MicroRNA-433在製備治療高血壓腎衰竭藥物中的應用及其藥物的製作方法

2023-11-03 03:16:47 1

MicroRNA-433在製備治療高血壓腎衰竭藥物中的應用及其藥物的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種將抑制miR-433的物質用於製備治療高血壓腎衰竭藥物的應用，其中使用敲低miR-433質粒製作所述藥物。本發明還公開了一種治療高血壓腎衰竭的藥物，其含有敲低miR-433質粒。本發明提供的藥物可用於實現新型、安全、有效、可控制的基因療法,來抑制從AngII信號活化的TGF-beta介導的腎臟纖維化。
【專利說明】MicroRNA-433在製備治療高血壓腎衰竭藥物中的應用及其藥物

【技術領域】
[0001]本發明涉及MicroRNA-433在製備治療高血壓腎衰竭藥物中的應用及其藥物。

【背景技術】
[0002]高血壓腎病變已是末期腎病最重要的原因之一，而高血壓也是慢性腎衰竭最常見的併發症。
[0003]在慢性高血壓腎臟病時，因為應腎絲球過濾率的下降，腎臟本身會造成第二型血管張力素(ang1tensin II,AngII),而Ang II會收縮出球小動脈造成腎絲球壓力上升來代償腎絲球過濾率的下降。同時，AngII通過活化TGF-beta/Smad信號引致腎臟纖維化，最後，腎臟纖維化導致終末期腎功能衰竭，由於TGF-beta/Smad信號調控在腎臟疾病中的細胞外基質的表達，所以針對TGF-beta信號是控制纖維化的一個有吸引力的治療方法。然而，在TGF-beta信號傳導途徑的複雜性使得選擇適當的治療靶點困難。尤其是，針對在TGF-beta信號傳導途徑中的單個元素的方法被證明效用不大。
[0004]在過去的十年中，許多策略以直接阻斷TGF-beta影響已經被開發，包括使用TGF-beta的中和抗體、抑制TGF-beta的寡脫氧核苷酸(ODN)、可溶性人類TGF-beta II型受體，或TGF-beta受體激酶的特異性抑制劑。然而，通過深入調查後，發現採用這些策略作沒有產生如預期的有效的結果。這可能是由於封鎖TGF-beta信號上遊傳導途徑會損害TGF-beta的有效的抗發炎特性，並隨後促進腎臟炎症。另一方面，細胞內的Smad通路的串擾會阻礙靶向TGF-beta與TGF-beta受體激酶的策略。


