豬圓環病毒2型Cap蛋白及其製備方法
2023-11-05 12:30:27 3
專利名稱：豬圓環病毒2型Cap蛋白及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種豬圓環病毒2型Cap蛋白及其製備方法，特別是指一種使用基因工程手段在家蠶中生產製備的豬圓環病毒2型Cap蛋白及其方法，屬於基因工程領域。
背景技術：
豬圓環病毒(Porcine circovirus, PCV)屬圓環病毒屬，是一種二十面對稱、共價閉合、環狀、單股DNA病毒。根據PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列的不同，可將PCV分為豬圓環病毒I型(PCVl)和豬圓環病毒2型(PCV2)。其中，PCVl對豬無致病性，PCV2對臨床危害很大，它可引起仔豬斷奶後多系統衰竭症候群(Postweaning multisystemicwastingsyndrome,PMWS)、豬皮炎腎病症候群(PDNS)、豬呼吸道疾病症候群及先天性震顫等多種疾病的爆發，給全世界養豬業帶來了巨大的經濟損失。研究發現，PCV2含有11個開放 閱讀框(Open reading frame,ORF),ORFl和0RF2為最主要的兩個閱讀框。現已證實0RF2為編碼病毒的主要結構蛋白和衣殼蛋白(Cap)，Cap蛋白上存在抗原表達位點，具有免疫原性，是PCV2特異性血清學檢測方法和亞單位疫苗、核酸疫苗的基礎。普萊柯生物工程股份有限公司的發明CN 101920012 A公開了一種家蠶生物反應器生產豬圓環病毒2型Cap蛋白的方法，以家蠶核型多角體病毒(BmNPV)為載體，通過轉移載體中的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)與家蠶核型多角體病毒(BmNPV)基因同源重組的方式將豬圓環病毒2型Cap蛋白基因整合至家蠶核型多角體啟動子下進行目的蛋白表達，可以獲得PCV2 Cap蛋白的大規I旲表達，製備成含有重組豬圓環病毒2型Cap蛋白的亞單位疫苗。但該方法需要通過使用BmNPV與AcNPV共轉染並通過噬斑篩選的方法，獲得含PCV2 Cap蛋白的重組家蠶核型多角體病毒，而BmNPV與AcNPV同源重組的機率低，噬斑篩選存在工作量大、成功率低的缺點；此外，噬斑篩選需要培養家蠶細胞，需要含胎牛血清(FBS)的TC-100培養基，且培養周期較長(一般為7-8天)。因此，該噬斑篩選方法存在工作量大、試驗成本高、試驗周期長的缺點。
發明內容
有鑑於此，本發明的主要目的在於提一種利用家蠶生物反應器生產豬圓環病毒2型Cap蛋白的方法，包括以下步驟(I).克隆豬圓環病毒2型Cap蛋白的編碼基因序列，轉入轉移載體，獲得包含豬圓環病毒2型Cap蛋白編碼基因的重組轉移載體；(2).將上述重組轉移載體轉化入含有病毒穿梭載體的大腸桿菌感受態細胞中，獲得含有豬圓環病毒2型Cap蛋白編碼基因的重組穿梭載體，再將該穿梭載體轉染入昆蟲細胞中，獲得重組杆狀病毒；(3).重組昆蟲杆狀病毒注射感染家蠶幼蟲或蠶蛹；(4).回收穫重組病毒感染的家蠶幼蟲或蠶蛹的血淋巴；(5).分離純化血淋巴中的重組豬圓環病毒2型Cap蛋白。
優選地，本發明的生產豬圓環病毒2型Cap蛋白的方法中步驟(I)中豬圓環病毒2型Cap蛋白的編碼序列包含序列表中的SEQ ID NOl。優選地，本發明的生產豬圓環病毒2型Cap蛋白的方法中步驟(2)中所述的豬圓環病毒2型Cap蛋白編碼的基因的表達受多角體啟動子的控制。優選地，本發明的生產豬圓環病毒2型Cap蛋白的方法中步驟(2)中所述的昆蟲杆狀病毒包括昆蟲核型多角體病毒。優選地，本發明的生產豬圓環病毒2型Cap蛋白的方法中步驟(2)中所述的昆蟲細胞包括Sf9細胞。優選地，本發明的生產豬圓環病毒2型Cap蛋白的方法中步驟(3)中所述的家蠶品種包括歐洲種Luobendihong、Baohuang、Hungary ;中 國種Dazao> Qiansanmian、Datuanyuan> Ankang> Lan 5 ；日本種RillO、Dongfei、Sul6、Sul4、YingHXZ、Haoyue 等。優選地，本發明的生產豬圓環病毒2型Cap蛋白的方法中，步驟(3)中所述的重組豬圓環病毒2型Cap蛋白序列包含序列表中的SEQ ID N02。