靶向連接蛋白的反義化合物及其使用方法

2023-12-08 06:26:31 2

專利名稱：：靶向連接蛋白的反義化合物及其使用方法
技術領域：
：本發明披露的內容涉及和描述利用化合物來調節間隙連接相關的蛋白質表達的試劑、組合物以及方法。這些試劑、組合物、以及方法可用於，例如，體內和體外組織工程，包括例如在皮膚中、角膜組織中、以及與眼有關的外科手術。
背景技術：
：由於生病或損傷引起的組織或器官衰竭是世界範圍內的主要健康問題，除了進行器官或組織移植外，很少有完全康復的選擇。但是，尋找合適供體的難題意味著這種選擇對於大多數患者來說是不可利用的。目前正在研究用作替代的組織工程或重建，由此形成合成或半合成組織或器官仿製品，其是全功能性的或者生長為希望的功能性。尤其是這種技術變得日益重要的一個領域是眼角膜。角膜移植是世界範圍內進行的最常見形式的固體器官移植。僅在美國和英國每年就進行約80，000例。諸如屈光角膜切除術(PRK)和雷射原位角膜磨削術(LASIK)的用來矯正近視的屈光性手術(refractivesurgery)的流行，導致了用於移植的合適角膜的短缺，這些角膜用於手術或疾病過程後的組織重建以及用於體內組織操作處理以設計變化(engineerchange)。另外,大約5%有雷射手術經歷的患者體驗到意外的結果。角膜是透明的組織，其包括眼睛外膜的中部六分之一。其一致的結構和功能為眼睛提供了清晰的折射界面、抗張強度，並且保護眼睛免於外部因素。角膜由三個不同的主要細胞層構成:上皮、間質、以及內皮(Pepose,J.S.etal.,「Thecornea;Adler’sPhysiologyoftheeye:Clinicalapplication，，，9thed.St.Louis:MosbyYearBook,1992,29-47;Spencer,ff.H.,「Thecornea;OphthalmicPathology:anatlasandtextbook」，4thed.，Philadelphia:W.B.SaundersC0.，1996，157-65)。另外，後彈性膜(Descemet’smembrane)、鮑曼層(Bowman’slayer)、以及基底膜是以一些方式來源於這些主要細胞層之一的結構。角膜上皮是直接接觸外部環境的層。它是一種分層鱗狀、非角質化的結構，在鼠和人體中，厚度範圍分別是40到ΙΟΟμπι。其包括:通常由兩到三層扁平鱗狀細胞形成的表面區、由兩或三層多面翼細胞(polyhedralwingcell)形成的中間區、以及由單排柱狀細胞構成的基底區。層狀角膜上皮的特徵是作為「緊密」離子轉運功能的合胞體(syncitium)，其用作眼表面的保護性屏障以及附屬液體分泌層，該分泌層有助於角膜內皮對間質水合的調節，並因此有利於保持角膜的透明。已證實角膜上皮具有的獨特和專一化性質對作為眼睛主要折射元件的角膜的運轉(operation)來說是必需的。因此不管任何環境應力下保持其層狀結構就很重要。角膜表面的外傷特別普遍；例如，小擦傷、眼睛感染和疾病、化學或機械意外事故以及手術實施都會損傷角膜。角膜外傷傷口癒合後的一個主要併發症是由於組織重新形成(reorganization)而喪失視敏度。有眼癒合問題的危險的患者包括那些經過手術的人。這樣的手術的實例包括但不限於有或沒有晶狀體置換的白內障摘除術、諸如穿透性角膜移植術(PKP)的角膜移植或其它穿透性手術、準分子雷射屈光性角膜切除術、青光眼濾過術、放射狀角膜切除術、以及用來矯正屈光或替換晶狀體的其它類型手術。角膜提供了外部光學平滑面(externalopticallysmoothsurface),以將光傳送到眼中。手術破壞了將角膜固定為其標準構型的力。對白內障患者，在邊緣區進行全部厚度的手術切口。角膜在其癒合時收縮，從而引起組織的局部變形以及受影響區的視野內的伴隨變形(散光)。其它角膜中的手術傷口會引發傷口癒合過程，其引起角膜曲率的預定局部移動。這些技術中最為廣泛知曉的是放射狀角膜切開術(RK)，其中，產生了幾個部分厚度切口而引起中心角膜扁平化。但是，這種技術由於缺乏可預知的結果和視力上的顯著波動(兩者都與傷口癒合的性質和程度有關)而受限(Jesteretal.，Cornea(1992)11:191)。例如，在大多數RK患者中觀察到在初始視力提高中具有伴隨的退化的角膜組織的外圍隆起中的復位(reduction)(McDonnellandSchanzlin,Arch.0phthalmol.(1998)，106:212)。角膜中的傷口癒合也很緩慢，並且不完全癒合往往與視敏度的不穩定性有關(具有從早晨到夜晚視力上的波動，以及在超過幾星期到幾個月的時間發生飄動(drifting)視敏度)，這可能是34%或更多進行過放射狀角膜切開術的患者手術後一年抱怨波動視力的原因(Waringetal.,Amer.J.0phthalmol.(1991)111:133)。同樣，如果角膜傷口未能徹底癒合，那麼可能會發生傷口「裂開」，從而會導致漸進的遠視作用。多達30%經過RK手術的患者遭受與傷口裂開有關的遠視飄移之苦(Dietzetal.,Ophthalmology(1986)93:1284)。外傷後的角膜再生較複雜並且還未很好地被理解。其涉及三種組織的再生:上皮、間質以及內皮。三種主要的細胞間發信號的途徑被認為可以調節組織再生:一個通過生長因子(Baldwin,H.C.andMarshall,J.,ActaOphthalmol.Scand.,(2002)80:238-47)、細胞因子(Ahmadi,A.J.andJakobiec,F.A.,Int.0phthalmol.Clinics,(2002)42(3):13-22)以及趨化因子(chemokine)(Kurpakus-ffheater,M,etal.,Biotech.Histochem,(1999)74:146-59)來介導；另一種通過細胞基質相互作用來介導(Tanaka,T.,etal.,Jpn.J.0phthalmol.,(1999)43:348-54);以及另一種通過間隙連接和通道形成蛋白的連接蛋白家族來介導。間隙連接是細胞膜結構，其有利於直接的細胞間通訊。間隙連接通道由兩個連接子形成，每個連接子由六個連接蛋白亞單位組成。每個六聚體連接子與相對膜中的連接子對接以形成單個間隙連接。可在整個身體中發現間隙連接通道。諸如角膜上皮的組織，例如，具有六到八個細胞層，然而在不同層中表現不同的間隙連接通道，其中在基底層中為連接蛋白-43以及從基底層到中部翼細胞層為連接蛋白-26。總體來說，連接蛋白是一種蛋白質家族，通常根據它們的分子量來命名或基於種系發生分為α、β以及Y子類。到目前為止，確定了20個人類和19個鼠類同種型(isoform)(ffillecke,K.etal.,Biol.Chem.，(2002)383，725-37)，這可能表示每個不同的連接蛋白可以進行功能專化。不同組織和細胞類型具有連接蛋白表達的特徵模式並且已表明諸如角膜的組織在損傷或移植以後會改變連接蛋白的表達模式(Qui,C.etal.，(2003)CurrentBiology,13:1967-1703;Branderetal.,(2004),JInvestDermatol.122(5):1310-20)。外傷后角膜再生過程會導致角膜透明度的喪失並因此影響屈光手術的結果。目前對於損傷角膜的治療通常包括角膜移植或試圖將角膜細胞/組織用於重建。但是，在諸如準分子雷射屈光角膜切除術的外科手術以後，對角膜和周圍軟組織的術後外傷經常會導致瘢痕形成，這是由於與細胞外基質的改變有關的細胞增多；包括在雷射所致的損傷處的上皮細胞生長模式(patterning)、肌纖維母細胞分化、間質重建、以及上皮增生的變化。在嚴重的脊髓損傷中，無論是通過橫斷、挫傷或加壓而發生的病理變化，都共有一些與術後瘢痕形成和組織重建的相似性。在損傷後24-48小時內，損傷會擴展並顯著增大受影響區域的尺寸。可能涉及間隙連接介導的副作用(bystandereffect)(Lin,J.H.etal.,1998,NatureNeurosc1.1:431-432),通過該副作用間隙連接通道將神經毒素和韓波(calciumwave)從損傷位置擴展到其它健康組織。這伴隨著特徵性的炎性腫脹。脊髓中的損傷區被腔或結締組織瘢痕代替，這兩者都阻礙軸突再生(McDonald，J.W.etal,(Septemberl999)ScientificAmerican.55-63;Ramer,M.S.etal.,SpinalCord.(2000)38:449-472;Schmidt,C.E.andBaierLeach,J.;(2003)Ann.Rev.Biomed.Eng.5:293-347)。儘管用一些當前治療方式取得了進步，但是對脊髓修復的主要限制仍然保持，這包括侵入性介入本身會進一步擴大損傷以及神經膠質瘢痕形成，這會阻礙修復過程以及冒進一步喪失神經功能的危險(Raisman,GJ.RoyalSoc.Med.96:259-261)。已利用反義技術來調節與病毒、真菌以及代謝病有關的基因表達。美國專利第5，166，195號提出了HIV的寡核苷酸抑制劑。美國專利第5，004，810號提出了用來雜交單純皰疹病毒Vmw65mRNA並抑制複製的寡聚物。還參見Becker等於2000年I月27日提交的題為「FormulationsComprisngAntisenseNucleotidestoConnexins，，的專利申請W000/44409(其全部內容以引用方式併入本文)，該專利描述了利用反義(AS)寡聚脫氧核苷酸來下調連接蛋白的表達，以治療大腦、脊髓或視神經中的局部神經元損傷，促進傷口癒合並減少在手術或燒傷以後的皮膚組織的瘢痕形成。但是，仍然需要克服許多難題。例如，經常是這種情形:在非靶細胞類型中的特定基因產物的下調可能是有害的。其它需要克服的難題包括這樣的ODN(未修飾的磷酸二酯低聚物)的短暫半衰期通常具有僅20分鐘的胞內半衰期，這是因為胞內核酸酶降解(Wagnerl994，見前)以及它們連貫且可靠地傳遞到靶組織。因此，需要並且存在對於用於上述問題的化合物開發的許多可能優點。在此將描述並要求保護這樣的化合物、相關組合物、以及它們的使用方法。
發明內容在此描述並要求保護的本發明具有許多特性和實施例，包括但不限於在本
發明內容中提出或描述或參照的那些特性和實施例。在此描述並要求保護的發明不限於或受限於在本
發明內容中確定的特性或實施例，其僅用於說明而不是用於限制的目的。本文提供了對組織工程很有用的化合物，包括反義化合物。還提供了反義化合物以及用來減少與眼科手術有關的組織損傷的方法。這些方法包括，例如，將足以抑制患者眼中或與患者眼有關的細胞中的連接蛋白表達的量的反義化合物給予患者的眼。雖然優選抑制連接蛋白的表達，但是可以想像到其它蛋白質可以是化合物(包括反義化合物)調節的靶，這些化合物單獨使用或者和抑制人類連接蛋白表達的反義或其它化合物一起使用。在一些實施例中，眼科操作是眼外科手術，包括但不限於準分子雷射屈光角膜切除術、白內障摘除術、角膜移植、矯正屈光的手術、放射狀角膜切開術、青光眼過濾術、角膜移植術、準分子雷射屈光角膜切除術、角膜移植、矯正屈光的手術、眼表面瘤切除術、結膜或羊膜移植、翼狀胬肉和瞼裂斑切除術、眼整形手術、眼瞼瘤切除術、用於先天性異常的重建眼瞼手術、外翻和內翻眼瞼修復、斜視手術(眼肌肉)、或任何穿透性眼外傷。通常，至少部分核苷酸序列因連接蛋白而眾所周知，其中抑制表達是所希望的。優選地，將反義化合物靶向一個或多個具體的連接蛋白同種型。反義化合物可以靶向的連接蛋白的具體同種型包括(不限於)43、37、31.1、以及26。優選但不要求靶向的連接蛋白是人類的。例如，連接蛋白(例如人類的)可以具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列(nucleobasesequence)。在一些實施例中，反義化合物靶向核酸分子的至少約8個核酸鹼基，其中核酸分子編碼具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列的連接蛋白。在一些其它實施例中，將第二反義化合物給予患者(例如眼)，其中一個或多個其它反義化合物靶向核酸分子的至少約8個核酸鹼基，其中核酸分子編碼具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列的連接蛋白(例如人類的)。至少第二反義化合物可以(例如)靶向不同於第一反義化合物靶向的連接蛋白。可用於本發明各個方面的反義化合物類型的實例包括反義寡核苷酸、反義多核苷酸、脫氧核酶、嗎啉代寡核苷酸、dsRNA、RNAi分子、siRNA分子、PNA分子、DNA酶、以及5，-端-突變的Ul小核RNA、以及前述的類似物；以及本文提供的或本
技術領域：
中知曉的其它化合物；包括但不限於(例如)非特定的解偶聯劑，如辛醇、硝酸甘油(glycerhetinicacid)、以及庚醇。在一些實施例中(例如)反義化合物是反義寡核苷酸，其包括天然存在的核酸鹼基以及未修飾的核苷間鍵合(linkage)。在其它實施例中(例如)反義化合物是反義寡核苷酸，其包括至少一個修飾的核苷間鍵合(包括那些藉助硫代偶磷酸酯鍵合的核苷間鍵合)。合適的反義化合物還包括(例如)寡核苷酸，其包括至少一個修飾的糖部分。合適的反義化合物還包括(例如)寡核苷酸，其包括至少一個修飾的核酸鹼基。在一些實施例中，將本文提供的反義化合物結合另一種化合物給予，例如可用於減少組織損傷、減少炎症、促進癒合、或一些具有其它所希望活性的化合物。在另一個方面,本發明包括通過將反義化合物給予患者來治療受治療者(例如患者)的方法。在一些實施例中，本文提供的反義化合物是通過局部或表面方式來給予。本文提供的反義化合物也可(例如)全身地或通過眼內注射方式給予。可以將本文提供的反義化合物在預定時間給予患者，例如，相對於傷口的形成，如進行眼科操作(例如手術)的時間。例如，反義化合物可以在進行眼科操作之前、眼科操作期間、或眼科操作之後給予。反義化合物(例如)可在進行眼科操作之前或之後幾分鐘或幾小時內給予受治療者。在一些實施例中，反義化合物在進行眼科操作之後給予，以及例如反義化合物在操作的約4小時內、操作的約3小時內給予、以及更通常地在眼科操作的約2小時內、或眼科操作的約I小時內給予。在另一方面，本文提供的反義化合物可用一定方法給予以影響組織工程。例如，本文提供的反義化合物可以結合增加患者角膜組織厚度的方法給予。這樣的方法可能(可能不)與眼科操作(例如手術)有關。作為實例，本文提供的反義化合物可以結合一種方法來給予，該方法促進癒合或在與患者角膜有關的細胞(例如角膜細胞)中防止組織損傷。在一些實施例中，例如，反義化合物減少瘢痕形成。在一些實施例中，例如，反義化合物減少炎症。在一些實施例中，例如，反義化合物促進傷口癒合。在一些優選實施例中,例如,反義化合物結合外科移植手術一起使用。在一些實施例中，例如，反義化合物靶向連接蛋白43並被給予用來調節上皮基細胞分化和生長。在一些實施例中，例如，反義化合物靶向連接蛋白31.1並被給予用來調節外層角質化。根據一些實施例，例如，眼科操作是白內障摘除術。在其它實施例中，例如，眼科操作是角膜移植。在其它實施例中，例如，眼外科手術是矯正屈光的外科手術。在另一些實施例中，例如，眼科操作是放射狀角膜切開手術。在另一些實施例中，例如，眼科操作是青光眼濾過手術。在其它實施例中，例如，眼科操作是角膜移植術。在其它實施例中，例如，眼科操作是眼表面瘤切除術。在其它實施例中，例如，眼科操作是結膜或羊膜移植。在其它實施例中，例如，眼科操作是翼狀胬肉和瞼裂斑切除。在其它實施例中，例如，眼科操作是眼整形手術。在其它實施例中，例如，眼科操作是眼瞼腫瘤切除。在其它實施例中，例如，眼科操作是用於先天性異常的重建眼瞼手術。在其它實施例中，例如，眼科操作是外翻和內翻眼瞼修復。在其它實施例中，例如，眼科操作是斜視手術(眼肌)。在其它實施例中，例如，眼科操作是穿透性眼創傷。在一些進一步實施例中，例如，利用化合物以及組合物來促進癒合或在與角膜有關的細胞中防止組織損傷，其中與角膜有關的細胞可以是眼中的任何細胞，包括但不限於角膜細胞。本文提供的藥劑(包括反義化合物)可增加患者角膜組織的厚度。在一些實施例中，例如，反義化合物結合另一種可用於減少組織損傷或促進癒合的化合物一起使用。例如，可將反義化合物結合生長因子、細胞因子、或類似物一起給予。在另一方面，例如，提供了用於減少與眼科手術有關的組織損傷的藥物組合物。適當配製藥物組合物，例如，用於表面或局部給予患者的眼，該藥物組合物包括足夠量的反義化合物以在與患者眼有關的細胞中抑制人類連接蛋白的表達。反義化合物(例如)優選靶向核酸分子的至少約8個核酸鹼基，其中核酸分子編碼具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列的連接蛋白(例如人類的)。在一些實施例中，例如，反義化合物是藥物組合物的形式，該藥物組合物包括藥用載體或賦形劑，以及藥劑或反義化合物的存在量可以有效促進患者傷口的癒合。在一些實施例中，藥物組合物可以是，例如，適用於局部給藥的形式，包括適用於表面或局部地給予患者眼的形式。在一些進一步實施例中，例如，組合物和製劑可以是凝膠、乳膏形式，或者本文描述的或本領域無論是目前或將來知道的任何形式。在另一方面，本發明包括藥物組合物，該藥物組合物包括反義化合物。在一個實施例中，例如，提供的藥物組合物用於減少與眼科操作(例如，手術)有關的組織損傷，使得製成的藥物組合物用於表面或局部給予患者的眼，並且該藥物組合物包括足夠量的反義化合物以在與患者眼有關的細胞中抑制人類連接蛋白的表達。在一些實施例中，例如，反義化合物靶向核酸分子的至少約8個核酸鹼基，其中核酸分子編碼具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列的連接蛋白(例如人類的)。在一些實施例中，例如，藥物組合物包括藥用載體，其包含緩衝的普盧蘭尼克酸(pluronicacid)或凝膠。在一個具體實施例中,這包括例如,在磷酸緩衝鹽溶液中高達約30%的普盧蘭尼克酸。在另一方面，提供了設計反義寡核苷酸的方法，其中反義寡核苷酸靶向一種或多種連接蛋白。該方法可包括所選參數的優化，如熱穩定性、親合力、以及特定寡核苷酸與所選擇靶的特異性。該方法可用於選擇和開發包含一個或多個特別希望的多核苷酸序列的反義寡核苷酸。反義寡核苷酸的試驗可結合該方法來進行，例如，用於它們剪切mRNA或阻斷連接蛋白翻譯的能力。圖1示出了屈光角膜切除手術12小時後對照和經反義寡核苷酸處理的眼睛的角膜的體內共焦顯微圖像。圖2示出了準分子雷射光切除術(excimerlaserphotoablation)後24小時對照(2A、2B、2C)和經反義寡脫氧核苷酸處理的鼠角膜(2D、2E)的角膜重建的組織檢查。圖3提供了顯微圖像，示出了準分子雷射切除術後24小時的連接蛋白43對照(3A、3B、3C)和經反義寡脫氧核苷酸處理的角膜(3D、3E、3F)的表達。結果表明了連接蛋白43的蛋白水平在用抗連接蛋白430DN處理以後而降低並導致間質中更小程度的細胞募集(cellrecruitment)。圖4示出了利用α平滑肌肌動蛋白抗體進行手術後I星期的成肌纖維細胞標記。圖4Α、4Β、以及4C作為對照；而4D、4E以及4F是經反義(化合物)處理的角膜。