【發明內容】

[0005]本發明的主要目的在於針對現有的治療高血壓腎衰竭藥物的不足，提供MicroRNA-433在製備治療高血壓腎衰竭藥物中的應用及其藥物。
[0006]為實現上述目的，本發明採用以下技術方案:
[0007]一種將抑制miR-433的物質用於製備治療高血壓腎衰竭藥物的應用，使用敲低miR-433質粒製作所述藥物。
[0008]優選地:
[0009]將所述敲低miR-433質粒與微泡造影劑混合以製作所述藥物。
[0010]所述微泡造影劑為六氟化硫微泡造影劑，優選Sonovue?:造影劑(Braccoimaging B.V, Plan-Les-Quates Geneve, Switzerland)。
[0011]所述敲低miR-433質粒與所述微泡造影劑的體積比為1:1。
[0012]構造敲低miR-433的質粒是將一個針對miR-433之初級轉錄物的短髮夾RNA (shRNA)合成在載體中，以產生一個miR-433的小髮夾RNA，其中所述短髮夾RNA的序列為:GAG AAG GAT CAT GAT GGG CTT，優選地，所述載體為 pSilencer4.1 載體(Invitrogen,Carlsbad, VA, USA)
[0013]採用不含內毒素的質粒試劑盒產生敲低miR-433的質粒。
[0014]製作含I μ M/ml的敲低miR-433的shRNA質粒的微泡的靜脈注射劑。
[0015]一種治療高血壓腎衰竭的藥物，含有敲低miR-433質粒。
[0016]還含有微泡造影劑，優選地，所述敲低miR-433質粒與所述微泡造影劑的體積比為 1:1。
[0017]採用含I μ M/ml的敲低miR-433的shRNA質粒的靜脈注射劑。
[0018]本發明的有益效果:
[0019]本發明提供抑制miR-433以治療高血壓腎衰竭的藥物及其製備方法。抑制miR-433的治療不單有效抑制AngII信號，也抑制從AngII信號活化的TGF-beta信號，壓制Smad3蛋白的磷酸化機制去調控Smad3的激活，而且減少體內腎纖維化和中止腎纖維化的進展。miR-433的抑制將會是打擊慢性高血壓腎臟病的一種有效的治療。
[0020]此外，MicroRNA的治療優點是，它們能針對參與同一信號途徑內多個基因。與此相反，傳統療法只針對單一蛋白，而使其他蛋白不會受到影響，因此未必能夠有效調控維持的病理機制。在另一方面中，miRNA具有特定的和定義的目標在該疾病的發病機制，從而導致治療的高特異性。其它的優點是長效作用和生物利用度，實際上的microRNA調節劑可以在體內大部分組織有效地作用。
[0021]本發明提供的藥物可用於實現新型、安全、有效、可控制的基因療法，來抑制從AngII信號活化的TGF-beta介導的腎臟纖維化。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1A示出未使用本發明實施例的藥物時和使用本發明實施例的藥物之後的實時PCR檢測結果；
[0023]圖1B示出未使用本發明實施例的藥物時和使用本發明實施例的藥物之後的免疫組織化學結果；
[0024]圖1C示出未使用本發明實施例的藥物時和使用本發明實施例的藥物之後的實時PCR檢測結果；
[0025]圖1D示出未使用本發明實施例的藥物時和使用本發明實施例的藥物之後的免疫印跡結果；
[0026]圖1E示出未使用本發明實施例的藥物時和使用本發明實施例的藥物之後的量化後的免疫印跡結果；
[0027]圖2A示出未使用本發明實施例的藥物時和使用本發明實施例的藥物之後，從組織學、馬森三色染色法(Masson』 s trichrome staining)和免疫組織化學的結果；
[0028]圖2B示出未使用本發明實施例的藥物時和使用本發明實施例的藥物之後的蛋白質印跡結果；
[0029]圖2C示出未使用本發明實施例的藥物時和使用本發明實施例的藥物之後的I型膠原、纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的表達。

