一株糞產鹼桿菌突變株及用它製備可得然膠的方法

2023-11-05 07:57:37 3

一株糞產鹼桿菌突變株及用它製備可得然膠的方法
【專利摘要】本發明公開了一株糞產鹼桿菌突變株及用它製備可得然膠的方法。該糞產鹼桿菌突變株的保藏編號為CGMCC?No.9291。以上述菌株製備可得然膠的方法，包括斜面培養、種子培養、發酵和後提取工藝。其中後提取為：發酵液中溶菌酶，攪拌均勻後離心分離，固形物加入水，攪拌後再次離心分離；取固形物加入乙醇，攪拌均勻後板框壓濾，乾燥得到產品。本發明的發酵初糖濃度高達7％，分批發酵最終膠得率高達4.8％，且發酵過程中發酵液不粘稠，傳質傳氧效果良好，該菌株發酵過程中所用碳酸鈣用量僅為0.05％，發酵結束後碳酸鈣幾乎無殘留，提取得到的產品純度可高達90％以上。所得膠體為半透明狀，韌性佳，後處理工藝簡單易行。
【專利說明】一株糞產鹼桿菌突變株及用它製備可得然膠的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種可得然膠的製備方法，具體是涉及一株糞產鹼桿菌突變株，用它 發酵生產可得然膠的方法及產品後提取的方法。

【背景技術】
[0002] 可得然膠（Curdlan)是一種新型的微生物胞外多糖，由於該多糖具有在加熱條件 下形成凝膠的獨特性質，故又稱作熱凝膠。化學與酶學分析都已確定，可得然膠是由單一的 D-葡萄糖在C1和C3位置以β-1，3-糖苷鍵連接而成的無分支的均一多糖聚合物。一般 情況下，每個可得然膠分子由300-500個葡萄糖殘基組成，平均聚合度為450,相對分子量 約為74000,分子式為（C 6H1(l05)n，n>250。據分析，分子聚合度的不同可能是由於菌種及發 酵條件不同造成的，菌種及發酵過程中的供氧及營養狀況都會影響可得然膠的聚合度，從 而影響可得然膠的質量。凝膠強度隨著聚合度值的變化而變化，當聚合度小於50時，可得 然膠在水中不能形成凝膠，當聚合度較低時，形成的凝膠強度較小，隨著聚合度的增高，凝 膠強度變大。通常情況下，由300-500個葡萄糖殘基連接而成的可得然膠就具有較強的熱 凝膠特性。可得然膠具有許多特殊的理化性質，在生物醫學和食品加工等領域有廣闊的應 用前景。美國FDA於1996年準許將其作為食品的穩定劑、增稠劑和調質劑應用於食品配料 中。可得然膠因此成為繼黃原膠、結冷膠之後第三個經FDA批准的發酵生產的食品用多糖， 這為可得然膠的進一步推廣應用提供了更為廣闊的空間，可得然膠的應用與食品開發也達 到了一個新的水平。我國於2006年正式批准可得然膠為食品添加劑新品種。
[0003] 目前，可得然膠主要採用土壤桿菌Agrobacterium biovarl或糞產鹼桿菌 Alcaligenes faecalis發酵蔗糖或葡萄糖製備而來，所用氮源則為酵母膏，這就導致發酵 產品顏色偏暗，且皆存在發酵效率偏低以及碳酸鈣用量偏高而導致發酵結束後碳酸鈣大量 殘留，從而出現產物純度低、透明度低且可得然膠強度偏低等問題。由於存在上述問題，想 要取得高質量的產品需要進行繁瑣複雜的提取工藝，同時提取過程中還容易造成可得然膠 的強度遭受破壞，產生大量的廢品。如申請號為200410041271.8(發明名稱為：一種微生 物多糖-熱凝膠的提取工藝）的中國專利，其精品熱凝膠的提取過程需要經過高濃度鹼溶 液，高轉速離心，大量鹽酸回調及大量水洗滌等過程，不僅工藝複雜，容易破壞凝膠強度，而 且汙染嚴重，不適合大批量生產，而且最終所得產品純度僅為83-86% ;未經酸鹼處理直接 離心洗滌得到的產品，純度僅為66. 7%。申請號為201110218879. 3 (發明名稱：可得然膠 的後提取方法）的中國專利，其整個提取過程雖然用到酶處理除雜，但同樣需經過大量酸 鹼處理及大量水洗滌。