圖5示出了屈光角膜切除手術24小時(5A-5D)以及48小時(5E-5H)後，對照(5A、5B)以及經連接蛋白43反義寡脫氧核苷酸處理的角膜的層粘連蛋白-1標記。在24小時時對照在切除區域(5A)的邊緣處具有很少和/或不均勻的層粘連蛋白沉澱並且中部更多(5B)，而經反義化合物處理的角膜在這兩個區(5C、)中均顯示出層粘連蛋白更規則的沉澱。在48小時時對照仍然不具有連續的層粘連蛋白沉澱(5E-切除區的邊緣；圖5F-中心)並且其極不均勻(5E)。相反，經反義ODN處理的角膜在傷口邊緣(5G)以及中心(5H)具有連續且相對均勻的基膜。圖6示出了層粘連蛋白-1不規則量化的示圖。圖7示出了在對照培養物中(7A)和在用抗連接蛋白43寡脫氧核苷酸三次處理24小時以後(7B)、以及連接蛋白31.1特異性反義(化合物)處理以後(7C、7D)，連接蛋白26與43的免疫組織化學標記。圖8示出了來源於在放入培養基24小時後的P7幼鼠(ratpups)的脊髓節段。對照節段(I)是腫脹的(箭頭)，伴隨組織從切開端擠出。虛線表示最初切除。組織檢查表明細胞有空泡和水腫(edemic)。第五天這些節段具有全部激活的小膠質細胞和很少存活的神經元。相反，相比於具有最小細胞水腫和空泡的對照(P〈0.001)，經反義處理的節段(2)具有顯著減少的腫脹。即使在培養基中20天後，灰質中的神經元仍然有活力，其中激活的小膠質細胞限於外部邊緣。圖9示出了來源於對照處理的節段(9A)和連接蛋白43反義處理的節段(9B)的神經元。對照節段中的神經元有空泡並且水腫，並且破壞周圍組織，但在處理節段中的神經元顯得健康並且有活力。圖10描述了放入培養基5天後在靠近培養的脊髓節段端部的MAP-2免疫標記。對照節段具有很少有活力的神經元和很少MAP-2標記(16%顯示出任何(any)MAP-2標記)(10A)，而66%的處理節段的暴露於介質和/或接近殘餘白質物質的切開端具有MAP-2表達區域。圖11描述了脫氧核酶在體外選擇性地剪切靶連接蛋白-43mRNA的特定區。在體外從質粒轉錄2.4kb大鼠連接蛋白-43mRNA(IlA)和1.2kb小鼠連接蛋白_43mRNA(IlB)並且用各種脫氧核酶培育I小時。大鼠mRNA(IlA)的區896-953是不確定的，因為沒有脫氧核酶設計用於小鼠相應的區。小鼠mRNA(IlB)中的區367-466的脫氧核酶剪切並不匹配來自大鼠連接蛋白_43mRNA的結果，可能由於在大鼠mRNA中存在5』非翻譯區的200個鹼基對。具有單點突變的有缺陷對照脫氧核酶(df605以及df783)表明這樣的分剪切是特異的。由小鼠dzl007和dzl028還觀察到一些由脫氧核酶對小鼠mRNA的非特異錯誤啟動。總的來說，靶向526-622、783-885、以及1007-1076鹼基區的脫氧核酶在大鼠和小鼠mRNA物種中表現出顯著的剪切。圖12描述了在體外脫氧核酶選擇性地剪切靶連接蛋白-26mRNA的特定區。在體外從質粒轉錄0.7kb大鼠(12A)和小鼠(12B)連接蛋白-43mRNA並且用各種脫氧核酶培育I小時。剪切結果表明齧齒動物連接蛋白26mRNA在318-379和493-567鹼基區中具有至少兩個被脫氧核酶靶向的區。具有單點突變的有缺陷對照脫氧核酶(df351以及df379)表明這樣的剪切是特異的。圖13示出了反義寡聚物穿透和在培養達I小時的角膜中的穩定性。Cy3標記的寡聚物顯示出用普盧蘭尼克凝膠傳遞I小時後的點狀核和細胞質粒標記(13A)。在角膜上皮中I小時後，可見的Cy3穿透速度為10-15μm。Taqman標記寡聚物探針用來測量在上皮細胞中的反義寡聚物的穩定性，其中在每個面板顯示出向紅色的5nm光發射光譜的情況下使用λ掃描(13Β)。完整的Taqman探針顯示出螢光共振能量傳遞，其中TAMRA的紅色螢光表示在灰度(13D)上，而斷裂產物表示為如從FAM所期望的綠色螢光(也在灰度上示出(13C))。細胞中有效反義寡聚物濃度可以比通過螢光技術可檢測的濃度更低。圖14描述了不同反義寡聚物對連接蛋白-43(明，灰度)和連接蛋白-26(暗，灰度)蛋白表達的作用通過體外脫氧核酶mRNA剪切顯示出來。圖14A示出了在基細胞中正常連接蛋白-43的蛋白表達(明，灰度)和在普盧蘭尼克凝膠對照處理的角膜上皮的基細胞至中間細胞中連接蛋白-26的蛋白表達(暗，灰度)。asl4(14B)、as769(14D)、as892(14F)(這三個在體外都不表現出脫氧核酶剪切)以及DBl有義對照(14H)寡聚物不影響活體外培養基中兩種連接蛋白的表達。as605(14C)、as783(14E)以及DBl(14G)(這三個都表現出積極的體外脫氧核酶剪切)僅在處理的角膜的上皮細胞中表現出特異連接蛋白-43降低。圖15示出了連接蛋白-43反義寡聚物選擇性地減少在大鼠角膜中的連接蛋白-43蛋白表達。每個點代表單個不同處理的角膜。實心點(黑色，DBl、as605、as783、as885、as953以及asl076)表示當與白色點(DBl有義、asl4、as769以及as892)相比較時，連接蛋白-43表達平均減少36%到85%。通過脫氧核酶三次預測化驗預測所有反義寡聚物具有很少或沒有作用，表示平均85%到134%的正常連接蛋白-43表達。所有實驗都用DBl有義處理的介質連接蛋白-43密度進行取準，並且結果是兩個負寡聚物(as769和as892)表現出比DBl有義對照處理更大的連接蛋白-43密度。圖16描述了利用實時PCR評價的在用反義或有義寡聚物處理的大鼠角膜中連接蛋白-43mRNA水平的對比。將水平表達為僅普盧蘭尼克凝膠處理的角膜的百分數。用體外化驗預測為功能性的三種反義寡脫氧核苷酸DBlAs、As605以及As783(黑色條)，將連接蛋白43mRNA表達分別減少到46.8%,44%以及25%的正常(僅凝膠，空白條)水平(#p〈0.001)。對DBl有義對照寡聚物(106%)看不到減少(空白條DBl有義)。在體外脫氧核酶三次預測化驗中不表現出Cx43cRNA的任何剪切的As769用作陰性對照(148%)(空白條As769)。圖17描述了在用反義或有義(對照)寡聚物處理並利用實時PCR評價的大鼠角膜中連接蛋白26mRNA水平的對比。將水平表達為僅普盧蘭尼克凝膠處理的角膜的百分數(僅凝膠空白條)。As330和As375分別將Cx26mRNA表達減少到33%和71%(**ρ〈0.001)(黑色條)。對於Rv330有義寡聚物觀察不到減少(109%)(Rv330空白條)。具體實施例方式本發明的實施可使用各種在本領域技術範圍內的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學、以及免疫學的傳統技術。這樣的技術在文獻中進行了全面的解釋，並且包括但不限於(僅通過舉例的方式)MolecularCloning:ALaboratoryManual,secondedition(Sambrooketal.，1989)和MolecularCloning:ALaboratoryManual,thirdedition(SambrookandRussel,2001),在這裡共同地和單獨地稱為「Sambrook」；01igonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；AnimalCellCulture(R.1.Freshney,ed.,1987)；HandbookofExperimentalImmunology(D.M.ffeir&C.C.Blackwell,eds.)；GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.Miller&M.P.Calos,eds.,1987)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubeletal.,eds.,1987,包括2001通過的增編)；PCR:ThePolymeraseChainReaction,(Mullisetal.,eds.,1994)；CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coliganetal.,eds.,1991)；TheImmunoassayHandbook(D.Wild,ed.,StocktonPressNY,1994)；BioconjugateTechniques(GregT.Hermanson,ed.,AcademicPress,1996)；MethodsofImmunologicalAnalysis(R.Masseyeff,ff.H.Albert,andN.A.Staines,eds.,ffeinheim:VCHVerlagsgesellschaftmbH,1993),HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPublications,NewYork,以及HarlowandLane(1999)UsingAntibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(在這裡共同地和單獨地稱為HarlowandLane),Beaucageetal.eds.,CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistryJohnffiley&Sons,Inc.,NewYork,2000);以及Agrawal,ed.，ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs,SynthesisandPropertiesHumanaPressInc.,NewJersey,1993)。定義在進一步從總體上和用各種非限制性具體實施例來描述本發明之前，提出了在描述本發明的上下文中所使用的一些術語。除非另有說明，當在本文中和所附權利要求中使用時，以下術語具有下述含義。未在下面或說明書中其它地方定義的那些術語具有該
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公認的含義。「反義化合物」包括不同類型的分子，這些分子的作用是抑制基因表達、翻譯、或起作用，包括那些用於治療應用的通過mRNA的序列特異靶向起作用的分子。因此反義化合物包括，例如，主要的基於核酸的基因沉默(gene-silencing)分子，如化學修飾的反義寡脫氧核糖核酸(0DN)、核酶以及siRNA(Scherer,L.J.andRossi,J.J.NatureBiotechnol.21:1457-1465(2003)。反義化合物還可包括反義分子如妝核酸(PNA)(Braasch,D.A.andCorey,D.R.,Biochemistry4I,4503-4510(2002)),嗎啉代二氨基憐酸酯(morpholinophosphorodiamidate)(Heasman,J.,Dev.Biol.,243,209-214(2002),DNA酶(Schubert,S.etal.,NucleicAcidsRes.31，5982-5992(2003)。Chakraborti，S.andBanerjea,A.C.,Mol.Ther.7,817-826(2003),Santoro,S.ff.andJoyce,G.F.Pr0.NatIAcad.Sc1.USA94,4262-4266(1997)，以及最近開發的5』-端-突變的Ul小核RNA(Fortes,P.etal.,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA100，8264-8269(2003))。術語「反義序列」指的是具有反義化合物活性的多核苷酸並且包括但不限於(例如)與RNA序列互補或部分互補的序列。因此反義序列包括，例如，包括結合mRNA或其部分以通過核糖體阻斷mRNA轉錄的核酸序列。反義方法通常在本領域中是熟知的。參見，例如，PCT公開W094/12633、以及Nielsenetal.,1991，Science254:1497;01igonucleotidesandAnalogues,APracticalApproach,editedbyF.Eckstein,IRLPressatOxfordUniversityPress(1991)；AntisenseResearchandApplications(1993,CRCPress)。如在本文中所使用的，「信使RNA」不僅包括利用三個字母遺傳密碼來編碼蛋白的序列信息，而且包括相關的形成5』-非翻譯區、3』-非翻譯區、以及5』-帽區的核糖核苷酸序列，以及形成各種第二結構的核糖核苷酸序列。寡核苷酸可根據本發明來製成，這些寡核苷酸整個或部分靶向任何這些序列。總之，核酸(包括寡核苷酸)可描述為「DNA類似物」卿，具有2』-脫氧糖和(通常)是T而不是U鹼基)或「RNA類似物」(即，具有2』-羥基或2』-修飾糖和(通常)U而不是T鹼基)。核酸螺旋可採用超過一種類型的結構，最通常是A-和B-型。通常認為具有B-型類似結構的寡核苷酸是「DNA類似物」並且那些具有A-型類似結構的寡核苷酸是「RNA類似物」。術語「互補」通常指的是在容許的鹽和溫度條件下通過鹼基配對的多核苷酸的自然結合。例如，序列「A-G-T」結合互補序列「T-C-A」。在兩個單鏈分子之間的互補性可以是「部分的」，使得只有一些核酸結合，或可以是「完全的」，使得在單鏈分子之間存在整個互補性。在核酸分子之間的互補程度對它們之間雜交的效率和強度有顯著影響。「可雜交」和「互補」是這樣的術語，其用來表明足夠程度的互補性以致在DNA或RNA靶標和寡核苷酸之間產生穩定的(和)結合。應該理解寡核苷酸不需要100%互補其靶核酸序列就可以雜交，並且還應該理解結合可以是靶標特異性的，或可以結合其它非靶標分子，只要非特異結合不顯著或不希望地阻礙治療的或其它的目標。寡核苷酸用來幹擾靶標分子的正常功能，以引起活性喪失或減小(dimunition),並且優選存在足夠程度的互補性，以避免在希望特異結合的條件下，即，在體內化驗或治療處理的情形、或體外化驗的情形中的生理條件下、在化驗進行的條件下，寡核苷酸非特異或不希望地結合非靶標序列。在本發明一些實施例的範圍內，不需要完全互補。通常優選具有足夠互補性的多核苷酸以在生理條件下形成解鏈溫度高於20°C、30°C、或40V的雙鏈體。「病症」是得益於用本發明的分子或組合物進行治療的任何狀況，包括本文描述或要求的那些狀況。這包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳動物易患所述病症的病理狀況。使寡核苷酸「靶向」選擇的核酸靶標可以是多步過程。該過程可從識別其功能將要調節的核酸序列開始。這可以是(例如)細胞的基因(或由該基因形成的mRNA)，其表達與特殊疾病狀態、或來源於感染物的外來核酸(RNA或DNA)有關。靶向過程還可包括在核酸序列內確定用於發生寡核苷酸相互作用的部位或多個部位，以產生所希望的效應，即，蛋白表達的抑制、減少的蛋白檢出、或其它活性調節。一旦確定靶位或多個靶位，則選擇反義化合物(例如，寡核苷酸)，這些化合物足夠地或所希望地互補於靶標，即充分雜交並具有足夠的或換句話說所希望的特異性，以產生所希望的調節。在本發明中，靶標包括編碼一種或多種連接蛋白的核酸分子。靶向過程還可包括確定發生反義相互作用的部位或多個部位，以產生所希望的效應。優選的基因內部位例如是包括基因的開放閱讀框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的區。翻譯起始密碼子通常是5』AUG(在轉錄的mRNA分子中；在相對應的DNA分子中的5』-ATG),並且還可稱為「AUG密碼子」、「起始密碼子」或「AUG起始密碼子」。少數基因具有含有RNA序列5』-GUG、5』-UUG或5』-CUG的翻譯起始密碼子，並且5』_AUA、5』-ACG和5』-CUG已顯示出在體內起作用。因此，術語「翻譯起始密碼子」和「起始密碼子」可包括許多密碼子序列，即使在每種情況下起始胺基酸通常是蛋氨酸(真核生物中)或甲醯甲硫氨酸(原核生物中)。在本領域中還已知真核生物基因和原核生物基因可具有兩種或更多可選的起始密碼子，在特定的細胞類型或組織中、或在一組特定條件下，起始密碼子的任何一種可優選用於翻譯起始。術語「寡核苷酸」包括核苷酸或核苷單體的寡聚物或聚合物，其包括天然存在的鹼基、糖以及糖內(主鏈)結合。術語「寡核苷酸」還包括包含非天然存在的單體、或其部分的寡聚物或聚合物，其功能類似。這樣修飾或取代的寡核苷酸通常比天然形式更優選，這是由於諸如提高的細胞攝取、在有核酸酶存在的情況下增高的穩定性、或提高的靶親合力的性能。已表明許多核苷酸和核苷修飾使得它們加入其中的寡核苷酸比天然寡脫氧核苷酸(ODN)更耐核酸酶消化作用。核酸酶抗性是通過用細胞提取物或分離的核酸酶溶液孵育寡核苷酸並且通常通過凝膠電泳測量經過一段時間殘留的完整寡核苷酸的水平來常規地加以測量。為提高其核酸酶抗性而已修飾的寡核苷酸在比未修飾的寡核苷酸可在更長時間內完整存活。還表明許多修飾可增大寡核苷酸與其靶標的結合(親合力)。寡核苷酸對其靶標的親合力是通過測量寡核苷酸/靶標對的Tm(解鏈溫度)來常規地加以確定，其中Tm是寡核苷酸和靶標分離的溫度。分離是用分光光度法進行檢測。Tm越大，寡核苷酸對靶標的親合力就越大。在一些情形中，提高靶標結合親合力的寡核苷酸修飾還能夠提高核酸酶抗性。「多核苷酸」意思是多個核苷酸。因此，術語「核苷酸序列」或「核酸」或「多核苷酸」或「寡核苷酸」或「寡脫氧核苷酸」都指的是核苷酸的雜聚物或這些核苷酸的序列。這些短語還指可以是單鏈或雙鏈並且可代表有義或反義鏈的基因組的或合成起源的DNA或RNA，指肽核酸(PNA)或指任何DNA類似物或RNA類似物。編碼連接蛋白、連接蛋白片斷、或連接蛋白變異體的多核苷酸包括這樣的多核苷酸，其編碼:天然發現的連接蛋白的成熟型；天然發現的連接蛋白及附加編碼序列(例如，前導序列或信號序列或原蛋白(proprotein)序列)的成熟型；任一種前述和非編碼序列(例如，用於天然發現的多肽的成熟型的編碼序列的內含子或非編碼序列5』和/或3』)；天然發現的連接蛋白的成熟型的片斷；以及天然發現的連接蛋白的成熟型的變異體。因此，「編碼連接蛋白的多核苷酸」及同類物包括只包含用於希望的連接蛋白、片斷、或變異體的編碼序列的多核苷酸，以及包含附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。術語「模擬肽(peptidomimetic)」或「模擬物」指的是合成化合物，其可具有大致與本文提供的反義多肽相同的結構和功能特性以及至少部分且在一定程度上模擬連接蛋白特異性的抑制活性。肽類似物通常在製藥工業中用作非肽藥，這些非肽藥具有類似於模板肽藥的性質。這些類型的非肽化合物稱作「肽模擬物」或「模擬肽」(Fauchere，J.Adv.DrugRes.15:29(1986);VeberandFreidinger;TINS;392(1985);andEvansetal.,J.Med.Chem.30:1229(1987);BeeleyN.,TrendsBiotechnol.1994Jun;12(6):213-6.;Kieber-EmmonsT,etal.;CurrOpinBiotechnol.1997Aug;8(4):435-41)。