通過基因治療的骨生成的製作方法

2023-12-08 06:29:11 1

專利名稱：通過基因治療的骨生成的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種將至少一種編碼轉化生長因子β超家族一員的基因導入至少一種哺乳動物結締組織細胞，用來生成或再生骨，特別是用來修復骨質疏鬆性骨折或融合哺乳動物宿主的脊柱。
背景技術：
活骨組織的動態平衡是一個由調控信號調節的動態過程，例如激素，生長和分化因子。已知刺激骨細胞繁殖的生長因子是骨形成蛋白(BMP)、轉化生長因子-β蛋白質(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF)和鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。骨質疏鬆症，其特點是低骨量和骨微結構的退化，會導致骨折，它是老年人中數量增加的一個普通健康問題。骨質疏鬆症可由許多因素引起，例如但不局限於絕經、鈣缺乏性飲食、卵巢切除後、糖皮質激素-誘導的骨質疏鬆症，甲狀腺功能亢進、制動、肝素誘導的或免疫抑制誘導的骨質疏鬆症。骨折癒合是一個複雜的過程，並仍不是很清楚。通過刺激患者骨質疏鬆的卵巢切除和低I丐飲食製造大鼠模型，骨折的骨頭沒有很好的癒合(Kubo等,Steroid Biochemistry& Molecular Biology,68:197-202,1999 ;Namkung_Matthai 等，Bone,28:80-86,2001)。因此，包括骨再生的治療也大大改善了骨質疏鬆性骨折的治療。在骨科領域,一些細胞因子已經被認為是治療骨科疾病的候選。骨形成蛋白已經被認為是一種有效的骨形成刺激劑(Ozkaynak等，EMBO J, 9:2085-2093,1990 ；Sampath和 Rueger, Complication in Ortho, 101-107,1994), TGF-β 已經被報導是一種骨生成和軟骨形成的刺激劑(Joyce等，J Cell Biology, 110:2195-2207,1990)。轉化生長因子-β (TGF-β)被認為是一種多功能的細胞因子(Sporn和Roberts, Nature (London),322:217-219，1988)，並在細胞生長、分化和細胞外矩陣蛋白合成中起了調節作用(Madri等，J Cell Biology, 106:1375-1384，1988)。TGF-β抑制體外上皮細胞和破骨樣細胞的生長(Chenu 等，Proc Natl Acad Sci，85:5683-5687，1988)，但它刺激了軟骨內骨化，並最終在體內形成骨(Critchlow 等，Bone, 521-527，1995 ;Lind 等，A Orthop Scand,64(5): 553-556，1993 ;和 Matsumoto 等，In vivo，8:215-220，1994)。TGF-β 誘導的骨形成是通過刺激骨膜下多能性細胞而調節的，所述多能細胞最終分化為軟骨-形成細胞(Joyce 等，J Cell Biology, 110:2195-2207,1990 ;和 Miettinen 等，J Cell Biology,127-6:2021-2036，1994)。骨科學中TGF-β的生物作用已經報導了(Andrew等，Calcif TissueIn.52:74-78,1993 ;Borque 等，Int J Dev Biol.，37:573-579，1993 ;Carrington等，J CellBiology,107:1969-1975,1988 ;Lind等，A Orthop Scand.64(5):553-556,1993 ；Matsumoto等，In vivo，8:215-220,1994)。在小鼠胚胎中，染色顯示TGF-β和來自間充質的組織緊密相關，例如結締組織、軟骨和骨。除了胚胎學的發現，TGF-β存在於骨形成和軟骨形成的部位。它還能增加兔脛骨的骨折癒合。近來，TGF-β的治療值已經被報導(Critchlow等，Bone, 521-527,1995 ;和 Lind 等，A Orthop Scand，64 (5): 553-556，1993)，但是短期的作用和高花費已限制了廣泛的臨床應用。許多過度損傷的骨缺陷不會完全恢復並需要治療性的幹預，例如自體移植或從存儲骨移植。高失敗率和這些傳統的治療相關。近來大多數可供選擇的方法利用注入骨誘導性蛋白的生物降解載體移植到損傷部位。見例如，美國專利第5，656，598號。其他方法包括應用機械裝置使得骨再生，例如美國專利第6，077，076和第6，022，349號中所揭示的。這些方法一個主要的不利之處就是需要大量重組蛋白來獲得治療作用，因為在體內治療性蛋白的作用持續時間短。脊柱椎體中骨退變是另外一個領域，其中融合椎體的骨形成會使飽受椎體塌陷導致後背疼痛之苦的患者獲得緩解。所以，文中治療性申請需要改善骨形成蛋白釋放的時間長度。正如本申請中所描述的，本發明提供了一種在骨缺陷部位持續表達這種骨形成治療性蛋白的方法，從而導致有效的骨再生。

發明內容
本發明已滿足了上文中的需要。本發明提供了一種將至少一種編碼產物的基因導入至少一種哺乳動物結締組織細胞的方法，用來治療哺乳動物宿主。這種方法包括運用重組技術製造包含編碼產物基因的DNA載體分子，並將包含編碼產物基因的DNA載體分子導入結締組織細胞。所述DNA載體分子可以是任何能被輸入和保留在靶細胞或組織中的DNA分子，這樣所述編碼有意義產物的基因可被穩定表達。在本發明中優選應用的DNA載體分子是病毒或質粒DNA載體。這種方法優選的包括將編碼產物的基因導入哺乳動物結締組織細胞用作治療。本發明提供了一 種在受低骨量折磨的患者骨缺陷部位形成骨的方法，包括:a)將編碼具有骨再生功能的蛋白質的基因插入載體，並操作性連接於啟動子，和b)用所述重組載體在體外轉染或轉導一群結締組織細胞；和c)將哺乳動物細胞移植到骨缺陷部位，並使骨缺陷部位形成骨。在這種方法中，所述載體可以無限制的是逆轉錄病毒載體或質粒載體。所述基因可以是TGF-β超家族的一員，特殊的是骨形成蛋白(BMP)。