一種從生物轉化或多酶反應液中分離純化胞二磷膽鹼的方法

2023-12-08 08:13:06 1

專利名稱：：一種從生物轉化或多酶反應液中分離純化胞二磷膽鹼的方法
技術領域：
：本發明涉及一種胞二磷膽鹼的分離純化方法。尤其是從生物轉化或多酶反應液中，採用新型離子交換樹脂組合柱層析，分離純化胞二磷膽鹼的方法。
背景技術：
：胞二磷膽鹼(cytidinediphosphatecholine,簡稱CDP-Choline，CDP-C)是機體卵磷脂合成的重要中間體，是磷脂代謝所必需的輔酶。在臨床上，CDP-C在腦中磷脂代謝受損的狀態下可以改善磷脂的代謝，從而促進意識的恢復。對腦外傷、腦手術所致的意識障礙，以及對一些慢性病如腦卒中後遺症、帕金森氏病、中樞性眩暈、耳鳴、青光眼和感覺性神經耳聾有一定的療效。CDP—C可用化學合成和生物合成製備。化學合成CDP-C通常需要製備一些中間體(如胞苷酸嗎啡胍鹽或胞嘧啶二磷酸二酚等)，工藝煩瑣；雖然Kennedy曾採用加入大量的二環己基羰基二亞胺(DCC)PH乍縮合劑直接縮合胞苷酸(CMP)和磷酸膽鹼來製備CDP-C(KennedyE.P.,J.Biol.Chem,1956,222:185)，但DCC試劑價格昂貴，用於工業生成成本過高；Ki:kugawa[叫(Kikugawa，Chem.Pharmaceut.BuU,1971,19:1011)和上海實驗生物研究所(海實驗生物研究所核酸研究組，生物化學與生物物理進展，1975，1:19)曾採用對甲苯磺醯氯代替DCC作縮合劑直接縮合CMP和磷酸膽鹼來製備CDP-C，但仍存在著操作要求嚴格和轉化率不高等問題。利用生物體內的相關酶系進行生物法合成，具有反應條件溫和、轉化率高、成本低等特點，因此近年CDP-C的生產大多都採用生物合成。生物合成中，以CMP與磷酸膽鹼(鹽)為底物生物合成CDP-C最為成熟。如文獻給出了利用酵母生物轉化合成CDP-C的生產條件pH8.0，20mmol/LCMP,酵母550g/L，磷酸鹽緩衝液為200mmol/L，葡萄糖1000mmol/L,磷酸膽鹼卯mmol/L，硫酸鎂20mmol/L，反應時間在24-32小時，反應溫度在28°C，CDP-C轉化率可達80%以上(生物化學與生物物理進展，1977,(4):15-19)。生物合成的CDP-C反應液中，含有蛋白質，色素，未反應完的磷酸鹽，磷酸膽鹼，硫酸鎂，胞苷酸，以及葡萄糖代謝副產物和胞苷等物質，這使CDP-C的分離純化帶來很多困難。CDP-C的分離提取先要經過離心去除菌體，調酸、調鹼去除蛋白；然後活性炭吸附洗脫；離子交換樹脂吸附，分部洗脫等步驟，一般回收率不超過40%，在工業生產中損耗嚴重(生物化學與生物物理學報，1976,8(3):199-205;黃穎，醫藥工業,1985,16(1):3-5)。另外價格較貴的未反應完的胞苷酸無法回收。
發明內容本發明需要解決的問題在於公開一種組合柱層析法從生物轉化或多酶反應液(以下簡稱反應液)中分離CDP-C的方法，以克服現有技術的缺陷，並適用於工業規模生產。本發明的構思是這樣的本發明採用新型離子交換樹脂組合層析法(圖1)。1#陽柱吸附中的色素，蛋白質，胞苷，調節pH;2#陰柱分離CDP-C和CMP;3，柱濃縮CDP-C溶液。1#陽柱可採用大孔酚醛系弱酸樹脂(HD-1)。該樹脂可吸附大分子物質，如蛋白質等，亦可交換去除陽離子，如鈣、鎂離子及胞苷，這樣可以保護後續分離不受這些物質的幹擾，增加後續柱的吸附量。同時還可以吸附去掉大部分的色素，改變反應液的pH為酸性。