與治療有用的妝的結構類似的肽模擬物可用來產生等效或提高的治療或預防作用。通常，模擬肽結構上類似於範例多肽(paradigmpolypeptide)(即，具有生物學或藥理學活性的多肽),如反義多核苷酸，但具有一個或多個肽鍵，所述肽鍵可選地由選自由(例如)-CH2NH-,-CH2S-,-CH2-CH2-,-CH=CH-(順式和反式)、-C0CH2-、-CH(OH)CH2-,以及-CH2SO-組成的組的鍵代替。該模擬物可以是全部由合成的、非天然的胺基酸的類似物組成，或者是部分天然肽胺基酸和部分胺基酸的非天然類似物的嵌合分子。該模擬物還可包括任何量的天然胺基酸的保守性置換，只要這樣的置換還不會實質上改變該模擬物的結構和/或活性。例如，模擬組合物是在本發明的範圍內，如果其能夠下調連接蛋白的生物活性，如，間隙連接介導的細胞間通訊。術語「組合物」用來包括包含一種或多種成分的產物。術語連接蛋白活性的「調節子」和「調節」(如本文以其各種形式使用的)用來包括對連接蛋白的表達或活性的整體或部分抑制。這樣的調節子包括連接蛋白功能或表達的小分子激動劑和拮抗劑、反義分子、核酶、三股螺旋分子(triplexmolecule)、以及RNAi多核苷酸、基因治療方法、以及其它。短語「同一'丨生百分數(percentidentity)(%)」指的是在兩個或更多序列的對比中發現的序列類似性的百分數。同一性百分數可利用任何合適的軟體用電子儀器來確定。同樣，在兩個序列(或它們其中的一個或兩個的一個或多個部分)之間的「類似性」是通過將一個序列的序列與第二個序列進行對比來確定。通過「藥學上可接受的(藥用)」的意思是，例如，與配方的其它成分相容並且適合給予其接受體的載體、稀釋劑或賦形劑。通常，術語「蛋白質」指的是通過肽鍵連接的兩個或多個單獨的胺基酸(無論是否天然存在)的任何聚合物，當結合到一個胺基酸(或胺基酸殘基)的α-碳的羧酸基團的羧基碳原子共價結合到氨基基團(其結合於相鄰胺基酸的α-碳)的氨基氮原子時發生。這些肽鍵鍵合、以及包括它們的原子(即，α-碳原子、羧基碳原子(以及它們的取代基氧原子)、以及氨基氮原子(以及它們的取代基氫原子))形成蛋白質的「多肽主鏈」。另外，如在本文中所使用的，術語「蛋白質」應理解為包括術語「多肽」和「肽」(有時其可在本文中互換使用)。同樣地，蛋白質片斷、類似物、衍生物、以及變異體本文中可稱為「蛋白質」，並且除非另有說明，應視為「蛋白質」。術語蛋白質的「片斷」指的是包括比蛋白質的所有胺基酸殘基更少的多肽。如同將要理解的，蛋白質的「片斷」可以是在氨基末端、羧基末端、和/或在其內部(如通過天然剪接)截短的蛋白質形式，並且還可以是變異體和/或衍生物。蛋白質的「域」也是片斷，並且包括要求賦予相應於天然存在的蛋白質的生物化學活性的蛋白質的胺基酸殘基。截短的分子，其是直鏈生物聚合物如核酸分子或多肽，可具有一個或多個從分子的其中一個末端的缺失和/或一個或多個從分子的非端區的缺失，其中這樣的缺失可以是約1-1500個鄰近核苷酸或胺基酸殘基的缺失，優選約1-500個鄰近核苷酸或胺基酸殘基的缺失，並且更優選約1-300個鄰近核苷酸或胺基酸殘基的缺失，包括約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31-40、41-50、51-74,75-100,101-150,151-200,201-250或251-299個鄰近核苷酸或胺基酸殘基的缺失。術語「嚴格條件」指的是允許多核苷酸之間雜交的條件。嚴格條件可通過鹽濃度、有機溶劑(例如甲醯胺)的濃度、溫度、以及其它本領域已知的條件來定義。嚴格性可通過減少鹽的濃度、增大有機溶劑(例如甲醯胺)的濃度、或者升高雜交溫度來提高。例如，嚴格的鹽濃度通常低於約750mMNaCl和75mM檸檬酸三鈉，優選低於約500mMNaCl和50mM檸檬酸三鈉，並且最優選低於約250mMNaCl和25mM檸檬酸三鈉。低嚴格性雜交可在沒有有機溶齊IJ(例如甲醯胺)存在的情況下實現，而高嚴格性雜交可在有機溶劑(例如，至少約35%甲醯胺，最優選至少約50%甲醯胺)存在的情況下實現。嚴格的溫度條件通常包括至少約30°C的溫度，更優選至少約37°C的溫度，並且最優選至少約42°C的溫度。變動其它參數，例如，雜交時間、去汙劑(例如，十二烷基硫酸鈉(SDS))的濃度、以及包含或不包含載體DNA，對本領域技術人員來說是熟知的。嚴格性的各種水平是通過組合這些所需的各種條件來完成，並且在本領域技術人員已知的範圍內。嚴格的雜交條件還可通過在低於靶標序列和對於該靶標具有精確或接近精確互補性的探針的解鏈溫度(Tm)約5°C到約20°C或25°C範圍內的條件來限定。如在本文中所使用的，解鏈溫度是雙鏈核酸分子群半解離成單鏈的溫度。用於計算核酸的Tm的方法在本領域中是熟知的(參見,例如,BergerandKimmel,1987,MethodsInEnzymology,Vol.152:GuideToMolecularCloningTechniques,SanDiego:AcademicPress,Inc.andSambrooketal.,(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,Vols.1-3,ColdSpringHarborLaboratory)。如由標準參考文獻表明的，當核酸在IMNaCl的水溶液中時，Tm值的簡單估計可通過等式來計算:Tm=81.5+0.41(%G+C)(參見，例如，AndersonandYoung,「QuantitativeFilterHybrization，，inNucleicAcidHybridization(1985))。雜交物的解鏈溫度(並且由此的嚴格雜交的條件)受各種因素的影響，諸如探針的長度和性質(DNA、RNA、鹼基組成)以及靶標的性質(DNA、RNA、鹼基組成、存在於溶液中或固定的等)、以及鹽和其它組分的濃度(例如，存在或缺少甲醯胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)。這些因素的影響在本領域中是熟知的並且在標準參考文獻中進行了討論，參見例如，Sambrook,見前，以及Ausubel,見前。通常，嚴格的雜交條件是:鹽濃度低於約1.0M鈉離子，通常在ρΗ7.0到8.3時約0.01到1.0M鈉離子，以及對於短探針(例如，10到50個核苷酸)溫度至少約30°C而對於長探針(例如，大於50個核苷酸)溫度至少約60°C。正如所指出的那樣，嚴格條件還可用諸如甲醯胺的去穩定劑的加入來實現，在該情形中可使用較低溫度。在本發明中，多核苷酸可以是這樣的多核苷酸，其在中等至較高的嚴格性的條件下如0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉、並在約50到約60°C攝氏度下雜交到連接蛋白mRNA。術語「有效治療量」意思是所討論的(subject)化合物的量，其將引起所希望的反應，例如，組織、系統、動物或人類的生物或藥物反應，而這是，例如，由研究人員、獸醫、醫生、或其它臨床醫生所尋找的。「治療」指的是治療處理和預防或保護措施。那些需要治療的患者包括那些已患有病症的患者以及那些需要防止病症的患者。術語「載體」是指核酸分子擴增、複製、和/或表達載體，其形式為質粒、噬菌體、病毒、或其它系統(天然存在的或合成的)，用於將核酸傳遞到細胞，其中質粒、噬菌體、或病毒可以藉助細菌、酵母菌、無脊椎動物、和/或哺乳動物宿主細胞起作用。載體可保持獨立於宿主細胞基因組DNA的狀態或可整體或部分地和基因組DNA結合起來。載體通常(但不需要)含有所有必要組分，以便在任何其相容的宿主細胞中起作用。「表達載體」是在適當條件下能夠引導外源多核苷酸(例如編碼連接域融合蛋白(bindingdomainfusionprotein)的多核苷酸)表達的載體。如在本文中所描述的，術語「同源和同源物」包括可以是連接蛋白多核苷酸中的序列的同源體的多核苷酸(例如，mRNA)ο這樣的多核苷酸通常與相關序列具有至少約70%的同源性，優選至少約80%、90%、95%、97%或99%的同源性，例如，超過(同源序列的)至少約15、20、30、40、50、100個更多相鄰的核苷酸的區。同源性可基於本領域的任何方法加以計算。例如，UWGCG包提供了可用來計算同源性(例如，根據默認設置使用)的BESTFIT程序(Devereuxetal.(1984)NucleicAcidsResearchl2,p387_395)。PILEUP和BLAST算法可用來計算同源性或校正(lineup)序列(通常基於其默認設置)，例如在AltschulS.F.(1993);JMolEvol36:290-300;Altschul,S.F.etal.;(1990);JMolBiol215:403-10中所描述的。用於進行BLAST分析的軟體通過國家生物技術信息中心可公開獲得(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/L)。該算法涉及首先通過在查詢序列中確定短字長(wordoflength)W來確定高得分序列對，當在資料庫序列中對準(alignwith)相同長度的字時,其匹配或滿足某一正值閾值得分(score)T。T稱為鄰域字得分閾值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschuletal.,見前)。這些初始鄰域字命中(wordhit)作為用來啟動搜索以找到含有它們的HSPs的種子(seed)。字命中沿著每個序列向兩個方向延伸直到可增加累積對準得分(alignmentscore)。字命中在每個方向的延伸會停止，當:累積對準得分從其最大獲得值下降量X;累積得分趨於零或以下，這是由於一個或多個負得分殘基排列的累積；或其中一個序列到達端點時。BLAST算法參數W、T以及X確定對準的靈敏度和速度。BLAST程序使用字長(W)為11、BL0SUM62得分矩陣(參見HenikoffandHenikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915-10919)對準(B)為50、期望值(E)為10、M=5、N=4、以及兩種鏈的對比)作為默認。BLAST算法對兩個序列之間的相似性進行統計分析；參見例如，KarIinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5787。BLAST算法提供的一種相似性測量是最小求和概率(P(N))，其提供概率讀數，兩個核苷酸或胺基酸序列之間的匹配通過該概率讀數偶爾發生。例如，如果與第一個序列相比最小求和概率小於約1，優選小於約0.1，更優選小於約0.01，並且最優選小於約0.001，那麼就認為序列與另一個序列相似。同源序列通常與相關序列相差至少(或不多於)約1、2、5、10、15、20或更多突變(其可以是替換、缺失或插入)。這些突變可通過任何上述與計算同源性有關的區來測量。同源序列通常以顯著高於背景的水平選擇性地雜交到初始序列。選擇性的雜交通常利用中等到高度嚴格性條件(例如，約50°C到約60°C，0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉)來實現。但是，這樣的雜交可在本領域已知的任何合適條件下進行(參見Sambrooketal.(1989),MolecularCloning:ALaboratoryManual)。例如，如果需要高嚴格性，那麼合適條件就包括在60°C下的0.2xSSC0如果需要較低嚴格性，那麼合適條件就包括60°C下的2xSSC0「細胞」意思是任何適用於所希望的應用的活細胞。細胞包括真核細胞和原核細胞。術語「基因產物」指的是從基因轉錄的RNA分子、或由基因編碼的或從RNA翻譯的多肽。術語「重組」是指:體外合成或以其它方式生成的多核苷酸(例如，「重組多核苷酸」)；利用重組多核苷酸來在細胞中或其它生物系統中生產基因產物的方法；或由重組多核苷酸編碼的多肽(「重組蛋白」)。因此，「重組的」多核苷酸通過其生產的方法或者其結構來定義。關於其生產方法，該過程指的是使用重組核酸技術，例如，涉及人為介入到核苷酸序列中，通常為選擇或生成。可替換地，其可以是通過生成序列而形成的多核苷酸，該序列包括兩個或多個不是相互天然鄰接的片斷的融合。因此，例如，包括通過用任何非天然存在的載體轉化細胞而形成的產物，也包括包含利用任何合成寡核苷酸過程衍生的序列的多核苷酸。同樣地，「重組的」多肽是從重組多核苷酸表達的一種。「重組宿主細胞」是包含載體(例如，克隆載體或表達載體)的細胞、或通過重組技術用其它方法已加以操作以表達感興趣的蛋白的細胞。本發明包括利用化合物和組合物對用於傷口癒合(例如，手術相關的傷口癒合和/或組織重建應用)的間隙連接相關的蛋白表達進行部位特異性調節的方法。本發明可用於，例如，連同雷射手術矯正視覺缺陷、體外角膜工程(engineering)、以及在希望進行角膜重建處直接眼處理，包括那些獨立進行的眼處理或可選地，連同對眼進行的操作(例如，手術)的眼處理。直接細胞間通訊的反義調節優選通過直接地或間接地減少組織中細胞之間的偶連的分子加以介導。這樣的分子包括諸如反義脫氧核苷酸的多核苷酸、嗎啉代核苷酸、RNAi以及靶向特定連接蛋白同種型(isoform)的脫氧核酶，其導致減少的蛋白質同種型的翻譯並且幹擾細胞間隙連接的功能。這些反義化合物的施加導致間隙連接介導的細胞間通訊在連接蛋白表達被下調的部位減少。連接蛋白在間隙連接介導的細胞間信號傳遞中起重要作用。連接蛋白的過度表達與術後瘢痕形成和外傷後引起的組織重建(remodeling)有關。根據本發明的一些實施例，連接蛋白代表有用的靶，該靶用於與角膜外傷和術後組織重建有關的不良作用的處理；以及用於這樣的疾病和病症，其中直接的細胞間通訊中局部破壞是希望的。尤其是，連接蛋白表達的調節可用於間隙連接相關的蛋白質表達(其用於組織重建/組織工程應用)的部位特異性調節。本文提供的反義化合物可與眼科操作或手術(如，例如，白內障手術、眼內晶狀體手術、角膜移植手術和一些類型的青光眼手術、以及其它在本文中描述的操作)結合，用於連接蛋白的調節。在一些實施例中，連接蛋白的調節可用於影響後段(包括視網膜和晶狀體)的眼科病症。在本發明的另一方面，連接蛋白的調節可用於影響前段(包括角膜、結膜以及鞏膜)的眼科病症。在本發明的範圍內，後段病症包括黃斑裂孔和變性、視網膜撕裂、糖尿病視網膜病變、玻璃體視網膜病變以及其它病症。還是在本發明的範圍內，晶狀體的病症可以包括白內障。在又一個方面，可以設想，角膜的病症是屈光病症，如放射狀角膜切開術的後遺症、乾眼症、病毒性結膜炎、潰瘍性結膜炎和傷口癒合中的瘢痕形成，如，角膜上皮傷口，以及舍格倫綜合症的後果。本發明披露了反義化合物，尤其是寡核苷酸，用於調節編碼連接蛋白的核酸分子的功能，最後調節產生的連接蛋白的量。這是通過提供特異性地與編碼連接蛋白的核酸(優選mRNA)雜交的寡核苷酸來完成。這種在諸如寡核苷酸的反義化合物和其互補核酸靶標(寡核苷酸與其雜交)之間的關係通常稱為「反義」。如在本文中所描述的，寡核苷酸「靶向」選擇的核酸靶標通常是多步過程。該過程通常從確定其功能需要調節的核酸序列開始。例如，這可以是其表達與具體疾病狀態有關的細胞基因(或由該基因形成的mRNA)。在本發明中，靶標是編碼連接蛋白的核酸；換句話說，編碼連接蛋白的基因、或從連接蛋白基因表達的mRNA。編碼連接蛋白的mRNA是當前優選的靶標。靶向過程還包括核酸序列內用於發生反義相互作用的部位或多個部位的確定，以便形成基因表達的調節。在本發明的範圍內，信使RNA不僅包括利用三個字母遺傳密碼編碼蛋白質的信息，而且包括有關的核糖核苷酸，其形成技術人員已知的區，如5』-非翻譯區、3』-非翻譯區、5』-帽區，以及內含子/外顯子連接核糖核苷酸。因此，寡核苷酸可根據本發明來製成，其整個或部分地靶向這些相關核糖核苷酸以及靶向信息核糖核苷酸。寡核苷酸因此可特異性地與轉錄起始部位區、翻譯起始密碼子區、5』帽區、內含子/外顯子連接、編碼序列、翻譯終止密碼子區或在5』-或3』-非翻譯區中的序列雜交。由於翻譯起始密碼子通常是5』-AUG(在轉錄的mRNA分子中；在相對應的DNA分子中的5』-ATG)，翻譯起始密碼子也稱為「AUG密碼子」、「起始密碼子」或「AUG起始密碼子」。少量基因具有含有RNA序列5』-GUG、5』-UUG或5』-CUG的翻譯起始密碼子，而5』-AUA、5』-ACG以及5』-CUG已表明在體內起作用。因此，術語「翻譯起始密碼子」和「起始密碼子」可包括許多密碼子序列，即使在每種情況下起始胺基酸通常是蛋氨酸(真核生物中)或甲醯甲硫氨酸(原核生物中)。本領域中還已知真核生物基因和原核生物基因可具有兩個或多個可替換的起始密碼子，其中任何一個可優選用於特定的細胞類型或組織中、或在特定的一組條件下的翻譯起始。在本發明的範圍內，「起始密碼子」和「翻譯起始密碼子」指的是密碼子或多個密碼子，這些密碼子在體內用來引發轉錄自編碼連接蛋白的基因的mRNA分子的翻譯，而與這樣的密碼子的序列無關。本領域中還已知，基因的翻譯終止密碼子(或「終止密碼子」)可具有三個序列(即，5』-UAA、5，-UAG以及5』-UGA，其相對應的DNA序列分別是5』-TAA、5』-TAG以及5』-TGA)中的一個。術語「起始密碼子區」、「AUG區」以及「翻譯起始密碼子區」指的是這樣的mRNA或基因的一部分，其在自翻譯起始密碼子的每個方向(即，5』或3』)包括約25個到約50個相鄰核苷酸。該區是優選的靶標區。同樣地，術語「終止密碼子區」和「翻譯終止密碼子區」指的是這樣的mRNA或基因的一部分，其在自翻譯終止密碼子的每個方向(即，5』或3』)包括約25個到約50個相鄰核苷酸。該區是優選的靶標區。本領域已知的開放閱讀框(ORF)或「編碼區」指的是在翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區，其也是可以有效靶向的區。其它優選的靶標區包括本領域已知的5』非翻譯區(5』UTR)，其指的是在5』方向上從翻譯起始密碼子開始的mRNA的部分，因此包括在mRNA的5』帽部位和翻譯起始密碼子之間的核苷酸或在基因上相對應的核苷酸，以及本領域已知的3』非翻譯區(3』UTR)，其指的是在3』方向上從翻譯終止密碼子開始的mRNA的部分，因此包括在mRNA的翻譯終止密碼子和3』末端之間的核苷酸或在基因上相對應的核苷酸。mRNA的5』帽包括通過5』-5』三磷酸鍵(triphosphatelinkage)連接到mRNA的5』-多數(most)殘基的N7-甲基化的鳥嘌呤核苷殘基。認為mRNA的5』帽區包括5』帽結構本身以及接近該帽的最初50個核苷酸。5』帽區也可以是優選的靶標區。儘管一些真核細胞的mRNA轉錄物被直接翻譯，但是許多含有一個或多個區(稱為「內含子」)，其從mRNA前體轉錄物被切除而產生一個或多個成熟mRNA。殘留的(並因此被翻譯)區稱為「外顯子」，並且被剪接在一起而形成連續的mRNA序列。mRNA剪接部位(B卩，外顯子之間或內含子一外顯子的連接部)也可以是優選的靶標區，並且在下述情況下是特別有用的:在疾病中涉及異常剪接、或在疾病中涉及特定mRNA剪接產物的過度產生。起因於重排或缺失的異常融合連接也是優選的靶標。在可選的剪接的mRNA中靶向特定外顯子也可以是優選的。還發現內含子也可以是有效的，並因此是優選的反義化合物靶向的靶標區，例如,靶向DNA或mRNA前體。