選自以下一組中的序列a)SEQ.ID.NO.5，前提是至少一半的CpG二核苷酸已經被替換，而沒有突變其所編碼的胺基酸序列，進一步的前提是所述起始密碼子是GTG或TTG;和b)SEQ.ID.NO.7，前提是編碼鏈至少一半的CpG二核苷酸已經被替換，而沒有突變其所編碼的胺基酸序列,進一步的前提是所述起始密碼子是GTG或TTG;和c)SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.7，前提是與原始序列所編碼的多肽相比，其包含突變以編碼下列多肽變體中的任何一種(i)第201位的纈氨酸置換成甘氨酸(201V〉G)，或(ii)第185位的穀氨酸置換成天冬氨酸(185E〉D)，或(iii)突變(i)和(ii)的組合(185E〉D和201V>G)，進一步的前提是，編碼鏈至少一半的CpG二核苷酸己經被替換，而除了(i)(iii)中所指定的突變外，沒有進一步突變所編碼的胺基酸序列，進一步的前提是所述起始密碼子是GTG或TTG。7、根據權利要求6所述的DNA分子，其包含SEQ.ID.N0.9，前提是第555位的核苷酸A被替換為C，第602位的核苷酸T被替換為G，第603位的核苷酸G被替換為T，進一步的前提是所述始密碼子是GTG或TTG。8、根據權利要求1~7中任一項所述的DNA分子，其中所述編碼可選擇標記多肽的開放閱讀框序列是還包含編碼感興趣的多肽的開放閱讀框序列的多順反子轉錄單位的一部分。9、根據權利要求8所述的DNA分子，其中所述編碼可選擇標記多肽的開放閱讀框在編碼感興趣的多肽的開放閱讀框的上遊，並且其中編碼可選擇標記多肽的開放閱讀框在編碼鏈中沒有ATG序列。10、根據權利要求8所述的DNA分子，其中所述編碼感興趣的多肽的開放閱讀框在編碼可選擇標記多肽的開放閱讀框的上遊，並且其中所述編碼可選擇標記多肽的開放閱讀框可操作地連接於內部核糖體進入位點(IRES)。11、一種表達盒，其包含根據權利要求810中任一項所述的DNA分子，所述表達盒在所述多順反子表達單位的上遊包含啟動子，在所述多順反子表達單位的下遊包含轉錄終止序列。12、根據要求ll所述的表達盒，其還包含至少一個染色質調控元件。13、一種宿主細胞，其包含權利要求110中任一項所述的DNA分子，或者權利要求11或12所述的表達盒。14、一種產生能夠表達感興趣的多肽的宿主細胞的方法，所述方法包括下列步驟a)將權利要求810中任一項所述的DNA分子或權利要求11或12所述的表達盒引入到多個前體細胞中，b)在適合所述可選擇標記多肽表達的條件下培養所述多個前體細胞，以及c)選擇至少一個表達感興趣的多肽的宿主細胞。15、一種表達感興趣的多肽的方法，其包括培養包含權利要求11或12所述表達盒的宿主細胞，以及從所述表達盒表達所述感興趣的多肽。16、根據權利要求16的方法，其還包括收穫所述感興趣的多肽。全文摘要本發明提供了一種DNA分子，其包含編碼可選擇標記多肽的開放閱讀框序列，其中編碼鏈中的所述DNA分子包含具有GTG起始密碼子或TTG起始密碼子的可選擇標記多肽的翻譯起始序列，其中，與編碼所述可選擇標記蛋白質的原始開放閱讀框序列相比，編碼所述可選擇標記蛋白質的開放閱讀框序列被替換其至少一半的CpG二核苷酸。文檔編號C12N15/67GK101437946SQ200780015813公開日2009年5月20日申請日期2007年4月24日優先權日2006年5月2日發明者A·P·奧特,H·J·M·范布洛克蘭,R·G·A·B·賽沃爾特,T·H·J·克瓦克斯申請人:科羅邁吉尼科斯公司