更特殊的，所述BMP可以是BMP-2。此外，所述結締組織細胞可以是成纖維或骨祖細胞。在以上的方法中，骨在早期或晚期產生。本發明還旨在提供一種融合脊柱的方法，包括:a)將編碼具有骨形成功能的蛋白質的基因插入載體；b)用所述重組載體在體外轉染或轉導一群結締組織細胞；和c)使成骨有效量的轉染或轉導的結締組織細胞群以及藥學上可接受的載體和脊柱接觸，這樣編碼基因的DNA序列在脊柱表達導致了骨生成，由此脊柱融合了。在這種方法中，所述載體可無限制的是逆轉錄病毒載體或質粒載體。所述基因可以是TGF-β超家族的一員，特殊的是骨形成蛋白(BMP)。更特殊的，所述BMP可以是BMP-2。此外，所述結締組織細胞可以是成纖維或骨祖細胞。在以上的方法中，骨在早期或晚期產生。此外，本發明旨在提供一種癒合骨質疏鬆性骨折的方法，包括:a)將編碼具有骨再生功能的蛋白質的基因插入載體，並操作性連接於啟動子，b)用所述重組載體在體外轉染或轉導一群結締組織細胞；和將結締組織細胞導入骨折部位，並使骨折癒合。在這個方法中，所述載體可無限制的是逆轉錄病毒載體或質粒載體。所述基因可以是TGF-β超家族的一員，特殊的是骨形成蛋白(BMP)。更特殊的，所述BMP可以是BMP-2。此外，所述結締組織細胞可以是成纖維或骨祖細胞。在以上的方法中，骨在早期或晚期產生。本發明的這 些和其他對象通過以下本發明的詳述、附帶的參考圖和所附的權利要求被更好理解。


本發明將通過以下給出的詳細描述和附帶的圖被更好理解，後者的給出僅僅是為了闡明，而不是限制本發明，其中；圖1A和IB顯示了包含人類BMP2基因pMT_BMP2的結構。圖2A-2F顯示了利用NIH3T3-BMP-2成纖維細胞的骨再生。圖2A和2B顯示了在注射對照NIH3T3成纖維細胞(A)和NIH3T3-BMP-2(B)8周後的腿骨圖。圖2C-2F顯示了在處死動物之前對照(C&D)和實驗(E&F)腿骨的X線檢查。用表達BMP-2蛋白細胞處理過的骨缺陷在注射8周後癒合。圖3A-3D顯示了再生骨組織的組織學檢查。製作再生骨組織的石蠟切片並用Mason’s三色染色。結果顯示再生骨組織(RB)的結構幾乎和正常骨組織(NB)的相同。圖3A和3B顯示了低放大率(40x)，圖3C和3D顯示了高放大率(IOOx)。點線表示再生和正常骨組織之間的界限。圖4A-4I顯示了用NIH3T3-BMP-2成纖維細胞的骨再生。將NIH3T3-BMP-2細胞(2ml2X106細胞/ml)在縫合後注射入脛骨的缺損區域。(A-G)在細胞注射1、2、3、4、5、6、7周後實施X線分析。(H)在注射後7周收穫樣本，並繪圖。(I)在收穫後進行組織學檢查。顯示Mason』 s三色染色的結果。圖5A-5I顯示了用對照DMEM培養基的骨再生。將DMEM培養基(2ml)縫合後注射入脛骨的缺損區域。(A-G)在注射培養基1、2、3、4、5、6周後實施X線分析。(H)在注射後6周收穫樣本，並繪圖。(I)在收穫後進行組織學檢查。顯示Mason』 s三色染色的結果。圖6A和6B顯示了大鼠TG001應用可吸收膠原海綿(ACS)載體在後外側橫突間處理融合植入細胞4和6周後的X線圖。在利用用於BMP-2後外側橫突間處理融合研究的cDNA轉染5X IO6成纖維細胞(小鼠)後，X線上左側富集了橋骨。注意右側如果有的話，可能細胞較少，骨形成較少。
具體實施方式
在本申請中，「一種」和「一個」用來指對象的單數和複數。正如這裡所應用的，「聯合」一種或多種治療藥物給藥包括同時(一起)和以任何順序連續給藥。正如這裡所應用的，關於核酸、蛋白質和蛋白片段或其衍生物的名詞「生物活性」定義為核酸或胺基酸序列模仿野生型核酸或蛋白質產生的已知生物功能的能力。正如這裡所應用的，名詞「骨生長」涉及骨質量。TGF-β蛋白被認為系統的增加骨量。這表現為在系統給藥後，成骨細胞的數量和大小增加，骨化加襯骨表面沉積的增加。正如這裡所應用的，「載體」包括藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在運用所述劑量和濃度時，對於暴露於其的細胞或哺乳動物是沒有毒性的。通常，藥學上可接受的載體是含水的PH緩衝溶液。藥學上可接受載體的實施例包括，不限於例如磷酸、檸檬酸和其他有機酸緩衝液；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(大約低於10個殘基)的多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、白明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物例如聚乙烯吡咯酮；胺基酸，例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA ;糖醇例如甘露醇或山梨糖醇；形成鹽的反荷離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑例如TWEENA聚乙二醇(PEG)，和PLUR0NICS 。正如這裡所應用的，名詞「結締組織」是指任何連接和支持其他組織或器官的組織，並包括但不局限於哺乳動物的韌帶、軟骨、腱、骨或滑膜。正如這裡所應用的，名詞「結締組織細胞」包括在結締組織中發現的細胞，例如成纖維細胞、軟骨細胞(軟骨細胞)和骨細胞(成骨細胞/骨細胞)，還有脂肪細胞(脂細胞)和平滑肌細胞。優選的，所述結締組織細胞是成纖維細胞、軟骨細胞和骨細胞。更優選的，所述結締組織細胞是成纖維細胞。作為選擇，所述結締組織細胞是成骨細胞或骨細胞。可以認識到本發明可用結締組織細胞的混合培養基實施，也可以用單一類型的細胞。也可認識到組織細胞可用例如化學或放射處理，這樣所述細胞穩定表達有意義的基因。優選的，所述結締組織細胞當注射入 宿主有機體時不會引起負性免疫反應。可以明白同種異體細胞可用於此，同樣自體同源細胞可用於細胞介導的基因治療或體細胞治療。正如這裡所應用的，「結締組織細胞」包括大量來源於普通親本細胞的結締組織細胞。正如這裡所應用的，「宿主細胞」包括可或已經作為本發明載體受體的個體細胞或細胞培養基。