在本發明的範圍內，反義多核苷酸可例如雜交到全部或部分的連接蛋白mRNA。通常，反義多核苷酸雜交到連接蛋白mRNA的核糖體結合區或編碼區。多核苷酸可以互補於連接蛋白mRNA的全部或一個(或幾個)區。例如，多核苷酸可以是連接蛋白mRNA的全部或部分的精確互補結構(complement)。反義多核苷酸可抑制連接蛋白的轉錄和/或翻譯。優選地，該多核苷酸是連接蛋白基因的轉錄和/或翻譯的特異性抑制劑，並且不會抑制其它基因的轉錄和/或翻譯。該產物可結合到連接蛋白基因或mRNA或者(i)5』到編碼序列，和/或(ii)到編碼序列，和/或(iii)3』到編碼序列。通常，反義多核苷酸會引起細胞中連接蛋白mRNA和/或蛋白的表達減少。反義多核苷酸對於連接蛋白mRNA通常是反義。這樣的多核苷酸可以能夠雜交到連接蛋白mRNA並且可通過幹擾連接蛋白mRNA代謝(包括轉錄、mRNA加工、mRNA從細胞核的轉運、翻譯或mRNA降解)的一個或多個方面來抑制連接蛋白的表達。反義多核苷酸通常雜交到連接蛋白mRNA，以形成一種雙鏈體，其可引起mRNA的翻譯的直接抑制和/或去穩定化。這樣的雙鏈體可容易受到核酸酶降解的影響。反義寡核苷酸與mRNA的雜交會干擾mRNA的一個或多個正常功能。要幹擾的mRNA功能包括所有生命必需的功能，如，例如，mRNA移位到蛋白質翻譯的部位、從RNA翻譯蛋白質、RNA的剪接以產生一個或多個mRNA種類，以及可由RNA參加的催化活性。也可通過反義寡核苷酸雜交到RNA來幹擾特定蛋白與RNA的結合。對mRNA功能進行幹擾的總體作用是調節連接蛋白的表達。在本發明的範圍內，「調節」包括抑制或者刺激；即，或者降低或者增加表達。這種調節可用本領域的常規方式加以測量，例如，通過mRNA表達的RNA印跡(Northernblot)實驗、或反轉錄酶PCR(如在本申請的實施例中講述的)、或通過蛋白質表達的蛋白質印跡實驗或ELISA、或通過蛋白質表達的免疫沉澱實驗。對細胞增殖或腫瘤細胞生長的影響也可以加以測量，如在本申請的實施例中講述的。目前抑制是優選的。一旦確定了靶位或多個靶位，則選擇與靶標足夠互補的寡核苷酸，S卩，足夠良好地雜交並且具有足夠的特異性，以獲得所希望的調節。反義核酸(DNA、RNA、修飾的、類似物等)可利用任何適合用來產生核酸的方法來製成。靶向其它連接蛋白的寡脫氧核苷酸可根據它們的核苷酸序列並通過任何本領域公認的方法(如，例如，電腦程式MacVector和OligoTech(來自Oligosetc.Eugene,Oregon,USA))加以選擇。用於這樣的合成的裝置可通過幾個包括MacVector和OligoTech(來自Oligosetc.Eugene,Oregon,USA)的賣主獲得。對於涉及反義多核苷酸的一般方法，參見AntisenseRNAandDNA,D.A.Melton,Ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1998)。還參見Dagleetal.,NucleicAcidsResearch,19:1805(1991)。對於反義治療，參見，例如，Uhlmannetal.，Chem.Reviews,90:543-584(1990)。通常，至少部分核苷酸序列對於連接蛋白是已知的，其中抑制表達是所希望的。優選地，反義化合物被靶向一個或多個特定連接蛋白同種型。可能由反義化合物靶向的連接蛋白的特定同種型包括但不限於43、37、31.1、26、以及在本文描述的其它連接蛋白的同種型。優選(但不必需)靶向的連接蛋白是人類的。連接蛋白可(例如)具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列。在一些實施例中，反義化合物靶向編碼連接蛋白的核酸分子的至少8個核酸鹼基，其中該核酸分子具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列。在一些其它實施例中，將第二反義化合物給予患者的眼，其中第二反義化合物靶向編碼連接蛋白的核酸分子的至少約8個核酸鹼基，其中該核酸分子具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列，其中所述第二反義化合物靶向不同於第一反義化合物靶向的連接蛋白。連接蛋白靶標依賴於要設計或重建的組織類型而變化，並且本發明使用的反義多核苷酸的精確序列依賴於靶標連接蛋白。由寡核苷酸靶向的連接蛋白或多種連接蛋白依賴於要進行下調的部位。這反映了就連接蛋白亞單位組成而論在整個身體(body)的不同部位間隙連接具有不均勻的組成。但是依據在組織中的分布，一些連接蛋白比其它連接蛋白更加普遍存在。如本文所描述的，諸如連接蛋白-43的角膜相關連接蛋白在一些實施例中是優選的。因此，在本發明的範圍內，寡核苷酸單獨或者組合地靶向適合於角膜設計或重建應用的連接蛋白43、26、37、30和/或31.1(例如，參見SEQ.1D.N0S:1-11)。在本發明的一個方面，該寡脫氧核苷酸可以是未修飾的磷酸二酯寡聚物。在本發明的另一方面，該多核苷酸可以是單鏈或雙鏈。還設想靶向分開的連接蛋白的寡核苷酸可組合使用(例如，可以靶向一種、兩種、三種、四種或更多不同的連接蛋白)。例如，可以組合使用靶向連接蛋白43、以及一種或多種連接蛋白家族的其它成員(如連接蛋白26、30、31.1、37以及43)的0DN。還設想單個反義多核苷酸對於特定連接蛋白可以是特異的，或可靶向1、2、3或更多不同的連接蛋白。特異多核苷酸通常將靶向連接蛋白基因或mRNA中的序列，其在連接蛋白之間不是保守的，而非特異多核苷酸將靶向保守序列。因此，在一些實施例中，反義化合物靶向核酸分子的至少8個核酸鹼基，其中該核酸分子編碼人類連接蛋白26、連接蛋白30、連接蛋白31.1、人類連接蛋白37、連接蛋白43，其中，所述反義化合物在與患者眼有關的細胞中抑制人類連接蛋白的表達。在一些實施例中，編碼連接蛋白的核酸分子具有選自SEQIDN0:12-31的核酸鹼基序列。在一些實施例中，該組合物靶向兩種或多種人類連接蛋白並且抑制兩種或多種人類連接蛋白的表達。在另外的一些實施例中，反義化合物是反義寡核苷酸。針對連接蛋白43選擇的典型的反義寡核苷酸包括GTAATTGCGGCAAGAAGAATTGTTTCTGTC(SEQIDNO:1);GTAATTGCGGCAGGAGGAATTGTTTCTGTC(SEQIDNO:2);以及GGCAAGAGACACCAAAGACACTACCAGCAT(SEQIDNO:3)。針對連接蛋白26的反義寡核苷酸的實例具有序列TCCTGAGCAATACCTAACGAACAAATA(SEQIDNO:4)針對連接蛋白37選擇的典型的反義寡核苷酸包括5』CATCTCCTTGGTGCTCAACC3』(SEQIDNO:5)和5』CTGAAGTCGACTTGGCTTGG3』(SEQIDNO:6)針對連接蛋白30選擇的典型的反義寡核苷酸包括5』CTCAGATAGTGGCCAGAATGC3』(SEQIDNO:7)和5』TTGTCCAGGTGACTCCAAGG3』(SEQIDN0:8)。針對連接蛋白31.1選擇的典型的反義寡核苷酸包括5』CGTCCGAGCCCAGAAAGATGAGGTC3』(SEQIDNO:9);5』AGAGGCGCACGTGAGACAC3』(SEQIDNO:10);以及5』TGAAGACAATGAAGATGTT3』(SEQIDNO:11)。在另外的實施例中，選自以下序列的寡脫氧核苷酸特別適合於下調連接蛋白43表達:5』GTAATTGCGGCAAGAAGAATTGTTTCTGTC3』(SEQIDNO:1)5』GTAATTGCGGCAGGAGGAATTGTTTCTGTC3』(SEQIDNO:2);以及5，GGCAAGAGACACCAAAGACACTACCAGCAT3』(SEQIDNO:3)在又一個實施例中，選自以下序列組的寡脫氧核苷酸特別適合於連接蛋白26、37、30、以及31.1:5，TCCTGAGCAATACCTAACGAACAAATA3，(連接蛋白26)(SEQIDNO:4)5，CATCTCCTTGGTGCTCAACC3，(連接蛋白37)(SEQIDNO:5)5，CTGAAGTCGACTTGGCTTGG3，(連接蛋白37)(SEQIDNO:6)5，CTCAGATAGTGGCCAGAATGC3』(連接蛋白30)(SEQIDNO:7)5』TTGTCCAGGTGACTCCAAGG3』(連接蛋白30)(SEQIDNO:8)5，CGTCCGAGCCCAGAAAGATGAGGTC3，(連接蛋白31.1)(SEQIDN0:9)5，AGAGGCGCACGTGAGACAC3，(連接蛋白31.1)(SEQIDNO:10)5，TGAAGACAATGAAGATGTT3，(連接蛋白31.1)(SEQIDNO:11)本文提供的反義化合物通常包括約8到約40個核酸鹼基(即，約8到約40個連接的核苷)，並且更典型地，包括約12到約40個核酸鹼基，並且甚至更典型地，包括約30個核酸鹼基。包含多核苷酸的反義化合物可以是至少約40，例如至少約60或至少約80個核苷酸的長度並且高達100、200、300、400、500、1000、2000或3000或更多個核苷酸的長度。適合的反義化合物包括，例如,30mer0DN。在一些實施例中，反義化合物靶向編碼連接蛋白的核酸分子的至少約8個核酸鹼基，其中核酸分子具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列。在其它實施例中，反義化合物靶向編碼連接蛋白的核酸分子的至少約10、至少約12、至少約14、至少約16、至少約18、至少約20、至少約25、至少約30、以及至少約35個核酸鹼基，其中核酸分子具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列。反義化合物(包括靶向編碼人類連接蛋白的核酸分子的至少在約8個和35個核酸鹼基之間的寡核苷酸)的大小可以是8個核酸鹼基的長度或更長，在8個到100個核酸鹼基之間、在8個到50個核酸鹼基之間、在8個到40個核酸鹼基之間、在10個到50個核酸鹼基之間、在12個到50個核酸鹼基之間、在14個到50個核酸鹼基之間、在16個到50個核酸鹼基之間、在18個到50個核酸鹼基之間、在20個到50個核酸鹼基之間、在25個到50個核酸鹼基之間、在15個到35個核酸鹼基之間等的長度。本發明的其它反義化合物可以是更短或更長的大小，例如，具有大於100個核酸鹼基的長度。反義化合物包括反義寡核苷酸(0DN)、反義多核苷酸、脫氧核酶、嗎啉代寡核苷酸、RNAi分子或其類似物、siRNA分子或其類似物、PNA分子或其類似物、DNA酶或其類似物、5』-端-變突的Ul小核RNA及其類似物。如本文所提供的，反義化合物可以包括使用寡脫氧核苷酸(0DN)。ODN通常是約20個核苷酸的長度並且通過雜交到mRNA前體和mRNA來起作用，以產生核糖核酸酶H(RNA酶H)的底物，其特異性地降解形成的RNA-DNA雙鏈體的RNA鏈。如果以一種阻止RNA酶H作用的方式進行修飾，那麼ODN可通過位阻來抑制mRNA的翻譯、或抑制mRNA前體的剪接。ODN及其修飾已用於靶向dsDNA以通過形成三股螺旋而抑制轉錄。ODN可通過本領域已知的自動合成的方法來獲得並且其相對更直接地獲得任何序列的ODN並通過反義鹼基配對來阻斷基因表達。在一些方面，ODN的磷酸二酯主鏈可加以修飾以增加其作為用於阻斷基因表達的靶標特異性試劑的效能。開發了這些主鏈修飾以提高ODN的穩定性並且提高它們的細胞攝取。最廣泛使用的修飾是這樣一種修飾，其中用硫原子代替非橋接氧，從而形成硫代磷酸酯(phosphorothioate)ODNo至少一種硫代磷酸酯ODN已由FDA批准,並且幾種其它硫代磷酸酯反義ODN處於用於各種癌症和炎性疾病的臨床試驗的早期階段。ODN關於阻斷基因功能的作用機制依賴於ODN的主鏈而變化(Branch,A.D.Hepatology24,1517-1529(1996);Dias,N.andStein,C.A.Mol.CancerThor.1,347-355(2002);Stein,C.A.andCohen,J.S.,CancerRes.48,2659-2668(1998);Zon,G.Ann.N.Y.AcadSc1.，616，161-172(1990))。淨負電荷的ODN(如磷酸二酯和硫代磷酸酯)弓丨起RNA酶H-介導的祀標mRNA的剪切。不補充(recruit)RNA酶H(因為其缺少電荷或與靶標RNA形成的螺旋的類型)的其它主鏈修飾可歸類為位阻ODN0常用的這種後一組的成員包括嗎啉代、U-O-甲基、2」-0_烯丙基、鎖定的(locked)核酸和肽核酸(PNA)。在其它抑制靶標中，這些ODN可阻斷剪接、翻譯、核-細胞質傳送和翻譯。在另一方面，連接蛋白表達的調節涉及核酶的使用。核酶是用作酶(即使完全缺少蛋白質)的RNA分子。它們具有特別專一的斷裂和/或形成共價鍵的催化活性，從而加速靶向反應的自發速率達許多數量級。核酶通過Watson-Crick鹼基配對結合RNA並通過催化磷酸二酯主鏈的水解而用於降解靶標RNA。有幾種不同類的核酶，其中『錘頭狀』核酶研究得最為廣泛。如同其名稱所暗示的，當雜交到其靶標mRNA時，錘頭狀核酶形成獨特的二級結構。核酶內的催化上重要的殘基在靶標互補序列的側面，該靶標互補序列在靶標RNA剪切部位的側面。由核酶進行的剪切需要二價離子，如鎂離子，並且也依賴於靶標RNA的結構和可接近性。通過利用定位信號將核酶協同定位到細胞內的靶標RNA可以在很大程度上增加它們的沉默效能。錘頭狀核酶足夠短而可以被化學合成或可從載體進行轉錄，使得在細胞內可以連續產生核酶。RNA用作催化劑的能力首先在四膜蟲嗜熱細菌(Tetrahymenathermophila)的自剪接I組內含子以及RNA酶的RNA部分得到證明。在發現這兩種RNA酶之後，發現RNA介導的催化作用與酵母菌、真菌以及植物線粒體(以及葉綠體)單鏈植物類病毒和擬病毒RNA、δ型肝炎病毒以及來自粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)線粒體的衛星RNA的自剪接II組內含子有關。核酶天然存在，但也可進行人工設計用於順式(在同一核酸鏈上)或反式(非共價連接的核酸)的特異序列的表達和靶向。利用體外選擇方案正開發新生物化學活性以及產生在不同於RNA的底物上起作用的新核酶基序。四膜蟲嗜熱細菌(T.thermophila)的I組內含子是被轉化成反式反應形式的第一順式剪切核酶(我們稱其為內含子/核酶)，使其可用於基因組研究並且作為可能的治療法。在反式剪接反應中，靶向的mRNA的缺陷型外顯子可交換成正確的共價連接到內含子/核酶的外顯子。這通過剪接反應發生，在剪接反應中，連接到內含子的外顯子是通過鹼基配對定位到靶標mRNA，以便在酯交換反應中其可共價結合到靶標轉錄物的5」端。這個反應已用於將野生型序列反式剪接到鐮狀細胞球蛋白轉錄物和突變型P53轉錄物中並替換在強直性肌營養不良等位基因中的蛋白激酶轉錄物的3」-UTR中的展開的三聯體。在整個自然界的有機體中發現了核糖核酸酶內切酶(endoribonuclease)RNA酶P。依賴於從其分離的有機體，這種酶具有RNA和一個或多個蛋白質組分。來源於大腸桿菌和枯草桿菌酶的RNA組分在缺少蛋白質並在(trader)—定鹽和離子條件下可用作部位特異性剪切劑。對於人類和細菌酶的底物要求的研究已表明，用於任何一種酶的最小限度的底物類似轉移RNA分子的片斷。這種結構可通過專門設計的與靶標RNA配對的反義RNA加以模擬，並在試管和細胞中用作RNA酶P-介導的、部位特異性剪切的底物。還表明，反義組分可共價結合到RNA酶PRNA,從而僅將酶引向感興趣的靶標RNA。研究人員在反義RNA的設計中利用了這種性能，其中反義RNA與感興趣的靶標mRNA配對以激發靶標的部位特異性剪切並在細胞培養中用於單純皰疹病毒和巨細胞病毒的靶向抑制。大量小植物病原RNA(類病毒、衛星RNA以及擬病毒)、來自粗糙脈孢菌(N.crassa)線粒體的DNA質粒的轉錄物以及動物δ型肝炎病毒在缺少蛋白質的情況下經歷體外自剪切反應。該反應需要中性pH和Mg2+。自剪切反應是複製的體內滾環(rollingcircle)機制的組成部分。這些自剪切RNA可根據剪切部位附近形成的序列和二級結構細分成若干組。小核酶來源於在單鏈植物類病毒和擬病毒RNA中發現的基序。基於共享的二級結構和保守的一組核苷酸，術語「錘頭狀」已指定給這種自剪切域的一個組。錘頭狀核酶包括30個核苷酸。錘頭狀催化域的簡單性使其成為在反式作用核酶的設計中的常見選擇。利用Watson-Crick鹼基配對，可將錘頭狀核酶設計成能夠剪切任何靶標RNA。在剪切部位的要求相對簡單，並且實際上可靶向任何UH序列基序(這裡H是U、C或A)。第二種來自植物的、自剪切基序(在菸草環斑衛星RNA的負鏈中最初確定的)稱為「髮夾」或「紙夾」。髮夾核酶在產生2」、Y-環狀磷酸酯以及5」-羥基Tl末端的可逆反應中剪切RNA底物一這種催化性基序的設計變型(engineeredversions)也剪切並且翻轉(turnover)各種反式靶標的多份複製。用於髮夾的底物要求包括⑶C，其中緊接著G的上遊發生剪切。髮夾核酶還催化連接反應，儘管其更經常用於剪切反應。在細胞中錘頭狀和髮夾狀核酶都有大量的應用，用於下調特定的細胞和病毒靶標。Haseloff和Gerlach設計了錘頭狀基序(HaseloffandGerlach;Nature.1988Augl8;334(6183):585-91),該基序通過修飾具有正確靶標的鹼基對的臂而可以用來剪切任何靶標。Ramemzani等證明了這種錘頭狀核酶基序在研究中具有潛在的治療應用，其中，利用設計用來表達抗人類免疫缺陷病毒(HIV)gag核酶的細胞，實際上完全抑制病毒基因表達和複製(RamezaniA.etal.,FrontiersinBioscience7:a,29-36;2002)。在另一方面，連接蛋白表達的調節涉及催化性DNA(或DNA酶)的使用。通過體外演變已開發了能夠部位特異性地剪切RNA靶標的小DNA(因為沒有已知的天然存在的DNA酶)。已確定了具有不同剪切部位特異性的兩種不同的催化性基序。最通常使用的10-20種酶通過Watson-Crick鹼基配對結合到其RNA底物並部位特異性地剪切靶標RNA，如同錘頭狀和髮夾核酶所做的那樣，這產生2;3」_環狀磷酸酯和5」-OH末端。靶標mRNA的剪切導致其破壞和DNA酶再循環並且剪切多個底物。催化性DNA對於合成來說相對廉價並且具有優良催化性質，使其用於取代反義DNA或核酶。已公布了在細胞培養中DNA酶的若干應用，包括VegFmRNA的抑制和血管生成的後續預防、以及慢性髓細胞源性(myelogenous)白血病的特徵的bcr/abl融合轉錄物的表達抑制。催化性DNA可以外源傳遞，並且它們可以加以主鏈修飾以便在缺少載體的情況下優化系統傳遞。在本發明的另一方面，組成型連接蛋白基因的調節涉及具有嗎啉代主鏈結構的寡核苷酸的使用。Summerton,J.E.和Weller,D.D的美國專利第5，034，506號。在本發明的另一方面，反義多核苷酸可以加以化學修飾，以便提高其對核酸酶的抗性並增大細胞進入的效能。