優選地，本發明的生產豬圓環病毒2型Cap蛋白的方法中，步驟(3)中所述的重組豬圓環病毒2型Cap蛋白為如下三種多肽的任意一種I)含有序列表中的SEQ ID N02序列的多肽；2)與I)所述多肽至少80%同源的多肽；3) I)和2)所述多肽的免疫原性部分。本發明的另一目的在於提供上述方法生產的重組豬圓環病毒2型Cap蛋白。技術效果從本發明後續實施例中可以看出，本發明至少有以下優點I、操作簡單、周期短。含PCV2 Cap蛋白的重組家蠶核型多角體病毒，傳統的方法需要通過二種病毒(BmNPV與AcNPV)共轉染並通過噬斑篩選的方法選擇重組病毒，操作周期長，一個噬斑篩選周期為10天左右，順利的情況下也要經過幾輪噬斑篩選才能得到重組病毒，同時要求實驗操作人員具有熟練的噬斑篩選技術。而本發明避免了病毒同源重組噬斑篩選這一難以操作並成功率低的步驟，極大地縮短了實驗周期。2、利用家蠶幼蟲和蠶蛹大規模進行Cap蛋白的分泌表達，成本低。重組病毒通過飼餵桑葉或注射的方式感染特定品種家蠶幼蟲或蠶蛹，經一定時間飼養後取血淋巴，每條家香或香蛹平均可獲得血淋巴500 μ I左右。該過程僅需對感染家香進行常規飼養，不需其他消耗，因此成本十分低廉；每條家蠶最後所取得的血淋巴量十分可觀，若經後期純化後制苗，每條家蠶的血淋巴可制疫苗10頭份；感染病毒的血淋巴先後經高速離心和超速離心後，即可獲得純化後的PCV2 Cap蛋白，整個純化過程沒有化學物質等的參與，而僅僅依靠物理方法，不存在汙染變性的可能，且操作簡單，成本低；若工業化生產成熟後，每頭份疫苗成本可控制在I元以內，而現存疫苗每頭份市場價格均在12元左右，進口疫苗價格均在35元左右。3、由於家蠶可採用飼料飼養，因此受季節影響不大。且大規模飼養家蠶可採用飼餵桑葉等方式，家蠶感染率可達到99. 8%以上。整個家蠶飼養及感染周期為I個月左右，後期純化也僅需幾天即可。使用該方法進行PCV2 Cap蛋白的表達，只需進行1-2個周期的常規昆蟲細胞培養，時間I周左右。在獲得一定量的病毒量後，進行下一步家蠶幼蟲或蠶蛹的感染。整個實驗過程不存在難度，且在常規實驗室即可進行。因此，本發明可以利用苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)直接感染家蠶幼蟲和蠶蛹，進行PCV2 Cap目的蛋白表達，可以大規模的生產PCV2 Cap蛋白。
圖I為PCV2 0RF2基因擴增圖；圖2 為 PCV2 Cap 蛋白 SDS-PAGE 電泳圖；圖3 為 PCV2 Cap 蛋白 Western blot 圖。
具體實施方式
本發明實施例中昆蟲細胞使用了 Sf9細胞(Spodoptera frugiperda(草地夜蛾)卵巢細胞)，購自Invitrogen公司。其他類型的昆蟲細胞,如家蠶胚胎細胞,家蠶卵巢細胞(BmN)等，只要可以感染本發明的轉染病毒，即可使用本發明之方法生產豬圓環病毒2型Cap蛋白。本發明實施例中使用的家蠶品種為大造(Dazao)，其他的與之相一致的家蠶品種，如所述的家蠶品種包括歐洲種Luobendihong、Baohuang、Hungary ;中國種Qiansanmian、Datuanyuan、Ankang、Lan5 ；日本種Ri 110、Dongfei、Sul6、Sul4、YingHXZ、Haoyue 等，也可使用本發明之方法生產豬圓環病毒2型Cap蛋白。本發明的豬圓環病毒2型Cap蛋白，可以使用本領域常用的藥用載體如ISA206佐劑等，或本領域其他類型的水性佐劑或油性佐劑，及本領域常用的其他乳化方法，製備豬圓環病毒2型Cap蛋白亞單位疫苗。本發明的豬圓環病毒2型Cap蛋白，可以使用本領域公知的方法製備試劑盒或直接作為檢測試劑用於檢測豬圓環病毒2型的感染。本實施例中構建的重組苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)，帶有完整的PCV2Cap蛋白基因，位於家蠶核型多角體基因啟動子控制下，多角體基因被PCV2 Cap蛋白基因取代，具有極晚期表達和表達量高的優點。在家蠶幼蟲和蠶蛹中，表達產物經SDS-PAGE和Western blot鑑定，結果表明構建的重組家蠶核型多角體病毒能夠高效表達PCV2 Cap蛋白，大小約為28kDa。