【發明內容】

[0004] 本發明克服了上述現有技術的不足，通過突變篩選得到了一株新的糞產鹼桿菌菌 株JSYM-1。本發明以葡萄糖、蔗糖及無機氮源為原料，採用該糞產鹼桿菌突變株JSYM-1發 酵生產可得然膠，發酵液中碳酸鈣加量僅為0. 05%，發酵結束後幾乎無殘留，後提取工藝簡 單易行，提取得到的產品純度可高達90%以上。
[0005] 本發明的糞產鹼菌（Alcaligenes faecalis)JSYM-l，是以糞產鹼桿菌CICC20602 為出發菌株，經紫外線、亞硝基胍誘變處理並塗布高糖苯胺藍篩選培養基分離篩選得到的 高產菌株，該菌株的生長活性好，發酵製備的可得然膠聚合度高，得率高。該菌株已於2014 年6月11日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北 京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所），保藏編號為CGMCC No. 9291。
[0006] 以該糞產鹼桿菌突變株JSYM-1製備可得然膠的方法，具體包括以下步驟：
[0007] (1)斜面培養：
[0008] 將糞產鹼桿菌突變株劃線接種於斜面培養基，於28-30°C靜置培養48-72hr，4°C 冰箱保藏1個月內可使用；
[0009] ⑵種子培養：
[0010] 將步驟（1)的培養物接種於種子培養基中，於28-30°C，通氣攪拌培養18-26hr，得 到種子液；
[0011] ⑶發酵：
[0012] 將步驟（2)的種子液接種於發酵培養基中，接種量為1-10%，28-3(TC，通氣攪拌 培養 84-96hr ;
[0013] ⑷後提取工藝：
[0014] 發酵結束後，向發酵液中加入l〇-l〇〇ppm的溶菌酶（溶菌酶單位為50-500萬）， 維持發酵液溫度在28-32°C，保溫低速（速度為60-80轉/分鐘）攪拌30-40min ;取發酵液 進行離心分離（分離因數8000-10000)，棄上清，固形物加入原發酵液體積1. 5-2倍的水， 攪拌均勻後，再次離心分離（分離因數6000-8000);棄上清，取固形物加入原發酵液體積 0. 4-0. 6倍的濃度為90% -95%的乙醇，攪拌均勻後板框壓濾，收集固體物料，經真空乾燥 機乾燥得到產品。
[0015] 各培養基成分如下：
[0016] 斜面培養基為（wt % ):葡萄糖或蔗糖1.00%，酵母膏0.30%，蛋白腖0.50%， NaClO. 50%，瓊脂 1.50%，pH 調至 7.0;
[0017] 種子培養基（wt % ):葡萄糖 2. 00 %，（ΝΗ4)2ΗΡ040· 50 %，ΚΗ2Ρ040· 15 %， MgS04 · 7Η200· 10%，玉米漿粉 0· 05%，CaC030 . 30%，ρΗ7· 2,121°C滅菌 20min ;
[0018] 發酵培養基（wt% ):葡萄糖 3.00%，蔗糖 4%，（ΝΗ4)2ΗΡ04 0 . 20 %，ΚΗ2Ρ04 0.20%，MgS04*7H20 0.10%，CaC03 0.05%，玉米漿粉 0.08%邛!17.0，1211：滅菌2〇11^11。
[0019] 本發明的有益效果是：