宿主細胞包括單一宿主細胞的後代，所述後代和原始親本細胞不一定是完全相同的(在形態學或完整DNA受體上)，這是因為自然、意外或誘導的突變和/或變化。宿主細胞包括在體內用包含編碼TGF-β超家族一員聚核苷酸的載體轉染或感染的細胞。正如這裡所應用的，名詞「低骨量」指一種骨量低於年齡特異正常水平的疾病，由世界衛生組織「骨折風險以及將其用於篩選絕經後骨質疏鬆的預測(Assessment ofFracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis)(1994).世界衛生組織研究組的報告，世界衛生組織技術組843」的標準定義，這裡包含進來作為骨量正常和骨質疏鬆水平的參考。而且，名詞「骨量」指骨質量/單位面積，它有時候指骨礦物密度。正如這裡所應用的，名詞「保留」，當應用於脂質體輸入的上下文中，表示導入DNA保留在細胞中的能力。當在其他文中應用時，它表示靶DNA保留在靶細胞或組織中的能力，從而產生治療作用。正如這裡所應用的，名詞「哺乳動物宿主」包括動物王國的成員，包括但不局限於人類。正如這裡所應用的，名詞「成熟骨」涉及礦化骨，和非-礦化骨，例如類骨質形成對比。正如這裡所應用的，名詞「成骨有效」指的是能影響成熟骨形成和發展的量。正如這裡所應用的，名詞「骨祖細胞」或「骨祖細胞」是有變成骨細胞潛力的細胞，並存在於骨膜和骨髓中。骨祖細胞來源於也存在於周圍組織(肌肉)的結締組織祖細胞。正如這裡所應用的，名詞「患者」包括動物王國的成員，包括但不局限於人類。正如這裡所應用的，一種組合物是「藥學上或生理上可接受的」，如果接受的動物可容忍給藥或適合對那種動物給藥。如果所述給藥的量是生理有效的，那這種試劑以「治療有效的量」施用。如果一種試劑的存在可導致受試患者生理上可察覺的變化，那麼它就是生理有效的。正如這裡所應用的，「藥學上可接受的載體和/或稀釋劑」包括任何和所有溶劑、分散介質、塗層、抗菌和抗真菌劑，等滲和吸收延遲劑等等。應用這種藥學活性物質的介質和試劑在文中是熟知的。除非任何傳統介質或試劑和所述活性成分不相容，可將它們應用於治療性組合物中。輔助活性成分也可被包含進所述組合物。正如這裡所應用的，「啟動子」可以是任何活性DNA序列，並控制真核細胞中的轉錄。所述啟動子在真核細胞和/或原核中是有活性的。優選的，所述啟動子在哺乳動物細胞中是有活性的。所述啟動子可在結構上表達或誘導。優選的，所述啟動子是可誘導的。優選的，所述啟動子可由外部刺激誘導。`更優選的，所述啟動子可由激素或金屬誘導。同樣，「增強子元件」也控制轉錄，它可被插入DNA載體結構，並和本發明的結構一起應用而增強有意乂基因的表達。正如這裡所應用的，「可選擇標記」包括由穩定保存導入DNA細胞表達的基因產物，並導致細胞表達改變的表型，例如形態的變化或酶活性。表達轉染基因細胞的分離通過將編碼可選擇標記的第二種基因導入相同的細胞而實現，例如有酶活性的，可對抗生素或其他藥物產生抵抗。可選擇標記的實施例包括，但不局限於胸苷激酶、二氫葉酸還原酶、氨基糖甙磷酸轉移酶，它會對氨基糖甙抗生素產生抵抗，例如卡那黴素、新黴素和遺傳黴素、潮黴素B磷酸轉移酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、CAD (—種具有從頭生物合成尿苷三種酶活性的單一蛋白質一氨甲醯磷酸酯合成酶、天冬氨酸轉氨甲醯酶和二氫乳清酸酶)，腺苷脫氨酶和天冬醯胺合成酶(Sambrook等，Molecular Cloning, Chapterl6.1989),這裡完整包含進來作參考。正如這裡所應用的，「受試者」是一種脊柱動物，優選的是哺乳動物，更優選的是人類。正如這裡所應用的，「治療」是指一種獲得有益或理想臨床結果的方法。對於本發明來說，有益或理想的臨床結果包括，但不局限於，症狀的緩解，疾病程度的減輕，疾病的穩定狀態(例如沒有惡化)，疾病進展的延遲或變慢，疾病狀態的改善或減輕，減輕(部分或全部)，可察覺或未察覺。「治療」也指和如果沒有接受治療獲得的理想生存相比生存延長。「治療」也指治療性處理和預防性的措施。需要治療的包括那些已經患有疾病的以及預防疾病的。「減輕」一種疾病指疾病狀態的程度和/或不理想的臨床表現減輕和/或進展的時間減慢或延長，這些都是和未治療的情況相比。正如這裡所應用的，「TGF-β蛋白質」指的是蛋白質TGF-β超家族中的一員。正如這裡所應用的，「載體」、「聚核苷酸載體」、「結構」和「聚核苷酸結構」這裡互換應用。本發明的聚核苷酸載體可以是任何形式，包括但不局限於，RNA、DNA、裝在逆轉錄病毒衣膠囊中的RNA，裝在腺病毒衣膠囊中的DNA，以其他病毒或病毒樣形式打包的DNA (例如單純皰疹病毒以及腺相關病毒(AAV))，裝在脂質體膠囊中的DNA，和賴氨酸結合的DNAJP合成的聚陽離子分子結合的DNA，與化合物例如聚乙烯二醇(PEG)結合的DNA，從而免疫「掩蓋」分子和/或增加半衰期，或與非-病毒蛋白質軛合。優選的，所述聚核苷酸是DNA。正如這裡所應用的，「DNA」不僅包括鹼基A、T、C和G，還包括任何它們的類似物或這些鹼基修飾後的形式，例如甲基化核苷、核苷內部的改變，例如不帶電荷的連接和thioate,糖類似物的應用，以及被修飾和/或可供選擇的脊柱結構，例如聚醯胺。轉化生長因子-β (TGF-β)超家族轉化生長因子_β (TGF-β)超家族包括一組結構相關的蛋白質，它們在胚胎發育期間影響許多分化過程。這以初級胺基酸序列同型為基礎，包括完全保存7個半胱氨酸殘基。所述家族包括，Mullerian抑制物質(MIS),它對於正常雄性發育是所需的(Behringer等，Nature, 345:167,1990), Drosophila decapentaplegic (DPP)基因產物，它對於背腹軸的形成和成蟲盤的形態形成來說是所需的(Padgett等，Nature, 325:81-84,1987),激活素(Mason 等，Biochem, Biophys.Res.Commun.，135:957-964,1986)，它能誘導 Xenopus 胚胎中胚葉和前結構的形成(Thomsen等，Cell，63:485，1990)，骨形成蛋白(BMP，s，例如BMP-2至 BMP-15)，它能再次誘導軟骨和骨的形成(Sampath 等，J.Biol.Chem.