本實施例中構建的重組苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒，使用的是Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統(Bac-to-Bac Baculovirus Expression System, Invitrogen),任何其他類型的表達系統及轉移載體、表達載體，只要可以實現將Cap蛋白基因克隆至重組病毒，並能夠感染家蠶及蠶蛹並表達Cap蛋白，都可以使用本發明相同的方法生產豬圓環病毒2型Cap蛋白。本實施例中採用大腸桿菌DHlOBac (購於Invitrogen)進行轉化,任何一種含有穿梭質粒的大腸桿菌，都可以使用本發明相同的方法生產豬圓環病毒2型Cap蛋白。本發明實施例中重組豬圓環病毒2型衣殼蛋白為序列SEQ ID N02的多肽；使用本發明之方法還可生產如下重組豬圓環病毒2型衣殼蛋白與所述選自序列SEQ ID N02的多肽至少80%同源的多肽及上述多肽的免疫原性部分，如截短型的Cap蛋白(S卩，雖然胺基酸序列被去除部分，依然保持免疫性的Cap蛋白)。製備上述多肽的實施例方法與過程與本發明實施例相同，下面不再累述。為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，應按照常規實驗方法進行。I、克隆豬圓環病毒2型0RF2基因，轉入pFastBacI轉移載體，獲得包含豬圓環病毒2型0RF2基因的重組轉移載體提取PCV2-SH株(保藏號為CGMCC No. 2389) DNA作為擴增Cap蛋白基因的模板，貯存於-20°C備用；根據GenBank的PCV2全基因序列，設計引物，分別在上下遊引物5'端加上BamHI和XholI酶切位點。上遊引物5'-CGCGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC-3'；
下遊引物5'-CCGCTCGAGGGGTTTAAGTGGGGGGTCT-3' ；利用設計的引物擴增PCV2 0RF2基因片段，瓊脂糖電泳回收並鑑定PCV2 0RF2基因條帶。如圖I為PCR電泳圖，其中I為目的條帶，M為DNA Marker2000。對回收的條帶進行BamHI和XholI雙酶切鑑定回收，同時將pBacPAK8質粒(購自Clontech公司)用BamHI和XholI同樣進行雙酶切並鑑定回收。對回收的目的片段和pBacPAK8質粒進行T4連接酶連接，轉化至DH5a大腸桿菌中，篩選陽性克隆，提取質粒，並將陽性質粒命名為pBacPAK8-0RF2。用PCR擴增並測序，測序結果與GenBank登記的豬圓環病毒2型0RF2基因一致。因此，由測序結果可知，含有PCV2 Cap蛋白基因重組轉移載體中含有0RF2基因序列。2、將含有PCV2 Cap蛋白基因重組轉移載體轉化入含有穿梭載體的大腸桿菌感受態細胞中，獲得包含PCV2 0RF2基因的穿梭載體，再將其穿梭載體轉染入昆蟲細胞中，獲得重組杆狀病毒vBac-0RF2 將pBacPAK8_0RF2轉化含有病毒穿梭質粒Bacmid的大腸桿菌DHlOBac (購自Invitrogen公司)，獲得重組質粒Bacmid_0RF2 ；PCR篩選,提取陽性質粒,製備陽性重組質粒 Bacmid_0RF2 DNA。米用 Cellfectin Reagent 轉染 Sf9 細胞(購自 Invitrogen 公司),待細胞出現病變後，進行重組病毒噬斑純化和病毒擴增，然後通過使用引物M13F和M13R進行PCR驗證目的重組0RF2基因。純化獲得重組杆狀病毒，命名為vBac-0RF2。擴增重組杆狀病毒vBac-0RF2作為種毒,通過噬斑法進行效價測定後於4°C保存。3、重組杆狀病毒vBac_0RF2感染家蠶幼蟲，產生PCV2 Cap蛋白；重組杆狀病毒vBac-0RF2以I. OX 105pfu(噬斑形成單位)/頭的感染劑量，用微量注射器於家蠶幼蟲腹部環節處射入蠶血淋巴腔中。分別於感染後72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h和156h後，收穫感染重組杆狀病毒的幼蟲，利用組織搗碎機進行蠶體破碎，IOOOOrpm離心，回收上清，及蠶血淋巴液。