例如，可使用含有硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸片斷以及適當放置的修飾寡脫氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸片斷的混合主鏈寡核苷酸(MBO)。MBO具有硫代磷酸酯連接的片斷和其它修飾寡核苷酸的其它片斷，如甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、N3』P5』-氨基磷酸酯和寡核糖核苷酸硫代磷酸酯及其2』-O-烷基類似物和2』-O-甲基核糖核苷酸甲基膦酸酯，其是非離子的，並且極耐核酸酶或2』-O-烷基寡核糖核苷酸。如本領域所已知的，核苷是鹼基-糖組合。核苷的鹼基部分通常是雜環鹼基。這樣的雜環鹼基的兩種最常見的類型是嘌呤和嘧啶。核苷酸是進一步包括磷酸酯基團的核苷，其中磷酸酯基團共價連接到核苷的糖部分。對於那些包括戍呋喃糖(pentofuranosyl)的核苷，磷酸酯基團可連接到糖的2』、3』或5』羥基部分。在形成寡核苷酸中，磷酸酯基團將鄰近核苷相互共價連接，以形成直鏈聚合化合物。這種直鏈聚合結構的各端又可進一步連接以形成環形結構，然而，開放式線性結構通常是優選的。在寡核苷酸結構中，磷酸酯基團通常稱為形成寡核苷酸的核苷間主鏈。RNA和DNA的正常鍵或主鏈是3』到5』磷酸二酯鍵。在本發明中有用的反義化合物可包括含有修飾主鏈或非天然核苷間連接的寡核苷酸。具有修飾主鏈的寡核苷酸包括那些在主鏈中保留磷原子以及那些在主鏈中不具有磷原子的寡核苷酸。在本發明的範圍內，在其核苷間主鏈中不具有磷原子的修飾寡核苷酸也可認為是寡核苷酸。在本發明中有用的具有修飾寡核苷酸主鏈的反義化合物可包括(例如)硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基磷酸酯(包括3』-亞烷基磷酸酯和手性磷酸酯、次磷酸酯)、氨基磷酸酯(包括3』-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯)、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、以及具有通常的3』-5』鍵合的硼代磷酸酯(boranophosphate)、這些硼代磷酸酯的2』-5』鍵合類似物、以及那些具有反向極性的反義化合物，其中，核苷單元的鄰近對是鍵接的3』-5』到5』-3』或2』-5』到5』-2』。還包括各種鹽、混合鹽以及游離酸形式。在一方面，可以設想，其中不包括磷原子的修飾寡核苷酸主鏈具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵、混合雜原子以及烷基或環烷基核苷間鍵、或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵形成的主鏈。這些主鏈包括那些具有嗎啉代鍵(部分地由核苷的糖部分形成)的主鏈；娃氧燒主鏈；硫化物、亞碸以及碸主鏈；甲醯基(formacetyl)和硫甲醯基主鏈；亞甲基甲醯基和硫甲醯基主鏈；含烯烴主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸酯和氨磺醯主鏈；醯胺主鏈；以及具有混合N、O、S和CH2組分的其它主鏈。在一方面，可以設想，寡核苷酸模擬物，糖和核苷間鍵二者，即核苷酸單元的主鏈用新基團替換。保持鹼基單元以與合適核酸靶標化合物進行雜交。一種這樣的寡聚物，已表現出具有優良雜交性質的寡核苷酸模擬物，稱為肽核酸(PM)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主鏈用含有醯胺的主鏈代替，尤其是用氨基乙基甘氨酸主鏈代替。保留核酸鹼基並直接或間接結合到主鏈醯胺部分的氮雜氮原子。PNA化合物的進一步內容(teaching)可在Nielsen等(Science,1991，254，1497-1500)中找到。在一方面，可以設想具有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸和具有雜原子主鏈的寡核昔、以及尤其一CH2—NH—O-CH2—、一CH2-N(CH3)—O—CH2-[稱為亞甲基(甲基亞氛基)或MMI王鏈]、一CH2—O—N(CH3)—CH2->—CH2—N(CH3)一N(CH3)—CH2—以及一O-N(CH3)--CH2--CH2-[其中原有磷酸二酯主鍊表示為--O--P-O-CH2--]。在又一個方面，還可以設想具有嗎啉代和醯胺主鏈結構的寡核苷酸。在另一方面，可以設想，修飾寡核苷酸還可包含一個和多個取代的糖部分。例如，在2』位置包括以下之一的寡核苷酸:0H;F;0-、S-、或N-烷基，O-烷基-O-烷基，O-、S-、或N-鏈烯基，或O-、S-、或N-炔基，其中烷基、鏈烯基以及炔基可以是取代的或未取代的C1到Cltl烷基或C2到Cltl鏈烯基和炔基。特別優選的是0[(CH2)n0]mCH3、O(CH2)nOCH3^O(CH2)2ON(CH3)2、O(CH2)nNH2,O(CH2)nCH3^O(CH2)nONH2,以及O(CH2)n0N[(CH2)nCHj2,其中η和m從I到約10。其它優選的寡核苷酸可包括在2』位置的以下一個基團=C1到Cltl低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3>0CN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3>SOCH3>S02CH3、ONO2>NO2>N3、NH2、雜環掠某、雜環掠芳某、氣某掠某氣某、多掠某氣基、取代的甲矽烷基、RNA剪切基團、報導基團、嵌入劑、用於提高寡核苷酸的藥物動力學性能的基團、或用於改善寡核苷酸的藥理動力學性能的基團、以及其它具有類似性能的取代基。優選的修飾包括2』-甲氧乙氧基(2』-O-CH2CH2OCH3，也稱為2』-0-(2-甲氧乙基)或2』-MOE)(Martinetal.Helv.Chim.Actal995,78，486-504)，即，烷氧烷氧基團。其它修飾包括2』-二甲基氨氧基乙氧基，S卩，O(CH2)2ON(CH3)2基團，也稱為2』-DMA0E，以及2』-二甲基氣基乙氧乙氧基(2，-DMAEOE)，即，2』_0_CH2_0_CH2_N(CH2)2。可以進一步設想，這些修飾可包括2』-甲氧基(2』-0_CH3)、2』-氨基丙氧基(2』-OCH2CH2CH2NH2)以及2』-氟(2』-F)。類似的修飾還可在寡核苷酸的其它位置上進行，尤其是在3』終端核苷酸上或在2』-5』鍵合的寡核苷酸中的糖的3』位置以及5』終端核苷酸的5』位置。寡核苷酸還可具有糖模擬物，如在戊呋喃糖位置中的環丁基部分。在另一方面，可以設想，寡核苷酸還可包括核酸鹼基(本領域中經常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如在本文所使用的，「未修飾的」或「天然的」核酸鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修飾的核酸鹼基包括其它合成和天然核酸鹼基，如5-甲基胞嘧啶(5-Me-C或m5c)，5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基以及其它烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基以及其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶，5-滷代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-滷代、8-氨基、8-硫羥、8-硫代烷基、8-羥基以及其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-滷代尤其是5-溴代、5-三氟甲基以及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤以及3-脫氮雜鳥嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。另外的核酸鹼基包括那些在美國專利第3，687，808號中披露的核酸鹼基、那些在ConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineeringl990,pages858-859,Kroschwitz,J.JohnWiley&Sons中披露的核酸鹼基、那些由Englisch等披露的核酸鹼基(AngewandteChemie,InternationalEditionl991,30，613-722)、以及那些由Sanghvi,Y.S.(Chapterl5,AntisenseResearchandAppIications1993,pages289_302,Crooke,S.T.andLebleu,B.,ed.,CRCPress)披露的核酸鹼基。一些這些核酸鹼基對於增大寡聚物的結合親合力特別有用。這些核酸鹼基包括5—取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已表明5-甲基胞嘧啶取代可增大0.6-1.2°C的核酸雙鏈體穩定性(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.andLebleu,B.,eds.,AntisenseResearchandApplicationsl993,CRCPress,BocaRaton,pages276_278),並且是目前優選的喊基取代，甚至更尤其是當其和2』-O-甲氧乙基糖修飾結合時。在另一方面，可以設想，寡核苷酸的修飾涉及化學鍵合到寡核苷酸一個或多個部分或者軛合物，其提高寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取。這樣的部分包括但不限於類脂部分，如膽固醇部分(Letsingeretal.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA1989,86，6553-6556)、膽酸(Manoharanetal.,Bioorg.Med.Chem.Lett.1994,4，1053-1059)、硫釀，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharanetal.,Ann.N.Y.Acad.Sc1.1992,660,306-309;Manoharanetal.,Bioorg.Med.Chem.Let.1993，3，2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauseretal.,Nucl.AcidsRes.1992,20,533-538)、脂肪族鏈,例如，十二燒二醇或十一燒基殘基(Saison-Behmoarasetal.,EMBOJ.1991,10,1111-1118;Kabanovetal.,FEBSLett.1990,259,327-330;Svinarchuketal.，Biochimiel993,75，49-54)、磷脂，例如，雙十六烷基-射碳-丙三醇或三乙基銨I，2_二-O-十六燒基-射碳-丙三醇-3-H-憐酸酯(Manoharanetal.,TetrahedronLett.1995，36，3651-3654;Sheaetal.,Nucl.AcidsRes.1990，18，3777-3783)、多胺或多聚乙二醇鏈(Manoharanetal.,Nucleosides&Nucleotidesl995,14，969-973)、或金剛燒乙酸(Manoharanetal.,TetrahedronLett.1995，36，3651-3654)、掠桐基部分(Mis小時aetal.,Biochim.Biophys.Actal995,1264,229-237)、或十八胺或己基氛基-竣基-氧膽固醇部分(Crookeetal.,J.Pharmacol.Exp.Ther.1996,277,923-937)。還設想使用的寡核苷酸是嵌合的寡核苷酸。在本發明的範圍內，「嵌合的」寡核苷酸或「嵌合體」是包含兩個或多個化學上截然不同的區的寡核苷酸，其中每一個區由至少一個核苷酸形成。這些寡核苷酸通常包含至少一個區，在該區中對寡核苷酸進行修飾，以便賦予寡核苷酸增大的對核酸酶降解的抗性、增大的細胞攝取、和/或對靶核酸增大的結合親合力。寡核苷酸的另外一個區可用作能夠剪切RNA=DNA或RNA=RNA雜交物的酶的底物。通過舉實的方式，RNA酶H是一種細胞核酸內切酶，其剪切RNA=DNA雙鏈體的RNA鏈。因此，RNA酶H的活化導致RNA靶的剪切，從而很大程度上提高基因表達的反義抑制的效率。RNA靶的剪切可通過凝膠電泳進行常規檢測，並且，如果必要，用本領域已知的有關核酸雜交技術進行檢測。這種RNA靶的RNA酶H-介導的剪切不同於利用核酶來剪切核酸。嵌合寡核苷酸的實例包括但不限於「多間隙體(gapmers)」，其中有三個不同的區，通常具有由兩個區(化學上相互等同但區別於間隙(gap))側面包圍著的中心區。優選的多間隙體的實例是寡核苷酸，其中，寡核苷酸的中部(「間隙」)用作RNA酶H的底物並且優選由2』-脫氧核苷酸組成，而將側面部分(5』和3』「翼(wing)」)被修飾以對靶RNA分子具有更大親合力但不能支持核酸酶活性(例如，氟-或2』-O-甲氧基乙基-取代的)。嵌合寡核苷酸不限於那些在糖上具有修飾的嵌合寡核苷酸，但還可包括具有修飾主鏈的寡核苷或寡核苷酸，例如，具有硫代磷酸酯(P=S)和磷酸二酯(P=O)主鏈鍵的區或具有MMI和P=S主鏈鍵的區。其它嵌合體包括「多翼物(wingmers)」,在本領域也稱為「半聚物(hemimers)」，即，具有兩個完全不同區的寡核苷酸。在多翼物的優選實例中，寡核苷酸的5』部分用作RNA酶H的底物並且優選由2』-脫氧核苷酸組成，而將3』部分用這樣的方式加以修飾，以便對靶RNA分子具有更大親合力但不能支持核酸酶活性(例如，氟-或2』-0_甲氧基乙基-取代的)，或反之亦然。在一個實施例中，本發明的寡核苷酸包含在至少一個核苷酸的糖部分的2』-O-甲氧基乙基(2』-O-CH2CH2OCH3)修飾。已表明這種修飾可增大寡核苷酸對其靶的親合力和寡核苷酸的核酸酶抗性。根據本發明，寡核苷酸的一個、多個、或所有核苷酸亞單位可帶有2』-O-甲氧基乙基(2』-O-CH2CH2OCH3)修飾。包括多個具有2』-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸亞單位的寡核苷酸可以在寡核苷酸內的任何核苷酸亞單位上具有這樣的修飾，並且可以是嵌合寡核苷酸。除了或除開2』(21)-0-甲氧基乙基修飾之外，還可以設想包含其它修飾的寡核苷酸，這些修飾可提高反義效能、效力或靶親合力。本發明還提供多核苷酸(例如，DNA、RNA、PNA或類似物)，其結合到雙鏈或雙鏈體連接蛋白核酸(例如，在連接蛋白RNA的摺疊區中或在連接蛋白基因中)，形成含有三股螺旋的核酸。三股螺旋形成導致連接蛋白表達的抑制，例如通過阻止連接蛋白基因的轉錄，因此降低或消除細胞中連接蛋白活性。不為任何特殊的機制所限制，相信三股螺旋配對會損害雙螺旋為發生聚合酶、轉錄因子、或調節分子的結合而足夠打開的能力。三股螺旋寡-和多核苷酸是利用三股螺旋形成的鹼基配對規則(參見，例如，Chengetal.,J.Biol.Chem.263:15110(1988);FerrinandCamerin1-Otero,Science354:1494(1991);Ramdasetal.,J.Biol.Chem.264:17395(1989);Strobeletal.，Science254:1639(199I);andRigasetal.,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.83:9591(1986))以及連接蛋白mRNA和/或基因序列來構成。通常，形成三股螺旋的寡核苷酸包括從約10到約25個核苷酸或更長的與連接蛋白RNA或基因中的特定序列「互補」的特異序列(即，足夠大以形成穩定的三股螺旋，但又充分小，其依賴於傳遞的模式，以體內給予，如果需要的話)。在本上下文中，「互補」意思是能夠形成穩定的三股螺旋。在一個實施例中，寡核苷酸用來特異性地結合到連接蛋白基因的調節區(例如，連接蛋白5』-側翼序列、啟動子、以及增強子)或特異性地結合到轉錄起始部位(例如，在從轉錄起始部位的-10和+10之間)。為了回顧近來利用三股螺旋DNA所取得的治療進展，參見Geeetal.,inHuberandCarr，1994，MolecularandImmunologicApprochesjFuturaPublishingCo，MtKiscoNYandRininslandetal.,1997,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:58540本發明還提供了可用於抑制連接蛋白活性的核酶。這些核酶結合併且特異性地剪切和鈍化連接蛋白mRNA。有用的核酶可包括互補於連接蛋白mRNA的5』-和3』-末端序列並且可由技術人員基於連接蛋白mRNA序列加以設計。可以設想，本文提供的核酶包括那些具有I組內含子核酶的特性的核酶(Cech，Biotechnologyl3:323(1995))和錘頭狀核酶的其它核酶(Edgington,BiotechnologylO:256(1992))。核酶包括那些具有剪切部位的核酶，如GUA、GUU以及⑶C。長度在15和20個核糖核苷酸之間並且對應於包含剪切部位的靶連接蛋白基因的區的短RNA寡核苷酸可以用二級結構特性加以評價，這些二級結構特性可使寡核苷酸更合乎需要。剪切部位的適合性也可利用核糖核酸酶保護測定通過測試與互補寡核苷酸雜交的可接近性，或根據本領域已知的標準程序通過體外測試核酶活性來加以評價。進一步設想這樣的反義化合物，其中反義和核酶功能可結合在單個寡核苷酸中。而且，核酶可包括一個或多個修飾的核苷酸或核苷酸之間的修飾鍵合，如上述結合對本文提供的反義寡核苷酸的說明所描述的。本發明還提供了通過諸如RNA幹擾(RNAi)的方法對連接蛋白活性的抑制很有用的多核苷酸。這種以及其它基因抑制的技術在本領域是熟知的。這種技術的回顧在Science288:1370-1372(2000)中可找到。RNAi在轉錄後水平起作用並且是序列特異的。該過程包括將具有部分或全部雙鏈特徵的RNA、或能夠編碼這樣的RNA的前體物引入細胞或引入細胞外環境。如由Fire等的美國專利第6，506,559號所描述的，RNA可包括聚合的核糖核苷酸的一鏈或多鏈。雙鏈結構可由單個自身互補的RNA鏈或兩個互補的RNA鏈形成。RNA可包括對磷酸酯-糖主鏈或核苷酸的修飾。RNA雙鏈體的形成可在細胞內或細胞外啟動。研究表明一種或多種核糖核酸酶特異性地結合併將雙鏈RNA剪切成短片斷。核糖核酸酶保持與這些片斷相關，其本身特異性地結合到互補mRNA，即，特異性地結合到用於連接蛋白基因的轉錄的mRNA鏈。用於連接蛋白基因的mRNA也通過核糖核酸酶降解成短片斷，從而避免連接蛋白基因的翻譯和表達，因此抑制連接蛋白活性。另外，RNA聚合酶可用於促進短片斷的許多拷貝的合成，其指數性地增大系統的效率。