，265:13198，1990)。TGF-β基因產物可影響許多分化過程，包括脂肪生成、肌形成、軟骨形成、造血作用和上皮細胞分化(回顧，見Massague，Cell 49:437，1987)，這裡完整包含進來作參考。TGF-β家族的蛋 白質一開始合成為大的前體蛋白質，接著在從C-末端大約110-140個胺基酸鹼基簇處蛋白水解。所述蛋白質的C-末端區域都是結構上相關的，不同的家族成員可根據它們同源的程度分為不同的亞群。雖然特殊亞群中的同源性範圍是70%-90%個胺基酸序列相同，但亞群之間的同源性明顯較低，通常僅有20%-50%。在各種情況下，活性種類似乎是C-末端片段的連有二硫化物的二聚體。對於已經研究過的該家族大多數成員，已發現同二聚體種類具有生物活性，但還檢測了該家族的其它成員，如抑制素(Ung 等，Nature, 321:779,1986)和 TGF-β (Cheifetz 等，Cell，48:409, 1987)的異二聚體，但它們似乎具有與同二聚體不同的生物特性。TGF- β 基因超家族的成員包括 TGF- β 3、TGF- β 2、TGF- β 4 (雞)、TGF- β 1、TGF- β 5 (非洲蟾蜍)、BMP-2、BMP-4、果蠅 DPP、BMP-5、BMP-6、Vgrl、0P-1/BMP-7、果蠅 60A、⑶F-l、非洲蟾蜍Vgf、BMP-3、抑制素一 β A、抑制素一 β B、抑制素一 α和MIS。這些基因在Massague, Ann.Rev.Biochem.67:753-791，1998中有討論，在此將其全文併入以供參考。優選地，TGF-β基因超家族的成員是BMP。更優選的，該成員是TGF-β 1、TGF-β 2、TGF- β 3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6 或 BMP-7。再優選的一個是人 BMP。最優選的成員是人BMP-2。BMP
BMP是在骨骼開始形成前誘導間充質類型細胞分化成軟骨細胞和成骨細胞的蛋白質。它們促進軟骨和骨骼形成細胞在骨折位置周圍分化，同時也在其它異位(ectopic)部位分化。這些蛋白質中的一些誘導鹼性磷酸酶和膠原在成骨細胞內合成。一些BMP直接作用於成骨細胞並促進它們的成熟，同時抑制肌細胞分化。其它BMP促進典型的成纖維細胞轉化成軟骨細胞，同時能夠誘導非成骨細胞類型表達成骨細胞表型。屬於TGF-β超家族的BMP家族包括:
ΒΜΡ-2Α或BMP-2_a(114個胺基酸)，也稱為ΒΜΡ-2。人、小鼠和大鼠蛋白質的胺基酸序列是相同的。該蛋白質與果蠅有68%的同源性。BMP-2B或BMP-2-β (116個胺基酸)，也稱為BMP-4。小鼠和大鼠蛋白質的蛋白質序列相同。BMP_3(110個胺基酸)是一種糖蛋白，且與骨生成蛋白相同。人和大鼠的成熟蛋白質有98%的同一性。BMP_3b(110個胺基酸)與BMP-3 (同一性82% )相關。人和小鼠的蛋白質顯示有97%的同一性(3個不同的胺基酸)。人和大鼠的蛋白質序列有兩個胺基酸不相同。該因子與⑶F-1O相同。BMP-4與BMP-2B和DVR-4相同。該蛋白質與果蠅有72%的同源性。BMP_5(138個胺基酸)。在胺基酸水平上，人和小鼠的蛋白質有96%的同一性。BMP-6 (139個胺基酸)與DVR-6和植物-特異性-相關蛋白一 I相同。BMP_7(139個胺基酸)與0P_1 (成骨蛋白一 I)相同。小鼠和人的蛋白質有98%的同一性。BMP-5、BMP-6和BMP-7的成熟形式顯示出75%的同一性。BMP-8 (139個胺基酸)與0P-2相同。該因子也被稱為BMP_8a。BMP_8b(139個胺基酸)與0P_3相同，且僅在小鼠中發現。該因子也被稱為0P_3。BMP-9 (110個胺基酸)也被稱為⑶F-5。BMP-10 (108個胺基酸)已從牛來源被分離。牛和人的蛋白質是相同的。BMP-1I (109個胺基酸)已從牛來源被分離。人和牛的序列是相同的。該蛋白質也被稱為⑶F-1 I。BMP-12 (104個胺基酸)也被稱為⑶F-7或CDMP-3。BMP-13 (120個胺基酸)與⑶F-6和CDMP-2相同。BMP-14(120個胺基酸)與⑶F-5和CDMP-1相同。BMP-15 (125個胺基酸)在卵母細胞中特異性表達。鼠類的這種蛋白質與鼠⑶F_9
最相關。這些蛋白質中的一些以異二聚體的形式存在。例如，OP-1與BMP-2A相結合。由於胺基酸序列同源性程度高(約90%)，BMP-5、BMP-6和BMP-7被認為是BMP —個不同的亞家族。編碼BMP-5和BMP-6的基因位於人染色體6上。編碼BMP-7的基因位於人染色體20上。可從脫礦物質的骨骼和骨肉瘤細胞分離BMP。已知它們在胚胎各種上皮組織和間充質組織中表達。已知一些BMP (例如BMP-2和BMP-4)將引發性質上完全相同的結果(形成軟骨和骨骼)並有相互取代的能力。骨生成蛋白和相關的BMP通過作為使單核細胞循環的有效化學引誘物，此外還通過誘導單核細胞合成和分泌TGF-βΙ，也促進軟骨成骨級聯中的額外連續步驟。TFG-β刺激下的單核細胞分泌許多趨化因子和促有絲分裂細胞因子到條件培養基，這可聚集內皮細胞和間充質細胞，並促進膠原和相關基質組分的合成。骨骼再生療法本發明揭示了將感興趣的DNA序列輸送到哺乳動物宿主結締組織的體外和體內技術。所述體外技術包括靶結締組織細胞培養基，在體外將DNA序列、DNA載體或其他有意義的傳輸載體轉染入結締組織細胞，接著將修飾過的結締組織細胞移植到哺乳動物宿主的目標骨缺損部位，這樣在體內影響有意義基因產物的表達。應該明白可能的是，將所述物質例如框架結構、矩陣或生物粘附例如棕黃層或其他化學粘附，還有各種外來組織和生物可容性載體，以及其他輔助材料可與本發明的遺傳修飾細胞一起植入。一方面，本發明包括治療組合物中的生物粘附劑，從而有利於遺傳修飾的結締組織細胞和骨缺損部位或鄰近部位接觸。作為選擇，可能將這種物質排除在本發明給藥系統中的組合物之外。普通的技工將會明白治療人類患者優選的細胞來源是患者自己的結締組織細胞，例如自體成纖維細胞或骨祖細胞(骨祖細胞)、骨細胞、成骨細胞或破骨細胞，也可以應用同種異體細胞。更特殊的，這種方法包括運用一種屬於轉化生長因子_β (TGF-β)超家族一員的基因產物，或具有生物活性的衍生物或其片段。在本發明另外一種實施方案中，所提供的以治療有效量胃腸外對患者施用包含TGF-β超家族蛋白質和合適藥物載體的化合物。本發明另外一種實施方案提供了以預防有效量胃腸外對患者施用包含TGF-β超家族蛋白質和合適藥物載體的化合物。