2#陰柱可採用大孔弱鹼性苯乙烯陰離子交換樹脂如D301或多孔結構的酚醛縮聚型弱鹼性陰樹脂如D345或大孔弱鹼丙烯酸系陰離子交換樹脂如D315等。由於CDP-C所帶負電荷要小於CMP，通過控制pH值可將兩者在柱上分離，即CMP吸附到樹脂，而CDP-C流出。同時大部分陰離子可被吸附到此柱上。3#陰柱可採用強鹼凝膠型陰離子交換樹脂，如華東理工大學HZ201或其它廠家生產的201x7，201x8等，粒徑在0.5-1.Omm之間。CDP-C可在此柱上得到濃縮，減少後續真空濃縮操作能耗。本發明的特徵是，通過新型陰陽離子交換樹脂的有序組合層析，可一次性分離純化得到高純度的CDP-C，與老工藝相比，柱分離時間縮短，水耗量降低60%以上，產品容易結晶。本發明的方法依次包括如下步驟1)將過濾後CDP-C反應液依次通過1、2、3#柱，使蛋白質、色素、陽離子吸附在1#柱中，陰離子和CMP及少量CDP-C吸附在2#柱中，大量CDP-C吸附在3#柱中。2)用去離子水洗滌1-3#柱，使P柱出口不再含CMP。3)用pH5.0的溶液串洗2-3#柱，使2#柱出口不再含有CDP-C。4)用高濃度的鹽和鹽酸濃液將CDP-C從3#柱上洗脫，即可得到高純度的CDP-C溶液。5)用pH3.0的溶液洗脫2#柱上吸附的CMP。通過上述分離過程，可高收率的獲得CDP-C產品，並可回收大部分未反應完的CMP,而其它副產物雜質都被柱所吸收或被洗脫時洗掉。本發明所用的方法具有操作簡便，產品回率高，分離效果好，所得產品質量優異，適合大規模工業生產等特點。圖1為流程圖。由圖1所示本發明所說的方法依次包括如下步驟，1)將CDP-C反應液過濾後，依次通過1#弱酸型陽離子交換樹脂柱，2#弱鹼型陰離交換樹脂和3#強鹼型陰離子交換樹脂。上柱總量為"柱總交換量的5-30%(摩爾比)，最佳為10-15%，即每30升樹脂可交換1公斤胞二磷膽鹼反應液。柱l:柱2:柱3體積比為1:1.2-2.5:0.3-0.8，最佳為1:1.4-1.8:0.5-0.7。上柱的線速度為0.11-0.45米/小時，最佳為0.25-0.35米/小時。上柱液中CDP-C的含量為l-20mg/mL，最佳為5-10mg/mL。上柱完畢，用去離子水充分淋洗，使1#柱出口不含胞苷酸為止。2)用pH5.0的溶液淋洗2#柱，使2#柱的出口不含CDP-C為止。然後改用pH3.0的溶液洗脫2"主，回收含CMP部分，經濃縮結晶得到CMP。3)用高濃度的鹽、酸混合溶液洗脫3#柱，所用的鹽可以為可溶性的鈉鹽或鉀鹽，本發明採用氯化鈉溶液，濃度為0.5-10%，最佳為3-5%。所用的酸溶液可以硫酸，鹽酸，磷酸等。本發明採用的稀鹽酸溶液，濃度為0.9-0.00001mol/L，最佳為0.1-0.001mol/L之間。得到的CDP-C溶液經濃縮後，加入3-5倍體積的乙醇，結晶，即可得到純度和含量都在98%以上的產品。本發明所說的1#柱所用樹脂為大孔酚醛系弱酸樹脂，如HD-l,122，125等，粒徑在5-30目，最佳在10-20目；所說的2#柱所用樹脂為大孔弱鹼性苯乙烯陰離子交換樹脂如D301或孔結構的酚醛縮聚型弱鹼性陰樹脂如D345或大孔弱鹼丙烯酸系陰離子交換樹脂如D315等，粒徑在在5-30目，最佳在10-20目；所說的3#柱可採用強鹼凝膠型陰離子交換樹脂，如HZ201、201x7，201x8，AmberlitelRA-900等，粒徑在60-150目之間，最佳為80-100目之間。分析檢測方法鈣鎂離子採用鉻黑T指示劑。蛋白質採用考馬斯亮藍顯色法測定。CDP-C和CMP採用HPLC法測定。