這種基因抑制途徑的獨特性質在於沉默不限於其啟動的細胞。基因沉默作用可散布到有機體的其它部分以及甚至通過種系傳達到好幾代。在一個方面，RNAi的雙鏈(ds)RNA依賴性基因特異後轉錄沉默策略包括使用短幹擾RNA(SiRNA)0常規RNAi方法的使用具有一些局限，包括在響應長dsRNA分子而活化的哺乳動物細胞中的非特異抗病毒防衛機制(GilJ,EstebanM,「InductionofapoptosisbythedsRNA-dependentproteinkinase(PKR):Mechanismsofaction，，.Apoptosis2000,5:107-114)。在本領域中已作出了進展，其中證明了合成的21核苷酸RNA的雙鏈體可介導哺乳動物細胞中的基因特異性RNAi而不引發一般的(generic)抗病毒防衛機制(ElbashirS，etal.,「Duplexesof21_nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells，，.Nature2001,411:494-498;CaplenN.etal.,ProcNatlAcadSci2001,98:9742-9747)。因此，siRNA正日益看作是基因特異調節的有效工具。如在本文中所描述的，RNAi包括一組相關的基因沉默機制，這些機制共用許多普通的生化組分，其中終端效應物分子是例如但不限於小21-23-核苷酸反義RNA。一種機制利用相對較長的dsRNA觸發子(trigger);其被細胞酶Dicer處理成短的,例如但不限於21-23-核苷酸dsRNA，稱為siRNA。siRNA互補於靶RNA的鏈併入稱為RNA誘導的沉默複合物(RISC)的多蛋白複合物中，在這裡,其用作革巴位內mRNA鏈的核內水解(endonucleolytic)剪切的嚮導。這引起整個mRNA的降解；反義siRNA然後可以再循環。在低級有機體中，RNA依賴性的RNA聚合酶也利用退火的嚮導siRNA作為引物，從而產生更多的dsRNA前靶標(frontthetarget),其本身用作Dicer底物,從而產生更多siRNA並放大siRNA信號。這種途徑在植物中通常用作病毒防衛機制。如在本文中所描述的，siRNA可包括(例如但不限於)21-23核苷酸的兩個分開的、退火的單鏈，其中終端兩個3」-核苷酸是未成對的(3」懸突(overhang))。可替換地,siRNA可以是單莖環的形式，經常稱為短髮夾RNA(s小時NA)。通常，但不是總是，s小時NA的反義鏈也是完全互補於si/s小時NA的有義搭配鏈(partnerstrand)。在哺乳動物細胞中，長dsRNA(長度通常大於30個核苷酸)觸發乾擾素途徑，從而激活蛋白質激酶R和2;5」_寡腺苷酸合成酶(oligoadenylatesynthetase)。幹擾素途徑的激活可引起翻譯的全面下調以及全部RNA降解。但是，已報導外源引入哺乳動物細胞中的較短siRNA會繞過幹擾素途徑。SiRNA反義產物還可來源於內源性微小RNA(microRNA)。在人類細胞中，不管最初形式(siRNA和微小RNA)或處理途徑,最終成熟的(例如但不限於)完全同源於mRNA的21-23-核苷酸反義RNA將引導mRNA剪切。通常，siRNA和靶位之間的錯配的影響可以從幾乎沒有到完全去除活性不等，其原因只是部分了解；但是，在至少一種情形下，部分同源性導致mRNA翻譯抑制。通常，設計用來模擬原型微小RNA-靶幹擾的具有靶錯配的siRNA可介導不同程度的翻譯抑制，其依賴於特定相互作用和mRNA中靶位的數量。RNAi可通過預先形成的siRNA的外源傳遞或通過siRNA或s小時NA的基於啟動子的表達來激活。短幹擾RNA(siRNA)可以化學合成或通過基於DNA的載體系統來產生。通常，這涉及經有效處理而在細胞內形成siRNA的短髮夾(sh)RNA的轉錄(PaddisonP,CaudyA,HannonG:StablesuppressionofgeneexpressionbyRNAiinmammaliancells.ProcNatlAcadSciUSA2002，99:1443-1448;PaddisonPjCaudyA,BernsteinE，HannonG，ConklinD:ShorthairpinRNAs(s小時NAs)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells.Genes&Dev2002,16:948-958;SuiG，etal.,ProcNatlAcadSci2002,8:5515-5520;BrummelkampT，etal.，Science2002，296:550-553)。因此，在上下文中，siRNA可用作組織特異靶向以及基因表達調節的有效策略。根據本發明使用的寡核苷酸可方便並常規地通過熟知的固相合成技術製備。用於這種合成的裝置由幾個本領域熟知的賣主銷售。任何其它用於這種合成的方法也可釆用；寡核苷酸的現行合成在本領域是公認的。熟知利用同樣的技術來製備寡核苷酸，如硫代磷酸酯和2』-烷氧基或21-烷氧基烷氧基衍生物，包括2』-O-甲氧乙基寡核苷酸(Martin，P.Helv.Chim.Actal995,78，486-504)。還熟知利用同樣的技術和工業上可獲得的修飾醯胺化物(amidites)和可控多孔玻璃(controlled-poreglass)(CPG)產物如生物素、突光素、口丫啶或補骨脂素-修飾的醯胺化物和/或CPG(可從GlenResearch,Sterling,Va.獲得)來合成螢光標記的、生物素化(biotinylated)的或其它共軛的寡核苷酸。方法在另一方面，本發明包括通過將反義化合物給予受治療者而治療該受治療者(例如，患者)的方法。通常，這些方法包括用於組織工程的方法以及用於減少與醫學操作(包括但不限於，眼科操作)有關的組織損傷的方法。方法可包括，例如，將反義化合物以足夠抑制眼中或與受治療者眼有關的細胞中的人類連接蛋白表達的量給予所述受治療者的眼。儘管優選對人類連接蛋白質的表達進行抑制，但是可以預想到其它蛋白質可以是由反義化合物(單獨或者聯合抑制人類連接蛋白表達的反義化合物)進行調節的靶。在一些實施例中，眼科操作是眼科手術，包括但不限於準分子雷射屈光性角膜切除手術、白內障摘除術、角膜移植、矯正屈光的手術、放射狀角膜切開手術、青光眼濾過手術、角膜移植手術、準分子雷射屈光性角膜切除手術、角膜移植、矯正屈光的手術、眼表面瘤切除術、結膜或羊膜移植、翼狀胬肉和瞼裂斑切除術、眼整形手術、眼瞼瘤切除術、用於先天性異常的重建眼瞼手術、外翻和內翻眼瞼修復、斜視手術(眼肌肉)、穿透性眼外傷。在一些實施例中，本文提供的反義化合物是通過局部給予藥來給藥的。本文提供的反義化合物還可(例如)全身地或通過眼內注射來給予。可以將本文提供的反義化合物在(例如)相對於傷口形成的預定時間給予受治療者，如在眼科操作(例如手術)中發生。例如，反義化合物可以在進行眼科操作之前、眼科操作期間、或眼科操作之後給予。例如，反義化合物可在進行眼科操作之前或之後幾分鐘或幾小時內給予受治療者。在一些實施例中，反義化合物在進行眼科操作之後給予，並且例如反義化合物在操作的約4小時內、操作的約3小時內給予、以及更通常地在眼科操作的約2小時內、或眼科操作的約I小時內給予。可替換地，反義化合物可在眼科操作的幾分鐘內給予，例如在眼科操作的5、10、15、20、30、45分鐘內。反義化合物還可在眼科操作的4小時後給予。在另一方面，本文提供的反義化合物可以用影響組織工程的方法給予。在這些實施例，以及本文提供的一些其它實施例中，反義化合物通常在更長時間內給予，例如在幾天、幾星期、幾個月、或者甚至更長的時間內，並且可獨立於對病人進行的特別操作(如對眼進行的操作)來給予。本文提供的反義化合物可以結合增加受治療者角膜組織厚度的方法來給予，包括以與眼科操作無關的方法給予，以及以與眼科操作(例如，手術)結合給予反義化合物的方法給予。本文提供的反義化合物可結合一種方法來給予，該方法可例如在與受治療者角膜有關的細胞(例如角膜細胞)中促進癒合或防止組織損傷。本文提供的反義化合物可結合減少受治療者眼中瘢痕的方法來給予。本文提供的反義化合物可結合減少受治療者眼中混濁(hazing)的方法來給予。本文提供的反義化合物可結合調節與成肌纖維細胞分化(與雷射所致損傷的部位有關)有關的細胞過多的方法來給予，優選在術後24小時到48小時期間內。本文提供的反義化合物可結合調節間質重建並減少與雷射所致損傷的部位有關的混濁的方法來給予，優選在術後24小時到72小時期間內。本文提供的反義化合物可結合增加受治療者眼中上皮細胞運動的方法來給予。本文提供的反義化合物可結合在將反義化合物給予受治療者眼的12小時內導致增大上皮細胞運動的方法來給予。本文提供的反義化合物可結合在將反義化合物給予受治療者眼的24小時內導致增大上皮細胞運動的方法來給予。本文提供的反義化合物可結合阻止間質細胞密度增大的方法來給予。本文提供的反義化合物可結合抑制與雷射所致損傷的部位有關的間質水腫的方法在術後24小時到72小時期間內給予。本文提供的反義化合物可結合減少上皮增生的方法在術後24小時到72小時期間內給予。本文提供的反義化合物可結合減少成肌纖維細胞活性長達術後I星期的方法來給予。本文提供的反義化合物可結合調節細胞分化的方法來給予，其中細胞分化會改善胞外基質。本文提供的反義化合物可結合減少細胞增殖的方法來給予。在一些實施例中，反義化合物會減少瘢痕形成。在一些實施例中，反義化合物可減少炎症。在一些實施例中，反義化合物可促進傷口癒合。在一些優選實施例中，結合手術移植操作來使用反義化合物。在一些優選實施例中，反義化合物靶向連接蛋白43並給予以調節上皮基細胞分裂和生長。在一些實施例中，反義化合物靶向連接蛋白31.1並給予以調節外層角質化。在其它實施例中，該方法促進癒合或防止與受治療者角膜有關的細胞中的組織損傷。根據一些實施例，反義化合物用於增大受治療者角膜組織厚度的方法中，或用於導致減少受治療者角膜細胞中組織損傷的方法中，或用於導致減少與受治療者角膜有關的細胞中組織損傷的方法中，或用於結合受治療者的準分子雷射屈光角膜切除手術進行的方法中，或用於調節與成肌纖維細胞分化(與雷射所致損傷的部位有關)有關的細胞過多的方法中，優選在術後24小時到48小時期間內，或用於調節間質重建並減少與雷射所致損傷的部位有關的混濁的方法中，優選在術後24小時到72小時期間內，或在術後24小時到72小時期間內用於抑制與雷射所致損傷的部位有關的間質水腫的方法中，或用於減少上皮增生的方法中，優選在術後24小時到72小時期間內，或用於減少成肌纖維細胞活性長達術後I星期的方法中，或用於調節細胞分化(其改善胞外基質)的方法中，或用於減少細胞增殖的方法中。在一些實施例中，眼科操作是白內障摘除術。在其它實施例中，眼科操作是角膜移植。在其它實施例中，眼外科手術是矯正屈光的手術。在其它實施例中，眼科操作是放射狀角膜切開手術。在其它實施例中，眼科操作是青光眼濾過手術。在還有的其它實施例中，目艮科操作是角膜移植手術。在一些實施例中，反義化合物或組合物是通過局部給藥方式來給予。在一些實施例中，反義化合物或組合物是通過直接塗敷到手術傷口來給予。在一些實施例中，反義化合物或組合物是通過眼內注射來給予。在一些實施例中，反義化合物或組合物是在進行外科手術之前給予。在一些實施例中，反義化合物或組合物是在外科手術過程中給予。在一些非限制性實施例中，反義化合物或組合物是在進行眼科操作之前約15分鐘內或在進行眼科操作之後長達約2小時給予。在一些其它實施例中，例如對於組織工程，可以給予本文提供的反義化合物幾天或甚至幾個月。在一些另外的實施例中，化合物和組合物用來促進癒合或阻止與角膜有關的細胞中的組織損傷，其中與角膜有關的細胞可以是眼中的任何細胞，其包括但不限於角膜細胞。本文提供的藥劑，包括反義化合物，可增加受治療者角膜組織的厚度。在一些實施例中，反義化合物結合另一種可用於減少組織損傷或促進癒合的化合物一起使用。例如，反義化合物可與生長因子、細胞因子、或類似因子一起給予，這些因子包括但不限於FGF、NGF、NT3、PDGF,TGF、VEGF,BDGF,EGF、KGF、整聯蛋白、白細胞介素、纖溶酶、以及semaphorins。在另一方面，提供了用於減少與眼科手術有關的組織損傷的藥物組合物。藥物組合物被適當配製，用於局部給予受治療者的眼，該藥物組合物包括足夠量的反義化合物以抑制與受治療者眼有關的細胞中的人類連接蛋白質的表達。反義化合物優選靶向核酸分子的至少約8個核酸鹼基，其中核酸分子編碼具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列的連接蛋白。在一些實施例中，反義化合物是包括藥用載體或賦形劑的藥物組合物的形式，並且藥劑或反義化合物以有效促進受治療者傷口癒合的量存在。在一些實施例中，藥物組合物可以是，例如，適合局部給藥的形式，包括適合局部給予受治療者眼的形式。在一些另外的實施例中，組合物以及劑型可以是凝膠劑、乳膏劑的形式，或任何本文描述的形式。在另一方面，提供了治療中樞神經系統的損傷的方法。方法包括結合為治療所述中樞神經系統的損傷而給患者進行的外科手術，將反義化合物給予接近中樞神經系統的預先存在傷口的部位，其中，所述反義化合物靶向核酸分子的至少約8個核酸鹼基，其中核酸分子編碼具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列的連接蛋白。在方法的一些實施例中，給予反義化合物以減少起因於脊髓物理損傷的神經元損失。在方法的一些實施例中，將反義化合物給予接近由外傷引起的傷口的部位。在方法的一些實施例中，將反義化合物給予接近由手術引起的傷口的部位。在方法的一些實施例中，將反義化合物給予接近脊髓損傷的部位。在方法的一些實施例中，反義化合物指向連接蛋白43並給予以調節上皮基細胞分裂和生長。在方法的一些實施例中，反義化合物促進傷口癒合。在方法的一些實施例中，反義化合物減少炎症。在方法的一些實施例中，反義化合物減少瘢痕形成。在方法的一些實施例中，中樞神經系統損傷是脊髓損傷。在方法的一些實施例中，在脊髓物理損傷後至少約24小時將反義化合物給予患者。在方法的一些實施例中，反義化合物結合外科移植手術一起使用。在方法的一些另外實施例中，外科移植手術結合用反義化合物進行的移植前處理以促進傷口癒合。在另一方面，提供了反義化合物，這些反義化合物結合用於治療患者預先存在的特徵在於神經元損失的傷口的操作能夠促進神經元的再生。在一些實施例中，藥劑是長度高達40個核酸鹼基的反義化合物，其靶向編碼人類連接蛋白的核酸分子的至少約8個核酸鹼基，並且反義化合物結合促進用於治療患者預先存在傷口的再生神經元的操作來抑制一種或多種人類連接蛋白表達。傷口包括那些特徵在於神經元損失的傷口。可被靶向的連接蛋白包括具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列的連接蛋白。在這些實施例中，反義化合物可在所述患者的導致神經元損失的脊髓物理損傷後至少24小時給予患者。反義化合物可在脊髓物理損傷超過24小時後給予患者幾星期、幾個月，或在導致神經元損失的物理損傷幾年後給予患者。在藥物組合物和方法的一些實施例中，反義化合物靶向編碼人類連接蛋白30或人類連接蛋白37的核酸分子的至少約8個核酸鹼基。優選地，反義化合物抑制與患者眼有關的細胞中的人類連接蛋白30或37的表達。其它藥物組合物包括一種反義化合物，其靶向核酸分子的至少約8個核酸鹼基，其中核酸分子編碼具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列的連接蛋白(例如，人類的)，並且優選地反義化合物結合一種操作來抑制人類連接蛋白的表達，從而為治療患者預先存在的傷口(特徵在於神經元損失)而促進再生神經元。藥物組合物在另一方面，本發明包括包含反義化合物的藥物組合物。在一個實施例中，提供的藥物組合物用於減少與眼科操作(例如，手術)有關的組織損傷，使得製成的藥物組合物用於局部給予患者的眼，並且它包括一定量的反義化合物，其足以抑制與患者眼有關的細胞中的人類連接蛋白質的表達。在一些實施例中，反義化合物祀向核酸分子的至少約8個核酸鹼基，其中核酸分子編碼具有選自SEQIDNO:12-31的核酸鹼基序列的連接蛋白(例如，人類的)。在一些實施例中，該藥物組合物包括藥用載體，該載體包括緩衝普盧蘭尼克酸(pluronicacid)或凝膠,例如在磷酸緩衝鹽溶液中高達約30%的普盧蘭尼克酸。反義組合物可包括不同量的普盧蘭尼克酸或凝膠，其量包括但不限於在磷酸緩衝鹽溶液中高達約5%的普盧蘭尼克酸、在磷酸緩衝鹽溶液中高達約10%的普盧蘭尼克酸、在磷酸緩衝鹽溶液中高達約15%的普盧蘭尼克酸、在磷酸緩衝鹽溶液中高達約20%的普盧蘭尼克酸、在磷酸緩衝鹽溶液中高達約25%的普盧蘭尼克酸、以及在磷酸緩衝鹽溶液中高達約30%的普盧蘭尼克酸。本文提供的反義化合物還可包括生物等效的化合物，包括藥用鹽和前藥。這用來包括任何藥用鹽、酯、或這樣酯的鹽、或任何其它化合物，其給予包括人類的動物以後，能夠提供(直接或間接地)生物活性代謝物或其殘餘物。因此，例如，披露內容還包括核酸的藥用鹽以及這樣的核酸的前藥。「藥用鹽」是生理上和藥理上可接受的本文提供的核酸的鹽:gp，保留母體化合物的所希望的生物活性並且不賦予不希望的毒性作用的鹽(參見，例如，Bergeetal.,J.0fPharmaSc1.1977,66,1-19)。對於寡核苷酸，藥用鹽的實例包括但不限於(a)和諸如鈉、鉀、銨、鎂、鈣的陽離子，和諸如精胺和亞精胺等的多胺形成的鹽；(b)和無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成鹽；(C)和有機酸，例如，醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、安息香酸、單寧酸、棕櫚酸、海藻酸、多聚穀氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的鹽；以及(d)和基本陰離子(elementalanion)如氯、溴、以及碘形成的鹽。本文提供的寡核苷酸可另外地或可選地加以製備以用「前藥」形式加以遞送。術語「前藥」表示治療劑，其製備成無活性形式並通過內源性酶或其它化學品和/或條件的作用在體內或細胞內轉化成活性形式(即，藥物)。尤其是，寡核苷酸的前藥形式可以根據在1993年12月9日公布的Gosselin等的W093/24510中披露的方法製成SATE[(S_乙醯基-2-硫乙基)磷酸酯]衍生物。反義化合物可製成藥物組合物，除了寡核苷酸之外，其可包括藥用載體、增稠劑、稀釋劑、緩衝劑、防腐劑、表面活性劑、中性或陽離子脂質、脂質複合物、脂質體、促滲劑、載體化合物以及其它藥用載體或賦形劑等。藥物組合物還可包括一種或多種活性成分，如幹擾素、抗微生物劑、抗炎劑、麻醉劑等。用於胃腸道外給藥的劑型可包括無菌水溶液，該無菌水溶液也可包含緩衝劑、脂質體、稀釋劑以及其它合適的添加劑。包括本文提供的寡核苷酸的藥物組合物可包括促滲劑，以便提高寡核苷酸的消化遞送(alimentarydelivery)。