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在本申請中，提供了一種通過注射一種合適的哺乳動物細胞產生或再生骨的方法，這種細胞用編碼轉化生長因子_β (TGF-β)超家族一員的基因轉染或轉導，包括但不局限於ΒΜΡ-2和TGF-β 1、2和3，ΒΜΡ-2是典型的實施例。在本發明的實施方案中，明白了可以將細胞注入骨產生或再生的部位，而需要或不需要腳手架材料或任何其他輔助材料，例如外來細胞或其他生物相容的載體。即被修飾過的細胞可被注入骨再生的部位，而沒有任何其他結構或框架的幫助。在本發明一種實施方案中，這樣的附加物質揭示於，例如美國專利第5，842，477號中，並排除在本發明的組合物之外。本發明的方法可應用於身體中所有類型的骨，包括但不局限於，非-連接的骨折(不能癒合的骨折)，顱面重建、由於腫瘤切除的部分缺損，在髖移植矯正周圍的骨增加(例如25%髖移植物被現存移植物代替，因為髖移植物的壽命僅僅〈10年)，為了牙齒的原因頜骨的骨重建。而且，其他靶骨包括用作脊柱融合的椎骨，大骨等等。被修飾的細胞包括任何合適的哺乳動物結締組織細胞，它會有助於骨的形成，包括但不局限於成纖維細胞、骨祖細胞、成骨細胞、骨細胞和破骨細胞，還包括軟骨細胞。然而，可以明白其他非-遺傳修飾的細胞也可被包括在用來接觸骨缺損部位的組合物中，例如成骨細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞等等。作為體外處理宿主細胞的一種選擇，可將編碼有意義產物的基因導入脂質體，並直接注射入骨折或骨缺陷部位或鄰近部位，其中脂質體與結締組織細胞融合，導致在體內表達屬於TGF-β超家族的基因產物。如果提及「骨缺陷」或「缺陷骨」，應該明白這種缺陷可包括骨折、斷裂和/或骨的退變，包括由損傷或疾病導致的這些情況，進一步還包括脊柱椎骨的缺損，椎體間椎間盤部分的退變。在本發明的一個方面，由於椎體間椎間盤退變導致的疼痛可通過融合退變椎間盤周圍的椎體而治療。作為體外處理宿主細胞的一種選擇，，將編碼有意義產物的基因導入缺損骨部位，作為裸露的DNA。所述裸露DNA進入結締組織細胞，導致體內表達屬於TGF- β超家族的基因產物。整個說明書中揭示的體外治療骨折或骨缺損的方法起初包括製造一種重組病毒或質粒載體，它們包含編碼蛋白質或其生物活性片段的DNA。接著將這種重組載體用來感染或轉染一群體外培養的結締組織細胞，從而產生一群包含載體的結締組織細胞。接著將這些結締組織細胞移植到哺乳動物宿主的目標骨缺損部位，從而影響接下來缺損部位中蛋白或蛋白片段的表達。這種有意義DNA序列的表達對於完全修復骨折或缺損是有益的。更特殊的，這種方法包括運用一種能編碼轉化生長因子超家族一員的基因或編碼生物活性的衍生物或其片段和一種可選擇的標記的基因，或一種生物活性的衍生物或其片段的基因。本發明另外一種實施方案包括運用一種能編碼至少轉化生長因子超家族一員的基因或編碼一種生物活性的衍生物或其片段的基因，以及運用任何對於文中技術人員來說是所知的DNA質粒載體，它們能夠通過輸入穩定的保留在靶細胞或組織中，不管所應用的傳輸方法是什麼。本發明另外一種實施方案提供了一種將編碼產物的至少一個基因導入結締組織至少一個細胞中的方法，用來治療哺乳動物細胞。這種方法包括運用非-病毒方法將編碼產物的基因導入結締組織 細胞。更特殊的，這種方法包括脂質體膠囊化、磷酸鈣共沉澱、電穿孔術或DEAE-右旋糖苷間介作用，還包括運用能夠編碼轉化生長因子超家族的一員或其生物活性衍生物或片段，以及一種可選擇標記，或生物活性的衍生物或其片段的基因。本發明的另外一種實施方案提供了另外一種將編碼產物的至少一個基因導入結締組織至少一個細胞中的方法，用來治療哺乳動物宿主。這種其他方法包括運用利用病毒的生物學方法，將DNA載體分子輸入到靶細胞或組織。優選的，所述病毒是偽-病毒，它的基因組已經被改變，這樣偽病毒僅能被傳輸並穩定的保留在靶細胞中，卻沒有保留在靶細胞或組織中複製的能力。所述已改變的基因組進一步通過重組DNA技術處理，這樣所述病毒基因組起到了 DNA載體分子的作用，它包含在靶細胞或組織中表達的有意義的異種基因。本發明一種優選的實施方案是，通過將TGF-β基因傳輸到哺乳動物宿主結締組織中而將TGF-β蛋白質輸入到目標缺損部位，通過應用所述說明書中揭示的體外技術及逆轉錄病毒載體。換而言之，編碼功能性TGF-β蛋白或蛋白片段的有意DNA序列並亞克隆入精選的逆轉錄病毒載體中，接著所述重組逆轉錄病毒載體生長到足夠的效價，並用它在體外感染培養的結締組織細胞，並將轉導的結締組織細胞，優選自體移植的細胞移植入骨缺損部位或治療有效的鄰近部位。本發明另外一種優選的方法包括在體內應用腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體或單純皰疹病毒(HSV)載體直接將TGF-β超家族基因傳輸到哺乳動物宿主的結締組織中。換而言之，將編碼功能性TGF- β蛋白或蛋白片段的有意DNA序列亞克隆入各自的病毒載體中。所述包含病毒載體的TGF-β接著生長到足夠效價並移植入骨缺損部位或有效成骨的鄰近部位。將DNA分子呈遞至目標關節結締組織的方法包括，但不局限於將DNA分子以膠囊裝入陽離子脂質體，將有意DNA序列亞克隆在逆轉錄病毒或質粒載體中，或將DNA分子本身直接注射入骨缺損部位或有效成骨的鄰近部位。所述DNA分子優選的作為DNA載體分子出現，或是重組病毒DNA載體分子或重組DNA質粒載體分子。有意異種基因表達的確保是通過將在真核細胞中有活性的啟動子片段直接插入到異種基因編碼區域的上遊。