【具體實施方式】
[0030]以下結合附圖對本發明的實施方式作詳細說明。應該強調的是，下述說明僅僅是示例性的，而不是為了限制本發明的範圍及其應用。
[0031]本發明的實施例優選採用超聲微泡質粒轉染技術將抑制miR-433的shRNA質粒轉染到腎臟，下調miR-433在腎臟細胞的表達。可以檢測miR-433治療慢性高血壓腎臟病的良好效果。由於TGF-beta調控的microRNA在TGF-beta誘導纖維化的過程發揮的重要作用，因此，我們特別可以以特異性靶向的TGF-beta下遊microRNA去抑制TGF-beta的下遊途徑，從而控制TGF-beta誘導下的纖維化，而避免影響TGF-beta的抗發炎特性，這會是一個治療腎臟纖維化更好的選擇。
[0032]具體來說，實施例優選提供用於靜脈注射的含有抑制miR-433的shRNA質粒的微泡的藥物，優選含量I μ M/ml。可通過靜脈注射此藥物質粒，然後在腎旁加進超聲能量，優選為5分鐘，Iff, IMHz的超聲能量，超聲治療增強質粒傳遞到整個腎臟，效率可達90%的細胞腎小球、腎小管間質和血管壁的細胞核。
[0033]藥物的組成成分
[0034]在優選的實施例中，藥物包括:
[0035]1.敲低 miR-433 的質粒；
[0036]2.Sonovue? (六氟化硫微泡)造影劑(Bracco imaging B.V, Plan-Les-QuatesGeneve, Switzerland)。
[0037]在優選的實施例中，還進一步提供含有上述藥物成分的靜脈注射藥物。
[0038]藥物的制各
[0039]在優選的實施例中，藥物採用敲低miR-433質粒和Sonovue? (六氟化硫微泡)造影劑混合來製備。
[0040]在更優選的實施例中，構造敲低miR-433的質粒是將一個針對miR-433之初級轉錄物的短髮夾RNA(shRNA)(序列為:GAG AAG GAT CAT GAT GGG CTT)合成在pSilencer4.1載體中(Invitrogen, Carlsbad, VA, USA),以產生一個miR-433的小髮夾RNA。並可採用不含內毒素的質粒試劑盒(Qiagen, Valencia, CA, USA)去大量產生敲低miR-433的質粒。最後，該質粒優選以1:1 (體積/體積)的比例與Sonovue? (六氟化硫微泡)造影劑(Braccoimaging B.V, Plan-Les-Quates Geneve, Switzerland)混合備用。
[0041]施藥方式
[0042]1.靜脈注射含有構造敲低miR-433的質粒的微泡(400 μ I)，
[0043]2.在腎旁加進超聲能量(1MHz，1W)5分鐘。
[0044]藥物療效實驗及實驗數據的具體i兌明
[0045]為了驗證抑制miR-433的表達對在體內血管緊張素II (AngII)誘導的腎纖維化的作用，我們利用小鼠殘腎模型作為高血壓腎病的模型，採用超聲微泡質粒轉染技術將抑制miR-433的質粒轉染到腎臟，下調miR-433在腎臟細胞的表達，檢測miR-433治療慢性高血壓腎臟病的效果。施用藥物中質粒優選份量:150 μ g/25g(質粒/小鼠體重)。
[0046]我們先建立5/6腎切除(動脈結紮)模型的小鼠殘腎模型，三天後，當高血壓形成，我們靜脈注射含有和抑制miR-433的質粒(1μΜ/πι1，400μ I)的微泡給小鼠，然後在腎旁加進超聲能量(1W，IMHz的)5分鐘，超聲治療增強質粒傳遞到整個腎臟。
[0047]在5/6腎切除後的第4周，腎臟內的miR-433的表達顯著增加(圖1A)。然而，輸入敲低miR-433的質粒抑制了在殘腎中miR-433的表達(圖1A)。
[0048]我們研究敲低miR-433治療會是否影響TGF-beta信號，因為TGF-beta信號是腎臟纖維化的關鍵信號通路，在高血壓腎病的小鼠殘腎模型中，腎臟的TGF-beta信號被激活，增加腎臟的TGF-betal，TGF-beta受體I (Τ β RI)和磷酸化Smad3 (P_Smad3)蛋白(圖1B-E)的表達。然而，輸入敲低miR-433的質粒抑制TGF-betal，T β RI和磷酸化Smad3蛋白的表達(圖1B-E)。這表明的是，敲低miR-433的表達抑制腎臟TGF-beta信號傳導的激活，導致腎纖維化被抑制。
[0049]組織學上，在4周5/6腎切除後引起繫膜擴張，腎小球纖維化和腎小管萎縮(圖2A),馬森三色染色法(Masson』 s trichrome stainin)顯示在殘腎間質出現纖維化。當比較用空載體治療後的小鼠，敲低miR-433治療減少腎小管萎縮和間質纖維化(圖2A)。符合腎損傷和間質纖維化程度，纖維化標誌物的表達(包括I型膠原，纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(a -SMA))的表達均上調(圖2A-C)，但輸入敲低miR-433的質粒下調纖維化標誌物的表達水平(圖2A-C)。這些結果證明了敲低miR-433的表達減少高血壓腎病的間質纖維化。