促滲劑可分類為屬於五個大類的一類，即脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、表面活性劑以及非表面活性劑(Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystemsl991，8，91—192;Muranishi，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystemsl990，7，1-33)。可包括來自一個或多個這些大類的一種或多種促滲劑。用作促滲劑的各種脂肪酸及其衍生物包括，例如，油酸、月桂酸、癸酸、豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、recinleate、一油精(a.k.a.1-甘油一油酸酯(monooleoyl—rac一glycerol))、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚烷-2-酮、醯基肉毒鹼、醯基膽鹼、單-甘油酯和二-甘油酯及其生理上可接受的鹽(即，油酸鹽(酯)、月桂酸鹽(酯)、癸酸鹽(酯)、豆蘧酸鹽(酯)、棕櫚酸鹽(酯)、硬脂酸鹽(酯)、亞油酸鹽(酯)等)。(Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystemsl991,page92;Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystemsl990,7,I;El-Haririetal.,J.Pharm.Pharmacol.199244,651-654)。膽汁的生理作用包括促進脂質和脂溶性維生素的分散和吸收(Brunton，Chapterf8In:Goodman&Gilman,sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,9thEd.,Hardmanetal.McGraw-Hill,NewYork,N.Y.，1996，pages934_935)。各種天然的膽汁鹽、及其合成衍生物用作促滲劑。因此，術語「膽汁鹽」包括任何天然存在的膽汁成分以及任何其合成的衍生物。可使用包括一種或多種促滲劑的複合劑型。例如，膽汁鹽可結合脂肪酸使用以製成複合劑型。螯合劑包括但不限於乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉、檸檬酸、水楊酸鹽(例如，水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鹽以及高香草酸鹽)、膠原的N-醯基衍生物、月桂基聚氧乙烯(9)醚(laureth-9)和β二酮(烯胺)的N-氨基醯基衍生物(Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1991,page92;Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1990，7，1-33;Buuretal.,J.ControlRel.1990，14，43-51)。螯合劑具有也用作DNA酶抑制劑的附加優點。表面活性劑包括，例如，十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-十二烷基醚和聚氧乙烯-20-十六燒基醚(Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystemsl991,page92)；以及全氣化合物的乳劑，如FC-43(Takahashietal.,J.Pharm.Phamacol.1988，40,252-257)。非表面活性劑包括，例如，不飽和環脲、1-烷基-以及1_烯基氮雜環-燒酮(alkanone)衍生物(Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystemsl991,page92)；以及非甾類消炎劑，如雙氯芬酸鈉、卩引哚美辛(indomethacin)以及苯丁唑酮(phenylbutazone)(Yamashitaetal.,J.Pharm.Pharmacol.1987,39,621-626)。如在本文中所使用的，「載體化合物」指的是核酸、或其類似物，其是惰性的(S卩，本身不具有生物活性)，但通過體內過程被識別為核酸，其中體內過程通過(例如)降解生物活性核酸或促進其從循環中去除來降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和載體化合物(通常具有過量的後者)的共同給予可導致在肝、腎或其它外循環儲液囊回收的核酸量顯著減少，大概由於在載體化合物和核酸之間對於共同受體的競爭。與載體化合物相反，「藥用載體」(賦形劑)是藥用溶劑、懸浮劑或任何其它用於將一種或多種核酸傳遞到動物的藥理惰性賦形劑。當結合核酸和所給藥物組合物的其它組分時，藥用載體可以是液體或固體並且用腦中計劃的給藥方式進行選擇，以便提供所希望的本體(bulk)和稠度等。通常的藥用載體包括但不限於粘合劑(例如，預膠化玉米澱粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)；填充劑(例如，乳糖和其它糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；滑潤劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、矽石、膠態二氧化矽、硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米澱粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、醋酸鈉等)；崩解劑(例如，澱粉、澱粉羥乙酸鈉等)；或溼潤劑(例如，十二烷基硫酸鈉等)。本文提供的組合物可另外包含在藥物組合物中通常發現的其它附屬組分，並且這些附屬組分使用水平在本
技術領域：
已確定。因此，例如，組合物可包含另外相容的藥物活性物質如，止癢藥、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎藥，或可包含另外的物質，這些物質可用於物理配製本發明的組合物的各種劑型，如染料、增香劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑、以及穩定劑。但是，當添加時，這樣的物質不應過度幹擾本文提供的組合物的組分的生物活性。不管寡核苷酸通過什麼方法引入患者，膠態分散系統可用作傳遞賦形劑，以提高寡核苷酸的體內穩定性和/或將寡核苷酸靶向特定器官、組織或細胞類型。膠態分散系統包括但不限於大分子複合物、微米囊、微球體、小珠以及基於脂類的體系，其包括水包油乳齊U、膠束、混合膠束、脂質體以及不典型結構的脂質:寡核苷酸複合物。優選的膠態分散系統是多種脂質體。這些脂質體是具有含水核(aqueouscore)的微球體，該水合核由一個或多個由排列成雙層構型的類脂形成的外層所圍繞(參見，通常，Chonnetal.，CurrentOp.Biotech.1995,6,698-708)。反義多核苷酸可以以基本上隔離的形式存在。應理解，產物可與載體或稀釋劑混合，其不影響產物的預定目的並且仍認為是充分隔離的。產物還可以是基本中純化的形式，在該情形下，其通常包括90%，例如至少約95%、98%或99%的多核苷酸或製劑的幹質量。反義多核苷酸可以局部給予(在要治療的部位)。優選地反義多核苷酸和藥用載體或稀釋劑結合，以生成藥物組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸緩衝鹽溶液。組合物可加以配製，以用於胃腸道外、肌內、腦內、靜脈內、皮下、或經皮給藥。哺乳動物細胞對核酸的攝取可通過若干已知的轉染技術，例如，那些使用轉染劑的技術來提高。給予的劑型可包含這樣的製劑。這些製劑的實例包括陽離子製劑(例如，磷酸鈣和DEAE-右旋糖酐)和脂轉染劑(Iipofectants)(例如,脂轉染劑TM和轉染劑(transfectam)TM)。在一方面，寡核苷酸可能需要部位特異性遞送。它們還需要在延長時期內遞送。儘管遞送時間將明顯依賴於要誘導下調的部位和所希望的治療效果，但是經常需要連續遞送24小時或更長時間。在本發明的一方面，這是通過將反義化合物與藥用載體或賦形劑一起包含在劑型中來實現，尤其是以用於局部給藥的劑型形式。尤其，諸如乳膏劑、滴劑、以及其它本文描述的局部劑型可用來調節上皮基細胞分裂和生長(利用靶向連接蛋白43的反義化合物)以及外層角質化(利用靶向連接蛋白31.1的反義化合物)。用於局部給藥的劑型可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體製劑和散劑。傳統藥物載體，含水的、粉末或油基、增稠劑等可以是必要的或所希望的。塗層保險套、手套等也是有用的。用於口服的組合物包括散劑或顆粒劑、在水或非含水介質中的混懸劑或溶液、膠囊劑、小藥囊或片劑。增稠劑、增香劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可以是希望有的。用於胃腸道外給藥的組合物可包括無菌水溶液，其也可包含緩衝劑、稀釋劑以及其它合適的添加劑。在一些情形下，結合其它傳統治療方式用寡核苷酸來治療患者可能是更有效的，從而增加治療方案的效能。如在本文中所使用的，術語「治療方案」意思是包括治療的、減輕的以及預防的方式。治療組合物的劑型及其後來的給藥認為是在本領域技術人員的知識範圍內。劑量依賴於要治療的疾病狀態的嚴重性和反應性，具有從幾天持續到幾個月、或直至達到治癒或實現疾病狀態的減少的治療期。最佳給藥方案可以根據患者體內藥物累積的檢測結果加以計算。普通技術人員可以很容易確定最佳劑量、給藥方法和重複率。最佳劑量可依賴於單個寡核苷酸的相對效力而變化，並且通常可基於在體外和在體內動物模型中發現是有效的EC50來估計。通常,劑量為從0.01mg/kg到100mg/kg體重,並且每天、每星期、每月或每年可以給予一次或多次，或甚至每2到20年一次。本領域普通技術人員可以基於測得的體液或組織中藥物的滯留時間和濃度容易地估計給藥的重複率。在治療成功以後，可能希望讓患者進行維持治療以防止疾病狀態的復發，其中以維持劑量給予寡核苷酸，範圍為從0.0lmg/kg到100mg/kg體重,每天一次或多次到每20年一次。在需要連接蛋白調節的疾病的治療或預防中，合適的劑量水平通常為約0.001到100mg/kg患者體重/天，其可以單劑量或多劑量進行給藥。優選地，劑量水平將為約I到約40mg/kg/天。本發明的寡核苷酸可用於診斷、治療、預防、用作研究試劑以及用於試劑盒中。由於本發明的寡核苷酸可以雜交到編碼連接蛋白的核酸，所以很容易構建夾層結構、量熱以及其它測定來利用這個事實。用於檢測寡核苷酸和連接蛋白基因或mRNA的雜交的方法的條件可常規地實現。這樣的條件可包括酶接合、放射性同位素示蹤或任何其它合適的檢測系統。還可以製備用於檢測連接蛋白存在或缺乏的試劑盒。本發明的寡核苷酸還可用於研究目的。因此，由寡核苷酸表現出的特異性雜交可用於測定、純化、細胞產物製備以及本領域普通技術人員已知的其它方法中。在本文描述的一些實施例中可以被靶向的示例性連接蛋白包括但不限於以下連接蛋白。人類Cx43，aI(SEQIDNO:12)LOCUSNM_0001653088bpmRNA直鏈PRI26-0CT-2004DEFINITION人類間隙連接蛋白質，al，43kDa(連接蛋白43)(GJAl)，mRNA。Iacaaaaaagcttttacgaggtatcagcacttttctttcattagggggaaggcgtgaggaa61agtaccaaacagcagcggagttttaaactttaaatagacaggtctgagtgcctgaacttg121ccttttcattttacttcatcctccaaggagttcaatcacttggcgtgacttcactacttt181taagcaaaagagtggtgcccaggcaacatgggtgactggagcgccttaggcaaactcctt241gacaaggttcaagcctactcaactgctggagggaaggtgtggctgtcagtacttttcatt301ttccgaatcctgctgctggggacagcggttgagtcagcctggggagatgagcagtctgcc361tttcgttgtaacactcagcaacctggttgtgaaaatgtctgctatgacaagtctttccca421atctctcatgtgcgcttcgtggtcctgcagatcatatttgtgtctgtacccacactcttg481tacctggctcatgtgttctatgtgatgcgaaaggaagagaaactgaacaagaaagaggaa541gaactcaaggttgcccaaactgatggtgtcaatgtggacatgcacttgaagcagattgag601ataaagaagttcaagtacggtattgaagagcatggtaaggtgaaaatgcgaggggggttg661ctgcgaacctacatcatcagtatcctcttcaagtctatctttgaggtggccttcttgctg721atccagtggtacatctatggattcagcttgagtgctgtttacacttgcaaaagagatccc781tgcccacatcaggtggactgtttcctctctcgccccacggagaaaaccatcttcatcatc841ttcatgctggtggtgtccttggtgtccctggccttgaatatcattgaactcttctatgtt901ttcttcaagggcgttaaggatcgggttaagggaaagagcgacccttaccatgcgaccagt961ggtgcgctgagccctgccaaagactgtgggtctcaaaaatatgcttatttcaatggctgc1021tcctcaccaaccgctcccctctcgcctatgtctcctcctgggtacaagctggttactggc1081gacagaaacaattcttcttgccgcaattacaacaagcaagcaagtgagcaaaactgggct1141aattacagtgcagaacaaaatcgaatggggcaggcgggaagcaccatctctaactcccat1201gcacagccttttgatttccccgatgataaccagaattctaaaaaactagctgctggacat1261gaattacagccactagccattgtggaccagcgaccttcaagcagagccagcagtcgtgcc1321agcagcagacctcggcctgatgacctggagatctagatacaggcttgaaagcatcaagat1381tccactcaattgtggagaagaaaaaaggtgctgtagaaagtgcaccaggtgttaattttg1441atccggtggaggtggtactcaacagccttattcatgaggcttagaaaacacaaagacatt1501agaatacctaggttcactgggggtgtatggggtagatgggtggagagggaggggataaga1561gaggtgcatgttggtatttaaagtagtggattcaaagaacttagattataaataagagtt1621ccattaggtgatacatagataagggctttttctccccgcaaacacccctaagaatggttc1681tgtgtatgtgaatgagcgggtggtaattgtggctaaatatttttgttttaccaagaaact1741gaaataattctggccaggaataaatacttcctgaacatcttaggtcttttcaacaagaaa1801aagacagaggattgtccttaagtccctgctaaaacattccattgttaaaatttgcacttt1861gaaggtaagctttctaggcctgaccctccaggtgtcaatggacttgtgctactatatttt1921tttattcttggtatcagtttaaaattcagacaaggcccacagaataagattttccatgca1981tttgcaaatacgtatattctttttccatccacttgcacaatatcattaccatcacttttt2041catcattcctcagctactactcacattcatttaatggtttctgtaaacatttttaagaca2101gttgggatgtcacttaacattttttttttttgagctaaagtcagggaatcaagccatgct2161taatatttaacaatcacttatatgtgtgtcgaagagtttgttttgtttgtcatgtattgg2221tacaagcagatacagtataaactcacaaacacagatttgaaaataatgcacatatggtgt2281tcaaatttgaacctttctcatggatttttgtggtgtgggccaatatggtgtttacattat2341ataattcctgctgtggcaagtaaagcacactttttttttctcctaaaatgtttttccctg2401tgtatcctattatggatactggttttgttaattatgattctttattttctctcctttttt2461taggatatagcagtaatgctattactgaaatgaatttcctttttctgaaatgtaatcatt2521gatgcttcgaatgatagaattttagtactgtaaacaggctttagtcattaatgtgagagac2581ttagaaaaaatgcttagagtggactattaaatgtgcctaaatgaattttgcagtaactgg2641tattcttgggttttcctacttaatacacagtaattcagaacttgtattctattatgagtt2701tagcagtcttttggagtgaccagcaactttgatgtttgcactaagattttatttggaatg2761caagagaggttgaaagaggattcagtagtacacatacaactaatttatttgaactatatg2821ttgaagacatctaccagtttctccaaatgccttttttaaaactcatcacagaagattggt2881gaaaatgctgagtatgacacttttcttcttgcatgcatgtcagctacataaacagttttg2941tacaatgaaaattactaatttgtttgacattccatgttaaactacggtcatgttcagctt3001cattgcatgtaatgtagacctagtccatcagatcatgtgttctggagagtgttctttatt3061caataaagttttaatttagtataaacat//人類Cx46，α3(SEQIDNO:13)LOCUSNM—0219541308bpmRNA直鏈PRI27-0CT-2004DEFINITION人類間隙連接蛋白質，a3，46kDa(連接蛋白46)(GJA3)，mRNA。