所述文中一個普通的技術人員會利用已知的載體構建策略和技術來保證DNA分子進入結締組織後有合適的表達水平。文中的那些技術人員會意識到，所述運用脂質體的病毒載體不會被細胞分裂所限制，後者是逆轉錄病毒影響結締組織細胞感染和整合所需的。這種先前所述的運用非病毒途徑的方法包括運用一種能夠編碼屬於TGF-β超家族一員的基因和可選擇性的標記基因，例如抗生素抵抗基因。本發明另外一種實施方案包括在轉移細胞之前保存結締組織細胞。文中那些技術人員意識到所述結締組織細胞可冷凍保存在10%的DMSO液態氮中。本發明者通過轉染ΒΜΡ-2表達結構製造穩定的成纖維細胞系。這些ΒΜΡ-2製造的細胞將活性ΒΜΡ-2的高濃度在體內維持較長時間。使骨質疏鬆性骨折癒合的治療骨質疏鬆是一種由於骨質丟失而導致的骨骼結構性退變，產生的原因有骨形成的不平衡、骨再吸收或兩者都有，這樣再吸收支配了骨形成階段，因此減少了所作用骨的承重能力。對於一個健康的成年人來說，骨的形成和再吸收率是緊密協調的，這樣就維持了骨骼的更新。然而，在骨質疏鬆的個體中，這些骨重塑循環中產生了不平衡，這導致了骨量的丟失以及骨連續性中微結構 缺陷的形成。這些由於重塑順序混亂產生的骨骼缺損累積起來並最終達到一個點，骨骼的結構完整性嚴重損害，就可能發生骨折。雖然這種不平衡在大多數個體中是隨著他們的衰老(「老年性骨質疏鬆」)而逐漸形成的，但它在絕經後的婦女中嚴重的多，並以較快的率發展。此外，骨質疏鬆也會來源於營養和內分泌的不平衡，遺傳性疾病和許多惡性轉化。本發明的一個目標是發明在受骨折之苦患者中產生骨的方法和組合物，這種患者，例如受骨量減少疾病的痛苦，特別的所述疾病導致了骨重塑的不平衡。另外一個目標是增加骨的生長，從而修復受骨疾病之苦兒童的骨折，包括代謝性骨疾病。還有一個目標是修復有骨量丟失風險個體的骨折，包括絕經後的婦女、衰老的個體和血液透析的患者。另外一個目標是提供修復結構損害骨微結構缺陷的方法和組合物，包括修復骨折。因此，本發明的目標是刺激骨形成和增加骨量，任選的通過延長的時間，特別是為了降低由於骨骼結構性退變而產生的新骨折發生率。Namkung-Matthai 等，Bone, 28:80-86 (2001)揭不了一種大鼠骨質疏鬆模型，其中對骨折後早期的骨修復進行了研究。早期表示骨折後3-6周。Kubo等，SteroidBiochemistry& Molecular Biology, 68:197-202 (1999)也揭不了一種大鼠骨質疏鬆模型，其中對骨折後晚期的骨修復進行了研究。晚期表示骨折後大約12周。這些參考條目對於大鼠骨質疏鬆模型的揭示以及涉及骨質疏鬆的數據這裡都完整包含進來作參考。另一方面，本發明旨在發明加強脊柱動物骨移植的方法，例如哺乳動物，通過根據本發明在或鄰近骨折或斷裂部位施用遺傳修飾的細胞。骨折癒合測定在文中是已知的，包括骨折技術、組織學分析和生物機械分析，描述於例如，美國專利第6，521，750號，完整的將它們對於導致骨折和測定骨折程度的實驗準則和修復過程，特別是骨質疏鬆受試者的揭示包含進來作參考。在治療性的申請中，如果一種治療有效的組合物和所述結締組織細胞聯合施用時，TGF-β蛋白配製用作局部施用。 技術和製劑通常見於Remington』 s PharmaceuticalScience, Mack Publishing C0.，Easton, Pa.，latest edition。所述活性成分 TGF-β 蛋白通常和一種載體結合，例如賦形劑稀釋液，包括填充劑、混合劑、粘合劑、潤溼劑、崩解劑、表面活性劑、腐蝕聚合物或潤滑劑，這依賴於給藥方式和劑量形式的特點。典型的劑量形式包括粉末、液體製劑，包括懸浮液、乳劑和溶液，顆粒和膠囊。其他合適的藥物載體的實施例是各種陽離子脂類，包括但不局限於N-(1-2, 3- 二油基氧)丙基)-η, η, η- 二甲基氯化銨(DOTMA)和二油基磷脂醯乙醇胺(dioleoylphophotidyl ethanolamine) (DOPE)。脂質體也是本發明TGF蛋白分子合適的載體。其他合適的載體是緩慢-釋放的凝膠或包含TGF蛋白分子的聚合物。所述TGF-β蛋白可與一定量生理上可接受的載體或稀釋劑混合，例如鹽溶液或其他合適液體。所述TGF-β蛋白分子也可與其他載體裝置結合而保護TGF-β蛋白和其生物活性形式免受降解，直至到達他們的目標和/或促進TGF- β蛋白或其生物活性形式移動穿過組織屏障。脊柱融合的基因治療本發明旨在發明一種融合脊柱靶椎體的方法，通過在需要融合椎體的脊柱部位施用本發明的組合物。成骨有效量的轉化或轉染結締組織細胞，這種成纖維細胞或骨祖細胞和缺損部位或其成骨有效部位接觸，由醫生選擇單次注射或多次注射，使之最佳，從而導致了靶椎體的融合。脊柱是一個頂部互相堆疊在一起的骨(椎骨)柱，在它們之間有緩衝的盤(椎間盤)。在脊柱的中央是脊髓。脊神經來自於脊髓，並從椎體之間的空隙離開脊柱。凸出或脫出的椎間盤會壓迫存在的神經根。不穩定的脊柱使得骨之間相互滑動和摩擦，導致後背疼痛，有時候會導致神經損害。開展脊柱融合手術的對象通常是脊柱大體不穩(不正常運動)，過度活動引起的嚴重椎間盤退變性疾病，脊椎前移(一個椎體滑移超過另外一個)，對於其他治療無反應的面(關節)疾病，以及骨折或腫瘤。脊柱融合治療最佳的候選者是那些椎間盤非常不正常，以致椎體間的空間坍塌了 50%或更多，或已經坍塌這樣周圍骨變成了刺激。骨移植，通常移植物用來在脊柱融合手術期間增加穩定性。在部分椎間盤被去除後，椎骨變粗糙，將其塑形接受移植物。過了一段時間後，所述移植物將鄰近節段的椎體融合在一起。當骨融合後，椎體不再單獨移動。這就使得脊柱更加穩定。典型的，釘、板、籠、金屬棒和其他移植物可應用於脊柱融合手術中來增加穩定性。治療性組合物在本發明另外一種實施方案中，提供了一種以預防或治療有效劑量經胃腸外施用給患者的化合物，它包含編碼結締組織細胞的TGF-β超家族基因和一種合適的藥物載體。在治療的申請中，所述結締組織細胞含有一種編碼TGF- β超家族一員的基因，這種細胞可配製用作局部給藥。在本發明中，所述結締組織細胞通常和一種載體結合起來，例如賦形劑的稀釋液，可包含填充劑、混合劑、粘合劑、潤溼劑、崩解劑、表面活性劑、腐蝕聚合物或潤滑劑，這依賴於給藥方式和劑量形式的特點。