[0020] 1、本發明通過誘變處理篩選得到的糞產鹼桿菌突變株JSYM-1，經發酵培養基及培 養條件優化後，分批發酵條件下得率可達到48g/L。本發明突變株所用氮源為無機氮，培養 基中幾乎無任何不溶性及色澤深的物質，使得發酵液顏色為淺灰色，產品色澤較白。
[0021] 2、本發明的發酵初糖濃度高達7%，發酵過程中無低分子量粘性多糖產出，使得分 批發酵最終膠得率高達4. 8 %，且發酵過程中發酵液不粘稠，傳質傳氧效果良好，該菌株發 酵過程中所用碳酸鈣用量僅為0.05%，發酵結束後碳酸鈣幾乎無殘留，提取得到的產品純 度可高達90%以上。所得膠體為半透明狀，韌性佳，後處理工藝簡單易行。利用本菌株發酵 生產可得然膠，發酵液得率高且成品品質優於現有產品。

【具體實施方式】
[0022] 實施例1糞產鹼桿菌菌株的突變篩選
[0023] 本發明以CICC20602糞產鹼桿菌為出發菌株，經紫外線、亞硝基胍誘變處理後，塗 布高糖苯胺藍分離篩選培養基，培養基組成如下（wt%):蔗糖10%，（ΝΗ 4)2ΗΡ04 0 . 20%， ΚΗ2Ρ04 0 . 20%，MgS04*7H20 0.10%，CaC03 0.2%，玉米漿粉 0.08%，苯胺藍加入量0·5%〇〇, ，pH7. 0,苯胺藍可以與可得然膠絡合形成藍色複合物，藍色複合物的形成率依賴於可得然 膠的濃度與聚合度，菌落藍色越深說明可得然膠濃度及聚合度越高，菌落越大，說明此菌株 生長活性越高，依據此可以選出產膠聚合度高及生長活性好的菌株。經多次篩選，最終選出 JSYM-1號菌株，此菌株發酵得率較高，所產可得然膠幾乎全部為高聚合度不溶性膠，發酵液 不粘稠，易於分離提取。經發酵條件及發酵培養基組分優化後，發酵得率達到48g/L。
[0024] 該菌株已於2014年6月11日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所）， 保藏編號為CGMCC No. 9291。
[0025] 實施例2
[0026] 斜面培養基為（wt % ):葡萄糖或蔗糖1.00%，酵母膏0.30%，蛋白腖0.50%， NaCl，0.50%，瓊脂 1.50%，pH 調至 7.0。
[0027] 種子培養基（wt % ):葡萄糖 2. 00 %，（ΝΗ4)2ΗΡ040· 50 %，ΚΗ2Ρ040· 15 %， MgS04 · 7Η200· 10%，玉米漿粉 0· 05%，CaC030 . 30%，ρΗ7· 2,121°C滅菌 20min。
[0028] 所述發酵培養基（《丨％):葡萄糖3.00%，蔗糖4%，（順4)2即0 4 0 . 20%，腿2?04 0.20%，MgS04*7H20 0.10%，CaC03 0.05%，玉米漿粉 0.08%，pH7.0，121°C滅菌 20min。
[0029] (1)斜面培養：
[0030] 取一接種環糞產鹼桿菌突變株，劃線接種於斜面培養基，於28-30°C靜置培養 50hr，4°C冰箱保藏1個月內可使用；
[0031] ⑵種子培養：
[0032] 取步驟⑴的培養物1支，接種環接一環種子於裝有100ml種子培養基的500ml 三角瓶中，於28-30°C，180轉/分鐘搖床震蕩培養20hr，得到種子液，種子液的有效活菌數 為 1012-1014/ml ;
[0033] (3)發酵：
[0034] 將步驟（2)的種子液接種於發酵培養基中，接種量為5%，於28_30°C通氣攪拌培 養96hr。發酵得率高達48. 3g/L。不經任何處理，發酵液離心烘乾後測得產品純度即為 87. 2%。