具體實施方式實施例14000mLCDP-C反應液，含CDP-C34.5g，CMP5.0g，磷酸鹽150g，磷酸膽鹼40g，硫酸鎂9.7g，蛋白質107mg，按順序通過1-3#柱，流速為0.3m/h。柱1尺寸為40xl000mm，裝處理過的HD-1(H+)樹脂1000mL;柱2尺寸為6OxlOOOmm，裝處理過的D315(OH-)樹脂2000mL;柱3的尺寸為30xl000mm，裝處理過的HZ201樹脂500mL。上柱完畢，用1000mL去離子水淋洗。斷開柱1和柱2。然後用1500mLpH5.0的稀鹽酸溶液淋洗柱2。斷開柱2和柱3。再用pH2的稀鹽酸溶液(含氯化鈉4%)洗脫柱3。收集含CDP-C的洗脫液約800mL，濃縮至100mL，用氫氧化鈉調pH7.5。加入400mL無水乙醇，攪拌均勻，置4。C放置16小時，過濾結晶，真空乾燥得CDP-C鈉鹽27.9g，收率為80.9%。經檢測CDP-C純度為98.8%，蛋白質檢測為陰性，未檢測出磷酸鹽及鎂離子(〈10ppm)。另用pH3.0的稀鹽洗脫柱2，收集含CMP溶液，經濃縮結晶，得到CMP4.5g，收率為90%。實施例2將實施例1中的CDP-反應液4000mL，依次通過1-3#柱，流速為0.3m/h。柱1尺寸為40xl000mm，裝處理過的HD-1(H+)樹脂1000mL;柱2尺寸為60xl000mm，裝處理過的D301(OH-)樹脂2200mL;柱3的尺寸為30><1000mm，裝處理過的AmberliteIRA-900(OH-)樹脂450mL。其它按實施例1操作。結果得到CDP-C鈉鹽28.5g，純度98.9%，收率82.6g。回收胞苷酸4.0g，收率為80%。實施例3將實施例1所得的CDP-C(A)和用傳統工藝製成的CDP-C(B)用無菌水配製成0.125g/mL溶液，真空密封，在110'C加熱30分鐘。冷卻，在430nm測定吸光度，結果如表l。表ltableseeoriginaldocumentpage9權利要求1一種從生物轉化或多酶反應液中分離純化胞二磷膽鹼的方法，包括如下步驟1)將CDP-C反應液依次通過陽離子交換柱1、陰離子交換柱2和陰離子交換柱3；2)用去離子水洗滌柱1-3，使陽離子交換柱1出口不再含CMP；3)用pH5.0的溶液串洗陰離子交換柱2和陰離子交換柱3，使陰離子交換柱2出口不再含有CDP-C；4)用高濃度的鹽和鹽酸濃液將CDP-C從陰離子交換柱3上洗脫，即可得到高純度的CDP-C溶液；和，5)用pH3.0的溶液洗脫陰離子交換柱2上吸附的CMP。全文摘要本發明屬於生化分離
技術領域：
。本發明所要解決的技術問題在於公開一種從生物轉化或多酶反應液中分離CDP-C的方法，以克服現有技術中存在的CDP-C回收率低和胞苷酸無法回收的技術缺陷。本發明的技術方案是將CDP-C反應液依次通過陽離子交換柱1、陰離子交換柱2和陰離子交換柱3；用去離子水洗滌柱1-3；用pH5.0的溶液串洗陰離子交換柱2和陰離子交換柱3；用高濃度的鹽和鹽酸濃液將CDP-C從陰離子交換柱3上洗脫得到高純度的CDP-C溶液；用pH3.0的溶液洗脫陰離子交換柱2上吸附的CMP。本發明的方法分離時間縮短，水耗量降低60％以上，產品容易結晶，可高收率的獲得CDP-C產品，並可回收大部分未反應完的CMP。文檔編號C07H1/06GK101096380SQ20071002241公開日2008年1月2日申請日期2007年5月10日優先權日2007年5月10日發明者丁慶豹,邱蔚然,閆蓬勃申請人:南通秋之友生物科技有限公司