適合注射應用的藥物形式包括無菌水溶液(其中是水可溶的)或懸浮液，以及用作臨時配製無菌可注射溶液或懸浮液的無菌粉末。在所有情況下，所述劑量形式必須是無菌的，它的流動性要到簡單可注射的程度。它在製造和保存的條件必須穩定，並且必須防止微生物的汙染，例如細菌和真菌。所述載體必須是溶劑或分散型介質，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液態聚乙烯二醇等等)，它們合適的混合物或植物油。維持合適的流動性可通過，例如應用塗層，如卵磷脂，在分散體的情況下維持所需的顆粒大小，以及通過應用表面活性劑。預 防微生物的作用可通過各種抗菌和抗真菌劑獲得，例如三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、theomersal等。在許多情況下，優選的包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可通過延遲吸收所述試劑組合物而獲得所述可注射組合物的延長吸收，例如利用單硬脂酸鋁和白明膠。尤其有利的是將胃腸外的組合物配製在劑量單位形式中，從而方便給藥及劑量的統一。這裡應用的劑量單位形式是指實體上分離的單位，是治療哺乳動物受試者合適的單一劑量；每個單位都包含預先決定量的活性材料，計算這些量聯合所需載體可以產生理想的治療作用。對於本發明劑量單位形式的詳述，受規定為並直接依賴於(a)所述活性材料的獨特特點以及獲得的特殊治療作用，以及(b)文中對化合物的限制，例如它是用來治療身體健康損害的活受試者疾病的活性材料。所述主要的活性成分以有效量配製為方便和有效的給藥，並與合適的藥物可接受載體一起配製在劑量單位形式中。在包含輔助活性成分的組合物中，所述劑量參考常規劑量以及所述成分的給藥方式決定。傳輸系統各種傳輸系統是已知的，並可用來施用本發明的組合物，例如脂質體中的膠囊，微顆粒、微膠囊，能夠表達所述化合物的重組細胞，受體介導的內吞作用，構建一種核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分等等，也可與其他生物活性劑一起施用。可以系統或局部給藥。在特殊的實施方案中，理想是將本發明的化合物或組合物局部施用到需要治療的部位；這可以通過，但不是為了限制，例如在手術中局部輸注，利用栓劑或移植物，所述移植物是多孔、非多孔或明膠材料，包括細胞膜，例如sialastic膜或纖維。本發明不局限於這裡描述的特殊實施方案的限制。實際上，除了這裡的描述外，根據先前的描述和附圖，本發明的各種修改對於那些文中的技術人員來說是顯而易見的。這些修改確定在所附權利要求的範圍內。為了闡明本發明給出了以下的實施例，而不是為了限制。實施例實施例1一骨再生的實驗步驟用人類胎腦cDNA和兩種引物通過PCR(聚合酶鏈反應)複製人類BMP2基因。5』弓 I物是 5 』 -TCCCAGCGTGAAAAGAGAGACTGC-3 』 (SEQ ID NO:1)，3 』 引物是 5 』 -TTTTGCTGTACTAGCGACACCCACAACC-3』 (SEQ ID NO: 2) 在利用富含 GC 的 PCR 系統(Roche)後，應用 TOPO TA 克隆成套工具(Invitrogen)克隆入pCRI1-TOPO載體(圖1A)。為了克隆入逆轉錄病毒載體，用Sal I剪切pCRIIbmp2DNA，並用Sal I和Not I懸突將人類BMP2cDNA插入物綁入pMTMLV中(圖1B)。在轉染前一天培養打包細胞系GP-293細胞(5x10s細胞/p60培養皿)。應用Fugene (Roche)將pMTMLV或pMT_BMP2轉染至GP-293細胞。在轉染48小時後，將新黴素加入培養基中，用來篩選抗新黴素細胞。篩選持續10天。培養選出293MT和293MTBMP2細胞(5x10s細胞/p60培養皿)用作第二天的編碼質粒pVSVG包膜的轉染。在轉染24小時後，為了感染鍍靶細胞NIH3T3 (5x10s細胞/p60培養皿)。將轉染細胞的上清過濾通過低蛋白粘合過濾器(0.45 μ m),並在轉染後48小時用相同體積的DMEM稀釋。去除NIH3T3培養基，並用過濾所得的上清替代。加入polybrene使得最終濃度為8 μ g/ml。在感染兩天後，開始新黴素篩選以獲得NIH3T3-neo和NIH3T3-BMP-2細胞穩定的細胞系。篩選持續10天。在24小時後測定產生的BMP2的量大約是150ng/105細胞。實施例2—將NIH3T3-BMP-2細胞注射入兔選擇體重2.0-2.5kg的紐西蘭白兔用作動物研究。暴露脛骨，並用骨科器械製造一個缺損(2cm長、0.5cm深)。在縫合後，將對照的NIH3T3_neo或NIH3T3-BMP-2細胞(2ml2xl06細胞/ml)注射入缺損部位。在注射所述細胞8周後，進行放射分析和組織學檢查。實施例3—每周X線檢查選擇體重2.0-2.5kg的紐西蘭白兔用作動物研究。暴露胚骨,並用骨科器械製造一個缺損(2cm長、0.5cm深)。在縫合後，將NIH3T3-BMP-2細胞(2ml2xl06細胞/ml)注射入脛骨的缺損部位。接著在注射細胞後1、2、3、4、5、6和7周進行X線放射分析。在注射後7周收穫樣本，並繪圖。在收穫後進行組織學檢查。