[0035] (4)後提取工藝：
[0036] 發酵結束後，向發酵液中加入50ppm的溶菌酶（溶菌酶單位為300萬），維持發 酵液溫度在28-32 °C，保溫低速（速度60轉/分鐘）攪拌35min ;取發酵液進行離心分離 (分離因數8000-10000)，棄上清，固形物加入原發酵液體積1. 8倍的水，攪拌均勻後，再 次離心分離（分離因數6000-8000);棄上清，取固形物加入原發酵液體積的1/2的濃度為 90% -95%的乙醇，攪拌均勻後板框壓濾，收集固體物料；真空乾燥機乾燥，前期乾燥溫度 不得高於40°C，當水分含量低於25%時，可升溫至60°C進行乾燥，至水分含量低於10%。
【權利要求】
1. 糞產鹼桿菌（Alcaligenes faecalis)菌株JSYM-1，所述菌株的保藏編號為CGMCC No.9291。
2. 用權利要求1所述的糞產鹼桿菌菌株JSYM-1製備可得然膠的方法，其特徵是， (1) 斜面培養： 將糞產鹼桿菌菌株JSYM-1劃線接種於斜面培養基，於28-30°C靜置培養48-72hr，4°C 冰箱保藏備用； (2) 種子培養： 將步驟（1)的培養物接種於種子培養基中，於28-30°C，通氣攪拌培養18-26hr，得到種 子液； (3) 發酵： 將步驟（2)的種子液接種於發酵培養基中，接種量為1-10%，28-30°C，通氣攪拌培養 84-96hr ;所述發酵培養基為：葡萄糖 3. 00%，蔗糖 4%，（ΝΗ4)2ΗΡ040 . 20%，ΚΗ2Ρ040. 20%， MgS04 · 7Η200· 10%，CaC030. 05%，玉米漿粉 0· 08%，ρΗ7· 0,121°C滅菌 20min ; (4) 後提取工藝： 發酵結束後，向發酵液中加入10-100ppm的溶菌酶，維持發酵液溫度在28-32°C，保溫 低速攪拌30-40min ;取發酵液進行離心分離，棄上清，固形物加入原發酵液體積1. 5-2倍的 水，攪拌均勻後，再次離心分離；棄上清，取固形物加入原發酵液體積〇. 4-0. 6倍的濃度為 90-95%的乙醇，攪拌均勻後板框壓濾，收集固體物料，經真空乾燥機乾燥得到產品。
3. 如權利要求2所述的製備方法，其特徵是，所述步驟（1)的斜面培養基為：葡萄糖或 蔗糖 1.00%，酵母膏 0.30%，蛋白腖 0.50%，NaCl 0.50%，瓊脂 1.50%，pH 調至 7.0。
4. 如權利要求2所述的製備方法，其特徵是，所述步驟（2)的種子培養基為：葡 萄糖 2. 00 %，（ΝΗ4) 2ΗΡ040· 50 %，ΚΗ2Ρ040· 15 %，MgS04 · 7Η200· 10 %，玉米漿粉 0· 05 %， CaC030 . 30%，ρΗ7· 2,121? 滅菌 20min。
5. 如權利要求2-4中任意一項所述的製備方法，其特徵是，所述步驟（4)溶菌酶的溶菌 酶單位為50-500萬。
6. 如權利要求2-4中任意一項所述的製備方法，其特徵是，所述步驟（4)對發酵液進行 離心分離的分離因數為8000-10000。
7. 如權利要求2-4中任意一項所述的製備方法，其特徵是，所述步驟（4)再次離心分離 的分離因數為6000-8000。
【文檔編號】C12R1/05GK104087531SQ201410315824
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月3日 優先權日:2014年7月3日
【發明者】周站平, 袁方, 郭宏明 申請人:江蘇一鳴生物科技有限公司