Iatgggcgactggagctttctgggaagactcttagaaaatgcacaggagcactccacggtc61atcggcaaggtttggctgaccgtgctgttcatcttccgcatcttggtgctgggggccgcg121gcggaggacgtgtggggcgatgagcagtcagacttcacctgcaacacccagcagccgggc181tgcgagaacgtctgctacgacagggccttccccatctcccacatccgcttctgggcgctg241cagatcatcttcgtgtccacgcccaccctcatctacctgggccacgtgctgcacatcgtg301cgcatggaagagaagaagaaagagagggaggaggaggagcagctgaagagagagagcccc361agccccaaggagccaccgcaggacaatccctcgtcgcgggacgaccgcggcagggtgcgc421atggccggggcgctgctgcggacctacgtcttcaacatcatcttcaagacgctgttcgag481gtgggcttcatcgccggccagtactttctgtacggcttcgagctgaagccgctctaccgc541tgcgaccgctggccctgccccaacacggtggactgcttcatctccaggcccacggagaag601accatcttccatcatcttcatgctggcggtggcctgcgcgtccctgctgctcaacatgctg661gagatctaccacctgggctggaagaagctcaagcagggcgtgaccagccgcctcggcccg721gacgcctccgaggccccgctggggacagccgatcccccgcccctgccccccagctcccgg781ccgcccgccgttgccatcgggttcccaccctactatgcgcacaccgctgcgcccctggga841caggcccgcgccgtgggctaccccggggccccgccaccagccgcggacttcaaactgcta901gccctgaccgaggcgcgcggaaagggccagtccgccaagctctacaacggccaccaccac961ctgctgatgactgagcagaactgggccaaccaggcggccgagcggcagcccccggcgctc1021aaggcttacccggcagcgtccacgcctgcagcccccagccccgtcggcagcagctccccg1081ccactcgcgcacgaggctgaggcgggcgcggcgcccctgctgctggatgggagcggcagc1141agtctggaggggagcgccctggcagggacccccgaggaggaggagcaggccgtgaccacc1201gcggcccagatgcaccagccgcccttgcccctcggagacccaggtcgggccagcaaggcc1261agcagggccagcagcgggcgggccagaccggaggacttggccatctag//人類Cx37，α4(SEQIDNO:14)LOCUSNM—0020601601bpmRNA直鏈PRI26-0CT-2004DEFINITION人類間隙連接蛋白質，α4，37kDa(連接蛋白37)(GJA4)，mRNA。Ictccggccatcgtccccacctccacctgggccgcccgcgaggcagcggacggaggccggg61agccatgggtgactggggcttcctggagaagttgctggaccaggtccgagagcactcgac121cgtggtgggtaagatctggctgacggtgctcttcatcttccgcatcctcatcctgggcct181ggccggcgagtcagtgtggggtgacgagcagtcagatttcgagtgtaacacggcccagcc241aggctgcaccaacgtctgctatgaccaggccttccccatctcccacatccgctactgggt301gctgcagttcctcttcgtcagcacacccaccctggtctacctgggccatgtcatttacct361gtctcggcgagaagagcggctggcgcagaaggagggggagctgcgggcactgccggccaa421ggacccacaggtggagcgggcgctggccggcatagagcttcagatggccaagatctcggt權利要求1.一種用於治療受治療者的角膜穿透性眼外傷的藥物組合物，包括連接蛋白43下調量的連接蛋白43反義化合物。2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述眼外傷為化學外傷。3.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述眼外傷為機械外傷。4.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述眼外傷導致角膜上皮損傷。5.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述連接蛋白43反義化合物被給予具有羊膜移植的受治療者。6.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物選自包括反義寡核苷酸和反義多核苷酸的組。7.根據權利要求6所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物包括選自SEQIDNO:1-3的核酸鹼基序列。8.根據權利要求6所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物靶向核酸分子的至少8個核酸鹼基，其中所述核酸分子編碼具有SEQIDNO:12的核酸鹼基序列的連接蛋白。9.根據權利要求1-8中任一項所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物是長度在15和35個核酸鹼基之間的反義寡核苷酸。10.根據權利要求9所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物是包括天然存在的核酸鹼基和未修飾的核苷間鍵的反義寡核苷酸。11.根據權利要求9所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物是包括至少一種修飾的核苷間鍵、至少一種修飾的糖部分、和/或至少一種修飾的核酸鹼基的反義寡核苷酸。12.根據權利要求11所述的藥物組合物，其中，所述修飾的核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。13.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物是通過表面方式來給予。14.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物是通過局部方式來給予。15.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物是通過眼內注射來給予。16.根據權利要求9所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物用普盧蘭尼克凝膠配製。17.根據權利要求16所述的藥物組合物，其中，所述普盧蘭尼克凝膠包括普盧蘭尼克F127。18.根據權利要求9所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物被給予一次。19.根據權利要求9所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物被給予多於一次。20.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述受治療者為人類。21.一種用於治療受治療者的眼的後段病症的藥物組合物，包括連接蛋白43下調量的連接蛋白43反義化合物。22.根據權利要求21所述的藥物組合物，其中，所述後段病症包括黃斑裂孔、黃斑變性、視網膜撕裂、糖尿病視網膜病變、和玻璃體視網膜病變。23.根據權利要求22所述的藥物組合物，其中，所述後段病症是黃斑變性。24.根據權利要求22所述的藥物組合物，其中，所述後段病症是糖尿病視網膜病變。25.根據權利要求21所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物選自包括反義寡核苷酸和反義多核苷酸的組。26.根據權利要求21所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物包括選自SEQIDNO:1-3的長度不超過40個核苷酸的核酸鹼基序列。27.根據權利要求21所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物靶向核酸分子的至少8個核酸鹼基，其中所述核酸分子編碼具有SEQIDNO:12的核酸鹼基序列的連接蛋白。28.根據權利要求21-27中任一項所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物是長度在15和35個核酸鹼基之間的反義寡核苷酸。29.根據權利要求26所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物是包括天然存在的核酸鹼基和未修飾的核苷間鍵的反義寡核苷酸。30.根據權利要求26所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物是包括至少一種修飾的核苷間鍵、至少一種修飾的糖部分、和/或至少一種修飾的核酸鹼基的反義寡核苷酸。31.根據權利要求30所述的藥物組合物，其中，所述修飾的核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。32.根據權利要求21所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物適合於通過眼內注射來給予。33.根據權利要求32所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物被給予一次。34.根據權利要求32所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物被給予多於一次。35.根據權利要求21所述的藥物組合物，其中，所述受治療者為人類。36.根據權利要求26所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物包括選自SEQIDNO:1的長度不超過40個核苷酸的核酸鹼基序列。37.根據權利要求26所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物與具有選自SEQIDNO:1-3的序列的多核苷酸具有至少80%的同源性。38.根據權利要求26所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物與具有選自SEQIDNO:1-3的序列的多核苷酸具有至少90%的同源性。39.根據權利要求26所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物與具有選自SEQIDNO:1-3的序列的多核苷酸具有至少95%的同源性。40.根據權利要求26所述的藥物組合物，其中，所述反義化合物與具有選自SEQIDNO:1-3的序列的多核苷酸具有至少97%的同源性。41.一種用於在受治療者中促進與眼科操作有關的角膜傷口癒合的藥物組合物，包括普盧蘭尼克酸或凝膠、以及連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物，其中所述連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物以結合所述操作給予所述受治療者的眼睛的量存在，所述連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物的量在0.001至0.01mg/kg體重範圍內並且在與所述受治療者的眼睛有關的角膜細胞中抑制連接蛋白的表達。42.一種用於促進與眼科操作有關的角膜傷口癒合的藥物組合物，包括普盧蘭尼克酸或凝膠、以及連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物，其中所述連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物以給予受治療者的眼睛的量存在，所述連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物的量在0.001至0.01mg/kg體重範圍內並且在所述受治療者的眼中或與所述眼有關的細胞中抑制連接蛋白的表達以及在所述受治療者眼中或與所述眼有關的細胞中調節細胞的增殖、遷移、或分化。43.一種用於在受治療者眼中或在與受治療者眼有關的組織中促進傷口癒合的藥物組合物，包括普盧蘭尼克酸或凝膠、以及連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物，其中所述連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物以給予受治療者的眼睛的量存在，所述連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物的量在0.0Ol至0.01mg/kg體重範圍內並且在所述受治療者的眼中或與所述眼有關的細胞中抑制連接蛋白的表達以及促進上皮細胞的累積。44.一種用於在受治療者眼中或在與受治療者眼有關的組織中促進傷口癒合的藥物組合物，包括普盧蘭尼克酸或凝膠、以及連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物，其中所述連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物以給予受治療者的眼睛的量存在，所述連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物的量在0.001至.0.01mg/kg體重範圍內並且在所述受治療者的眼中或與所述眼有關的細胞中抑制連接蛋白的表達以及抑制細胞過多。45.一種用於治療中樞神經系統損傷的藥物組合物，包括普盧蘭尼克酸或凝膠、以及連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物，其中所述連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物以結合對受治療者進行的外科手術一起給予接近所述中樞神經系統的預先存在的傷口的部位的量存在，所述連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物的量在0.001至0.01mg/kg體重範圍內以治療所述中樞神經系統的所述損傷，其中所述反義化合物靶向核酸分子的至少8個核酸鹼基，其中所述核酸分子編碼具有SEQIDNO:12或25的核酸鹼基序列的連接蛋白。46.一種用於接觸角膜細胞以治療角膜損傷的製劑，包括普盧蘭尼克酸或凝膠、以及連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物，其中所述連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物以給予所述角膜細胞的量存在，所述連接蛋白43反義化合物或連接蛋白31.1反義化合物的量在0.001至0.01mg/kg體重範圍內。47.根據權利要求46所述的製劑，其中，所述反義化合物是選自包括反義寡核苷酸、反義多核苷酸、脫氧核酶、嗎啉代寡核苷酸、RNAi分子、siRNA分子、PNA分子、DNA酶、以及5』-端-突變的Ul小核RNA、以及前述的類似物的組。48.根據權利要求46所述的製劑，其中，所述反義化合物包括選自SEQIDN0:l_3的核酸鹼基序列。49.根據權利要求46所述的製劑，其中，所述反義化合物靶向核酸分子的至少8個核酸鹼基，其中所述核酸分子編碼具有SEQIDNO:12的核酸鹼基序列的連接蛋白。50.根據權利要求46或47所述的製劑，其中，所述反義化合物靶向核酸分子的至少8個核酸鹼基，其中所述核酸分子編碼具有SEQIDNO:25的核酸鹼基序列的連接蛋白。51.根據權利要求46-49中任一項所述的製劑，其中，所述反義化合物是長度在15和35個核酸鹼基之間的反義寡核苷酸。52.根據權利要求51所述的製劑，其中，所述反義化合物是包括天然存在的核酸鹼基和未修飾的核苷間鍵的反義寡核苷酸。53.根據權利要求51所述的製劑，其中，所述反義化合物是包括至少一種選自至少一種修飾的核苷間鍵、至少一種修飾的糖部分、和至少一種修飾的核酸鹼基的反義寡核苷酸。54.根據權利要求53所述的製劑，其中，所述至少一種修飾的核苷間鍵是硫代磷酸酯鍵。55.根據權利要求56-59中任一項所述的製劑，其中，所述普盧蘭尼克凝膠或酸包括普盧蘭尼克F127。56.根據權利要求56-59中任一項所述的製劑，其中，普盧蘭尼克凝膠或酸進一步包括在磷酸緩衝鹽溶液中高達5%的普盧蘭尼克酸。57.根據權利要求56-59中任一項所述的製劑，其中，普盧蘭尼克凝膠或酸進一步包括在磷酸緩衝鹽溶液中高達10%的普盧蘭尼克酸。58.根據權利要求56-59中任一項所述的製劑，其中，普盧蘭尼克凝膠或酸進一步包括在磷酸緩衝鹽溶液中高達15%的普盧蘭尼克酸。59.根據權利要求56-59中任一項所述的製劑，其中，普盧蘭尼克凝膠或酸進一步包括在磷酸緩衝鹽溶液中高達20%的普盧蘭尼克酸。60.根據權利要求56-59中任一項所述的製劑，其中，普盧蘭尼克凝膠或酸進一步包括在磷酸緩衝鹽溶液中高達25%的普盧蘭尼克酸。61.根據權利要求56-59中任一項所述的製劑，其中，普盧蘭尼克凝膠或酸進一步包括在磷酸緩衝鹽溶液中高達30%的普盧蘭尼克酸。全文摘要本發明提供了靶向連接蛋白的反義化合物及其使用方法。本發明提供了用於調節連接蛋白活性的方法以及組合物，包括例如，用於術後、外傷，或組織工程應用。這些化合物以及方法可在治療上，例如，用來降低與疾病和病症有關的不良作用的嚴重性，其中直接細胞間通訊的局部破壞是所希望的。文檔編號A61K48/00GK103212088SQ20131009801公開日2013年7月24日申請日期2004年12月3日優先權日2003年12月3日發明者維爾達·勞克斯,科林·R·格林申請人:科達治療(紐西蘭)有限公司