圖2A-2F顯示用NIH3T3-BMP-2成纖維細胞的骨再生。圖1A和IB顯示了注射對照NIH3T3成纖維細胞(A)和NIH3T3-BMP-2細胞(B) 8周後的腿骨圖。圖2C-2F顯示了在處死動物之前對照(C&D)和實驗(E&F)腿骨的X線檢查。用表達BMP-2蛋白細胞治療的骨缺損在注射8周後癒合，而在用對照成纖維細胞處理的缺損中不產生骨再生。圖3A-3D顯示了再生骨組織的組織學檢查。製造再生骨組織的石蠟切片並用Mason’s三色染色。結果顯示，再生骨組織(RB)的結構幾乎和正常骨組織(NB)的相同。圖3A和3B顯示了低倍放大(40x)，圖3C和3D顯示了高倍放大(IOOx)。點線表示再生和正常骨組織之間的邊界。這些結果表明再生骨組織的量和正常骨組織的相似。圖4A-4I顯示了用NIH3T3-hBMP2成纖維細胞的骨再生。在縫合後將NIH3T3-BMP-2細胞(2ml2xl06細胞/ml)注入脛骨的缺損部位。在注射所述細胞後的1、2、3、4、5、6和7周進行(A到G)X線分析。結果顯示在注射所述細胞後3周，缺損已經開始被新產生的骨組織填充，並在注射後6周完成。(H)在注射後7周收集樣本並繪圖。這張圖也顯示了再生骨組織完全填充了缺損。(I)在收穫後進行組織學檢查。顯示Mason’s三色染色的結果。染色的結果表明被修復的骨組織和正常骨組織有相似的特點。圖5A-5I顯示了用對照DMEM培養基的骨再生。在縫合後將對照DMEM培養基(2ml)注入脛骨的缺損部位。在注射所述培養基1、2、3、4、5、6周後進行(A到G)X線分析。所得結果，和NIH3T3-hBMP2成纖維細胞的數據相比，顯示所述缺損即使在注射細胞6周後也沒有被完全填充。(H)在注射後6周收集樣本並繪圖。這張圖也顯示了不完全填充的缺損。
(I)在收穫後進行組織學檢查。顯示Mason』 s三色染色的結果。實施例4一用NIH3T3-BMP2注射骨質疏鬆大鼠所述骨質疏鬆大鼠模型，例如揭示於Kubo等，Steroid Bioche-mistry &Molecular Biology,68:197-202,1999 ;和 Namkung-Matthai 等，Bone, 28:80-86,2001。暴露胚骨，並用骨科器械製造一個缺損(2cm長、0.5cm深)。在縫合後,將對照的NIH3T3_neo或NIH3T3-BMP-2細胞(2ml2xl06細胞/ml)注射入缺損部位。以數周間隔，尤其在注射所述細胞8周後，進行放射分析和組織學檢查。實施例5—脊柱融合的實驗步驟複製人類BMP2並轉染至NIH3T3，正如上面的實施例1所述。分別培養來自人類(包皮成纖維衍化細胞系，I型(Phase I))，小鼠(NIH-3T3，I型(Phase I))，大鼠(Lewis大鼠假關節纖維組織衍化細胞，II型(Phase II))以及人類(假關節纖維/疤痕組織衍化成纖維細胞，II型(Phase II))的粘附成纖維細胞並用BMP_2cDNA通過逆轉錄病毒轉染。應用Dulbecco改進的Eagle培養基(Cellgro, Herndon, Vir-gina), 10%熱失活的胎牛血清(Gibco BRL,Grand Island,New York)和青黴素及鏈黴素(Cellgro,Herndon,Virgina)使細胞在60mm的皿中生長。用逆轉錄病毒-BMP-2或-1acZ (陰性對照)感染成纖維細胞4小時/天持續2天。完成ELISA來測定表達蛋白的濃度(ng/ml)。對於每個樣本，將量為5xl06，10xl06，20xl06BMP-2產生的細胞吸收到1x0.5cm的膠原止血海綿上(ACS，HeIistat，Integra LifeSciences，Plainsboro，NJ)。 將 0.16-0.18mg/ml rhBMP-2(GeneticsInstitute, Cambridge, MA)吸到 1x0.5cmACS (陽性對照)上。將 Morselized 黯嵴骨放在融合部位。

例6—將細胞注射入大鼠的脊柱應用總共48隻雌性成年(3-4個月)無胸腺rnu/rnu大鼠(I型24隻；11型24隻)。麻醉大鼠。應用後正中線途徑暴露L4和L5的橫突。應用一種高速鑽僅剝離橫禿。衝洗部位(抗生素-ringers溶液)。在L4和L5橫突床之間植入細胞/ACS。每兩周進行一次X線檢查，直至處死。手觸L4-L5節段。在橫突間發現有移動就認為是融合失敗。進行非-脫鈣組織學檢查。圖6A和6B顯示了大鼠TGOOl應用可吸收膠原海綿(ACS)載體在後外側橫突間處理融合植入細胞4和6周後的X線圖。在利用用於BMP-2後外側橫突間處理融合研究的cDNA轉染5X IO6成纖維細胞(小鼠)後，X線上左側富集了橋骨。注意右側如果有的話，可能細胞較少，骨形成較少。正如所示，骨再生並且脊柱融合了。這裡所有弓I用的參考數目都完整的包含進來做參考。氺氺氺氺氺雖然為了闡明本發明特殊的實施方案，已經在上面進行了描述，但對於那些文中的技術員來說，顯而易見的是本發明細節的可發生各種變化但不背離本發明，正如所附權利要求所限定的。
權利要求
1.含有軟骨細胞和合適的藥物載體的組合物在製備在受低骨量折磨的患者骨缺陷部位形成骨的藥劑中的用途，其中，該軟骨細胞含有含編碼BMP-2的基因的載體。
2.如權利要求1所述的用途，其中，所述載體是逆轉錄病毒載體。
3.如權利要求1所述的用途，其中，所述載體是質粒載體。
4.如權利要求1所述的用途，其中，所述骨在早期產生。
5.如權利要求1所述的用途，其中，所述骨在晚期產生。
6.含有成骨細胞和合適的藥物載體的組合物在製備在脊柱的骨缺陷部位中形成骨以融合脊柱的藥劑中的用途，其中，該成骨細胞含有含編碼BMP-2的基因的載體。
7.如權利 要求6所述的用途，其中，所述載體是逆轉錄病毒載體。
8.如權利要求6所述的用途，其中，所述載體是質粒載體。
9.含有成骨細胞和合適的藥物載體的組合物在製備在骨質疏鬆性骨折部位形成骨以癒合該骨折的藥劑中的用途，其中，該成骨細胞含有含編碼BMP-2的基因的載體。
10.如權利要求9所述的用途，其中，所述載體是逆轉錄病毒載體。
11.如權利要求9所述的用途，其中，所述載體是質粒載體。
12.如權利要求9所述的用途，其中，所述骨在早期產生。
13.如權利要求9所述的用途，其中，所述骨在晚期產生。
全文摘要
本申請涉及通過基因治療的骨生成，具體涉及含有軟骨細胞和合適的藥物載體的組合物在製備在受低骨量折磨的患者骨缺陷部位形成骨的藥劑中的用途、在製備在脊柱的骨缺陷部位中形成骨以融合脊柱的藥劑中的用途以及、在製備在骨質疏鬆性骨折部位形成骨以癒合該骨折的藥劑中的用途，其中，該軟骨細胞含有含編碼BMP-2的基因的載體。
文檔編號A61P19/08GK103182092SQ20131009792
公開日2013年7月3日 申請日期2003年3月28日 優先權日2002年3月28日
發明者S·U·宋, 李泳錫, 李寬熙, 盧文鍾, H·裴 申請人:組織基因股份有限公司