[0050]如圖1A所示，實時PCR檢測結果表明，在5/6腎切除後的第4周，腎臟內的miR-433表達增加，但輸入敲低miR-433的質粒抑制後，miR-433的表達就降低。
[0051]如圖1B所示，從免疫組織化學結果表明，在5/6腎切除後的第4周TGF-betal和Smad3的磷酸化表達是增加的,但輸入敲低miR-433的質粒抑制後,其表達就降低。
[0052]如圖1C所示，實時PCR檢測結果表明，在5/6腎切除後的第4周，腎臟內的TGF-betal的表達增加，但用敲低miR-433質粒治療後抑制其表達水平。
[0053]如圖1D所示，免疫印跡結果及(圖1E)量化後的免疫印跡結果顯示，在5/6腎切除後的第4周，腎臟的TGF-betal，TGF-beta受體I (Τ β RI)和磷酸化Smad3 (P-Smad3)蛋白的表達增加，但用敲低miR-433質粒治療後減少這種增加。
[0054]如圖2A所示,從組織學，馬森三色染色法(Masson，s trichrome staining)和免疫組織化學的結果均表明，在5/6腎切除後的第4周，敲低miR-433質粒治療能物改善腎間質纖維化，降低在4周殘餘腎臟中膠原基質的積累，包括減少I型膠原，纖連蛋白和α -平滑肌肌動蛋白的表達。
[0055]如圖2Β所示，蛋白質印跡結果表明，在5/6腎切除後的第4周，I型膠原，纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的表達是升高，但用敲低miR-433的質粒的治療後卻降低它們的表達。
[0056]如圖2C所示，實時PCR檢測結果表明，在5/6腎切除後的第4周，I型膠原，纖連蛋白和α -平滑肌肌動蛋白的表達是升高，但輸入敲低miR-433的質粒抑制後，其表達就降低。
[0057]總結來說，抑制miR-433的治療有效抑制從AngII信號活化的TGF-beta信號，壓制Smad3蛋白的磷酸化機制去調控TGF-beta信號的激活，而且減少體內腎纖維化和中止腎纖維化的進展。miR-433的抑制將會是打擊高血壓腎臟病的一種有效的治療。
[0058]以上內容是結合具體/優選的實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，其還可以對這些已描述的實施方式做出若干替代或變型，而這些替代或變型方式都應當視為屬於本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種將抑制miR-433的物質用於製備治療高血壓腎衰竭藥物的應用，其特徵在於，使用敲低miR-433質粒製作所述藥物。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，將所述敲低miR-433質粒與微泡造影劑混合以製作所述藥物。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述微泡造影劑為六氟化硫微泡造影劑，優選Sonovue?:造影劑。
4.如權利要求2或3所述的應用，其特徵在於，所述敲低miR-433質粒與所述微泡造影劑的體積比為1:1。
5.如權利要求1至4任一項所述的應用，其特徵在於,構造敲低miR-433的質粒是將一個針對miR-433之初級轉錄物的短髮夾RNA(shRNA)合成在載體中，以產生一個miR-433的小髮夾RNA，其中所述短髮夾RNA的序列為:GAG AAG GAT CAT GAT GGG CTT，優選地，所述載體為 pSilencer4.1 載體(Invitrogen, Carlsbad, VA, USA)。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，採用不含內毒素的質粒試劑盒產生所述敲低miR-433質粒。
7.如權利要求1至6任一項所述的應用，其特徵在於，製作含Iμ M/ml的敲低miR-433的shRNA質粒的微泡的靜脈注射劑。
8.一種治療高血壓腎衰竭的藥物，其特徵在於，含有敲低miR-433質粒。
9.如權利要求8所述的藥物，其特徵在於，還含有微泡造影劑，優選地，所述敲低miR-433質粒與所述微泡造影劑的體積比為1:1。
10.如權利要求8或9所述的藥物，其特徵在於，採用含Iμ M/ml的敲低miR-433的shRNA質粒的靜脈注射劑。
【文檔編號】A61P9/12GK104174030SQ201410348629
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月21日 優先權日:2014年7月21日
【發明者】鍾志剛 申請人:香港中文大學深圳研究院