人參促生細菌fy4-2及其應用的製作方法

2023-11-05 10:28:32

人參促生細菌fy4-2及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了從大量人參內生細菌中篩選到一株具有產生長素、固氮、解磷、解鉀和產鐵載體特性，並對宿主人參生長具有促進功能的細菌菌株FY4-2。經鑑定為阿氏腸桿菌（Enterobacterasburiae）。它產IAA能力強，可達到13.5μg/mL，無氮條件下長勢良好，具有固氮潛能，定量測定其解磷含量，可達到130.6μg/mL，解鉀可達到4.33μg/mL，有產生鐵載體的能力，其活性達92%。能促進人參種子發芽生長，芽長增加81.97%；對人參根生長具有明顯的促進作用，鮮重增加40.5%，乾重增加43.97%；該菌株的發現為人參促生菌肥的開發及其利用奠定了良好的基礎。
【專利說明】人參促生細菌FY4-2及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬微生物領域，確切地說是人參促生細菌FY4-2及其應用。
【背景技術】
[0002]近二十年來，伴隨化肥和農藥的大量使用，在滿足作物高產防病的同時，所帶來的土壤惡化、環境汙染等問題也越來越嚴重。此外，隨著石油能源的日趨匱乏，以石油為原料的化肥和農藥生產成本日益提高，進而導致農業成本逐漸上升，效益日益下降。這些問題都對人類的生產生活構成了極大的威脅。發展新型肥料，應用生物防治是現代農業和未來農業的必然趨勢。近年來，微生物菌肥具有對人畜安全、不汙染環境等優點已受到人們的重視，開展了一些相關研究和應用。而發展微生物菌肥的前提是獲得具有高效生物活性功能的有益微生物，例如具有促進植物生長的微生物，簡稱植物促生菌。植物促生菌促進植物生長的機理不盡相同，其可合成某些對作物生長發育有直接作用的物質和(或)改變土壤中某些無效元素的形態，使之有效化而利於作物吸收，作用途徑包括分泌有機酸溶解磷並使之有效化；自生固氮；通過嗜鐵素增加植物鐵營養；產生植物激素，調節植物乙烯等。植物促生菌還具有抑制或減輕某些植物病害對作物生長發育和產量的不良影響，其間接作用途徑包括產生抗生素抑制植物病原微生物；清除植物根圍可供病原菌利用的鐵；誘導植物系統獲得抗性；合成抗真菌代謝物；與病原微生物爭奪根圍生存空間等。
[0003]人參是 我國最為重要的中藥材之一，被稱為「百草之王」。2012年，人參(人工種植)被國家衛生部批准為新資源食品，消費量和市場需求量極具增加。人參種植對土壤和環境條件要求較高，在我國主要集中在吉林省長白山地區。吉林省人參產量佔全國80%、世界70%，出口佔世界60%，是吉林省主要出口創匯的農產品。在有限的土地資源條件下，提高人參產量和品質是滿足市場需求的基礎，保護種植區生態環境是人參產業可持續發展的必要條件，減少化肥農藥不合理使用所造成的品質下降、農藥殘留超標等問題是人參產品順利出口的重要保障。因此，分離篩選獲得具有促進植物生長的微生物並研製成菌肥加以應用對於發展人參產業具有重要意義。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是為了減少化肥的使用，而提供一種對人參生長具有促進功能的人參內生菌株，人參促生細菌FY4-2。
[0005]阿氏腸桿菌株FY4-2，保藏編號為CCTCC NO:M2013630。
[0006]阿氏腸桿菌株FY4-2，它來源於人參體內，為人參內生菌。
[0007]阿氏腸桿菌株FY4-2在促進人參發芽及生長方面的應用。
[0008]一種生物菌肥，它是阿氏腸桿菌株FY4-2菌體的無菌水懸浮液；
所述的菌體的無菌水懸浮液濃度為IO8-1O9 Cfu/mL。
[0009]本發明提供了從大量人參內生細菌中篩選到一株具有產生長素、固氮、解磷、解鉀和產鐵載體特性，並對宿主人參生長具有促進功能的細菌菌株FY4-2。經鑑定為阿氏腸桿菌{Enterobacter asburiae、。它產IAA能力強,可達到13.5Pg/mL,無氮條件下長勢良好,具有固氮潛能，定量測定其解磷含量，可達到130.6 Pg/mL，解鉀可達到4.33 Pg/mL，有產生鐵載體的能力，其活性達92%。能促進人參種子發芽生長，芽長增加81.97% ;對人參根生長具有明顯的促進作用，鮮重增加40.5%，乾重增加43.97% ;該菌株的發現為人參促生菌肥的開發及其利用奠定了良好的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1FY4-2菌株產生IAA圖；
圖2FY4-2菌株促生功能分析圖；其中，1:固氮潛能，2:解磷特性，3:解鉀特性，4:產體載體能力；
圖3FY4-2菌株在NA培養基上的菌落形態；
圖4FY4-2菌株電鏡下觀察的菌體形態；
圖5FY4-2菌株的分子鑑定聚類圖譜；
圖6FY4-2菌株對人參種子發芽的促生作用圖；
圖7FY4-2菌株對人參種子發芽的促生作用結果；
圖8FY4-2菌株對人參根的促生作用圖；
圖9FY4-2菌株對人參根鮮重的促生作用結果；
圖10FY4-2菌株對人參根乾重的促生作用結果。