然後加入100倍體積的PBS (pH7. 4,0. 01M)，利用超濾濃縮機進行超濾出去雜蛋白，利用SDS-PAGE電泳與Western blot進行PCV2 Cap蛋白的鑑定。鑑定結果見圖2、3，由圖可知，SDS-PAGE電泳與Western blot中均有明顯的Cap蛋白條帶，說明PCV2 Cap在家蠶體內進行了表達。圖2為SDS-PAGE電泳圖，其中I為PCV2 Cap蛋白誘導前樣品；2為PCV2 Cap蛋白誘導後樣品；M為蛋白Marker ;圖3為Western blot鑑定圖,其中I為PCV2 Cap蛋白誘導後樣品；2為PCV2 Cap蛋白誘導前樣品；M為雙色預染蛋白Marker。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。·
權利要求
1.一種利用家蠶生物反應器生產豬圓環病毒2型Cap蛋白的方法,其特徵在於,包括以下步驟 (1)·克隆豬圓環病毒2型Cap蛋白的編碼基因序列，轉入轉移載體，獲得包含豬圓環病毒2型Cap蛋白編碼基因的重組轉移載體； (2).將上述重組轉移載體轉化入含有病毒穿梭載體的大腸桿菌感受態細胞中，獲得含有豬圓環病毒2型Cap蛋白編碼基因的重組穿梭載體，再將該穿梭載體轉染入昆蟲細胞中，獲得重組杆狀病毒； (3).重組昆蟲杆狀病毒注射感染家蠶幼蟲或蠶蛹； (4).回收穫重組病毒感染的家蠶幼蟲或蠶蛹的血淋巴； (5).分離純化血淋巴中的重組豬圓環病毒2型Cap蛋白。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述的步驟(I)中豬圓環病毒2型Cap蛋白的編碼序列包含序列表中的SEQ ID NOl。
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述的步驟(2)中所述的豬圓環病毒2型Cap蛋白編碼的基因的表達受多角體啟動子的控制。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中所述的昆蟲杆狀病毒包括昆蟲核型多角體病毒。
5.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中所述的昆蟲細胞包括Sf9細胞。
6.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(3)中所述的家香品種包括 Dazao> Luobendihong、Baohuang、Hungary> Qiansanmian、Datuanyuan>Ankangλ Lan 5、Ri 110、Dongfei、Su 16、Su 14、YingHXZ、Haoyue。
7.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(3)中所述的重組豬圓環病毒2型Cap蛋白序列包含序列表中的SEQ ID Ν02。
8.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(3)中所述的重組豬圓環病毒2型Cap蛋白為如下三種多肽的任意一種 1)含有序列表中的SEQID Ν02序列的多肽； 2)與I)所述多肽至少80%同源的多肽； 3)1)和2)所述多肽的免疫原性部分。
9.根據權利要求I 8任意一項的方法生產的重組豬圓環病毒2型Cap蛋白。
全文摘要
本發明提供了一種利用家蠶生物反應器生產PCV2 Cap蛋白的方法及Cap蛋白製品，包括克隆PCV2 Cap蛋白的編碼基因序列，至重組杆狀病毒，使用重組昆蟲杆狀病毒直接注射感染家蠶幼蟲或蠶蛹，回收並分離純化PCV2 Cap蛋白。本發明具有操作簡單、周期短的特點，避免了病毒同源重組噬斑篩選這一難以操作並成功率低的步驟，極大地縮短了實驗周期；操作簡單，成本低，後提取方法簡單，適合工業化的生產。
文檔編號C07K14/01GK102911947SQ201110218780
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月1日 優先權日2011年8月1日
發明者張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司