【具體實施方式】
[0011]實施例一菌株FY4-2促生特性的測定
從來自於吉林省健康人參植株體內，採用平板稀釋法篩選獲得了人參內生細菌FY4-2。
[0012]1.產IAA能力的測定
將FY4-2接種到液體LB培養基中，30°C 160rpm培養12h。測定吸光值後將菌液在工作檯操作下稀釋到吸光值0.8左右。取0.2ml接種到含100mg/L色氨酸培養基中，培養48h後1000Orpm離心5min,取上清液2ml加入顯色液4ml,暗處放置0.5h後在540nm下測定吸光值。共得到6株產IAA能力較高的菌株，其中FY4-2產IAA能力最高，可達到13.5μδ/mL (圖1)。
[0013]2.固氮能力的測定
將FY4-2劃線接種於Ashby固體培養基上，30°C恆溫培養2d，觀察菌株長勢，結果發現菌株FY4-2在無氮條件下長勢良好，具有固氮潛能(圖2)。
[0014]3.人參內生解磷細菌的測定
採用PKO固體培養法，將分離於吉林省健康人參植株體內的內生細菌FY4-2接種在NA培養基上，培養12h後，打孔接種於PVK固體培養基，3d後觀察解磷圈大小。然後將FY4-2菌株採用鑰銻鈧比色法進行解磷效果的檢測，方法為將FY4-2菌株打菌碟接種於50mL LB液體培養基，160 r/min培養12h。取I mL接種於裝有50 mL PVK液體培養基的150 mL三角瓶中，3 d後取培養液5mL，8000 r/min離心5min後取上清，鑰銻鈧比色法測量可溶性磷含量。結果顯示，在PVK平板上，FY4-2菌株具有清晰可見的解磷圈(圖2);定量測定其解磷含量，可達到130.6 Pg/mL。[0015]4.解鉀能力的測定
初篩採用矽酸鹽固體培養基，將在NA培養基上培養好的FY4-2菌塊接種於矽酸鹽固體培養基上，30°C培養3d後觀察解鉀圈大小。復篩採用火焰光度法，將FY4-2接種到液體LB培養基上，300C，160 rpm培養12h後測定吸光值。取2ml菌液接入50ml液體矽酸鹽培養基中，30°C，160 rpm培養72h後，用火焰光度計定量測量解鉀含量。結果顯示，在矽酸鹽平板上，FY4-2菌株具有明顯的的解鉀圈(圖2);定量測定其解鉀含量，可達到4.33 Pg/mL。
[0016]5.產鐵載體能力的測定
採用刃天青法定性和定量測定FY4-2產鐵載體能力。定性檢測是將在NA培養基上培養好的FY4-2菌塊接種到刃天青平板，28°C培養3天後觀察藍色培養基上橙黃色暈圈的出現和大小。定量檢測是用鉬金絲接種環取一環新鮮菌苔於MKB液體培養基內，28°C搖床培養(150 r/min) 48h後,取菌液10 ml,8000 rpm離心10 min,取上清3 ml到試管，再加入3ml刃天青檢測液混勻，Ih後測量630nm下的吸光值(As)，以雙蒸水為對照調零。另外，取3ml未接菌的MKB液體培養基與3ml刃天青檢測液混勻後做同樣處理，其吸光值為(Ar)。根據公式:鐵載體活性單位％=[ (Ar — As) /Ar]X 100計算菌株產鐵載體的量。結果FY4-2有產生鐵載體的能力，其活性高達92% (圖2)。
[0017]實施例二菌株FY4-2的鑑定
將FY4-2菌株劃線接種在NA培養基上，28 °C培養12~24h後，觀察記錄單菌落形態。FY4-2在NA培養基上呈淡黃色不透明圓形小菌落，邊緣整齊(圖3)。
[0018]取在LB液體培養基中培養24h的FY4-2菌株菌液，離心用無菌水反覆衝洗後，懸浮於適量無菌水中進行負染色製備樣品，用鑷子夾住帶膜的銅網蘸取微量菌液，靜置2min，從邊緣用濾紙吸乾剩餘液；然後再用鑷子夾住帶菌的銅網浸入盛有雙蒸水的燒杯內漂洗，再用濾紙吸乾液體，接著用2%磷鎢酸負染色5 min，乾燥後用透射電鏡觀察發現菌體呈杆狀，具有周生鞭毛(圖4)。
[0019]參照《常見細菌系統鑑定手冊》和《伯傑系統鑑定手冊》中推薦的部分培養基(表1)和方法測定FY4-2菌株的生理生化特性發現，菌株FY4-2為革蘭氏染色陰性菌；接觸酶、氧化酶、V-P反應為陽性；能利用檸檬酸、丙二酸，使硝酸鹽還原；但不能使澱粉和油脂水解，可使明膠液化；石蕊牛奶試驗產酸，對NaCl的耐受性為7% ;可以利用葡萄糖、甘露醇、半乳糖和果糖。
[0020]表1菌株FY4-2的生理生化特性
【權利要求】
1.阿氏腸桿菌株FY4-2，保藏編號為CCTCCNO:M2013630o
2.權利要求1所述的阿氏腸桿菌株FY4-2，它來源於人參體內，為人參內生菌。
3.權利要求1所述的阿氏腸桿菌株FY4-2在促進人參發芽及生長方面的應用。
4.一種生物菌肥，它是權利要求1所述的阿氏腸桿菌株FY4-2菌體的無菌水懸浮液； 根椐權利要求4所述的一種生物菌肥，其特徵在於:所述的菌體的無菌水懸浮液濃度為108-1O9 cfu/mL。
【文檔編號】C12R1/01GK103834591SQ201410055821
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月19日 優先權日:2014年2月19日
【發明者】陳長卿, 李桐, 姜雲, 田磊, 張冠軍 申請人:吉林農業大學